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DiagnóStico Molecular De La InfeccióN Por Hpv
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  • Transcript

    • 1. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR HPV NUEVAS TECNOLOGIAS DETECCIÓN HPV Juan José Terrádez Raro Anatomía Patológica H. Arnau de Vilanova BASES MOLECULARES DEL CANCER APLICACIÓN A LA PATOLOGIA TUMORAL Hospital Luis Alcanyís XATIVA. Valencia
    • 2. Situación de la detección precoz en EUROPA 1959 ( Ostfold County,Norway ) 1960 ( Región de Grampian. Scotland) 1963 Programas de cribado organizado en países nórdicos: Finlandia, Islandia y Suecia No se introduce en Noruega Éxito del Programa Finlandés : Cribado a mujeres de 30-60 años Pauta: Cada 5 años. Suecia: Valoración de la eficacia del cribado basado en el análisis de lesiones preinvasivas. 1965: Programa de cribado organizado en Paises Bajos (BENELUX) 1980: Programa de cribado organizado en una provincia de Dinamarca 1980/ 1989: Programa de cribado organizado en Inglaterra Austria, Alemania y Luxemburgo en año 2000. Tendencia ineficaz de sus cribados 1990: “ European commission, “ Europe Aganist cancer”. Red Europea de cribado Grupo de Epidemiología de la Red E. de cribado CC. VARIABILIDAD entre los Pr. De Cribado : Organización/Aplicación Metodología de Cribado 2008 España: Cribado oportunista Evaluación / Manejo clínico 1993: European Commision´s Quality Assurance Guidelines for CC screening 1995-2005 Numerosos Estudios multicéntricos y Planes Pilotos con N.Tecnologías Miller AB. The inefficiency of cervical screening in Europe. European J Cancer 2002;38:321-326 A.Linos, E.Ariza. Introduction Cervical Cancer Screening. European J of Cancer 36 (2000) 2175-2176
    • 3. A pesar del cribado, el cáncer de cuello uterino sigue siendo demasiado frecuente *Grupo de edad 0->65 1- Van Ballegooijen y cols. Eur J. Cancer. 2000; 36: 2177-2188. 2- Anttila y cols. Brit. J. Cancer . 2004; 91: 935-941. 3- Luengo Matos y cols. Aten Primaria. 2004; 33(5):229-36. 4- Ferlay J y cols. GLOBOCAN 2002 3- Quinn et al. BMJ 1999; 318: 904-908 9,3 3,4 58 3 25-64 Bélgica 1 12,6 5,0 75 3 23-59 Dinamarca 2 8,2 3,1 83 3 23-60 Suecia 2 7,6 2,2 49,6 3 a 5 20-64 España 2, 3 7,3 2,3 77 5 30-60 Países Bajos 2 8,1 2,2 53-74 3 25-64 Italia 2 10,8 3,8 50 1 20-85 Alemania 2 9,8 3,1 69 3 25-65 Francia 2 4,3 1,8 93 5 30-60 Finlandia 2 8,3 3,1 83 3 a 5 20-64 Inglaterra 2 Incidencia de cáncer de cuello uterino/ 100.000 4 Mortalidad del cáncer de cuello uterino/ 100.000 4 % con detección selectiva regular Intervalo (años) Límites de edad (años) Recomendación
    • 4. Segundo cáncer en frecuencia en mujeres jóvenes europeas UE, mujeres (edad 15–49) Casos nuevos de cáncer cada año: 106,906 1. Ferlay y cols., editores. Globocan 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, version 1.0 IARC Cancer-Base No.5. Lyon. IARC Press, 2001
    • 5. Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000) (1) Estimación basada en Globocan 2000. (2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2-7%). (3) Estimación de un 0.1% de prevalencia de HSIL basado en (2) Cerca de 1000 muertes/ año 2008 MUJERES (1) (15 - 74 años) 15.640.000 VPH + (2) 655.000 ASCUS/LSIL (2) 497.000 HSIL (3) 16.000 Cáncer invasor (1) 2.000
    • 6. ESTUDIO AFRODITA 2007 Informe sobre la situación de la Patología Cervical en España Encuesta poblacional 6852 mujeres (18-65) 19 C. Autónomas XVII Reunión AEPC Dr. J. Castellsegué Serv. Epidemiologia I.C.O. 2006. Análisis de cobertura en dif. Comunidades Autónomas (58%-85%) 51% no saben ¿HPV? 38% conocen su existencia 25% no PAP en su vida
      • Cribado oportunista poco eficiente / NO equitativo
      • Ausencia de un cribado poblacional organizado
      • Diferencias respecto
      • de la frecuencia de
      • realización de la toma
      Sanjose S et al. Eur J Obstet Gynecol and Reprod Biol 2008, May 20 Puig Tintoré LM; J Low Genit Tract Dis 2008; 12:82-9
    • 7. Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España (1975-2004) Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)
    • 8. Hitos en el Screening del Cáncer de Cérvix ThinPrep ® SurePath ® 1996 1999 1949 LBC: Citología líquida 2003 Revisión de las pautas de screening 1990s LBC 2000s Test de Papanicolau VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix 1 1 Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado ) PCR 1980 P16 CINTec Cervatec p16 ELISA L1Ag Cytoactiv ONCOTEC mRNA E6/E7 Screening 1º basado en DNA HPV HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD 2008 PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia 1963-2008 Meisels and Fortin 1976 Purola and Savia 1977 Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al. 1983
    • 9. Filogenia Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995) 31 16 35 45 18 39 11 6 33 VP Humanos (mucosa genital) Beta HPV VP Animales VP Humanos (cutaneos) Alfa HPV
    • 10. HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age 15- 19 20- 24 25- 29 30- 34 35- 39 40- 44 45 - 49 50- 54 55- 59 60- 65 Age (Years) HPV Prevalence (%) HPV (HC2) Cancer 1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871. 0 5 10 15 20 25 30 Cancer incidence per 100,000 0 5 10 15 20 25 30
    • 11.
      • Historia natural de la Infección por HPV
      • La infección por HPV-HR produce una lesión morfológíca con fuerte tendencia
      • a la regresión y muy baja a la progresión ( Moscicki 2004; Castle 2005)
      • La resolución de la infección confiere inmunidad.
      • Una inf. posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación
      • de una infección latente lo que podría explicar el aumento de prevalencia
      • observado en mujeres mayores de 60 años ( Silvia de Sanjosé 2006)
      • En el proceso de carcinogénesis los eventos moleculares no se correlacionan
      • con las categorias morfológicas . ( Gran variabilidad interobservador del CIN II)
      • La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo
      • contrario. (Cantor et al 2005)
      • Pueden aparecer lesiones de alto grado en ausencia de LSIL. (Schiffman et al 2005)
      • La carcinogenesis precisa de una infección persistente
      • Inf. 7-15 a. CIN III 10 a. C. E. I. ( Bosch y Sanjose , 2003)
    • 12. Historia natural de la Infección por HPV Sylvia MichelinaFernandes Brenna; Kari Juhani Syrjänen Sao Paulo Med. J. vol.121 no.3 Sao Paulo  2003
      • Sobreexpresión de E5,E6 y E7
      • Alteración en los oncogenes y genes supresores de la célula infectada:
      • Alt. Genéticas: Pérdidas en 3p,6q,10p,11p,13q y 18q
      • Ganancias en 3q,7q,8q,9q y 20q
      • Alteraciones estructurales en 10,18 y 20 . (Cottage et al 2001)
      • Oncogenes: Gen del EGFR, c-myc, neu/c-erB2, MDM2 y Ras
      • Genes supresores: CDH1, DAPK,FHIT,HIC-1,p16,RAR-beta,RASSFIA,TIMP-2
      • TSLC1. Hipermetilación de genes supresores entre el 20-40% de CEI
      • (Steeenbergen et al 2005)
      • Activación de la telomerasa: subunidad catalítica hTERT . (Snijders et al 1998)
    • 13. World Health Organization Classification
    • 14.  
    • 15. Nuestro problema: Lesión escamosa atípica
    • 16. Metaplasia transicional
    • 17. METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV
    • 18. Metaplasia papilar inmadura
    • 19. ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos Diagnóstico diferencial con SIL
    • 20.  
    • 21. EL PAPILOMAVIRUS
    • 22. EL VIRUS: ORGANIZACIÓN GENÓMICA
      • Consta de varios genes u “Open Reading Frames” (ORF) de dos tipos diferentes:
      • Hasta 8 genes de expresión temprana o “early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en proteínas para la regulación y replicación viral
      • 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2) que generan las proteínas para la unión de la cápside
      • Una región URR ó LCR que controla la expresión de los genes tempranos E6 y E7
    • 23. REGION EARLY: Funciones proteínas Mecanismos reguladores crecimiento Membrane associated epitelial hiperplasia Activation EGFR / Inhibition Vascular ATPase Inhibition MHC-I and MHC-II E5B E1 (Factor Replicación ADN viral) E2 (Regulador de la replicación ADN y transcripción ARN) Target: CRA-UBF (Upstream Binding Factor) Domínio: 5H 216-255C E7 (Ruptura ciclo celular). Rb / P16 E6 (Degradación p53) Antiapoptotic / BAK Activ. TELOMERASA
    • 24. Patogenia del cáncer de Cérvix 1 . Bosch FX, et al. Journal of Clinical Pathology , 2002,55: 244-265.
      • RESPUESTA INMUNE:
      • Enmascaramiento antigénico
      • MHC-II En células dendríticas
      • POLIMORFISMOS
      • VARIANTES APLOTÍPICAS
      • TOll like Receptors
      HPV infection Persistent HPV infection Cellular dysregulation High-grade CIN Invasive cancer Immunologic factors Co-carcinogens
    • 25. REGION LATE: Funciones proteínas L1 Proteina mayor cápside 57 KDa Virion formation Interactua con L2 Interactua con receptores de la célula 72 capsómeros Capsómero de L1 5 x L1 Partícula viral Virus HPV Proteina L1 L2 Proteina menor cápside de 43-53 KDa Genome encapsidation / Membrana penetration / Entry / Traficking
    • 26. VARIABILIDAD GENÉTICAY DETECCIÓN
      • Los genes de expresión tardía “Late” presentan secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos de VPH.
      • gen L1 principal diana “consenso” de detección.
      • Los genes de expresión temprana “Early” presentan secuencias muy variables por lo que se han utilizado para la detección específica del tipo.
        • genes E6 y E7.
    • 27. Changes in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTION Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )
    • 28. Infección productiva HPV
    • 29. Changes in expression patterns that accompany progression to cervical cancer Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez ) Decresing epitelial diferentation Virus producing Non productive
    • 30. ¿Cómo se transforma una infección HPV en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN huésped Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46. LCR E7 E6 E1 L1 L2 E2 E4 E5 Punto de rotura e integración + – LCR E7 E6 E1 L1 L2 E2 E4 E5 ADN del VPH integrado AND huésped ADN huésped E2 ADN episomal del VPH
    • 31. La integración aumenta el riesgo de cáncer - I PA p53 E6 Después de la integración Episoma Asociación de E6 con p53 y PA
      • Efecto
      • Expresión del gen E6 controlada por E2
      • La expresión de E6 deja de estar controlada
      • Bloqueo de la actividad de p53
      • Resistencia a la apoptosis
      • Aumento de la inestabilidad cromosómica
      Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46. Forma del VPH en la célula
    • 32. La integración aumenta el riesgo de cáncer - II E2F pRB E7 Después de la integración Episoma Libre Forma del VPH en la célula
      • Efecto
      • Expresión del gen E7 controlada por E2
      • La expresión de E7 deja de estar controlada
      • Generación de múltiples cromosomas
      • Inmortalización celular
      • Oncogénesis
      + Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
    • 33. DETECCIÓN DEL HPV
      • El HPV no puede cultivarse in vitro.
      • No hay tests serológicos lo suficientemente sensibles y seguros para la detección de la presencia del HPV.
      • Los tests utilizados en la actualidad se basan en la detección de ácidos nucleicos del virus ( DNA, RNA).
    • 34.  
    • 35. Proposed new screening algorithm Women aged 25-64 y HPV Test Normal 5 year recall CYTOLOGY HPV test and Cytology at 6-12 months Colposcopy Normal 5 Year Recall Cyto Neg HPV Neg Colposcopy Negative Positive =/> Mild Normal or Borderline Cyto=/> Mild HPV and Cytology at 6-12 months HPV+ and Cyto >mild HPV – and Cyto Borderline EUROGIN November 2008
    • 36. Métodos de detección del HPV y uso clínico
      • Citología Papanicolau / citología líquida
      • Automatización de la lectura.
      • Colposcopia / Microcolposcopia
      • Colposcopia computarizada
      • Métodos moleculares basados en la detección
      • de ADN / RNA viral
      • Métodos basados en la detección de patrones de
      • expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA / Cit/ Tej.
      • Métodos SEROLOGICOS de detección de Ac. contra HPV
    • 37. Carácter ísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicos Pendiente de estandarizar. Tecnologías patentadas. Requieren experiencia y dotación costosa del laboratorio. Tecnología flexible (carga viral y genotipo). Sensibilidad muy alta. Análisis múltiple. Amplificación de la diana Tecnologías patentadas y costes elevados. Genotipado en grupos. Comercializada y estandarizada. Semicuantitativa. Señal amplificada Baja sensibilidad, laborioso, y el SB no puede utilizar tejido con ADN degradado. SB es el estándar y el FISH permite ver el VPH asociado con la lesión histológica. Sonda directa Inconvenientes Ventajas Método
    • 38. Principios usados en las técnicas mas comunes de detección del HPV 1- Hibridación in situ (ISH): (Sonda directa) Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. ( Comercial ) 2- Hibridación seguida de “amplificación de la señal” Hybrid Capture 2 (HC2 R ,Qiagen): RNA probe Coktail. (Comercial). Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test. ( Comercial). 3- PCR de amplio espectro : “ Amplificación de DNA con primers consenso” o formato múltiplex ( Disponibles comercialmente) Real time HR-HPV ( Aboot) AMPLICOR R ( Roche) 4- PCR tipo específicas: Linear Array / Secuenciación
    • 39. 1- Hibridación in situ sobre tejido: sondas HPV HR Poca sensibilidad
    • 40.
      • • Hibridación ADN/ARN.
      • • Cóctel de sondas:
        • Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
        • Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.
      • • Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/mL).
      • • Aprobado por la FDA.
      • • Posibilidad de semicuantificar.
      • • Estandarizada y automatizable.
      • • Detecta de forma cruzada otros genotipos.
      2- Detecci ón del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2) (Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)
    • 41.
      • • LIMITACIONES:
      • Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral
      • La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias
      • No distingue los diferentes tipos virales
      • No detecta infecciones múltiples
      • Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo
      2- Detecci ón del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)
    • 42. M étodo de captura de híbrido (HC2) • DESNATURALIZACIÓN • HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO • CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN • FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI- ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA • DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE
    • 43. • Es la técnica molecular más sensible y flexible. • Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional. • La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos). • Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales. L2 L1 CGTCC M A RR GGA W ACTGATC GC M CAGGG W CATAA Y AATGG 3- Detecci ón del VPH por PCR GPMY09/11 E6 E7 E1 E2 E5 E4 1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb primers 450 bp MY09/11 PGMY GP5+/6+ 150 bp 65 bp SPF10 165 bp AMPLICOR ROCHE ®
    • 44. Description of main primer sets used in PCR amplification 1
    • 45. Description of main primer sets used in PCR amplification 2
    • 46.
      • • El genotipado es importante en tres situaciones:
      • - El potencial oncogénico y el riesgo de progresión a CIN III difieren de forma importante según el genotipo.
      • - Es necesario monitorizar la eficacia de las vacunas multivalentes.
      • - Estudios epidemiológicos.
      • • La incidencia acumulativa de CIN III en pacientes seguidas durante diez años e infectadas con VPH-16 y 18 es muy superior (17,2/13,6) a la de las infectadas por otros tipos oncogénicos (3%) o sin detección de VPH (0,8%). Estos datos se refuerzan en mujeres con más de 30 años.
      Genotipado del VPH ¿aporta informaci ón útil? VPH-16 VPH-18 (Schiffman et al. Virology 2005; 337: 76-84. Khan et al. JNCI 2005; 97: 1072-9. Castle et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3915-7)
    • 47. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real
    • 48. Hibridaci ón reversa LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL) • Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1 ( primers SPF). • Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples. LINE-BLOTTING (PGMY-LB) • Amplifica la región L1 con mezclas de primers (PGMY09/PGMY11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados. • El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa. (Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17. Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7. Kornegay et al . J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6. Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.) 0,79 Valor kappa 8,2 Discordancia 11,2 Compatibilidad 80,6 Concordancia LIPA Vs. LINE-BLOTTING
    • 49. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real
    • 50. • Método que permite combinar la sensibilidad de la PCR con el poder discriminatorio de las endonucleasas de restricción. • Es un sistema poco laborioso y menos costoso que LIPA y secuenciación. • Resulta difícil detectar infecciones mixtas. Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85. Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70. RFLP (patr ón de restricción con endonucleasas)
    • 51. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real
    • 52. • Tras una PCR de la región L1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray . • Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción. • Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado. • Hibridación y lectura. (An et al. Cancer 2003; 97: 1672-80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272-80. Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025-31.) Hibridaci ón con microarrays
    • 53. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real
    • 54. TESTS PARA LA DETECCIÓN DE ADN-VPH HC I HC II HC III TS.PCR; L1.PCR GP.PCR realtime -PCR Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix (Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.) 1980 1990 2000 SOUTHERN FISH SENSIBILIDAD - + ADN-VPH EN CÁNCER CERVICAL 30%-60% 75% 95% 99%
    • 55. - + SENSIBILIDAD Hibridación in situ Southern blot HC II PCR real time PCR Sonda directa Señal amplificada Amplificación de la diana
    • 56. Tests VPH hoy… VPH-ADN Hibridación In situ (ISH) Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)
      • Valor predictivo negativo
        • Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan
        • Si test VPH negativo , es muy difícil que se desarrolle el cáncer
      • El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5 años)
      • Sólo detectan infecciones muy prevalentes , de las cuales 70% de las infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin ningún tipo de tratamiento)
      • Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de mujeres con el virus.)
      Por tanto, estos tests presentan limitaciones que las tecnología basada en la determinación de proteínas virales pretende resolver
    • 57. • No se correlaciona bien con el nivel de lesión histológica. • Hay que distinguir la alta carga vírica previa al aclaramiento del virus y la que es consecuencia de la persistencia del virus. • Únicamente se ha demostrado que tiene valor en las infecciones simples por HPV 16. Gravitt et al., Int J Cancer, 2007,121,2787. Briolat et al., Int J Cancer, 2007,121,2198. Determinaci ón de la carga vírica
    • 58. Carga viral total / Carga viral relativa 1- Celularidad de la toma 2- Distribución superficial de la lesión 3- Tasa de infección por célula 4- Conservación de la muestra ( DNA, Inhibidores) CVR= CVT : nº cel.
    • 59. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real
    • 60. La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION valor en la predicción de Progresión
      • PCR a tiempo real:
      • Asigna valores cuantitativos reales a los amplificados
      • Usa sondas específicas marcadas con fluorocromos (Taqman, Scorpions)
      • Se mide la excitación lumínica ciclo a ciclo ( Laser + Cámara CCD)
      • Análisis de regresión de las variaciones de niveles lumínicos con elaboración
      • de línea gráfica donde extrapolar los valores iniciales cuantitativos para cada
      • gen estudiado.
      • Carga viral:
      • Permite la comparación de las cantidades de un determinado gen viral con
      • un gen celular constitutivo.
      • Permite determinación de CV Total
      • Determinación de CV Relativa: CVR = CVT : nº de cel. ( Gen Constitutivo)
      • Estado de integración: Análisis de la proporción de E6-7 con el gen susceptible
      • de pérdida de E2
      • ,Episomal: E6-7 = E2
      • Integración total: E2 = 0
      • Formas episomales e integradas: E6-7> E2
    • 61. • La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E6 y E7 • Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad incrementada (HPV-CARD) • El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de visualización chimnich et al., Cancer Cytopath,2007,111,330. Integraci ón del ADN vírico en el cromosoma celular Algeciras-S
    • 62. Tests de detección de RNA Métodos de amplificación de RNA isotérmicos PreTec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA GenProbe: 13 Genotipos HR-HPV. Detección mRNA sin destrucción celular: ONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo
    • 63.  
    • 64. Detecci ón de ARNm de E6/E7 del VPH • La expresión de E6 y E7 puede medirse por sus niveles de ARNm. • Es un marcador indirecto de integración vírica. (Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.) • Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado. • Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH.
    • 65. • Amplificación de diana ARN (NASBA) • Utiliza sondas específicas ( molecular beacons ) • Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45 • Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p16INK) pero no con la carga vírica. Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204. Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705 Detecci ón de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- Proofer
    • 66.
      • • Técnica de FISH
      • • Directamente de citología líquida.
      • • Se realiza en menos de 3 horas
      • • Lectura en citómetro de flujo
      • • En muestras de LSIL:
        • - Sensibilidad 83.3%
        • - Especificidad 91.3%
      Narimatsu y Patterson, Am J Clin Pathol,2005,123,716. Detecci ón de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV Oncotect
    • 67. XVIII Congreso Nacional de la SEC. XVI Reunión de la SPC. XIII Reunión Iberoamericana de citología. Mayo del 2008 .
    • 68. Método HPV OncoTect CÉLULAS exocervicales con secuencia diana Etiqueta anticuerpos CITÓMETRO DE FLUJO HPV E6, E7 ARNm+ Cels (%) HPV E6, E7 ARNm - Cels FIJAR/ PERMEABILIZAR (R1, R2, R3) + CALOR/LAVADO (R6/R7) OLIGONUCLEÓTIDOS marcados con fluorocromo (R5) ARNm E6/E7 Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm ATTAGAAT PMNs Células endocervicales Células exocervicales Debris
    • 69. Distribución de poblaciones celulares según expresión de E6/E7 Narimatsu R, Patterson BK. High-throughput cervical cancer screening using intracellular human papillomavirus E6 and E7 mRNA quantification by flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2005 May;123(5):716-23. Sobrexpresión E6/E7 presente (doble pico) No expresión E6/E7detectada
    • 70. Hibridación In situ (ISH) Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Quiagen) VPH negativo VPH positivo Test VPH - ADN significación diagnóstica
        • La mujer no se encuentra infectada por VPH.
        • Es muy difícil que se desarrollen lesiones severas o cáncer
      Alto Valor predictivo negativo (VPN) (cribado 3 a 5 años)
        • La mujer esta infectada por VPH
        • NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan
        • Bajo Valor predictivo positivo (VPP)
        • Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años
    • 71. Test VPH -ARNm significación diagnóstica HPV OncoTect HPV OncoTect negativo HPV OncoTect positivo
        • No hay expresión de oncoproteínas
        • Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica
      Alto Valor predictivo negativo (VPN)
        • Presencia de oncoproteínas en el exocervix.
        • Existe actividad celular anormal, integración viral y alta probabilidad de progresión.
        • Alto Valor predictivo positivo (VPP)
        • Alta correlación con progresión
    • 72. Utilidad clínica mRNA HPV-HR
      • VPH ARNm E6/E7 como marcador clínico para la detección precoz del cáncer de cérvix 1 :
      • detección de VPH mRNA E6/E7 indica la actividad oncogénica del VPH y no sólo la presencia de una infección frecuente (tests de VPH ADN)
        • Es el indicador clínico más relevante para el desarrollo del cáncer de cérvix, y puede ser usado como un marcador clínico predictivo para identificar aquellas mujeres con riesgo alto de desarrollar lesiones displásicas de alto grado y cáncer
        • Debido a la integración del VPH y la fragmentación del ADN, en muchos casos los tests basados en detección de ADN darán resultado negativo 2 : 4-25% casos
      • Sería un método de cribado ideal ³ aquel que incidiera en la detección de la transcripción activa de oncogenes VPH-AR o de las proteínas resultantes de su expresión
      (1) HPV HandBook: "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", edited by Professor Walter Prendiville and Dr Philip Davies, supports detection of oncogenic activity (page 75 and 76): (2) Sankaranaryanan et al., Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India. International Journal of Cancer 112: 341-347, 2004 (3) Documento de consenso SEGO: “La infección por papilomavirus”.
    • 73. Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido vaginal P16 en citología / Tejido parafinado
    • 74.  
    • 75.
      • Diseño general del Estudio CERVATEC:
      • Estudio prospectivo, comparativo multicéntrico y multinacional
      • Se inicia como proyecto piloto en 2007
      • Duración de la participación:
      • Alta de la primera paciente: Enero 2007
      • Baja de la última paciente: Mayo de 2007
      • Cierre de la Base de Datos: Junio 2007
      • Numero de pacientes: 12000 pacientes en España, Italia y Francia
      • Se realiza paralelamente un estudio en Alemania ( 12000 )
      • Población a Estudio: Criterios de inclusión y de exclusión
      • Condiciones del muestreo y seguimiento de la paciente
      • Se establecen medidas de control de calidad
      • Se documentan y definen las bases científicas del estudio
      • Con los resultados se realizará análisis estadístico
      Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002
    • 76.
      • Cervatec TM p16 INK4a ELISA
      • Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente.
      • El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas).
      • Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p16.
      • El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.
      Tecnología aplicada en el Estudio CERVATEC
    • 77.
      • Objetivo principal
      • Identificación de mujeres que sufren HSIL en Cuello Uterino
      • Demostrar que CERVATEC p16 junto con el test de Pap mejora la
      • sensibilidad para identificar mujeres con HSIL ( CINII-CIN III )
      • Objetivos secundarios:
      • Comprobar el valor límite predefinido ( Punto de cohorte a partir del cual la
      • prueba se considera positiva.
      • Comparar la sensibilidad de la detección de lesiones CIN II y CIN III con
      • CERVATEC versus citología convencional.
      • Comparar la idoneidad del test para identificar de forma correcta a las
      • mujeres sin HSIL frente a la citología convencional
      Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002
      • Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:
      • Alta sensibilidad (93%) para identificación de
      • HSIL en mujeres < 35 años
      • Especificidad del (92%)
      • La especificidad se incrementa al 97% cuando
      • se combina con test de HPV
      • Satellite Symposium. EUROGIN 2007
    • 78.
      • Determinación de p16:
      • Citologías y Biopsias :
      • Aumenta la concordancia inter-observador
      • Aumenta la sensibilidad y especificidad de los resultados
      • respecto de HC-II para detectar lesiones de alto grado (HSIL ).
      • Fluido vaginal: Cervatec p16 ELISA
      • Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:
      • Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL
      • en mujeres < 35 años
      • Especificidad del (92%)
      • La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina
      • con test de HPV
    • 79. Expresión de P16 Infección HPV Infección HPV Persistente Desregulación Celular CIN Alto grado Cancer Invasivo HPV test (HC2 o PCR) Nuevo biomarcador (p16 INK4a ) Pap test Individuos en riesgo Pacientes con Enfermedad
    • 80.  
    • 81. Utilidad del estudio de patrones de expresión de p16
    • 82.  
    • 83.
      • Criteria for assessment of p16 INK4 a
      • POSITIVE CELLS
      • Nuclear size and nuclear-cytoplasmic ratio:
      • nucleus significantly enlarged >50%
      • Hipercromasia and nuclear texture:
      • coarse and inhomogeneous cromatin
      • Nuclear shape and membrana structure:
      • Irreg. of the nuclear shape/or border.
      • Anisonucleosis
      Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
    • 84. SCORE 1 SCORE 2 p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
    • 85. SCORE 3 SCORE 4 p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
    • 86. Muchas Gracias

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