4. Boman, H.G., Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu Rev of Immunol. 13 , 61-92 (1995). Sitaram, N. & Nagaraj, R. Host-defense Antimicrobial Peptides : Importance of Structure for Activity. Current Pharmaceutical Design 8 , 727-742 (2002).
5. Essendo i dati disponibili sui Peptidi Antimicrobici sparsi in letteratura e in vari database, diventa necessario disporre di nuovi sistemi di immagazzinamento ed accesso alle informazioni. AMPDB si propone di essere un Database innovativo e funzionale contenente dati dettagliati e completi sull’attività degli AMPs noti in letteratura.
Il mio progetto di tesi si è focalizzato su due obiettivi. Il primo è stato quello di effettuare una raccolta dati da inserire in seguito all’interno di un nuovo Web Knowledge Database sui Peptidi Antimicrobici, mentre il secondo obiettivo ha riguardato lo studio computazionale di membrane fosfolipidiche con differerente grado di insaturazione sottoposte all’influenza di campi elettrici esterni.
Stiamo lentamente entrando in quella che può essere definita “Era post-antibiotici”, nella quale gli attuali antibiotici che mostrano sempre di più fenomeni di resistenza da parte dei batteri, saranno sostituiti da nuove molecole attive. Tra i potenziali candidati a diventare gli antibiotici del futuro ci sono sicuramente i Peptidi Antimicrobici, sostanze naturali che fanno parte del Sistema Immunitario Innato di una vasta gamma di organismi e che sono stati estratti in particolar modo dall’essudato degli anfibi. Essi possono avere una conformazione ad alfa-elica, a beta-lamina (con più ponti disolfuro), una struttura dotata di un solo ponte disolfuro, oppure possono essere particolarmente ricchi di amminoacidi basici quali l’arginina, la prolina e il triptofano.
l’esatto meccanismo d’azione degli AMPs rimane ancora sconosciuto, ma si pensa che il passaggio chiave per l’azione dei Peptidi Antimicrobici sia il legame alla parete cellulare del microorganismo bersaglio, il quale viene realizzato mediante interazioni elettrostatiche tra il peptide, carico positivamente, e la parete cellulare batterica, carica negativamente. La carica negativa esterna è una peculiarità dei batteri e non delle cellule umane e questo potrebbe spiegare l’attività preferenziale degli AMPs sui batteri. Non è ancora noto quale conformazione adottata in soluzione conduce al legame alla parete cellulare, ma è noto che in seguito al binding tutti i peptidi antimicrobici assumo una conformazione ad alfa-elica, a volte formando addirittura dei dimeri ed oligomeri. In seguito al binding col Peptide Antimicrobico, la cellula batterica diventa permeabile agli ioni e ad altri componenti cellulari, provocando in questo modo una consistente perdita elettrolitica e la morte del microorganismo. Gli AMPs potrebbero agire come tensioattivi, perturbando gravemente l’integrità strutturale di membrana (il modello “a tappeto” mostrato sulla sinistra) oppure formando dei pori di membrana (modello del “poro a botte” e “poro toroidale”, mostrato sulla destra) e andando a legarsi a target intracellulari, quali DNA e proteine. Nei peptidi antimicrobici l’effetto battericida prevale nettamente su quello batteriostatico, come mostrato dal fatto che le loro MIC spesso coincidono con le Minime Concentrazioni Battericide.
Considerato quanto detto finora, è comprensibile il motivo per il quale l’interesse nei confronti dei Peptidi Antimicrobici sta diventando sempre più crescente. Esistono numerosi database su di essi ed articoli scientifici, i quali però spesso forniscono informazioni troppo generiche, per cui è necessario effettuare delle integrazioni che rendono il lavoro troppo dispersivo. Diventa necessario quindi disporre di nuovi sistemi di immagazzinamento dei dati sugli AMPs di facile accesso, da dove poter trarre le informazioni di cui si ha bisogno per un eventuale lavoro di ricerca e sintesi. Il Web Knowledge Database da noi realizzato si propone di essere un Database innovativo e funzionale, contenente dati dettagliati e completi sulle caratteristiche e l’attività degli AMPs noti in letteratura. Per quanto ne sappiamo non esiste ad oggi un altro Database che
Dal database APD sono state estratte 76 sequenze con struttura ad alfa-elica e 138 sequenze con strutture random, tra cui a beta-lamina, con un ponte disolfuro o sconosciute. Sono state in seguito ricavate informazioni sulla loro struttura, carica, lunghezza, idrofobicità e presenza o assenza di attività nei confronti di patogeni Gram positivi, Gram negativi, funghi, virus e cellule di mammiferi. Ci siamo resi conto che in molti casi i valori delle MIC per le sequenze peptidiche erano mancanti. Essendo tali valori fondamentali per l’attività antimicrobica di queste molecole e per la scelta di una sequenza da sintetizzare, abbiamo effettuato un’estesa ricerca bibliografica ed estrapolati le MIC da numerosi articoli presenti in letteratura. In questi articoli abbiamo trovato altre sequenze che sono state aggiunte alla raccolta dati, arrivando in questo modo all’accumulo di informazioni su ben 814 AMPs, i quali sono stati inseriti all’interno del Web Knowledge Database.
Il sito è attivo dal primo dicembre 2007 e può già vantare un ampio numero di accessi. Qua possiamo vedere la Home Page del database, dove sono contenute delle informazioni chiave sugli AMPs e gli obiettivi del database. Un utente generico che vuole accedere alle informazioni può utilizzato il link messo a disposizione dal sistema.
Qui possiamo vedere in dettaglio la pagina che il sistema presenta all’utente per poter effettuare una ricerca nel sistema, selezionando come chiave di ricerca la struttura, la carica, la lunghezza, la sequenza del peptide o il microorganismo sul quale il peptide è attivo.
Ogni ricerca dà come risultato una serie di sequenze che soddisfano i criteri selezionati nella form, disposte in ordine di MIC crescente. In questo modo i peptidi avente MIC più bassa, ossia i più efficaci contro i microorganismi, saranno i primi a comparire nella lista.
Andando alla pagina “detailed description” l’utente ha a disposizione tutte le informazioni che sono state raccolte sul Peptide Antimicrobico di suo interesse, tra cui il nome con cui è conosciuto o utilizzato in letteratura, la sequenza amminoacidica, il link alle voci pertinenti nella banca dati Swiss Prot, l’attività su batteri, funghi e cellule tumorali, la struttura, l’idrofobicità, la carica, e così via. Infine troviamo il titolo dell’articolo scientifico dal quale sono stati attinti i dati ed il realtivo link per avere un riscontro su quanto pubblicato nell’applicazione. Eì inoltre presente un archivio attraverso il quale è possibile accedere a tutti gli articoli pubblicati sugli AMPs, ordinati per data di pubblicazione, ossia dai più recenti ai meno recenti. Quest’archivio viene aggiornato continuamente.
Il secondo progetto di tesi si è composto di due obiettivi: investigare l’influenza degli acidi grassi polinsaturi, in particolar modo dell’acido docosaesenoico, sulle proprietà delle membrane neuronali e sul loro corretto funzionamento e individuare il valore soglia per l’elettroporazione di membrane lipidiche con diverso grado di insaturazione. Vediamoli nel dettaglio.
Il primo obiettivo scaturisce dall’evidenza che il 60% delle membrane neuronali, aventi un ruolo vitale per il funzionamento delle cellule nervose, è costituito da fosfolipidi, tra i quali il più abbondante è il DHA, presente al 20%. Il DHA è quindi un componente chiave di queste membrane. Esso è concentrato in particolar modo a livello delle sinapsi della corteccia cerebrale, la “parte pensante” del nostro cervello, e della guaina mielinica, la cui integrità è di fondamentale importanza per le normali funzioni cerebrali. La carenza di omega-3, e in particolar modo del DHA, provoca una riduzione delle sostanze chimiche che sono deputate alla trasmissione di segnali in queste sinapsi, causando una malfunzione di alcune vie cerebrali. Il DHA ha dei ruoli chiave nel cervello. Esso aumenta la “fluidità” delle membrane neuronali, potenzia l’attività degli enzimi collegati alla membrana, modifica il numero e l’affinità dei recettori di membrana, il funzionamento dei canali ionici, la produzione e l’attività dei neurotrasmettitori, e la trasduzione del segnale, la quale controlla a sua volta l’attività dei vari neurotrasmettitori e i fattori di crescita neuronale. L’importanza del DHA è confermata dal coinvolgimento di quest’acido grasso polinsaturo in numerosi disturbi neurologici e psichiatrici, quali il Morbo di Alzheimer e di Parkinson, la Schizofrenia e la Depressione. In tutte queste patologie si riscontra infatti una diminuzione dei livelli di DHA nelle membrane neuronali, a causa dello stress ossidativo o di una down-regulation di enzimi che incorporano il DHA nelle membrane.
Partendo da queste assunzioni è stata effettuata un’analisi comparativa su membrane di tre differenti composizioni: una membrana di DMPC, fosfolipide completamente saturo, una di POPC, parzialmente insaturo, e una di SDPC, contenente l’acido docosaesenoico, per cui altamente insatua. Le membrane sono state costruite con VEGA ed in seguito sottoposte a minimizzazione, riscaldamento e Dinamica Molecolare con NAMD. Le simulazioni di Dinamica Molecolare sono un insostituibile strumento computazionale per lo studio delle proprietà dei sistemi biomolecolari. Queste simulazioni, e i modelli di meccanica classica su cui si basano, sono di fondamentale importanza per la comprensione del comportamento di macromolecole complesse e aiutano a mettere in relazione la loro struttura, dinamica e funzione. Uno dei benefici primari di tali simulazioni è la loro complementarietà ai risultati sperimentali, fornendo non soltanto valori medi, ma distribuzioni e serie temporali di qualsiasivoglia quantità definibile in termini matematici. Inoltre, la possibilità pratica di entrare in possesso di una visione meccanico-statistica dei sistemi studiati offre una chiave interpretativa che è, nella maggior parte dei casi, preclusa agli esperimenti. Le simulazioni hanno avuto una durata complessiva di 1 ns e sono state effettuate prima in assenza di un campo elettrico, e in seguito applicando un potenziale elettrico di 55 mV. All’interno delle membrane è stato posto come probe lo ione sodio, il quale ci ha permesso di osservare i cambiamenti delle proprietà delle membrane in base alla loro insaturazione e all’applicazione di un campo elettrico esterno.
Qui possiamo vedere le animazioni della fase di Dinamica Molecolare delle membrane simulate. Per il DMPC in assenza di campo elettrico si osserva una migrazione del probe sodio (rappresentato con la sfera rossa) dalle code apolari verso le teste fosfolipidiche della membrana, rappresentate in rosso e blu, mentre applicando il campo elettrico sorprendentemente il probe resta pressochè fermo al centro della membrana. Questo risultato apparentemente strano potrebbe essere spiegato dal fatto che il campo elettrico induce un aumento di ordine nelle membrane sature, un aumento dell’impaccamento e delle rigidità, come confermato dalla contrazione di membrana che si osserva in presenza del campo elettrico. Sotto la sua influenza le teste fosfolipidiche subiscono un riorientamento e si ha un aumento dell’idratazione dei gruppi carbonilici e fosfato. L’acqua riesce quindi a diffondere molto di più tra le teste polari del bilayer, conducendo ad un loro spostamento e all’avvicinamento delle code sature, quindi appunto, ad un maggiore impaccamento. Questo riorientamento della membrana fa in modo che lo ione sodio resti intrappolato tra le code fosfolipidiche. Per il POPC invece si osserva un leggero spostamento in assenza del campo elettrico e un maggiore spostamento applicando il potenziale di 55 mV. Per la membrana di SDPC otteniamo uno spostamento verso le teste fosfolipidiche sia in presenza che in assenza del campo elettrico, e un’interazione che comporta il ripiegamento di queste teste verso l’interno. Inoltre questa membrana mostra una maggiore deformazione rispetto alle altre due. Si pensa che il doppio legame in posizione 4 del DHA, trovandosi molto vicino all’interfaccia membrana-acqua, possa assumere una conformazione unica o interagire in modo specifico con l’acqua, se paragonato al doppio legame del POPC. Analisi condotte sul momento dipolare delle membrane simulate mostrano infatti una grande differenza tra il momento dipolare della membrana di SDPC e quelle degli altri due fosfolipidi. La presenza di insaturazioni comporta quindi un aumento della polarizzabilità e quindi del momento dipolare totale in seguito all’applicazione di un campo elettrico. La differenza del momento dipolare dell’SDPC si traduce soprattutto in un aumento di forza del campo elettrico nella regione interfacciale. Si può supporre che le interazioni elettrostatiche che si creano tra i dipoli della membrana e i residui amminoacidici carichi delle proteine-canale di membrana regolino la chiusura dei canali, e quindi il processo di signaling elettrico nei neuroni.
Ulteriori analisi effettuate sono state la misurazione delle RMSD (radice quadratica media della deviazione) e della traiettoria lungo l’asse z dello ione sodio. In questo caso sono state calcolate le RMSD per lo ione sodio tra frame successivi della simulazione, e quindi in modo implicito le velocità di movimento dello ione. L’istogramma ottenuto dai valori medi per le 6 membrane mostra maggiori fluttuazioni per le membrane di POPC ed SDPC, in accordo con la teoria di una maggiore fluidità delle membrane contenenti acidi grassi mono e polinsaturi. Inoltre dai valori superiori delle RMSD per le membrane sottoposte al campo elettrico rispetto a quelle prive di campo elettrico, si può dedurre che per ogni membrana le fluttuazioni aumentano in seguito all’applicazione di un campo elettrico esterno. Questo potrebbe far pensare che il potenziale d’azione provochi un aumento della fluidità delle membrane neuronali, in modo tale da riuscire a mantenere la plasticità sinaptica, fondamentale per il corretto funzionamento del sistema nervoso. Dal grafico che mette in relazione gli spostamenti del probe lungo l’asse z per tutte e 6 le simulazioni possiamo vedere chiaramente che tali spostamenti sono superiori per la membrana di SDPC, sia in assenza che in presenza del campo elettrico, in accordo con una sua magggiore fluidità.
Il secondo obiettivo dello studio computazionale, come accennato precedentemente, è stato quello di individuare il valore soglia per l’elettroporazione delle membrane fosfolipidiche di DMPC, POPC ed SDPC. L’elettroporazione è un fenomeno che comporta la formazione di buchi reversibili di membrana in seguito all’applicazione di un campo elettrico elevato, accompagnata da deformazione e a volte rottura della membrana, e trova numerose applicazioni nel settore medico, biologico e biotecnologico. Alcune delle applicazioni più frequenti ed importanti sono l’introduzione del DNA, enzimi, anticorpi e farmaci all’interno delle cellule.
Nel video che stiamo per vedere e’ stato preso come esempio dimostrativo la membrana di POPC. Applicando un potenziale di 550 mV lo ione sodio si sposta verso le teste polari ed interagisce con queste, senza riuscire però ad andare oltre. Aumentando il potenziale a 4400 mV lo ione riesce ad attraversare il bilayer, ma si blocca a livello delle teste polari del lato opposto. Inoltre all’elettroporazione si accompagna una notevole deformazione della membrana, in accordo con le evidenze sperimentali riportate in numerosi articoli. Soltanto a 4600 mV il probe riesce a fuoriuscire dal bilayer, per cui si ha la completa elettroporazione.
Questo è il grafico relativo alle traiettorie dello ione sodio lungo l’asse z in tutte e tre le simulazioni. Prendendo come valore 0 il punto esterno alla membrana in cui si trova il sodio, il grafico mostra chiaramente la migrazione di questo lungo lo spessore del bilayer, evidenziato con la striscia verde chiaro, mentre in azzurro è riportato lo spessore di tutta la membrana, inclusa l’acqua. E’ evidente che a 4600 mV lo ione sodio riesce a fuoriuscire dal bilayer, effettuando così una completa elettroporazione della membrana.
Entrambi i modelli presentati, oltre a chiarire aspetti finora poco compresi della riorganizzazione delle membrane sottoposte a campi elettrici, costituiscono un formidabile modello in silico per l’indagine degli effetti di farmaci capaci di superare la BBB e di interagire con le membrane neuronali. Queste analisi computazionali potranno permettere lo studio dell’effetto di numerosi farmaci applicabili nella terapia di disturbi neurologici e psichiatrici.
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