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Reações de precipitação Aula 6 Trabalho realizado  pelos  acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo F...
<ul><li>Complexos moleculares gerados a partir  da  interação  de  Ag solúveis  com Ac específicos tendem a precipitar em ...
Curva de precipitação É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. O...
À medida que concentrações crescentes de Ag são adicionados a uma quantidade constante de Ac, a quantidade de complexos im...
IMUNODIFUSÃO Imunodifusão dupla:   <ul><li>Coloca-se agarose sobre uma  lâmina, por exemplo de  vidro </li></ul><ul><li>ti...
* Pode ser visualizada após lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação ...
* São três os padrões possíveis: 1) Os arcos de precipitação formados entre o Ac e os dois antígenos se fundem, indicando ...
IMUNODIFUSÃO RADIAL Imunodifusão radial simples Gráfico padrão Concentrações conhecidas Ag * Permite a quantificação do an...
Utilização da técnica: dosagem de imunoglobulinas (A,G,M) e outras proteínas séricas
Imunodifusão radial Um exemplo de sua utilização: dosagem de  imunoglobulinas numa placa disponível no mercado. Poços onde...
IMUNOELETROFORESE Veja a explicação no próximo  slide + - Ag Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta ...
NA IMUNOELETROFORESE: * Pode-se fazer  comparação de misturas complexas de Ag. * Os Ag são separados em gel de agarose, pe...
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Ap6 - Reação de Precipitação

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  1. 1. primária – Imunofluorescência, ELISA, Western Blotting, Fluorometria, Luminescência, Radioimunoensaio e Citometria de Fluxo. secundária – Precipitação e Aglutinação As próximas oito aulas tratam de métodos que se baseiam na ligação do anticorpo com o antí- geno. Tais ligações, como você já sabe, podem ser do tipo primária, secundária e terciária. Veja os métodos que serão apresentados, com base na ligação:
  2. 2. Reações de precipitação Aula 6 Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brods- Kyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em junho de 2003
  3. 3. <ul><li>Complexos moleculares gerados a partir da interação de Ag solúveis com Ac específicos tendem a precipitar em um determinado meio. </li></ul><ul><li>Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se observa a formação do precipitado, o que só é possível se o Ac e o Ag interagirem. </li></ul><ul><li>Técnicas utilizando a precipitação em meio líquido são raramente utilizadas (e somente em pesquisa), para verificação da resposta de um animal a um dado antígeno solúvel. </li></ul><ul><li>Algumas técnicas foram desenvolvidas a partir da observação de que Ag - Ac precipitam em meio semi-sólido, tipo gel (em geral de agarose). </li></ul><ul><li>Ex: - Imunodifusão dupla </li></ul><ul><li>- Imunodifusão radial </li></ul><ul><li>- Imunoeletroforese </li></ul>
  4. 4. Curva de precipitação É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: Veja os detalhes no próximo slide Zona de excesso de anticorpo Zona de equivalência Zona de excesso de antígeno + - - + - - Anticorpo livre Antígeno livre 100% -- Percentual de complexo imune precipitado Quantidade de antígeno adicionado
  5. 5. À medida que concentrações crescentes de Ag são adicionados a uma quantidade constante de Ac, a quantidade de complexos imunes preci- pitados inicialmente aumenta, caindo a seguir. De modo sequenciado, observa-se a: * zona de excesso de Ac: quantidade de Ag é insuficiente para reagir com e precipitar todo o Ac presente. O Ac livre pode ser detectado no sobrena- dante. * zona de equivalência: o Ag adicionado é suficiente para se combinar com e precipitar todo o Ac presente. Nem Ag nem Ac livre podem ser detectados no sobrenadante. * zona de excesso do Ag: a quantidade de Ag excede aquela necessária para ligar todo o Ac, havendo redução da quantidade de Ac precipitado. Esta diminuição é resultante da solubilização dos complexos Ag-Ac pelo excesso de Ag . A seguir, as principais técnicas de precipitação em gel:
  6. 6. IMUNODIFUSÃO Imunodifusão dupla: <ul><li>Coloca-se agarose sobre uma lâmina, por exemplo de vidro </li></ul><ul><li>tipo de microscopia, deixando-a solidificar: </li></ul>. Faz-se em seguida pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo é mostra- do abaixo: Ac Ag Ag
  7. 7. * Pode ser visualizada após lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante. Lavagem + coloração Observe a seguir os principais padrões de reação que podem ser gerados: * As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Ac Ag Ag Ac Ag Ag Ac Ag Ag
  8. 8. * São três os padrões possíveis: 1) Os arcos de precipitação formados entre o Ac e os dois antígenos se fundem, indicando que o Ac está precipitando epítopos idênticos. 2) O Ac preparado distingue os três Ag diferentes que formam arcos independentes de precipitação. 3) Os antígenos compartilham o epítopo 1, mas um deles também possui um epítopo 3. A linha de precipitação in- dica, então, uma identidade parcial e não total, entre as preparações de Ag. Utilização: muito usada em pesquisa. Na rotina: diagnóstico de algumas doenças, como a cistecercose 1 1 Ac Anti -1 A: identidade Ag B: não identidade 1 2,4 Ac C: identidade parcial Anti –1, 2 e 4 1 1/3 Anti –1 e 3 esporão Ac
  9. 9. IMUNODIFUSÃO RADIAL Imunodifusão radial simples Gráfico padrão Concentrações conhecidas Ag * Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. *O Ac é adicionado a uma solução de agarose (~1%), que em seguida é dispensada em lâmi- nas e deixada gelificar. *Orifícios são feitos no gel para adição do Ag teste. *Incubação por 24h. Durante este período o Ag adicionado difunde-se no gel de agarose, formando complexos solúveis com o Ac. *O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitan- do-se em um anel (halo) em torno do orifício. *Colocando-se pelo menos em tres dos orifíci- os concentrações conhecidas do Ag, é possível construir uma curva com os diâmetros dos ha- los obtidos. Assim, medindo-se o halo gerado por uma concentração desconhecida do Ag e lançando-se o valor na curva, a concentra- ção é determinada. 2 Diâmetro do anel 0 25 10 50 100 Concentração do antígeno Gel contendo Ac Ag Ag colocado no orifício Anel de precipitação Teste
  10. 10. Utilização da técnica: dosagem de imunoglobulinas (A,G,M) e outras proteínas séricas
  11. 11. Imunodifusão radial Um exemplo de sua utilização: dosagem de imunoglobulinas numa placa disponível no mercado. Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA Halo de precipitação IgG – anti-IgG
  12. 12. IMUNOELETROFORESE Veja a explicação no próximo slide + - Ag Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta canaleta 3- Difusão e precipitação
  13. 13. NA IMUNOELETROFORESE: * Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag. * Os Ag são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica . * O pH do gel é escolhido de modo que as moléculas carregadas positivamente migrem para o eletrodo negativo. Um fluxo de água gerado por ação das cargas residuais (negativas) da agarose (eletroendosmose), empurra tais moléculas para o pólo negativo. Assim, após um tempo determinado, essas moléculas apresentam-se distribuídas no gel, de acordo com os seus PM e cargas elétricas. * Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. * O Ag e Ac formam arcos de precipitação. Utilização: avaliação de atipias das imunoglobulinas G, M e A
  14. 14. FIM
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