173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd

12,580 views
12,194 views

Published on

4 Comments
9 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
12,580
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
6
Actions
Shares
0
Downloads
358
Comments
4
Likes
9
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd

  1. 1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM (Dành cho hệ CĐNKN) Biên soạn : Nguyễn Thúy Hương Tp.HCM 09/ 2011 1
  2. 2. MỤC LỤC Chương 1: Đối tượng vi sinh vật và các chỉ tiêu trong thực phẩm………….3 Chương 2: Kỹ thuật cơ bản trong phân tích vi sinh vật……………………..17 Chương 3: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp truyền thống...39 Chương 4: Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp hiện đại……...85 Chương 5:Đánh giá vệ sinh công nghiệp…………………………………….95 2
  3. 3. Chương I ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT VÀ CÁC CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM 1.1GIỚI THIỆU Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên, trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp là có nguôn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về phương diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cầu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm. Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy hải sản, thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho hơn 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản của nước ta cũng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới (Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản…), mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước, giải quyết việc làm cho một số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tăng cường về quản lý của Nhà nước, kiểm tra, giám sát của các cơ quan chức năng, yêu cầu nghiêm ngặt về chỉ tiêu vi sinh của thị trường thế giới, việc phân tích vi sinh vật gây bệnh, thực hiện các biện pháp nhằm đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được các đơn vị sản xuất, chế biến thực phẩm nội địa quan tâm thực hiện. Tuy nhiên không phải vì thế mà ngộ độc thực phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm, mức độ ngộ độc thực phẩm khi con người tiêu thụ thực phẩm được thuyên giảm. Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ độc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hoá học hoặc chứa các vi sinh vật gây bệnh. Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu là các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm bệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ăn có chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở mức độ rất thấp trong nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tố của chúng có thể tăng nhanh đến mức độ gây ngộ độc. Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sốt, đau đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tuỳ thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vâtk tạo ra và tiết vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tế bào vi sinh vật (nội độc tố). 3
  4. 4. Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gây ngộ độc hay gây bệnh ở người khi bị đào thải khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị nhiễm phân này. Nước trở thành môi trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho người khi sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách. Nước là môi trường sống, môi trường nuôi trồng của các loài thuỷ sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh vật gây bệnh có thể nhiễm vào các loài thuỷ hải sản, làm nhiễm nguồn nguyên liệu của các thực phẩm thuỷ hải sản chế biến. Đó là một trong những con đường nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thực phẩm. Mặt khác, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, vi sinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt thiết bi, công nhân. Mặc dù có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh vật hiện diện hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật trong quá trình chế biên hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. Do vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong đa số các trường hợp là bằng không. 1.2. TÌNH HÌNH CÁC VỤ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG CẢ NƯỚC VÀ Ở TP. HỒ CHÍ MINH TRONG THỜI GIAN VỪA QUA Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm. Hàng năm Việt Nam có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Đây là con số được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra trong một hội thảo về an toàn thực phẩm - dantri.com.vn - 18:02 15-04-2011.  Theo số liệu thống kê tại Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, từ 1997 tới 2004 đã có 2.237 vụ ngộ độc thực phẩm với 43.655 người mắc và 429 người tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất (24,9%) và độc tố tự nhiên trong thực phẩm (25,2%), còn lại không xác định được nguyên nhân. 4 lý do chưa thể xác định được nguyên nhân các vụ ngộ độc là: Lấy mẫu chậm, không lấy được mẫu, không có cách nào điều tra được hoặc còn phải xét nghiệm. ………  Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người nhập viện. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện giảm 174 người. Theo TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP, trong năm 2010, hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác 4
  5. 5. hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Mặc dù vậy, TS. Hùng cho hay, ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc, điều đó cho thấy, các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình chưa có xu hướng giảm. Do đó, người dân cần phải nâng cao ý thức trong việc thực hiện ATVSTP ngay chính tại bếp ăn của gia đình mình. Nếu như năm 2000, ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 70%) thì tới năm 2010, ngộ độc vi sinh vật thấp đi (<50%), ngộ độc chủ yếu do hóa chất, chiếm tới trên 60%. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Xu thế ngộ độc cho hóa chất càng ngày càng tăng lên, ngộ độc do vi sinh vật có xu hướng kiểm soát tốt hơn nhưng không có nghĩa là nguy cơ giảm đi. So với cùng kỳ năm 2009, số người mắc giảm 189 người, số người đi viện giảm 186 người. Tuy nhiên số người tử vong lại tăng lên 2 người. Số vụ ngộ độc thực phẩm có quy mô lớn (trên 30 người) giảm 3 vụ, số người mắc giảm 215 người, số người đi viện giảm 174 người. Năm 2010, số vụ ngộ độc do hóa chất là chủ yếu, chiếm trên 60%. TS. Lâm Quốc Hùng - Trưởng phòng Quản lý ngộ độc thực phẩm, Cục ATVSTP - nhận xét: Các vụ ngộ độc thực phẩm được chẩn đoán, xác định nhanh nguyên nhân và xử lý kịp thời, thông tin ghi nhận nhanh chóng, chính xác hơn. Công tác quản lý ngộ độc thực phẩm đã có nhiều chuyển biến tích cực. Đặc biệt, thời gian vừa qua, không có vụ ngộ độc nào xảy ra trong suốt thời gian diễn ra Đại lễ 1.000 năm Thăng Long – Hà Nội. Mặc dù vậy, ông Hùng cũng khuyến cáo người dân trước tình trạng ngộ độc thực phẩm tại gia đình chiếm gần 60% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước, đặc biệt là ngộ độc cá nóc. Điều đó cho thấy: Các vụ ngộ độc thực phẩm diễn ra tại khu vực hộ gia đình có xu hướng tăng, ý thức người dân chưa cao trong việc thực hiện ATVSTP. 5
  6. 6. Trong khi đó, theo kết quả điều tra của Cục ATVSTP, nhận thức của người dân về vấn đề ATVSTP đều được nâng cao hơn từ 2005-2008. Theo đó, nhận thức của người sản xuất sản phẩm thực phẩm tăng từ 47,8% lên 55,7%; nhận thức của người kinh doanh thực phẩm tăng từ 38,6% lên 49,4%; nhận thức của người sử dụng thực phẩm tăng từ 38,3% lên 48,65%. Nhờ đó, số vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước vẫn cao (8 triệu người/năm) nhưng đã bắt đầu có chiều hướng giảm. Số người mắc ngộ độc thực phẩm năm 2005 đã giảm gần một nửa (43,34%) so với năm 1994, số ca tử vong cũng giảm 28,17%. Các cơ sở đảm bảo ATVSTP tăng mạnh. Năm 2006, cả nước chỉ có 1.106 cơ sở đạt yêu cầu. Nhưng chỉ sau 2 năm, con số này đã lên tới 17.592 cơ sở. Theo báo cáo của Bộ Trưởng Bộ Y tế Nguyễn Quốc Triệu, trong năm 2010, tỷ lệ người kinh doanh thực phẩm có hiểu biết đúng đắn về VSATTP đã tăng từ 65% (2008) lên 73% (2010); người tiêu dùng có hiểu biết đúng tăng từ 65,5% (2009) lên 84,5% (2010); người sản xuất và chế biến thực phẩm có hiểu biết đúng tăng từ 44,4% (2009) lên 79,4% (2010). Trưởng Ban chỉ đạo, Phó Thủ tướng Nguyễn Thiện Nhân đánh giá sự chuyển biến trong nhận thức của người dân là một trong những điểm sáng của công tác VSATTP.  Năm 2011 : trong quý I/2011, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 50% và số ca tử vong giảm tới 75% so với cùng kỳ năm ngoái (2010). Trong 3 tháng đầu năm 2011, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442 người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người. So với cùng kỳ năm ngoái, số vụ ngộ độc giảm 10 vụ (giảm 50%), số người mắc giảm 321 người, số tử vong giảm 11 trường hợp (giảm 75%). Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm trong 6 tháng đầu năm 2011 toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với 1.776 nạn nhân, trong đó có 9 trường hợp tử vong. Nguyên nhân gây ngộ độc do vi sinh vật (17 vụ), do hóa chất (10 vụ), do độc tố tự nhiên (17 vụ)... 1.3. ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT–TÁC NHÂN CHÍNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Các quá trình hư hỏng của thực phẩm thường do vi sinh vật gây nên. Trong đó rất nhiều trường hợp các vi sinh vật này còn tạo ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Chính vì vậy việc tìm hiểu về các vi sinh vật gây bệnh để từ đó tìm ra các biện pháp khống chế chúng là việc làm cần thiết. Có 2 dạng gây bệnh có nguồn gốc từ vi sinh vật: - Vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của các độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Clostridium botulinum tiết ra độc tố gây nên bệnh botulism (chứng ngộ độc thịt); Staphylococcus aureus gây nên bệnh tụ cầu khuẩn - Vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người. Sự hiện diện của chúng hoặc của các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Ví dụ: Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli,… Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả 2 dạng gây bệnh này. Ví dụ Clostridium perfringens và Bacillus cereus. 6
  7. 7. 1.3.1.Tổng vi khuẩn hiếu khí: Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật chỉ sinh trưởng trong điều kiện có oxy.Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30o C trong khoảng 3 ngày. Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như: - Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count _ APC) - Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count _ TPC) - Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count _ TVC) - Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count _ SPC) 1.3.2.Tổng nấm men, nấm mốc: Nấm mốc là vi nấm có khả năng tạo sợi nấm, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty Nấm men là những tế bào đơn tính sinh sản chủ yếu dạng vô tính theo kiểu nảy chồi. Aspergillus Aspergillus flavus và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7- 400 C và tối ưu ở 24-280 C, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, đậu phộng, bắp…). Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người. Hình 9. Asperillus flavus (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 7
  8. 8. 1.3.3. Salmonella Nếu phân loại theo mức độ gây bệnh của Salmonella ta có các loại sau: - Loại chỉ gây bệnh cho người (vd: S. typhi gây sốt thương hàn tại người) - Loại chỉ gây bệnh cho động vật (vd: S. typhimurium gây sốt thương hàn tại chuột) - Loại gây bệnh cho cả người và động vật (chiếm đa số) Salmonella là trực khuẩn gram (-), không tạo bào tử, có tiên mao (trừ S. gallinarum), có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 µm. Giống như nhiều loài vi khuẩn khác Salmonella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng từ 6 đến 45.60 C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối ưu là 370 C. Salmonella phát triển trong khoảng pH từ 4.1 – 9.0. Trong các món salad có độ pH khoảng 5.5 – 5.7 không nhận dạng được sự thay đổi mùi vị khi Salmonella phát triển. Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của Salmonella là 0.93 – 0.95. Hình 1. Salmonella typhy (Chuïp qua kính hieån vi ñieän töû) Salmonella xâm nhập vào cơ thể bằng hai con đường: từ phân người hoặc động vật; từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng của chúng và nhất là phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là những tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng hơn khi chúng truyền phân vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. Trong quá trình giết mổ cũng cần phải đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12-36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2-7 ngày. 1.3.4. Coliforms Đây là những vi sinh vật hình que, G- , không tạo bào tử, có khả năng lên men latose và sinh khí trong quá trình lên men này. Phát triển trong khoảng nhiệt độ (từ – 2 8
  9. 9. đến 50oC ), pH từ 4,0 đến 8.5, có thể sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Sau 12 – 16 giờ trên môi trường thạch tạo ra những khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Coliform đi vào thực phẩm từ nước hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân. Các loài tiêu biểu cho Coliform: Escherichia coli và Enterobacter aerogenes. Tuy nhiên, ngoài ra còn có khoảng 20 loài mang những tính chất đặc trưng cho Coliform, trong đó bao gồm cả các Enterobacteriaceae khác và các loài thuộc Aeromonas. Nhóm Coliform phân là những Coliform có khả năng phát triển trong môi trường có nhiệt độ từ 44.5 – 450 C (các Coliform khác có t0 opt=370 C). Đây cũng là đặc điểm nhận biết và phân biệt Colifom phân. Tuy nhiên việc xác định này chỉ là giá trị dùng để tham khảo cho việc xác định điều kiện sống của Coliform. Dưới đây là một vài tính chất đặc trưng cho việc làm hư hỏng thực phẩm của Coliform: - Chúng có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất khác nhau: carbohydrate, các chất hữu cơ sinh năng lượng, các hợp chất chứa nitơ đơn giản,.. - Có khả năng tổng hợp hầu hết các vitamin cần thiết. - Có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 10 – 460 C. - Có khả năng tạo ra acid và sinh gas từ đường - Sinh ra mùi vị hư hỏng, khó chịu Escherichia coli: Được phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1700. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Các loài E. coli hiện diện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Các. Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài, nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất chế biến. Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit. Gây nhầy nhớt, hư hỏng thực phẩm. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy. Hình 2. Escherichia coli (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 9
  10. 10. 1.3.5. Staphylococcus Hiện nay tìm thấy 31 loài. Staphylococcus là cầu khuẩn, G+ , các tế bào thường liên kết thành hình chùm nho. Không di động, không tạo bào tử. Nhiệt độ tối ưu là 37oC . Chịu được khô hạn, hơi nóng (ở 50oC vẫn sống được trong 30 phút). Có khả năng sống được trong nồng độ NaCl là 9-10%. pHopt= 6-7 ; aw opt = 0,83- 0,90. Staphylococus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau nhất là trên các môi trường chứa chất hữu cơ. Tuy nhiên phải có nitơ trong môi trường. Nguồn nitơ sử dụng là acid amin. Trong tự nhiên Staphylococcus được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các động vật máu nóng. Staphylococcus sinh một số độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt và không bị phân huỷ ở 1000 C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tó này, sau 4-6 giờ người ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài 6-8 giờ. Ngoài ra Staphylococcus còn tạo mụn nhọt, làm đông huyết tương, từ đó gây nên các bệnh như viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viêm tủy xương ở người. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến Hình 3. Staphylococus aureus (Chụp qua kính hiển vi điện tử) Staphylococcus aureus Đặc trưng nhất của loài nay là gây viêm ruột dẫn đến bệnh chảy máu ruột. Mang tính chất đặc trưng của loài Staphylococcus, kết lại với nhau thành dạng chùm nho hoặc thành từng chuỗi ngắn. Có một vài loài Staphylococcus aureus có khả năng chịu mặc rất tốt (10 – 20% NaCl) và cũng chịu được tác động của nitrit. Chính vì vậy phải rất kiểm tra sự hiện diện của Staphylococcus aureus đối với các sản phẩm thịt như: xúc xích, dăm bông, lạp xưởng. Staphylococcus aureus cũng phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao (50 – 60% đường). Chúng lên men và phân giải đường nhưng lại không tạo mùi vị khó chịu cho sản phẩm. Nguồn gây nhiễm Staphylococci vào cơ thể người thường từ những người bị viêm mũi gây nên viêm xoang, từ các ung nhọt, hoặc các vết thương bị nhiễm trùng, từ da người tiếp xúc với người bệnh. Staphylococci còn gây nên chứng viêm vú bò dẫn đến làm nhiễm sữa và các sản phẩm từ sữa. Riêng không khí không phải là nguồn gây nhiễm đặc trưng trừ phi trong môi trường có quá nhiều Staphylococci. Các sản phẩm thực phẩm thường có Staphylococci : thịt và các sản phẩm từ thịt, cá và các sản phẩm từ cá, sữa và các sản phẩm từ sữa, salad, pudding, cream. Nếu không được trữ lạnh đúng mức thì Staphylococci sẽ phát triển mãnh liệt và gây bệnh. 10
  11. 11. 1.3.6. Vibrio Có khoảng 28 loài. Trong đó có 4 loài thường gặp nhiều trong hải sản: - Vibrio vulnificus - V. cholerae - V. parahaemolyticus - V. alginolyticus Vibrio là phẩy khuẩn. Phần lớn thuộc gram (-). Di động nhanh nhờ đơn mao ở đầu. Không sinh nha bào, phản ứng oxydase dương tính. Thuộc loài hiếu khí tùy tiện. Vibrio là loài vi khuẩn ưa mặn, trong môi trường sống yêu cầu có khoảng 1 – 3% NaCl. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ muối đến 7.0%. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 35 – 370 C, tuy nhiên vẫn phát triển được ở khoảng nhiệt độ từ 10 – 440 C. Khoảng pH mà Vibrio có thể phát triển từ 5.0 – 11.0. Vibrio cholerae tạo ra độc tố tả cholerae-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5µg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố này, loài này còn tiết độc tố hemolysin có độc tính tương tự tetrodotoxin của các nóc. Thường có mặt ở hải sản, các sản phẩm hải sản, nước biển. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây và các sản phẩm sữa, các loại thuỷ hải sản tươi sống. Tuy nhiên bị tiêu diệt dưới tác động của nhiệt độ. Nói một cách khác, khi nấu chín thực phẩm thì không phải lo sợ sự tác động của Vibrio. Hình 4. Vibrio cholerae (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 1.3.7. Shigella Shigella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gây bệnh lỵ trực trùng. Chỉ gây bệnh cho người và linh trưởng. Sinh độc tố enterotoxin. Là trực khuẩn gram(-), không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện. Phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 40oC , t0 opt = 370 C, pH = 6 – 8, nồng độ muối 5 – 6%. Nhạy cảm với nhiệt. Hình 5. Shigella sonnei (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 11
  12. 12. Bao gồm 4 loài – S. dysenteriae – S. boydii – S. plexnery – S. sonnei Shigella tạo độc tố gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng), kích thích lên thành ruột, lên hệ thần kinh trung ương, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu đường và acid amin ở ruột non. Nếu tác động lên hệ thần kinh thì có thể gây tử vong. Khi bị nhiễm Shigella, chúng sẽ tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột già, gây hoại tử, làm loét, xuất huyết. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng dữ dội, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt, có máu. Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Không được phép hiện diện trong 25g thực phẩm Thường nhiễm vào cá, quả, rau, thịt, các loại salad từ nước hoặc phân người. Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. 1.3.8. Yersinia Hiện nay tìm thấy 11 loài. Là trực khuẩn gram(-). Trong một số trường hợp có khả năng chuyển động. Thuộc loại kỵ khí tùy tiện, không tạo bào tử, không sinh nha bào. Khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 – 32oC . Bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 1 – 3 phút. Đại diện tiêu biểu là Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica phát triển trên nhiều loại thực phẩm khác nhau: bò, heo, dịch trứng, pho mát mềm, sữa, cá, tôm, cua, gà, đậu phụ,… Y. enterocolitica thường gây bệnh đường ruột, gây viêm dạ dày tại người. Sau 24 – 36 giờ sau khi sử dụng thực phẩm có mầm bệnh thì triệu chứng của bệnh bắt đầu xuất hiện như đau bụng, sốt, tiêu chảy, các vết loét dạ dày hình thành. Nếu để lâu sẽ dẫn đến chảy máu dạ dày. 12
  13. 13. Hình 6. Yersinia pestis (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 1.3.9. Clostridium Hiện nay phát hiện ra hai chủng gây ngộ độc thực phẩm: - Clostridium botulinum: tạo độc tố gây hại đến hệ thần kinh - Clostridium perfringens: gây đau bụng, tiêu chảy và giải phóng nhiều khí. Khi vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra độc tố ruột, gây ngộ độc cho người. Clostridium botulinum là trực khuẩn gram (+), không di động, yếm khí, tạo bào tử. Bào tử rất chịu nhiệt. Nhiệt độ phát triển tối ưu là : 43 – 47oC , pH từ 5 – 9, bị ức chế bởi NaCl 5%, hoặc NaNO3 2,5% C.botulinum là vi khuẩn sinh độc tố. Tế bào C.botulinum bị tiêu ở nhiệt độ 800 C đến 900 C. Trong đa số trường hợp C.botulinum sinh gas và tạo mùi khó chịu. Từ đặc điểm này ta có thể loại bỏ thực phẩm nhiễm C.botulinum một cách dễ dàng. Tuy nhiên cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bằng cảm quan về sự nhiễm vi khuẩn C.botulinum của thực phẩm, do đó người sử dụng sẽ bị nhiễm độc tố gây hội chứng botulism (ngộ độc thịt). Sự ngộ độc thịt xảy ra không thường xuyên, nhưng nó thường gây tử vong. Theo sự phát triển của khoa học, tỷ lệ tử vong do botulism ngày càng giảm. Ví dụ vào những năm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ này chiếm trên 60% tại Mỹ. Theo như thống kê của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh tại Mỹ, thì các sản phẩm được làm tại nhà dễ bị nhiễm C.botulinum hơn là các sản phẩm sản xuất trong công nghiệp. Hình 7. Clostridium botulinum và bào tử hình viên đạn (Chụp qua KHV điện tử) 13
  14. 14. Tùy theo từng loại C. botulinum mà triệu chứng bệnh xuất hiện sau khi sử dụng thực phẩm chứa độc tố xuất hiện sau các khoảng thời gian khác nhau (từ 12 – 36 giờ). Khi bị ngộ độc các triệu chứng đầu tiên xuất hiện là: nôn mửa, tiêu chảy, mệt mỏi, chóng mặt và đau đầu. Sau đó là các triệu chứng táo bón, nhìn một thành hai. Rồi các hiện tượng khó nuốt, khó phát âm xuất hiện. Người bệnh cảm nhận được sự khô miệng, khó thở, lưỡi bị sưng và xuất hiện màng. Có thể lên cơn sốt hoặc không. Tiếp theo là cơ bị tê cứng, rồi đến hệ thống hô hấp bị tê cứng và cuối cùng là tim ngừng đập. Kết quả là người bị bị tử vong do tê liệt hệ thống hô hấp. Sự tử vong này thường diễn ra sau 3 – 6 ngày sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố. Phương thức duy nhất để chữa trị là sử dụng các chất kháng độc tố. Tuy nhiên nó chỉ hiệu nghiệm nếu sử dụng khi phát hiện ra các triệu chứng đầu tiên của bệnh. Còn để khi các triệu chứng đặc trưng xuất hiện thì đã muộn rồi. Chính vì vậy việc xác định bệnh là rất khó khăn. Kèm theo việc sử dụng chất kháng độc tố là phải giữ cho người bệnh ở trạng thái yên tĩnh, sử dụng phương pháp thở nhân tạo, tạo sự cân bằng các chất lỏng trong cơ thể,.. Để ngăn chặn sự nhiễm C.botulinum vào cơ thể cần chú ý thực thi các việc sau: - Nên xử lý nhiệt các đồ hộp trước khi sử dụng. - Loại bỏ các đồ hộp có triệu chứng phồng, méo mó. - Không nếm các thực phẩm có mùi khó chịu. - Không sử dụng các thực phẩm đã được nấu chín nhưng không được bảo quản tốt và không được hâm nóng. - Cần đun nóng lại thực phẩm nghi ngờ trong khoảng 15 phút. - Đối với cảc sản phẩm xông khói thì cần chú ý một số điểm sau: - Sản phẩm được giữ sạch, tay trước khi cầm sản phẩm được rửa sạch. - Trrong quá trình xông khói cần giữ ít nhất ở 820 C trong 30 phút. - Làm lạnh nhanh sau khi đóng gói và bảo quản lạnh. - Tất cả các bao bì sử dụng phải là loại được bộ Y tế cho phép và chịu lạnh tốt. 1.3.10. Bacillus cereus B. cereus là trực khuẩn G(+), sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5-500 C, tối ưu ở 35-400 C. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…). Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ lạnh vài giờ trước khi sử dụng. Triệu chứng ngộ độc phổ biến là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 14-16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ. Hình 8. Bacillus cereus (Chụp qua kính hiển vi điện tử) 14
  15. 15. 1.3.11. Feacal streptococcus (Streptococcus phân) Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, hình cầu hay hình oval kéo dài, Gram dương, thường tụ tập thành hình đôi hay hình chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các loài này sống hiếu khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng. Các loài này có thể phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH ở 9,6 ở 450 C. 1.4. CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ TRONG THỰC PHẨM 1.4.1. Chỉ tiêu vi sinh vật trong nước * Nước dùng cho mục đích sinh họat và sản xuất Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (TCVN 5942 – 1995) quy định hai mức như sau: - Loại A dùng là m nguồn cấp nước sinh họat nhưng phải qua quá trình xử lý, giới hạn tối đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml - Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho phép là 10.000 MPN/100ml * Nước uống Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn). Tiêu chuẩn (TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994) quy định về vi sinh vật của các dạng nước này như sau: - Nước uống đóng chai Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép 1. Coliform (MPN/100ml) 2. Coliform phân (MPN/100ml) 3. E. coli (CFU/100ml) 4. Clostridium khử sulphat (CFU/100ml) 5. Streptococci phân (CFU/100ml) 0 0 0 0 0 15
  16. 16. - Nước giải khát không cồn Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép Không đóng chai Đóng chai 1. Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml) 2. E. coli (CFU/100ml) 3. Clostridium perfringens 4. Leuconostoc (CFU/100ml) 5. Nấm men – nấm mốc (CFU/100ml) 6. Staphylococus aureus 5x104 0 0 0 103 0 102 0 0 0 0 0 - Nước giải khát có cồn Chỉ tiêu Mức độ tối đa cho phép Không đóng chai Đóng chai 1. Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFU/100ml) 2. E. coli (CFU/100ml) 3. Clostridium perfringens 4. Vi khuẩn gây đục (quan sát bằgng mắt) 5. Nấm men – nấm mốc (CFU/100ml) 6. Staphylococus aureus/vi khuẩn gây bệnh đường ruột 103 0 0 0 102 0 102 0 0 0 0 0 1.4.2. Chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y tế tháng 4/1998 bao gồm các chỉ tiêu: - Tổng vi khuẩn hiếu khí - Coliform - E. coli - Staphyloccocus aureus - Salmonella - Vibrio parahaemolyticus - Bacillus cereus - Streptococcus faecalis - Pseudomonas aeruginosa - Clostridium botulinum 16
  17. 17. - Clostridium perfringens - Tổng số nấm men, nấm mốc Chương II KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 2.1.LẤY MẪU 2.1.1.ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU THỰC PHẨM Trong mẫu thực phẩm vi sinh vật hiện diện cở mật độ thấp và không có sự phân bố đồng đều trong mẫu Trong quá trình chế biến thực phẩm vi sinh vật trong nguyên liệu và bán thành phẩm thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh sáng…), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muối, dung môi, …) được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của vi sinh vật trong quá trình chế biến. Sự tổn thương và sức sống yếu của các vi sinh vật cần phát hiện có thể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật. Do vậy, hầu hết các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước và trong thực phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đối của vi sinh vật cần phát hiện, ức chế sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác. 2.1.2. PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU Lấy mẫu nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm để xác định chất lượng bằng cảm quan và phân tích trong phòng thí nghiệm (PTN) là khâu đầu tiên rất quan trọng trong công tác phân tích, góp phần vào tính chính xác của kết quả kiểm nghiệm và xử lý thực phẩm sau này. Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu mặc dù được thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm nhưng lại là công đoạn rất quan trọng trong quá trình thử nghiệm. Mọi sai sót trong công đoạn này đều có thể dẫn tới những sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm. 2.1.2.1. Nguyên tắc lấy mẫu Việc lấy mẫu phải đảm bảo 02 điều kiện sau: - Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng hay nơi lấy mẫu và được nhận dạng rõ ràng. - Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích. Khi lấy mẫu cần lưu ý các nguyên tắc sau: 17
  18. 18. - Người lấy mẫu đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng (tài liệu luôn có thể sẵn dùng). Lô hàng đồng nhất: là lô hàng bao gồm những sản phẩm có cùng một tên gọi, cùng một loại phẩm chất và cùng một khối lượng, đựng trong bao bì cùng 1 kiểu, cùng một kích thước, sản xuất trong cùng một thời điểm nhất định theo cùng một quy trình công nghệ. - Trước khi lấy mẫu trung bình, phải xem xét lô hàng có đồng nhất không và kiểm tra tình trạng bao bì của lô hàng đó. - Mẫu thực phẩm phải có tính chất đại diện cho cả một lô hàng thực phẩm đồng nhất. - Tỉ lệ lấy mẫu từ 0,5 ÷1,0% tùy theo số lượng, nhưng mỗi lần không ít hơn lượng cần thiết để phân tích. - Mẫu hàng lấy để đưa đi kiểm phải là mẫu trung bình. Nghĩa là sau khi chia thành lô hàng đồng nhất, mẫu sẽ lấy đều ở các góc, ở các phía trên dưới, giữa lô hàng và trộn đều.. - Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô thực phẩm. Mẫu kiểm của một lô hàng lớn hơn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu bao gói rồi tối thiểu cần 100 g. Với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm còn nguyên mới được dùng để phân tích. Đối với dạng lỏng (nước dùng trong chế biến, nước mắm..): 500ml… - Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp. Dụng cụ lấy mẫu, bảo quản mẫu phải được tiệt trùng - Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu. - Trên mẫu cần ghi:  + Tên mẫu  + Người lấy mẫu  + Tên và địa chỉ nhà sản xuất  + Số lượng mẫu lấy  + Địa điểm, thời gian lấy mẫu. - Những mẫu chưa sử dụng ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không cần bảo quản đông thì có thể bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC để tránh sự biến động về thành phần đặc tính của mẫu cũng như vi sinh vật. Nhìn chung, mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 24h.Để lâu hơn có thể bị tăng hoặc giảm vi sinh vật. Bảng 2.1. Lượng mẫu tối thiểu cần thiết để phân tích STT Tên thực phẩm Lượng mẫu Đơn vị 18
  19. 19. 1 Thịt và các sản phẩm của thịt 200 ÷ 500 gram 2 Cá, tôm, cua (nguyên con) 200 ÷ 500 gram 3 Trứng 5 ÷ 10 Quả 4 Nước mắm, nước chấm 500 ÷ 750 ml 5 Dấm 500 ÷ 750 ml 6 Sữa tươi 500 ÷ 750 ml 7 Dầu, mỡ 500 ÷ 750 ml 8 Rượu các loại 750 ÷ 1000 ml 9 Bột ngũ cốc, sản phẩm của bột 250 ÷ 500 gram 10 Bánh, mứt, kẹo 250 ÷ 500 gram 11 Gia vị, muối 50 ÷ 100 gram 12 Phẩm màu 20 ÷ 50 gram 13 Đồ hộp, nước giải khát 5 ÷ 10 hộp, chai Tùy theo lô hàng và yêu cầu kiểm nghiệm, thực phẩm có thể lấy nhiều hơn mức trên. 2.1.2.2. Kế hoạch lấy mẫu * Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M - Số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M (c); - Số lượng mẫu cần thử (n); - Giới hạn vsv, m & M + Chấp nhận (acceptable) (< m) + Ngưỡng lân cận giới hạn (Marginally acceptable) (> m and < M) + Không chấp nhận (Unacceptable) (> M); Các loại kế hoạch lấy mẫu: Kế hoạch hai thuộc tính và kế hoạch ba thuộc tính. * Kế hoạch hai thuộc tính - Chỉ nêu ra m - Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu trong số n mẫu thử >m thì chấp nhận lô hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng * Kế hoạch ba thuộc tính - Đặt ra cả m và M - Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP - Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không chấp nhận được - Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m và ≤M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng > m và ≤M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm * Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong thực phẩm. Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thì thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính. 19
  20. 20. VD: Số mẫu phải kiểm tra và giới hạn vi khuẩn cho thịt tươi Mẫu Test N C m M Thịt tươi gia súc Thịt gia cầm - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình - Samonella - Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình - Salmonella 5 5 5 5 3 0 3 0 106 0 106 0 107 107 2.1.2.3. Thu và vận chuyển mẫu Thu tại nhiều thời điểm và vị trí. Đối với loại thực phẩm đã biết chỉ nhiễm bề mặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hoặc cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu Dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ vỡ) Chú ý nhiệt độ và thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm của thực phẩm) Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng, biến dạng, bị hở các mối ghép hay không? Ghi lại các nhận xét trên. Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm. Chú ý chỉ kiểm các hộp phồng khi có yêu cầu. Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm 2.1.2.4. Chuẩn bị mẫu phân tích - Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo, mứt… Cân 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau đó bỏ vào erlen 150 ml hoặc 200 ml đã có sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1 . - Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… cân 10-100 g mẫu (cả cái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào erlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1 . - Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… Có thể hút trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml mẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt khuẩn. Ta có độ pha loãng 10-1 . 20
  21. 21. - Đối với các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE (Polyetylen), đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18 h; hoặc 45oC trong 15 phút nếu cần (liên tục lắc bình chứa mẫu nếu có thể để tăng tốc độ giải đông) - Có thể dùng Stomacher để xử lý mẫu rắn - Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước đệm phot phat, nước muối sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần. 2.2. KỸ THUẬT PHA LOÃNG Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theo bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch pha loãng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thực phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật. 2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT - Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau. Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật. - Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng… cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lượng của đối tượng vi sinh vật quan tâm. Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu. - Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ thể thực vật, động vật hoặc VSV. - Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 – 0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%. - Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin, các acid béo, các thành phần của màng tế bào... Nồng độ thích hợp của các gốc 21
  22. 22. kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 µg /ml. Nồng độ thích hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 µg/ml (1 µg = 10-6 g ) Thành phần cơ bản chính màng xelluloza của tế bào vi khuẩn 2.3.1. Phân loại môi trường Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thành phần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng. -  Theo bản chất - - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác định. - - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với hàm lượng xác định - - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên. -  Theo trạng thái vật lý 22 Nguyên tố Dạng tồn tại cho vi sinh vật sử dụng Thành phần trung bình (%) C Chất hữu cơ CO2 50 O Chất hữu cơ 20 N NH4 + ,NO3 - ,NO2 - 14 H Chất hữu cơ 8 P H2PO4 2- , HPO4 2- , PO4 3- 3 S SO4 2- 1
  23. 23. - - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá. - - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng mật độ vi sinh vật. - - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp -  Theo mục đích - - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton. - - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng sinh chọn lọc Salmonella - - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc: - + Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin, oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide); - + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium tellurite, sodium lauryl sulfate; - + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic); - + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ. - - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân biệt trong môi trường phân biệt: - + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH. Chỉ thị pH thường dùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple. - + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H2S. H2S được phát hiện bằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo ra FeS có màu đen. - + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môi trường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn. - + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes. 23
  24. 24. - - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng. - Chỉ thị màu môi trường - Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích vi sinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa những chất chỉ thị màu. Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác nhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môi trường có màu hoặc thay đổi màu.... Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổi màu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinh hoá. Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau. Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích, môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thị màu cho phù hợp. Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng - - - - - - - - 24
  25. 25. - - - - 2.3.2. Pha chế, chuẩn bị môi trường Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trường đông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH- MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi trường ở các lần kiểm nghiệm khác nhau. Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ các môi trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan, chỉnh pH và hấp khử trùng. Phương pháp pha chế môi trường này được thực hiện như sau: - Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn - Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần thiết. Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại. Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cần phải gia nhiệt để làm tan môi trường. - Điều chỉnh pH môi trường. Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N - Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho các dụng cụ chứa. - Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực - Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường: - Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bị hỏng - Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác - Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn - Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường, giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọn lọc bị mất, tạo thành các chất ức chế mới. - Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid - Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ở phòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm) 2.4.KHỬ TRÙNG 2.4.1. Khử trùng dụng cụ, môi trường nuôi cấy Các tác nhân vật lý hay hóa học như nhiệt độ cao, một số dạng bức xạ hay hóa chất chuyên dụng… có thể dùng để khử trùng vật dụng nuôi cấy 25
  26. 26. Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do khả năng làm hỏng hay biến tính các thành phần quan trọng tham gia vào hoạt động sống của tế bào như protein và acid nucleic. Có thể khử trùng dụng cụ bằng phương pháp nhiệt khô (sấy 170o C trong 2 giờ) hay nhiệt ướt (đun ở 60o C trong 30 phút, 72o C trong 15 phút, hoặc 100o C trong 10 phút) để diệt thể dinh dưỡng của vi sinh vật. Cũng có thể khử trùng dụng cụ bằng hơi nước cao áp 121o C trong 15-30 phút để diệt cả các thể sinh dưỡng lẫn các bào tử-nếu có- của mọi vi sinh vật Các bức xạ điện từ với bước sóng ngắn (như tia X hay tia gamma) có khả năng ion hóa nhiều loại phân tử tạo nên những gốc tự do với hoạt tính hoạt hóa cực mạnh có thể phá hủy các thành phần cũng như cấu trúc quan trọng như acid nucleic, màng lipoprotein, các protein trong tế bào. Tia tử ngoại tuy không có khả năng ion hóa nhưng lại là một tác nhân diệt khuẩn mạnh do khả năng tác động lên acid nucleic tạo đột biến gây chết tế bào. Sóng viba (microwaves, dạng sóng điện từ có bước sóng từ khoảng 1-1000nm) cũng được dùng phổ biến nhờ khả năng sinh nhiệt do kích thích các phân tử bất đối xứng về điện tích dao động với tần số cao (trên 900 triệu lần/giây). Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước giới hạn (< 0,75 µm), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật (trừ mycoplasma có đường kính chỉ khoảng 0,2-0,3 µm và virus). Một số hóa chất như ethylen oxyde, triethylglycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh… có thể kiểm soát sự tăng trưởng của vi sinh vật thường được dùng để khủ trùng hoặc ức chế sự sống cũng như tăng trưởng của vi sinh vật. 2.4.2.Khử trùng dụng cụ, môi trường sau nuôi cấy Môi trường sau nuôi cấy vi sinh vật và các dụng cụ bị nhiễm cần được khử trùng, tiêu hủy hoặc làm sạch phù hợp. Nói chung việc khử trùng bằng nhiệt đóng vai trò quan trọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau nuôi cấy. Việc khử trùng bằng hóa chất thường chỉ được thực hiện với các dụng cụ có kích thước và cấu tạo nhỏ gọn (như pipet, lam kính…)hoặc trong vài trường hợp đặc biệt. Đối với các dụng cụ thủy tinh được dùng làm nhiều lần (như bình tam giác, ống nghiệm…) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121o C trong 30 phút. Vật liệu nuôi cấy trong các dụng cụ chứa dùng một lần (như plastic) cũng có thể khử trùng ở nhiệt độ tương tự trong các bao plastic có điểm nóng chảy cao. Sau khi vi sinh bị diệt có thể loại bỏ các đĩa Petri hoặc bao bì nhựa cùng các thứ bên trong. 2.5.KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT 2.5.1. KỸ thuật gieo cấy vi sinh vật Mục đích của việc gieo cấy VSV để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước, đất...) cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của đối tượng VSV mục tiêu. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước như sau: - Ồng nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa. 26
  27. 27. - Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành và miệng ống nghiệm. - Đầu que cấy có dính VSV được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn. - Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que cấy. - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại. - Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để que cấy. - Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy: ghi tên vi sinh vật và ngày gieo cấy. Chú ý : Khi cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm kia có thể cầm hai ống nghiệm cùng một lúc trên cùng bàn tay trái. Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm thạch nghiêng Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên. Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các bước tiến hành cũng tương tự như mục 1.1 và 1.2, nhưng có điểm khác như sau: - Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc nhiễm khuẩn lúc gieo cấy. - Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy ống nghiệm. Lưu ý: Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút que cấy ra, chú ý phải giữ que cấy thẳng, nhẹ nhàng và không làm cho môi trường bị nứt nẻ. 2.5.2.Phân lập vi sinh vật VSV tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài VSV. Việc phân lập 1 loài nhất định trong quần xã VSV dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc. Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng để phân tách tế bào VSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau: 2.5.2.1.Kỹ thuật hộp ria (streak plate) Là kỹ thuật phân tách hỗn hợp VSV bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao cho các tế bào riêng rẽ nhau ra. Sau khi được ủ trong một thời gian, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sinh sản, phân chia từ một tế bào ban đầu. 27
  28. 28. Trong kỹ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là môt số kỹ thuật ria thường dùng: Kỹ thuật ria chữ T (T streak) Kỹ thuật ria liên tục (continuous streak) Kỹ thuật ria 4 góc (quadrant streak) Kỹ thuật ria tia (radiant streak) Hình 3.1 Các kiểu ria trên môi trường thạch Chú ý: Sau mỗi vùng ria, người ta phải tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. 2.5.2.2.Kỹ thuật hộp trải : Môi trường được chuẩn bị trước trong các đĩa Pettri. Yêu cầu bề mặt môi trường phẳng, không ướt. Nhỏ 0,1 hoặc 0,2 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa môi trường. Dùng que trang vô trùng trải đều mẫu khắp bề mặt đĩa. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. 2.5.2.3.Kỹ thuật hộp đổ : Hút 1 ml dịch mẫu đã được pha loãng vào chính giữa đĩa. Đổ 15-20 ml môi trường đã tiệt trùng, đã để nguội khoảng 45-50o C vào giữa đĩa. Dùng tay xoay nhẹ sang trái và xoay nhẹ sang phải vài lần để dịch mẫu hòa để vào môi trường. Để yên đĩa trên bề mặt phẳng cho đông. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. 2.6.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 2.6.1. ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIÊP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (ĐỘ ĐỤC) Tế bào vi sinh vật là một thực thể khi có trong môi trường sẽ làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường. Trong một giới hạn nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong môi trường tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Do đó có thể định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm. Trong trường hợp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số 28
  29. 29. lượng vi sinh vật có trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp. Phương pháp tiến hành theo hai bước: 1. Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung dịch thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định lượng tế bào vi sinh vật có trong 1ml ký hiệu N/ml. Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng. Vẽ đồ thị biểu diễn log (N/ml) (trục tung) theo các giá trị OD đặt trên trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính giữa log (N/ml) với OD. 2. Xác định lượng tế bào theo độ đục: - Đo độ đục của huyền phù của tế bào vi sinh vật cần xác định. - Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. Lưu ý N/ml = 10a với a=log (N/ml). Hình 13. Máy đo độ đục Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Trong trường hợp không cần thiết giá trị tuyệt đối của tế bào vi sinh vật thì không cần phải xây dựng biểu đồ tuyến tính giữa mật độ vi sinh vật và giá trị OD. Phương pháp này cho kết quả nhanh, thường được dùng để theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất, tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật 2.6.2.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu. Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thích hợp. 29
  30. 30. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Phương pháp này thực hiện như sau:pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên một dĩa petri khoảng 25 – 250. Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức 250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm. Mẫu có thể được cấy bằng kỹ thuật cấy ria hay cấy trải. Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu. Sao cho các tế bào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc. Kết quả thu được là số trung bình của 2 – 3 đĩa petri với cùng điều kiện nuôi cấy. Kết quả cũng thường được trình bày dưới dạng CFU (Colony Forming Unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc. Hình 11. Khuẩn lạc vi khuẩn và dụng cụ đếm khuẩn lạc Mặc dù có một số nhược điểm song đây vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định số lượng tế bào vi sinh vật. Phương pháp này có độ nhạy cao, nên thường được dùng trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm. Quy trình chi tiết của phương pháp đếm khuẩn lạc: mẫu được pha loãng theo dãy nồng độ như sau: 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 … Ví dụ: lấy 1ml mẫu, pha vào 9ml dung dịch, pha loãng trộn đều, rồi tiếp tục lấy 1ml của dung dịch 1 cho vào 9ml dung dịch pha loãng ta được dung dịch 2 với độ pha loãng là 10-2 . Cứ tiếp tục, sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng thêm 10 lần cho đến khi tìm được độ pha loãng thích hợp, cho phương pháp đếm khuẩn lạc. 30
  31. 31. Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu + 9 phần dung dịch pha loãng cho nên nếu là 0,1ml cần bổ sung 0,9ml dung dịch pha loãng. Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri Cách tính kết quả : Ví dụ: kết quả số khuẩn lạc trung bình từ 2 đĩa petri thu được là 35, độ pha loãng 10-4 , số lượng mẫu đưa vào đĩa petri là 0,1ml ta có: 35.10.10000 = 3500000 CFU/ml Cách biểu diễn kết quả: - Biểu diễn kết quả phù hợp phương pháp đang áp dụng - Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa. - Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10). Ví dụ: - Kết quả 3500000 CFU/ml viết thành 3,5.106 CFU/ml - Kết quả 3572000 CFU/ml viết thành 3,6. 106 CFU/ml - Kết quả 3532000 CFU/ml viết thành 3,5. 106 CFU/ml 2.6.3.ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẲNG PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) (SỐ CÓ KHẢ NĂNG CAO NHẤT – SCKNCN) Quy trình định lượng theo phương pháp này như sau: Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cần xác định với 3 mức nồng độ 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ với thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như:sinh hơi, đổi màu, đục…) ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng MPN/100ml hay số MPN/gam. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Bảng. Bảng tra MPN cho loạt 3 ống Số ống dương tính MPN/100 ml Số ống dương tính MPN/100 ml Số ml mẫu sử dụng (ml) Số ml mẫu sử dụng (ml) 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 - 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 31
  32. 32. Số ống dương tính MPN/100 ml Số ống dương tính MPN/100 ml Số ml mẫu sử dụng (ml) Số ml mẫu sử dụng (ml) 10 1 0,1 10 1 0,1 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6 2 2 0 21 0 2 1 9 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 4 3 0 0 23 1 0 1 7 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 - 2.6.4. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT MÀNG LỌC Phương pháp này được dùng để định lượng vi sinh vật trong các mẫu nước với mật độ vi khuẩn thấp. Vì vậy phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật có trong mẫu nước trên màng lọc. Việc xác định số lượng tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được. Sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thật có thành phần dinh dưỡng thích hợp. Theo nguyên lý một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật. Màng lọc có kích thước 0,2 – 0,45 µm được chế tạo từ các sợi thủy tinh hay sợi polypropylene. Ngoài màng lọc thông thường, ngày nay còn dùng màng lọc kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane). Các vạch chia ô làm bằng vật liệu ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc. Số vi sinh vật được tính theo số khuẩn lạc mọc trong các ô. - Từ số các ô vuông có khuẩn lạc suy ra mật độ vsv trong mẫu theo dạng số có xác xuất lớn nhất (MPN): MPN = N. ln(N/(N-x)); trong đó N là tổng số các ô vuông, x là số ô có khuẩn lạc mọc. 32
  33. 33. Hình 12. Bộ lọc vô trùng và màng lọc 2.6.5. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men tảo … Có thể định lượng trực tiếp trong buồng đếm hồng cầu qua kính hiển vi. Quy trình đếm trực tiếp cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật trong mẫu. Tuy vậy phương pháp này có các nhược điểm sau: - Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Không phân biệt dược tế bào vi sinh vật, các hạt vật thể khác lẫn trong mẫu - Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Có ba phương pháp đếm trực tiếp: 1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu là một dụng cụ bằng thuỷ tinh. Diện tích buồng đếm là 1mm2 , chiều cao là 0,1mm. Diện tích 1mm2 được chia làm 400 ô nhỏ và thể tích của 400 ô nhỏ sẽ bằng hoặc 25 ô vuông lớn, tương ứng thể tích của ô vuông lớn là 1/250mm3 . Trước khi quan sát cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu. Pha loãng mẫu sao cho trong mỗi ô vuông nhỏ có khoảng 5 – 10 vi sinh vật. Muốn đạt được yêu cầu 33
  34. 34. trên cần phải ước lượng số vi sinh vật trong mẫu, hay phải làm thử một vài lần để xác định được công thức pha loãng tối ưu. Hình 10. Buồng đếm hồng cầu Mẫu được pha loãng bằng dung dịch có thành phần: Thành phần dung dịch pha loãng. - Pepton 0,1% - Laurylsulphate 0,1% - Methyl blue 0,01% Các dung dịch pha loãng sau khi chuẩn bị phải lọc qua trước khi sử dụng. Điều chỉnh kính ở độ phóng đại 400 lần rồi tiến hành đếm. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn nằm trên đường chéo của buồng đếm. Cách tính số vi sinh vật. Gọi x1, x2, x3, x4, x5 là số lượng vi sinh vật trong từng ô lớn ta có : X = 5 54321 xxxxx ++++ Ta biết thể tích của 1 ô lớn bằng 1/250 mm3 Do đó số lượng tế bào vi sinh vật co trong 1 ml mẫu sẽ là: Số vi sinh vật (trong 1 ml mẫu) = X .250.1000 = X .250000 2. Đếm trực tiếp bằng đường đếm Breed Buồng đếm Breed có diện tích 1cm2 được đánh dấu. Dùng bơm tiêm cho chính xác 0,01ml dung dịch mẩu dàn trên mặt buồng đếm. Sấy khô bằng cách hơ nhẹ trên đèn cồn bằng methyl blue. Khi đếm phết một lớp dầu trên bề mặt cần đếm. Số lượng vi sinh vật /ml được tính theo công thức: N/ml=4a.104 /∏d2 a: số lượng tế bào vi sinh vật trong vùng đếm d: đường kính của vùng đếm 34
  35. 35. 3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như: - Acridin Cam (AODC) - 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT) - Fluoresecin isothio cyanate (FITC) Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang. Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương pháp đếm khuẩn lạc. Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năng phát triển thành khuẩn lạc. Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật có thật trong mẫu. 2.7. THỬ NGHIỆM SINH HÓA Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật. Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động. Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính. Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng. Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinh hoá thường dùng được trình bày trong bảng sau: Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC Acinetobacter calcoaceticus Aci. lwoffi 7844 5886 15308 15306 Aeromonas hydrophila 8049 7966 Alkaligenes faecalis 415 19018 Bacillus cereus Bac. subtilis 10876 6633 7464 10400 Clostridium histolyticum Clos. Perfringens 19401 13124 503 8237 Edwardsiella tarda 10396 19547 Enterobacter aerogenes Ent. cloacae 13048 10005 10006 - 35
  36. 36. Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC Enterococcus faecalis 29212 - Escherichia coli 25922 10418 Mycobacterium fortuitum Myco. kansasii Myco. phlei Myco. terrae 10349 10268 8151 10856 6841 14471 19249 15755 Norcadia brazilensis Nor. otitidicarcaviarum 11274 1934 19296 14629 Proteus mirabilis Pro. rettgeri 10975 7475 - - Pseudomonas aeruginosa 10662 Serratia marcescens 13880 10218 Staphylococcus aureus Staph. epidermidis 25923 12228 6571 - Streptococcus agalactiae Strep. pneumoniae Strep. salivarius 13813 6303 8681 8181 - 7073 Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật bao gồm như sau: 1. Thử nghiệm khả năng lên men Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống này sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉ thị màu được bổ sung vào môi trường. Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red. 2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp. Phản ứng được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làm chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau. 36
  37. 37. Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là bromothymol blue 3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue. 4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium. Thử nghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màu bromothymol blue. 5. Thử nghiệm catalase Thử nghiệm dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2. Phản ứng được nhận diện nhờ sự sủi bọt của giọt H2O2 khi O2 bay lên. 6. Thử nghiệm decarboxylase Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH môi trường. 7. Thử nghiệm coagulase Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đông huyết tương. 8. Thử nghiệm urease Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi sinh vật, nhất là nhóm Proteus. Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường. 9. Thử nghiệm gelatinase Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật. 10. Thử nghiệm khả năng sinh H2S Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase. 11. Thử nghiệm khả năng sinh idol Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá thành indol. Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu đỏ. 37
  38. 38. 12. Thử nghiệm KIA, TSI Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật. 13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng. 14. Thử nghiệm oxidase Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật. Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện của enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương. 15. Thử nghiệm ONPG Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym β-galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o- nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng. 16. Thử nghiệm MR (Methyl Red) Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môi trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử. 17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của pepton tạo phức đỏ. 18. Thử nghiệm CAMP Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và β-hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của β-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết) 19. Thử nghiệm tính di động Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào kích thước của vệt cấy vi sinh vật. Bộ KIT sinh hoá định danh vi sinh vật 38
  39. 39. Ngày nay, các thử nghiệm sinh hoá truyền thống để định danh vi sinh vật đã có thể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngoài ra, còn có các bộ KIT cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hoá theo một quy trình hai lựa chọn để định danh vi sinh vật. Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như mỗi bộ KIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn Hình 24. Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật CHƯƠNG III QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 1. PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1.1.Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit _ CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 1.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất 39
  40. 40. 1.2.1.Dụng cụ và thiết bị Bảng 1.1.. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 1 Dụng cụ Thiết bị Ống nghiệm (∅16 mm) Tủ cấy vô trùng Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm Bình tam giác (250 ml) Máy dập mẫu (Stomacher) Ống đong (100 ml) Máy trộn mẫu (vortex mixer) Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Cân phân tích Que trải pH kế Kẹp inox Bể ổn nhiệt Đèn cồn Pipetman (1000, 5000 µl) Lò viba 1.2.2.Môi trường và hóa chất Bảng 2.2.. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 1 Môi trường Hóa chất Saline Pepton Water (SPW) Cồn 90o và 70o Môi trường Cao thịt – pepton HCl 10% plate count agar (PCA) NaOH 10% 40
  41. 41. 1.3.Thực hành 1.3.1.Quy trình phân tích Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 1.3.2.Các bước tiến hành 1. Định lượng mẫu: Bước 1. Cân 10,0 g (hay 25 g) hay hút 10,0 ml (hay 25 ml) mẫu đưa vào cốc thuỷ tinh vô trùng (nếu là mẫu rắn, phải dập mẫu) 2. Đồng nhất và pha loãng mẫu: Bước 2. Đổ mẫu vào bình tam giác đã có 90 ml (hay 225 ml) SPW. Bước 3. Mẫu lỏng thì lắc đều, mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Bước 4. Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng 10-1 41 Định lượng mẫu 10 g hoặc 10 ml Đồng nhất và pha loãng mẫu Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri Đếm khuẩn lạc Chọn đĩa có 25 -250 khuẩn lạc 250 khuẩn lạc Ủ mẫu 30 ± 1 o C trong 72 giờ
  42. 42. 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 9ml 9ml 9ml SPW SPW SPW 90 ml SPW + 10g maãu Hình 1.1. Kỹ thuật pha loãng Bước 5. Dùng pipetman với đầu tip vô trùng (hay pipet 1ml vô trùng) hút 1ml dịch mẫu 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch SPW để được độ pha loãng 10-2 . Làm tương tự để được các độ pha loãng cao hơn (theo Hình 4.1) Bước 6. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay. 3. Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa petri: Bước 7. Chọn các độ pha loãng thích hợp (dự kiến có 25 - 250 TB vi khuẩn/1ml mẫu). Đối với mẫu lạ, không ước đoán được lượng vi sinh vật nhiều hay ít phải cấy nhiều nồng độ pha loãng từ thấp đến cao. Bước 8. Dùng pipetman hút 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi độ pha loãng 02 đĩa) Bước 9. Đổ vào mỗi đĩa petri 15 - 20 ml môi trường Bước10. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ 3 - 5 lần. 4. Ủ mẫu: Bước11. Đặt các đĩa trên bề mặt ngang cho thạch đông lại. Lật ngược và ủ trong tủ ấm 30 ± 1 o C trong 72 giờ. 5. Đếm khuẩn lạc Bước 12. Chọn các đĩa có 25 - 250 khuẩn lạc đếm. 1.3.3.Kết quả Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trên 1 g mẫu được tính như sau: ...VfnVfn N A(CFU/g) 2211 ++ = Trong đó: A là số tế bào vi khuẩn /1g mẫu N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn ni là số lượng đĩa cấy tại một độ pha loãng 42
  43. 43. Petri có > 250 khuẩn lạc Petri có 25 – 250 khuẩn lạc Petri < 25 khuẩn lạc Petri có khuẩn lạc mọc loang Hình 1.2. Số khuẩn lạc đếm trên đĩa Petri V là thể tích dịch cấy vào petri fi là độ pha loãng tương ứng Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo quản 3 ngày ở 10 o C. Kết quả: Độ pha loãng (fi) 10-3 10-4 Đĩa số 1 (n1) 224 20 Đĩa số 2 (n2) 235 26 Áp dụng công thức, ta có kết quả: (CFU/g)102,3 10111012 26235224 A 5 43 ×= ××+×× ++ = −− Các kết quả của tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân. Trường hợp khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một khuẩn lạc. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ 10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10-2 CFU/g. 1.4.Câu hỏi ôn tập 1. Taïi sao moâi tröôøng nuoâi caáy toång vi khuaån hieáu khí ñöôïc coi laø moâi tröôøng dinh döôõng? 2. Keå teân moät soá thöông hieäu moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät maø em bieát? 43
  44. 44. 2. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MỐC 2.1.Nguyên tắc phân tích tổng số nấm men – nấm mốc Mật độ nấm men và nấm mốc được xác định dưới dạng tổng nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)…. Mỗi một khuẩn lạc được phát triển từ một tế bào hay bào tử. 2.2.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất 2.2.1.Dụng cụ và thiết bị Bảng 2.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 2 Dụng cụ Thiết bị Ống nghiệm (∅18 mm) Tủ cấy vô trùng Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm Bình tam giác (250 ml) Máy dập mẫu (Stomacher) Ống đong (100 ml) Máy trộn mẫu (vortex mixer) Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Cân phân tích (4 số lẻ) Que trải pH kế Đèn cồn Pipetman (1000, 5000 µl) Lò viba 2.2.2Môi trường và hóa chất Bảng 2.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 2 Môi trường Hóa chất Saline Pepton Water (SPW) Cồn 90o và 70o DG18 HCl 10% DRBC NaOH 10% 2.3.Thực hành 2.3.1.Quy trình phân tích 44 Định lượng mẫu 10 g hoặc 10 ml Đồng nhất và pha loãng mẫu trong dung dịch SPW Trải 0,1 ml dung dịch mẫu lên môi trường DRBC Đếm khuẩn lạc Chọn đĩa có 25 - 250 khuẩn lạc Ủ mẫu 30 ± 1 o C trong 3 – 7 ngày Hình 2.1. Nấm men và nấm mốc (DRBC)
  45. 45. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số nấm men - nấm mốc 2.3.2.Các bước thực hiện Bước 1. Định lượng mẫu 10 g hay 10 ml bằng cân kỹ thuật độ chính xác 0,01 g Bước 2. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (mẫu dạng mềm) hay xay mẫu (mẫu dạng cứng, dai). Sau đó pha loãng theo cấp 10-n . Bước 3. Chọn độ pha loãng phù hợp và hút 0,1 ml dịch VSV trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa. Bước 4. Ủ mẫu 30 o C từ 3 – 7 ngày. Bước 5. Chọn đếm đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc. 2.3.3. Tính kết quả Tương tự cách tính tổng số vi khuẩn hiếu khí. 2.4. Caâu hoûi thảo luận 1. Em cho bieát ngoaøi moâi tröôøng DRBC, caùc moâi tröôøng naøo khaùc ñöôïc söû duïng ñeå nuoâi caáy toång soá naám men, naám moác? 2 .Taïi sao ña soá caùc vi khuaån khoâng moïc ñöôïc trong moâi tröôøng nuoâi caáy DRBC? 45
  46. 46. 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC XUẤT LỚN NHẤT (MPN) 3.1.Nguyên tắc Phương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh Lauryl Sulphate Broth (LSB) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng canh Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) và ủ ấm ở 37o C/24-48 giờ. Phương pháp MPN là phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại có ống Duharm. Theo dõi sự đục môi trường và sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 3.2.Dụng cụ, môi trường, hóa chất và thiết bị 3.2.1.Dụng cụ và thiết bị Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 3 Dụng cụ Thiết bị Túi dập mẫu Tủ cấy vô trùng Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl) Que trang Máy dập mẫu (Stomacher) Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer) Đèn cồn Cân kỹ thuật Ống nghiệm Pipette 1 ml, 10 ml 3.2.2.Môi trường và hóa chất Bảng 3.2. Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 3 Môi trường Hóa chất Dung dòch Saline Peptone Water (SPW) Cồn 90o và 70o Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 10% Môi trường BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Salt) NaOH 10% 46

×