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Diagnostico Molecular De Los Linfomas No Hodgkin
 

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    Diagnostico Molecular De Los Linfomas No Hodgkin Diagnostico Molecular De Los Linfomas No Hodgkin Presentation Transcript

    • DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN Jerónimo Forteza Vila Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica Hospital Clínico Universitario de Santiago 12 de Enero de 2009 Xátiva (Valencia) BASES MOLECULARES DEL CÁNCER APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORAL
    • LINFOMAS 1832 Acuarela Robert Carswell
    • Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG. Blood (2008) 112: 4384-4499 Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson
    •  
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      • Datos Clínicos
      • Estudio Morfológico
      • Estudio Inmunohistoquímico
      • Estudio Molecular
      DIAGNÓSTICO
    • Características moleculares de los linfomas
      • Diagnóstico
      • Pronóstico
      • Terapéutica
    • Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas
      • ¿Es realmente esencial para el diagnóstico?
        • En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo son suficientes
        • Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos
      Bcl2 HE Linfoma folicular
    • Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas
      • ¿Qué cuestiones puede resolver?
        • Benignidad vs Malignidad (clonalidad)
          • Proliferaciones de células B ambiguas
          • Linfomas de células T
          • Síndromes linfoproliferativos en pacientes inmunocomprometidos
        • Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal)
        • Tipos específicos de linfomas (translocaciones)
    • Técnicas moleculares en linfomas
      • Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de antígenos
      • Translocaciones (“clonality markers”)
    • Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos
      • Proceso inmunológico
      • Generación de variabilidad genética para obtener receptores diversos y específicos
      • Proceso similar en células B y en T (Ig y TCR)
    • Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon
      • Policlonal
      • Monoclonal
    • Estudios de clonalidad: Métodos
      • Southern blot: “gold standard”
        • Necesita buena calidad de ADN (Tejido congelado)
        • Muy laborioso
        • Necesidad de material reactivo
      • PCR: más práctico
        • Permite el uso de material fijado en formol e incluido en parafina
        • Resultados en dos días
        • Más sensible
    • FR3 mw M P C- Electroforesis en gel de poliacrilamida
    • Monoclonal Policlonal Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar) FR3
    • “ Patrón de puercoespín” Monoclonal Policlonal FR3 Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar)
    • Reordenamiento en TCR por PCR
      • Cadena TCR gamma
      • Cadena TCR beta
      Electroforesis en gel de poliacrilamida P M C (-) PM
    • TCR1 Reordenamiento monoclonal TCR2 Reordenamiento policlonal Reordenamiento monoclonal Reordenamiento policlonal Análisis de fragmentos
    • Recidiva vs. Segundo tumor Linfoma de la zona marginal esplénico
    • Tres años después Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
    • ¿Transformación o segundo linfoma? 1ª biopsia (bazo) 2ª biopsia (ganglio)
    • Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
      • Resultados falso negativos
        • Degradación del ADN
          • Incluir un gen de control interno
        • Hipermutación somática del gen IgH
          • Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas
        • Abundante población acompañante policlonal
        • Reordenamientos inusuales, interferencia con segmentos translocados,…
      • Resultados falso positivos
        • Exceso de sensibilidad
        • “ Pseudo-clones”: Pobreza de células diana
        • Baja resolución en electroforesis (gel de agarosa)
          • Usar poliacrilamida o electroforesis capilar
      Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
      • Reordenamientos clonales tanto de los genes Ig o TCR no es equivalente a línea B o T.
          • Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico)
          • Explansión clonal de células B en linfomas T (LAI) o viceversa
      Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
      • ¡Monoclonalidad no es sinónimo de malignidad!
      • - Inmunodepresión
            • - Reacciones hiperinmunes (infecciones virales)
            • - Enfermedades autoinmunes
            • - Enfermedad de Castleman
      • BIOMED-2
        • PCR Multiplex (estudio de varias regiones en la misma reacción de PCR)
        • Realizable y reproducible
        • Linfomas B: 99% monoclonales
        • Linfomas T: 94% monoclonales
        • Lesiones reactivas: policlonalidad en la gran mayoría
      Estudios de clonalidad por PCR: Estandarización van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206
    •  
    • Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones citogenéticas ALK1 Cyclin D1 Inmunohistoquímica como técnica molecular diagnóstica
    • Técnicas moleculares en linfomas
      • Características de las alteraciones citogenéticas
    • Anormalidades citogenéticas por FISH
      • ¿Porqué es mejor el FISH?
      • Aplicaciones en el diagnóstico de los linfomas
    • Ventajas del FISH
      • No necesita células en cultivo
      • Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado en formol e incluido en parafina
    • Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
    • Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Sondas “Break-appart” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Sondas “Break-appart” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
    • Ventajas del FISH “split”
      • Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6)
      • No hay falsos positivos virtualmente
        • En contraste, señales de fusión falsas son posibles debido a solapamiento nuclear
      • Fácil evaluación
    • Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
    • Linfoma folicular Bcl2 positivo
    • Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
    • Linfoma folicular Bcl2 negativo
    • Translocación en BCL2
      • 90 % de los linfomas foliculares
      • 30% de los linfomas B difusos de célula grande
      1 2 C+ C- PCR Major Breakpoint Region Crom 18 bcl-2 Crom 14 IgH 5’ 3’ MBR
    • t(14;18) implicando al gen BCL2 PCR MBR PCR MBR+MCR FISH 100% 50% 30-40%
    • FISH - BCL2: utilidad
      • Hiperplasia folicular vs. Linfoma
      • Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón nodular
      • Linfoma B de células grandes: pronóstico (?)
    • t(11;14)
      • Linfoma del manto
      • Cr. 11: gen Ciclina D1
      • Cr. 14: gen IgH
      PCR en región MTC (“Major Translocation Cluster”) Sólo 50%! C- C+ 3 2 1
    • Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
    • Linfoma del manto Ciclina D1 positivo
    • FISH – CCND1: utilidad
      • Linfoma del manto
        • Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Ciclina D1 (no debería de haberlos)
      • Tricoleucemia
        • Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por inmunohistoquímica pero negativa por FISH (clinicopatológicamente es una enfermedad muy distinta)
    • Sangre periférica CD22 TRICOLEUCEMIA - Pancitopenia - Aspirado seco - Marcada esplenomegalia - No hay adenopatías B. Fallini (2007)
    • FISH – Translocaciones en MALT1
      • Pronóstico (Linfoma MALT gástrico)
        • No respuesta a los antibióticos
        • Probable diseminación
      • Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias endoscópicas)
      • Diagnóstico diferencial
        • Infiltrados reactivos
        • Otros LNH
    • Isaacson and Spencer Histopathology 1987 Linfoma MALT “ Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm” Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery . Blood (2008) 112:4384-4399
    • Marshall BJ y Warren JR (Premios Nobel de Medicina en 2005) Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
    • Reordenamientos de BCL6
      • Gen en 3q27
      • Sonda ‘Split’
      • Utilidad:
        • Linfoma B de células grandes (¿pronóstico?)
    • Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo
    • Reordenamientos de MYC
      • Característico del Linfoma de Burkitt
      • Más frecuente: t(8;14)
      • ‘ Breakpoints’: alta variabilidad (PCR)
      • FISH split : lo más útil
    • CD20 BCL6 CD10 HE MIB1 EBER MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT
    • FISH – Reordenamiento en MYC
      • También útil:
        • Como marcador de progresión (Aberración secundaria)
        • Para la detección de LBCG con doble translocación (“double hit”): BCL2 + MYC
    • BCL-2 MYC FISH
    • Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC (Linfoma de la zona gris)
    • Translocación en ALK
      • Usualmente los linfomas anaplásicos portan la t(2;5) – ALK/NPM
      • Posibilidad de diversos patrones
      ALK split probe ALK1 “ INMUNOFISH”
      • Estudios de clonalidad: PCR
      • Translocaciones características: FISH
      • Material de rutina (Fijado en formol e incluido en parafina)
      • Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas en el contexto clínicopatológico
      Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas no Hodgkin
    • Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma . N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
    •  
      • Datos Clínicos
      • Estudio Morfológico
      • Estudio Inmunohistoquímico
      • Estudio Molecular
      DIAGNÓSTICO
    •  
    • Plasmocitoma (HE)
    • Linfoma de Burkitt
    • Facultad de Medicina (Universidad de Santiago Gracias por vuestra atención