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Presentazione marco perone
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Presentazione marco perone

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  • Non si conosce ancora la funzione specifica di ogni microdominio. In particolar modo oggi è noto il coinvolgimento della membrana plasmatica nel percepire condizioni di stress, ma ancora non si conoscono le precise implicazioni dei singoli microdomini. Inoltre non è noto il meccanismo mediante il quale variazioni nella fluidità della membrana provochino attivazione del fattore 1 di trascrizione heat shock.
  • L’aumento dell’espressione delle HSP è metodo con il quale le cellule si difendono da insulti esterni; le HSP sono iperespresse, ad esempio, nel cancro. Con il mio lavoro ho simulato diversi microdomini di membrana in presenza di molecole in grado di determinare un aumento della fluidità di membrana e assieme un aumento dell’espressione di HSP in vivo.
    L’idea è che i fluidificanti nelle cellule sane determinano un leggero aumento di fluidità ed una iperattivazione del fattore 1 di trascrizione HS: funzione protettiva in caso di stress cellulare.
    Nelle cellule tumorali, con una fluidità di membrana già maggiore rispetto alle sane, l’interazione con i fluidificanti potrebbe determinare una eccessiva fluidità e dunque innescare processi pro apoptotici…
  • BC: contro la neuropatia diabetica
    DPH (1,6-difenilesatriene). Misure dell'anisotropia della fluorescenza possono dare indicazioni sulla mobilità delle molecole
  • Il calcolo dell’energia ha chiarito le diverse tendenze dei fluidificanti di interagire con un dominio piuttosto che con un altro
    Spiegare il grafico delle energie chiarendo le differenze tra i diversi domini di membr
  • Quest’analisi ha permesso di chiarire le variazioni del packing delle teste fofolipidiche
  • Ruolo centrale dei domini SM-CHOL nello stress sensing: tali microdomini, infatti, sembra che, alla luce delle alterazioni al normale packing di membrana derivanti dalla presenza di fluidificanti,giochino un ruolo fondamentale nel percepire varie situazioni di stress cellulare.
  • Transcript

    • 1. Page 1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO Facoltà di Farmacia Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche ANALISI COMPUTAZIONALE DELL’ATTIVITÀANALISI COMPUTAZIONALE DELL’ATTIVITÀ ANTITUMORALE DI COMPOSTI INTERAGENTIANTITUMORALE DI COMPOSTI INTERAGENTI CON MEMBRANE CELLULARICON MEMBRANE CELLULARI Relatore: Dott. Stefano Piotto Piotto Candidato: Marco Perone Matr. 0730/200201 Anno accademico 2009/2010
    • 2. Page 2 OBIETTIVI TESIOBIETTIVI TESI  Costruzione di validi modelli di membrane cellulari mediante tecniche di molecular modelling  Chiarire il comportamento morfologico e termodinamico di diversi doppi strati lipidici in presenza di fluidificanti di membrana mediante l’ausilio della dinamica molecolare  Comprendere i meccanismi d’azione dei fluidificanti di membrana
    • 3. Page 3 RAFT RAFT 1) 2) Modelli di membraneModelli di membrane = = I vari microdomini hanno diverse composizioni lipidiche, proteiche e grado di fluidità
    • 4. Page 4*L. Vigh et al, 2005. The significance of lipid composition for membrane activity: new concepts and ways of assessing function, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.32 No.8 Fluidità di membrana e HSPFluidità di membrana e HSP Le HSP sono iperespresse in cellule tumorali (meccanismo di difesa) L’aumento di fluidità è uno dei meccanismi mediante i quali le cellule percepiscono condizioni di stress*
    • 5. Page 5 Sono molecole capaci di interagire con i lipidi di membrana e di provocarne modifiche tali da alterare varie funzioni cellulari. a) Immagine modificata da Török, Z., et al., Heat shock protein coinducers with no effect on protein denaturation specifically modulate the membrane lipid phase,. PNAS, 2003. 100: p. 3131-3136 a) • Alcol benzilico (BA) e 2-Feniletanolo (FE)• Bimoclomol (BC) (R,S) -(N-[2-idrossi-3-(1-piperidinil) propossi]-3 pridin-carbossimidoil-cloruro b) Fluidificanti di membranaFluidificanti di membrana NIH 3T3 fibroblasti H9c2 cardiociti di ratto
    • 6. Page 6  SM o SM(18:0)  N-ottadecanoil-D-eritro-sfingosilfosforilcolina  CHOL Colesterolo Lipidi di base per i modelli di membraneLipidi di base per i modelli di membrane  POPE o PE(16:0/18:1(9Z)) 1-esadecanoil-2-(9Z-ottadecenoil)-glicero-3-fosfoetanolammina  POPC o PC(16:0/18:1(9Z)) 1-esadecanoil-2-(9Z-ottadecenoil)-glicero-3-fosfatidilcolina  DMPC o PC(14:0/14:0) ,2-ditetradecanoil-glicero-3-fosfatidilcolina
    • 7. Page 7 Valori sperimentali da: Department of Biological Sciences, Brock University, Canada: http://www.brocku.ca/researchers/peter_rand/lipid/default.html  Tra parentesi i valori misurati in seguito alle dinamiche Composizione delle 5 membrane n° lipidi Area superficiale dei singoli fosfolipidi (Å2 )* Spessore medio bilayer (Å)* Pura DMPC 72 61,7  35,7  (33,1) Pura POPC 72 69,5  39 (35,3) Pura POPE 72 56,6  41(37,2) Mista POPE-POPC 80 56,6 - 69,5  40 (36,5) Mista SM-CHOL 100 49,5 - 29,6  42 (38,8) Costruzione dei modelli di membraneCostruzione dei modelli di membrane Le 20 membrane totali sono state sottoposte a  2 ns di dinamica molecolare
    • 8. Page 8 Analisi: Calcolo delle EnergieAnalisi: Calcolo delle Energie Etot = Eb + Ea + Et + Ei + EVdW + Ec+ EHB Energia di legame Energia di non-legame Eb = energia di legame Ea = energia angolare Et = energia torsionale Ei = energia degli angoli impropri EVdW  = energia di Van der Waals Ec = energia elettrostatica (coulombiana) EHB= energia dei legami d’idrogeno Alcuni parametri compresi nei force field
    • 9. Page 9 Calcolo delle EnergieCalcolo delle Energie ←Tabella delle energie delle  dinamiche I force field utilizzati per le  parametrizzazioni sono stati  CHARMM_lipid e CHARMM Valori in Kcal/mol; (dev. standard) Grafico delle energie →
    • 10. Page 10 Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari La funzione di distribuzione radiale: g(r) ~ 7 Å        Nella membrana DMPC pura il picco  massimo risulta a circa 7 Å. Dopo l’aggiunta dei tre fluidificanti  i  picchi non si discostano  significativamente. Mostra  la  variazione  della  densità  di  determinati  atomi  in  funzione  della distanza da un punto assegnato (l’atomo P)  Chiarisce l’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle membrane lipidiche.
    • 11. Page 11 ~ 6 Å La funzione di distribuzione radiale: g(r) Anche il packing sulla superficie della membrana POPE-POPC non risulta modificato dall’addizione di fluidificanti ~ 7 Å Per le membrane pure POPE e POPC (non mostrate in figura) i picchi sono rimasti costanti intorno ai 6 e 7 Å
    • 12. Page 12 Il Density profile • Permette di seguire l’andamento delle distribuzioni dei vari tipi atomici nel box di simulazione lungo l’asse Z (spessore bilayer). • Vengono generate curve gaussiane che mostrano il profilo di densità di tutti gli atomi del sistema. • È stato adoperato uno script matlab per leggere il file multi pdb delle dinamiche. Z Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
    • 13. Page 13 Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari Density profile Membrana SM-CHOL -19,6 +19,2 Spessore medio bilayer: 38,8 Å
    • 14. Page 14 -17,7 +17,8 Spessore medio bilayer: 35,5 Å Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari Density profile Membrana SM-CHOL-BC a) b)
    • 15. Page 15 Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari Density profile Membrana SM-CHOL-BA - 19 +17,7 Spessore medio bilayer: 36,7 Å
    • 16. Page 16 Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari Density profile Membrana SM-CHOL-FE -19,7 +17,1 Spessore medio bilayer: 36,8 Å
    • 17. Page 17 CONCLUSIONICONCLUSIONI Nessuna variazione dell’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle membrane POPE, POPC, POPE-POPC e DMPC; I quattro modelli di bilayer hanno subito alterazioni non significative in seguito all’aggiunta dei tre fluidificanti. Spostamento delle molecole di colesterolo verso l’interno del bilayer. Leggera variazione dell’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle membrane SM-CHOL; Aumento della fluidità nelle regioni più interne del doppio strato lipidico (BC>FE e BA). Ruolo centrale dei domini SM-CHOL nello stress sensing: variazioni strutturali a tali raft comportano probabilmente l’attivazione del fattore 1 di trascrizione heat shock (HSF1). Prospettive future: valutazione dell’utilizzo dei fluidificanti come coadiuvanti ai classici antitumorali e dell’attività pro-apoptotica.
    • 18. Page 18 RINGRAZIAMENTIRINGRAZIAMENTI •Prof. Stefano Piotto Piotto •Prof. Simona Concilio •Dott. Federica Campana •Dott. Erminia Bianchino •Maria Luisa Nappi •Tutti i ragazzi del lab I4B Grazie per l’attenzione!

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