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Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Imunofluorescencia

Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Imunofluorescencia

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  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
    IMUNOFLUORESCÊNCIA
    Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
  • 2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
  • 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenosemcélulas e tecidosutilizandoanticorposespecíficos, marcados com fluorocromos, de modoque a localização dos antígenos se tornavisívelaomicroscópio de fluorescência.
    • 4. De acordo com o mesmoprincípio, podemosdetectar e localizaranticorposemfluidosbiológicosusandoseuantígenocorrespondente.
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • Baseia-se nacapacidade das moléculas de anticorpo se ligaremcovalentemente a fluorocromossemperdersuareatividadeespecífica com o antígeno.
    • 5. Testequalitativo/semi-quantitativo.
    • 6. Método de altasensibilidade e altaespecificidade.
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • FLUOROCROMOS:
    • 7. Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.
    • 8. 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.
    • 9. Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • FLUOROCROMOS:
    • 10. São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência.
    • 11. Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
  • CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
    • 12. A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).
    • 13. Para deixar passar somente a emissão
    secundária desejada, devem-se utilizar filtros
    apropriados dependendo da cor
    do fluorocromo.
  • 14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
    • TIPOS DE REAÇÃO:
    Detecção de Ag
    Detecção de Ag
    Detecção de Ac
    INDIRETA
    DIRETA
  • 15. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
  • 16. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
    Y
    O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    O anticorpo não ligado é removido por lavagens.
    O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
    Antígeno pesquisado
    Y
    Conjugado
  • 17. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
    • VANTAGENS
    • 18. Alta especificidade e sensibilidade
    • 19. Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.
    • 20. DESVANTAGENS
    • 21. Alto custo do microscópio de fluorescência
    • 22. Necessidade de um conjugadoparacadaantígenoque se desejaidentificaroulocalizar
    • 23. Subjetividadedaleitura
  • IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
    • APLICAÇÕES
    • 24. Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
    • 25. Embacteriologia, um dos poucosmétodos de IFD aindausadosemlaboratóriaclínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
  • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
  • 26. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
    PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
    Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo.
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.
    A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.
    Antígeno pesquisado
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Conjugado
    O preparado é observado em microscópio de fluorescência.
    Y
    Anticorpo Monoclonal
  • 27. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
    PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
    Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.
    O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo.
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.
    A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.
    Antígeno padronizado
    Y
    Conjugado
    Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.
    Y
    Y
    Y
    Y
    Y
    Anticorpo pesquisado
  • 28. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
    • VANTAGENS
    • 29. Sensibilidade
    • 30. Especificidade
    • 31. Reprodutibilidade
    • 32. De simples padronização e execução
    • 33. O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
    • 34. Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos
    • 35. DESVANTAGENS
    • 36. Necessidade de microscópio de fluorescência
    • 37. Subjetividade na leitura
    • 38. Não-automação
  • IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
    • APLICAÇÕES
    • 39. Medicina humana
    • 40. Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
    • 41. Medicina Veterinária
    • 42. Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.
  • CONSIDERAÇÕES FINAIS
    As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.