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    Tesi Irma Tesi Irma Presentation Transcript

    • UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO Facoltà di Farmacia Corso di Laurea in Chimica e tecnologia farmaceutiche A.A. 2010/2011 Progettazione e sintesi di potenziali inibitori della Telomerasi ad azione sulle G- quadruplexProf. Simona Concilio Irma Spiniello 176000265
    • I Telomeri  Complessi nucleoproteici localizzati alle estremità dei cromosomi.  Sono costituiti da sequenze ricche in guanine (5’-TTAGGG-3’).  La cellula può acquisire la capacità di replicarsi indefinitamente, divenendo immortale: l’evento fondamentale è la riattivazione dell’enzima telomerasi.Moyzis R.K., Buckingham J.M., Cram L.S., Dani M., Deaven L.L., Jones M.D., Meyne J., Ratliff R.L., Wu J.R., (1988),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6622-6626
    • La Telomerasi: l’enzima dell’immortalità cellulare  Ribonucleoproteina costituita da:  subunità hTERT  subunità hTR  Attiva nell’80-85% delle cellule tumorali, e nelle cellule germinali e staminali.  Ha un importante ruolo biologico: è coinvolta nel mantenimento della lunghezza dei telomeri.Burger A. M., Bibby M. C., Double J. A., (1997),Brit. J. Cancer, 75,516
    • Meccanismo d’azione  L’allungamento del telomero si realizza in diversi passaggi:  Ibridazione del templato di RNA con il filamento di DNA  Il templato non ibridizzato fa da stampo per la subunità hTERT  Il filamento neosintetizzato viene traslocato in direzione 5’lungo lo stampo di RNANeidle S., Parkinson G., (2002), Nat. Rev. Drug Discov., 1, 383- 393;
    • Terapia antitelomerasica Azione diretta Azione indirettaFarmaci attivi Farmaci attivi sulla Farmaci attivi sulsulla subunità subunità subustrato hTERT hTR telomero Farmaci Farmaci con citotossici Stabilizzatori azione sulle di strutture convenzionali proteine POT1 e G-quadruplex (Cisplatino) TRF1
    • Le quadrupliche eliche del DNA  Strutture secondarie costituite da sequenze di acidi nucleici ricche in guanine.  I G-quartetti sono generati attraverso legami idrogeno tra quattro guanine .  Distribuiti in tutto il genoma umano: nei telomeri e nei promotori del gene (hTERT) e dei proto-oncongeni (c-myc,VEGF,c-kit e BCL2 )
    • Polimorfismo delle G-quadruplex  Le strutture G-quadruplex si possono classificare in varie classi in base ai seguenti parametri:  Stechiometria e orientamento delle catene  Geometria dei loop  Conformazione glicosidica
    • Obiettivo della tesi Induzione e/o stabilizzazione delle G-quadruplex del DNA telomerico Inibizione della Telomerasi AZOMOLECOLE CARBAZOLI
    • Azomolecole  Caratteristiche strutturali :  nucleo aromatico azobenzene  due catene laterali aventi gruppi carichi positivamente, in posizione para Introduzione di un anello 1,1-etil-metilpirrolidinicoAZO3
    • Switching conformazionale delle G-QuadruplexWang X., Huang J., Zhou Y., Yan S., Weng X., Wu X., Deng M., and Zhou X., Angew. Chem. Int., 49, 5305 –5309
    • 1. Sintesi dell’AZO1 NH2 OHHO 0°C 1) HCl (acq) 0°C KOH/MeOH 2) NaNO2(acq) N2 O +HO 0°C 2h OH  Reazione di Sostituzione Elettrofila N N Aromatica (diazocopulazione) HO AZO1
    • Caratterizzazione: AZO1 1) Osservazione al microscopio ottico Aspetto cristallino ad aghi2) 1H NMR• Protoni aromatici nella zona tra 6.5 ppm e 8 ppm• Protone fenolico intorno a 10 ppm
    • CHCl3 3) Spettroscopia UV-VIS • max=355 nm sistema azobenzene coniugato • max=239 nm anelli aromatici4) Spettroscopia IR• 3193,5 cm-1 stretching dell’OH• 1587 cm-1 stretching del gruppo azo• 1238 cm-1 stretching del legame c-o 5) DSC • Picco di fusione a 228,66 C • Decomposizione del composto, dopo la fusione
    • 2. Sintesi dell’AZO2 N OH O N Cl N aH , D M Fdry N N 70-80°C N N OH O AZO1 N AZO2
    • Caratterizzazione: AZO2 1) Osservazione al microscopio Il composto presenta un aspetto cristallino2) 1H NMR Il segnale dell’H2O a 3.3 ppm e del DMSO-d a 2.5 ppm non hanno permesso l’identificazione di alcuni segnali nella zona alifatica
    • 3) Spettroscopia IR • A 1588,24 cm-1 lo stretching del gruppo azo • A 1217 cm-1 lo stretching del legame c-o4) DSC• Picco di fusione a 192 C• Decomposizione dopo fusione
    • 3. Sintesi dell’AZO3 La reazione viene eseguita per 24h N N I O O C H 3I T H F d ry N 4 5 °C N N N O O N N I AZO2 AZO3
    • Caratterizzazione: AZO3 1) Osservazione al microscopio • Aspetto cristallino • Punto di fusione superiore a 250 C2) 1 H NMR• Il segnale dell’H2O, a 3.3 ppm, copre i segnali della catena CH2-CH2 e quello dei CH3 sugli atomi di azoto• Il segnale del DMSO-d a 2.5 ppm copre i segnali dell’anello pirrolidinico• Il segnale a 2.42 ppm è dovuto a iodometano residuo
    • Obiettivo della tesi Induzione e/o stabilizzazione delle G- quadruplex del DNA telomerico Inibizione della Telomerasi AZOMOLECOLE CARBAZOLI
    • Carbazoli NH2  Caratteristiche strutturali  Sistema planare aromatico carbazolo N  Due catene laterali aventi gruppi carichi positivamente in posizione 3 e 6I I N N Introduzione di un segmento 4-amminofenilico in posizione 9
    • 1. Sintesi del CARB1  Per ottenere il composto CARB 1 sono stati necessari diversi tentativi di sintesi  Cicli vuoto/azoto sul pallone di reazione e anidrificazione dei reagenti di partenza  La reazione viene eseguita in ambiente inerte per 48h NO2 H N F NO2 Br Br N aH , D M F dry, 70-80°C N Br Br CARB1
    • Caratterizzazione:CARB11) DSC• Picco di fusione a 148 C • Doppio fenomeno di cristallizzazione con picco massimo a 112,30 C
    • 2) ( 1H NMR) • I protoni aromatici nella zona compresa tra 7 e 8.5 ppm • I segnali tra 1 e 1.5 ppm impurezza del reagente di partenza 3,6-dibromo-9-H- carbazolo3) Spettroscopia IR• NO2: stretching asimmetrico a 1592,85 cm-1 stretching simmetrico a 1334,89 cm-1
    • 2. Sintesi del CARB2 NO2 NH2 S n C l 2 .2 H 2 O 60 °C N N E tO H ab so lu teBr Br Br Br CARB1 CARB2  Reazione a riflusso per 48 h
    • Caratterizzazione:CARB21) DSC• Picco di fusione 222,033 C • Durante la fase di raffreddamento, il composto ricristallizza a 183,96° C
    • 2) ( 1H NMR)• Gruppo NH2 aromatico a 4 ppm• I segnali tra 1 e 1.5 ppm impurezze del 3,6-dibromo-9-H-carbazolo 3) Spettroscopia IR • Lo stretching a 3283,64 cm-1 e il bending a 1621,29 cm-1del gruppo amminico • Lo stretching del legame C-N a 1227,45 cm-1
    • 3. Sintesi del CARB3 Reazione di Heck Una serie di cicli freeze and thaw, prima della sigillazione della fiala di vetro sotto azoto Il composto è in fase di caratterizzazione A questa reazione seguirà la protezione del gruppo NH2 con il gruppo protettore Fmoc e l’ultimo step di metilazione degli atomi di azoto degli anelli della piridina. NH2 N N N N N P d(O A c) 2 + T rifen ilfo sfin a Br Br E t 3 N /T H F d ry 1 0 5°C CARB2 NH2 CARB3
    • Le conclusioni La struttura delle molecole sintetizzate è stata studiata e realizzata proprio al fine di promuovere l’interazione con le quadruple eliche di DNA Il presente lavoro di tesi prevede un prosieguo rivolto sia al completamento della sintesi del composto a base carbazolo, sia all’analisi della effettiva attività di inibizione della telomerasi da parte dei composti sintetizzati.