O documento descreve as características básicas da imunohistoquímica, incluindo sua capacidade de identificar antígenos celulares ou teciduais através da reação com anticorpos específicos. Detalha os princípios da técnica, etapas, sistemas usuais e aplicações como diagnóstico de neoplasias e detecção de agentes infecciosos.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 IMUNOHISTOQUÍMICA Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Patrícia Meira, sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS A imunohistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas objetivando identificar componentes celulares ou tissulares (denominados antígenos) através da reação com anticorpos específicos, em uma secção histológica, esfregaço ou suspensão celular. A denominação imunohistoquímica é habitualmente utilizada para a avaliação de fragmentos tissulares. Imunocitoquímica, por sua vez, se refere à avaliação a nível celular.

4. Essa técnica imunológica possibilita visualizar distribuição e localização de componentes celulares específicos na célula/tecido. Para tal, o antígeno deve permanecer insolúvel e sua estrutura terciária deve estar preservada, permitindo a ligação com o anticorpo. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

6. Custo baixo a moderado.

7. Alta sensibilidade e especificidade.

8. Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos simultaneamente.

9. Possibilidade de detecção e localização de proteínas intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para essa finalidade, as membranas celulares são solubilizadas com Triton.

10. É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos em uma mesma lâmina.

11. Aplicável a células vivas.

12. Padronização e realização simples.

14. Necessidade de mão de obra especializada.

15. Processamento demorado da amostra.

16. Não automação.

17. Preparações não permanentes.

18. Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para imunohistoquímica nem sempre estão presentes.

19. Necessidade de microscopia especializada (quando usando fluorocromos).

21. PRINCÍPIO DA TÉCNICA O anticorpo de detecção, antígeno-específico, é marcado com uma substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou enzima. As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos (quando Ac está marcado com enzima), produzindo um produto que sofre precipitação direta no corte histológico, gerando uma coloração castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no tecido/célula analisado.

22. PRINCÍPIO DA TÉCNICA A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente. Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado (conjugado com biotina, uma vitamina com alta afinidade por estreptoavidina) nos ensaios enzimáticos. Essa metodologia serve para ampliar o sinal gerado, tornando o método mais sensível.

23. PROPRIEDADES DOS FLUOROCROMOS

24. ENZIMAS E SEUS CROMÓGENOS

25. PASSOS DA TÉCNICA

26. Secções Histológicas Recuperação Antigência Bloqueio Enzima Endógena Bloqueio Background Anticorpo Primário Anticorpo Secundário Substrato Cromógeno Counterstain Montagem Observação (Microscopia) Slide 3 of 23 PASSOS DA TÉCNICA

28. PREPARO DA AMOSTRA 3) Desidratação É realizada com álcool absoluto. 4) Clareamento Para tal, é utilizado o xilol. Os efeitos lesivos causados pelo uso do xilol podem ser revertidos por tripsina. 5) Inclusão em blocos de parafina A temperatura não deve ultrapassar 60 °C. 6) Obter secções em micrótomo e re-hidratar com xilol e álcool em diferentes concentrações.

29. AMOSTRAS Células (pellet) Células em monocamada Secções tissulares com vários tipos celulares e componentes da matriz extracelular

31. Digestão enzimática proteolítica: tripsina, quimotripsina, pepsina, proteinase K.

32. Pelo calor: microondas, banho-maria, panela de pressão.

33. Forma combinada: digestão enzimática + calor.RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA

35. As peroxidases endógenas, citocromo oxidase e catalase produzem produtos de reação com a diaminobenzidina (DAB), sendo necessário o bloqueio das mesmas com:

36. Peróxido de hidrogênio (0,3-0,5%) em metanol.

38. O bloqueio da fosfatase alcalina é realizado com:

39. Levamizole 1-5mmol/L adicionado na solução substrato da enzima.

41. O bloqueio é realizado com:

42. Tampões alcalinos.

43. Leite desnatado.

46. Método indireto.

47. Método da Peroxidase-Antiperoxidase (PAP).

48. Método do Complexo Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC).

49. Método da Estreptoavidina-Biotina-Peroxidase (ABP).

50. Método da Estreptoavidina-Fosfatase Alcalina (SAAP).SISTEMAS USUAIS DE IMUNOHISTOQUÍMICA

51. MÉTODOS

52. MÉTODO DIRETO Substrato Anticorpo + Enzima Antígeno Tissular/Celular

53. MÉTODO INDIRETO Substrato Anticorpo secundário (+ Enzima) Anticorpo primário Antígeno Tissular/Celular

54. MÉTODO PAP (PEROXIDASE ANTI-PEROXIDASE) Anticorpo anti-peroxidase Anticorpo terciário conjugado Anticorpo secundário Anticorpo primário Antígeno Tissular/Celular

56. Pode necessitar de recuperação antigênica.

57. Bloquear enzimas endógenas.Incubação Ac primário Bloquear enzimas endógenas Incubação Ac secundário Incubação Ac terciário

58. PROBLEMAS

59. PROBLEMAS EM IMUNOHISTOQUÍMICA Inativação inadequada de enzimas endógenas. Difusão do Ag investigado do local de síntese para o tecido circundante. Presença de Ag em altas concentrações no plasma perfundindo o tecido anteriormente à sua fixação. Injúria física do tecido por dessecação ou fixação inadequada. Autólise.

60. PROBLEMAS EM IMUNOHISTOQUÍMICA Pigmentos teciduais coloridos similares ao produto final da reação. Reação cruzada inespecífica do Ac quando o epítopo do Ag a ser corado é partilhado com outras proteínas. Ingestão do Ag por fagócitos, resultando em coloração não normalmente observada nessas células.

61. APLICAÇÕES

63. Em neoplasiasDiferenciar uma proliferação celular maligna e benigna. Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente indiferenciadas. Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica. Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas (ex: hormônios).

65. Em neoplasiasCaracterizar a origem de carcinomas. Identificar micrometástases. Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptores hormonais em neoplasia mamária). Orientação terapêutica.

67. Para detecção de antígenos:Virais: dengue, febre amarela, citomagalovírus, adenovírus, etc. Bacterianos: micobactérias, leptospiras. De Fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc. De Protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi, Leishmania sp, Plamodium sp. De Helmintos: Schistosoma.

68. Imunohistoquímica para CD68 em região de infarto isquêmico em córtex cerebral: identificação de macrófagos no centro necrótico Imunohistoquímica para GFAP em região de infarto isquêmico em córtex cerebral: ausência de astrócitos no centro necrótico e gliose na periferia GAFP = Proteína glial ácida fibrilar

69. Imunohistoquímica anti- ERB2 Imunohistoquímica anti-tirosina hidroxilase em estrutura axonal

70. Imunohistoquímica: detecção de múltiplos antígenos