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I M U N O F L U O R E S C E N C I A
 

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Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Imunofluorescencia

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    I M U N O F L U O R E S C E N C I A I M U N O F L U O R E S C E N C I A Presentation Transcript

    • UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
      IMUNOFLUORESCÊNCIA
      Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenosemcélulas e tecidosutilizandoanticorposespecíficos, marcados com fluorocromos, de modoque a localização dos antígenos se tornavisívelaomicroscópio de fluorescência.
      • De acordo com o mesmoprincípio, podemosdetectar e localizaranticorposemfluidosbiológicosusandoseuantígenocorrespondente.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • Baseia-se nacapacidade das moléculas de anticorpo se ligaremcovalentemente a fluorocromossemperdersuareatividadeespecífica com o antígeno.
      • Testequalitativo/semi-quantitativo.
      • Método de altasensibilidade e altaespecificidade.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • FLUOROCROMOS:
      • Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.
      • 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.
      • Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • FLUOROCROMOS:
      • São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência.
      • Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
      • A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).
      • Para deixar passar somente a emissão
      secundária desejada, devem-se utilizar filtros
      apropriados dependendo da cor
      do fluorocromo.
    • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
      • TIPOS DE REAÇÃO:
      Detecção de Ag
      Detecção de Ag
      Detecção de Ac
      INDIRETA
      DIRETA
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
      Y
      O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
      Y
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      O anticorpo não ligado é removido por lavagens.
      O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
      Antígeno pesquisado
      Y
      Conjugado
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
      • VANTAGENS
      • Alta especificidade e sensibilidade
      • Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.
      • DESVANTAGENS
      • Alto custo do microscópio de fluorescência
      • Necessidade de um conjugadoparacadaantígenoque se desejaidentificaroulocalizar
      • Subjetividadedaleitura
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
      • APLICAÇÕES
      • Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
      • Embacteriologia, um dos poucosmétodos de IFD aindausadosemlaboratóriaclínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
      PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
      Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo.
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      Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.
      A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.
      Antígeno pesquisado
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      Conjugado
      O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
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      Anticorpo Monoclonal
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
      PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
      Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.
      O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo.
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      Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.
      A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.
      Antígeno padronizado
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      Conjugado
      Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.
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      Anticorpo pesquisado
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
      • VANTAGENS
      • Sensibilidade
      • Especificidade
      • Reprodutibilidade
      • De simples padronização e execução
      • O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
      • Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos
      • DESVANTAGENS
      • Necessidade de microscópio de fluorescência
      • Subjetividade na leitura
      • Não-automação
    • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
      • APLICAÇÕES
      • Medicina humana
      • Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
      • Medicina Veterinária
      • Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.
    • CONSIDERAÇÕES FINAIS
      As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.