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Tesis corregido kike Document Transcript

  • 1. Universidad Nacional Intercultural de la AmazoniaEVALUACION DE LA CAPACIDADANTIOXIDANTE EN LA HOJA DE PEPINO(Cucumis sativus L.)TESISPara Obtener el Grado de:INGENIERO AGROINDUSTRIALPresenta:Víctor Enrique Lozano MaldonadoDocenteIris O. Ruiz Yance.Pucallpa, 2013
  • 2. ÍNDICEINTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….04CAPÍTULO 1: DATOS INFORMATIVOS........................................................051.1. Institución................................................................................................051.2. Carrera profesional.................................................................................051.3. Titulo.........................................................................................................051.4. Investigador..............................................................................................051.5. Asesor......................................................................................................051.6. Duración....................................................................................................05CAPÍTULO 2: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA......................................061.1. Planteamiento del Problema...................................................................061.2. Formulación del Problema......................................................................061.3. Objetivos..................................................................................................071.3.1. Objetivo General............................................................................071.3.2. Objetivos Específicos....................................................................071.4. Justificación de la Investigación............................................................071.5. Limitaciones de la Investigación............................................................07CAPÍTULO 3: MARCO TEÓRICO...................................................................082.1. Antecedentes de la Investigación..........................................................082.2. Bases Teóricas.........................................................................................142.3. Hipótesis...................................................................................................232.4. Sistemas de Variables.............................................................................24CAPÍTULO 4: METODOLOGÍA.......................................................................264.1. Tipo y Nivel de Investigación.................................................................262
  • 3. 4.1.1. Tipo de Investigación......................................................................264.1.2. Nivel de Investigación.....................................................................264.2. Método de la Investigación.....................................................................264.3. Diseño de la Investigación......................................................................274.4. Población y Muestra................................................................................274.4.1. Población..........................................................................................274.4.2. Muestra.............................................................................................274.5. Técnica de Recolección de Datos..........................................................274.6. Tratamiento Estadístico..........................................................................28CAPÍTULO 5: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS............................................295.1. Asignación de Recursos.........................................................................295.1.1. Recursos Humanos........................................................................295.1.1.1. Personal de Apoyo...........................................................295.1.1.2. Personal Especializado...................................................295.1.2. Recursos Materiales.......................................................................295.1.2.1. Equipos...............................................................................295.1.2.2. Materiales...........................................................................295.1.2.3. Reactivos...........................................................................305.1.2.4. Insumo................................................................................305.2. Presupuesto.............................................................................................305.3. Cronograma..............................................................................................31CAPÍTULO 6: BIBLIOGRAFÍA........................................................................333
  • 4. INTRODUCCIÓNLa formación de radicales libres mediante procesos naturales conduce a laoxidación de biomoléculas, dando lugar a diversas enfermedades. Losorganismos fotosintéticos están expuestos a ambientes muy oxidativos, por loque poseen un sistema antioxidante muy eficaz. Presentamos en este trabajoun sencillo método para la extracción y evaluación de la capacidad antioxidantede los polifenoles DE PEPINO (Cucumis sativus L.). La concentración depolifenoles se determina siguiendo el método de Folin-Ciocalteu, y la mediciónde la actividad antioxidante se realiza por el método del DPPH.El estudio de plantas medicinales se ha venido realizando desde hacedécadas, por causa de su uso potencial como fuente de sustancias conpropiedades biológicas. Cucumis sativus L. ha presentado algunas aplicacionesmedicinales, por lo que surge la necesidad de indagar su eventual capacidadantioxidante. 1Los nuevos conceptos fisiológicos, farmacológicos y clínicos, han devenido eninvestigaciones que han demostrado el rol en diferentes patologías, de lasespecies reactivas del oxígeno que se generan como producto de nuestrometabolismo. Como consecuencia, en los últimos años se actualizó el tema delos antioxidantes biológicos y se ha incrementado la investigación en búsquedade nuevos antioxidantes, principalmente de origen natural. Considerando lasperspectivas que, a la par de los nuevos descubrimientos de la acción de lasespecies reactivas del oxígeno, se generarán requerimientos de nuevasfuentes de agentes o sustancias antioxidantes. 2CAPÍTULO 1: DATOS INFORMATIVOS1Pratico D., Delanty N. (2000) Oxidative injury in diseases of the central nervous system: focuson Alzheimer’s disease. Am. J. Med. 109: 577-5852Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L (2006) Silvia Klinar B., Artemio Chang C.y Jorge Chanllio L. Evaluación de la actividad antioxidante de Lactuca sativa L. (Lechuga).FITOICA, Año 1- Número 1- Enero del 20064
  • 5. 1.1. Institución : Universidad Nacional Intercultural de laAmazonía1.2. Carrera profesional: Ingeniería agroindustrial1.3. Titulo : EVALUACION DE LA CAPACIDADANTIOXIDANTE EN LA HOJA DE PEPINO(Cucumis sativus L.)1.4. Investigador : Víctor Enrique Lozano Maldonado1.5. Asesor : Ing. Iris O. Yance Ruiz.1.6. Duración : 12 mesesCAPÍTULO 2: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA5
  • 6. 2.1 Planteamiento del ProblemaLas hortalizas conocidas solamente poseen usos ya conocidos, de usosfarmacéuticos o alimenticios. Pero no se han evaluado en su mayoría lacapacidad Antioxidante que poseen estas.Un gran número de plantas aromáticas y medicinales contienen compuestosquímicos con propiedades antioxidantes. El descubrimiento de estaspropiedades resulta interesante y útil particularmente como nuevas fuentes deantioxidantes naturales, alimentos funcionales y nutracéuticos.El pepino por su riqueza en agua, vitamina "E" y aceites naturales, constituyeuno de los mejores remedios para el cuidado externo de la piel. Asi puesresulta muy adecuado para pieles que han sufrido las consecuencias de unaexposición prolongada al sol. 32.2. Formulación del ProblemaEl presente estudio nos mostrará la capacidad antioxidante que se puedaencontrar en la hoja de pepino “Cucumis sativus”, esto significa que seobtendrá información relevante sobre los distintos antioxidantes.Por lo anterior, se está en condiciones de afirmar que esta investigaciónaportará datos útiles para prevenir los patógenos radicales libres.¿Se podrá “Evaluar de la capacidad antioxidante en la hoja de pepino (CucumisSativus L.)”?2.3. OBJETIVOSGENERAL:3María Serrano Maldonado. 2010. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE PARAEL APROVECHAMIENTO DEL MUÉRDAGO QUE INFESTA LA ZONA CHINAMPERA DEXOCHIMILCO. México, D.F. julio6
  • 7. Evaluar la capacidad antioxidante en la hoja de Pepino.ESPECIFICOS:1. Evaluar la presencia DE LA VITAMINA C.2. Evaluar la presencia DE COMPUESTOS FENÓLICOS.2.4. Justificación de la InvestigaciónMuchos metabolitos secundarios sintetizados en las plantas, son una fuente decompuestos con capacidad antioxidante, los cuales contribuyen en laprevención y tratamiento de enfermedades crónicas. El incremento de losniveles de antioxidantes en hortalizas es un área de gran interés querepresenta una oportunidad y un reto para los investigadores, para eldesarrollo de la región.En las hojas se mezclan dos potentes antioxidantes tal es el caso de lavitamina C y la clorofila.El pepino contiene folato, fósforo, potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, peropocas calorías (15kcl) y mucha agua (95ml) y fibras. Por esa razón, sonmuy empleados en las dietas para adelgazar.Su contenido de potasio ymagnesio disminuye la presión arterial o hipertensión.Igualmente,contiene vitamina C y ácido cafeico, ambos de acción antioxidante, quealivian las irritaciones de la piel y reducen hinchazones del cuerpo.Posee pequeñas cantidades de provitamina A, vitamina E, vitamina B1, B2 yB3 que intervienen en la producción de glóbulos rojos y blancosEl pepino es un alimento saludable que tiene diversos usos medicinales ycurativos y nos puede ayudar a tener un cuerpo saludable.2.5. LimitacionesLas hojas son muy útiles en la alimentación, sobre todo por su contenidoen vitaminas (Vit. A y Vit C) además de otros componentes como la clorofila.7
  • 8. En las hojas se mezclan dos potentes antioxidantes tal es el caso de lavitamina C y la clorofila.CAPÍTULO 3: MARCO TEÓRICO3.1. Antecedentes de la InvestigaciónA continuación referenciamos las investigaciones realizadas en el pasado endiversos centros de investigación, relativas única y exclusivamente al tematratado en esta tesis.3.1.A. "EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEMyrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”En ese marco, el presente trabajo corresponde a la evaluación del extractoacuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”.La evaluación se realizó por un procedimiento “in vitro” que se fundamenta enla determinación de la capacidad de inhibir a las enzimas Polifenol Oxidasas(PPO), cuando actúan sobre el catecol oxidándolo a o-benzoquinona, la cualabsorbe a 420nm.En la evaluación de la actividad antioxidante se ha comprobado que el extractoacuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”,presenta capacidad de inhibición a las enzimas Polifenol Oxidasas. Al realizaruna estimación cuantitativa, por comparación con la capacidad de inhibiciónenzimática de un estándar de referencia (Vitamina C), se comprobó que dichoextracto presenta una actividad antioxidante mayor que la vitamina C.El extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh“Camucamu”, muestra actividad antioxidante en el método de inhibición de lasenzimas PPO.8
  • 9. En la estimación cuantitativa de la actividad antioxidante detectada se observóque el extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh“Camucamu”, presenta una actividad antioxidante de 416% comparada con laVitamina C, es decir una potencia antioxidante 4 veces mayor.3.1.B. “Evaluación de la capacidad antioxidante de siete plantasmedicinales peruanas”Se evaluó la capacidad antioxidante de veintinueve extractos de las siguientesplantas medicinales: Cinnamomum zeylanicum “canela”, Calophyllumbrasiliense “lagarto caspi”, Myrciaria dubia “camu camu”, Minthostachys mollis“muña”, Alchornea castaneifolia “hiporuro”, Smallanthus sonchifolius “yacón”,Lepidium peruvianum y Lepidium meyenii “maca”, por el método de ladecoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).Los diferentes extractos de las plantas estudiadas, presentaron una buenaactividad antioxidante, siendo el extracto etanólico de canela, el que presentóuna mayor capacidad de captación de radicales libres, seguido por el extractometanólico de lagarto caspi, camu camu, extracto acuoso de muña y extractometanólico de hiporuro.Es recomendable seguir realizando estudios adicionales por medio de otrosmétodos y otras técnicas de aislamiento e identificación estructural de losprincipios activos presentes en estos extractos polares, semipolares y apolares,estudiados en el presente trabajo, que han presentado una gran capacidadantioxidante.3.1.C. “EFECTO ANTIOXIDANTE DE FRUTAS Y HORTALIZASDE LA ZONA CENTRAL DE CHILE”9
  • 10. Se obtuvieron especies hortofrutícolas de diferentes familias botánicas con elpropósito de obtener extractos utilizando sus órganos comestibles en estadofresco.La actividad antioxidante de los extractos se determinó usando la prueba dedecoloración del radical violeta 2,2-difenil-1-picril hidrazilo hidratado (DPPH,C18H12N5O6) (5,6). La actividad antioxidante se mide en términos de donarhidrógeno o de la capacidad atrapadora de radicales. La reducción yestabilización del DPPH por los antioxidantes da lugar a la decoloración deéste, produciendo una disminución de la absorbancia a 517 nm y se expresacomo porcentaje de decoloración de la solución radicalaria a una concentracióndada.El rendimiento de los extractos acuosos y metanólicos de las frutas fue de14,5± 4,5% y 11,2 ± 4,4%, respectivamente; en el caso de las hortalizas fue7,2±2,8% y 4,7±2,4%, respectivamente.La actividad antioxidante, expresada como porcentaje de decoloración de lasolución radicalaria de DPPH, por parte de extractos a 1000, 500, 100 y 50μg/mL de concentración final, se muestra en la tabla 1 para frutas y en la tabla2 para hortalizas.Las especies reactivas del oxígeno (ERO) causan daño celular que se puedeexpresar como patología, tales como las enfermedades cardiovasculares (ECV)y otras enfermedades crónicas no transmisibles. El organismo humano cuentacon sistemas antioxidantes; algunos provienen de la dieta, especialmente defrutas y hortalizas, otros los genera el mismo organismo de manera endógena.El objetivo de este estudio fue conocer la capacidad antioxidante in vitro dealgunas frutas y hortalizas que se consumen en la Región del Maule de Chile.3.1.D. “ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CONTENIDO TOTAL DE FENOLESDE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE Salvia aratocensis, SalviaSochensis, Bidens reptons y Montanoa ovalifolia”10
  • 11. Se puede indicar que los extractos etanólicos de Salvia aratocensis, Bidensreptans y Salvia sochensis al presentar valores de EC50 similares entre sí,poseen una capacidad análoga de capturar al radical DPPH, y muy superior alextracto etanólico de Montanoa ovalifolia. A su vez, aunque los extractos deSalvia aratocensis, Bidens reptans y Salvia sochensis presentaron actividadesantioxidantes diez veces menores en relación con la vitamina E, podríanconvertirse en extractos candidatos para el aislamiento de sustancias activascomo antioxidantes, puesto que este caso la actividad observada equivale alefecto total (sinérgico o no) de la mezcla.Los valores hallados del contenido total de fenoles (mg fenoles/100 mg deplanta), de los extractos etanólicos de Salvia aratocensis, Salvia sochensis,Bidens reptans y Montanoa ovalifolia.los extractos etanólicos de Salvia aratocensis y Bidens reptans, poseen elmayor contenido total de fenoles.Los extractos etanólicos de Salvia aratocensis y Bidens reptans, presentaron lamayor capacidad de capturar el radical DPPH. A su vez, tuvieron el mayorcontenido totalde fenoles. Mientras que, lo contrario sucede con los extractos de Salviasochensis y Montanoa ovalifolia. En general, los resultados obtenidos dan unindicio sobre la posibilidad de utilizar las especies Salvia aratocensis y Bidensreptans como plantas promisorias para el aislamiento de sustancias fenólicascon actividad antioxidante.3.1.E. “Análisis de polifenoles, actividad antioxidante y genotoxicidad enespecies argentinas de Lippia y Aloysia (Verbenaceae)”11
  • 12. Se determinó la capacidad antioxidante y genotoxicidad de las preparacionesacuosas (infusiones y cocimientos). L. integrifolia fue la especie con mayorcontenido de fenoles totales y A. polystachya la menor. En el análisis de loshidroxicinámicos, A. polystachya fue la que mayor concentración mostró. Encuanto a los flavonoides, A. polystachya fue la que poseyó menorconcentración en tanto que A. gratissima var. schultziana fue la más rica enestos compuestos. A. polystachya es la especie que presenta los menoresvalores de actividad antioxidante, seguida por A. gratissima var. gratissima y A.gratissima var. schulziana, mientras que L. integrifolia es la especie con mayoractividad antioxidante, en correlación con los valores de polifenoles totales.Ninguna de las especies analizadas demostró actividad genotóxica en elensayo del cometa. La ausencia de genotoxicidad, sumada a una marcadaactividad antioxidante, justificaría el empleo de las infusiones y cocimientos enel tratamiento de aquellas patologías donde los agentes antioxidantes jueganun importante rol terapéutico. Estos estudios sugieren el empleo seguro en lamedicina tradicional de los pueblos y comunidades que las incluyen entre susplantas medicinales.En la cuantificación de fenoles totales no se han determinado diferenciassignificativas cuando se compara la infusión y el cocimiento de cada especie(Tabla 1), si bien los cocimientos provenientes de A. gratissima var. gratissimay A. polystachya presentan menores concentraciones de fenoles respecto desus infusiones. Probablemente, debido a la naturaleza de los compuestosfenólicos presentes, durante el proceso de infusión se extrae la mayoría de lospolifenoles, no obteniéndose concentraciones significativamente mayorescuando el método empleado involucra condiciones más enérgicas deextracción (cocimiento).Las especies correspondientes al género Aloysia presentan los valores másbajos de fenoles totales. Dentro del género se observa que A. polystachya es laespecie que presenta los valores más bajos, A. gratissima, en sus dosvariedades, es la especie que presenta valores intermedios de fenoles totales,12
  • 13. pero existe una diferencia significativa entre ambasvariedades. Por último,Lippia integrifolia es la especie con mayores niveles de polifenoles.De acuerdo con los valores obtenidos de los ácidos hidroxicinámicos totales(Tabla 2), A. polystachya es la especie con menor concentración; L. integrifoliapresenta valores inferiores a los detectados para las dos variedades de A.gratissima.El análisis del contenido de flavonoides totales (Tabla 3), muestra que A.polystachya es la especiecon menor concentración de dichos compuestos y esduplicada en el contenido de flavonoides por las otras especies del géneroAloysia. Para L. integrifolia se obtuvieron valores intermedios entre ambasvariedades de A. gratissima.La ausencia de genotoxicidad, sumada a una marcada actividad antioxidante,estaría avalando el empleo de las infusiones y los cocimientos en la medicinatradicional de los pueblos y comunidades que incluyen a las especies aquíanalizadas entre sus plantas medicinales.3.1.F. “Capacidad antioxidante in vitro de fracciones de hojas de Piperpeltatum L.”La composición fitoquímica del extracto crudo demostró que estos extractosson ricos en compuestos fenólicos, con una menor presencia de compuestosterpenoides.En el potencial antioxidante de las fracciones fue considerablemente más altoque el extracto crudo. Por otro lado, la EC50 estuvo en el intervalo de 4,7 a 87,1mg extracto/µmol DPPH. Lo anterior sugiere que la fracción 1 puede contenerlos compuestos con mayor capacidad antioxidante.La actividad de las muestras de las hojas de P. peltatum sobre el reactivo deFRAP. Se observa que la absorbancia para las fracciones 1, 2 y 3 aumentó porcausa de la formación del complejo Fe2+-TPTZ con el incremento de laconcentración de los extractos. De la misma manera como sucedió con el13
  • 14. ensayo de DPPH, la fracción 1 presentó la actividad reductora más promisoria.El estado estacionario de la reacción entre el DPPH y las diferentes fracciones,el cual fue en todos los casos menores que 5 min. En este estudio preliminartanto el extracto crudo como las fracciones presentaron buena actividadantirradical.3.2. Bases Teóricas3.2.1. HISTORIA NATURAL DE LA ESPECIECENTRO DE ORIGENAsia y en particular la India es considerado el centro de origen del pepino,debido a la frecuente ocurrencia de especies silvestres de Cucumis connúmero cromosómico n=7, además de la existencia de vestigios del cultivo dehace 3000-4000 años, y aunque algunos autores señalan que el centro deorigen es África tropical, la mayoría de los trabajos señalan un origentotalmente asiático. 4CENTRO DE DIVERSIFICACIÓN DE LA ESPECIEEl centro de diversificación primario de la especie es la zona sur y este delHimalaya en la India y de ahí fue trasladado para Grecia e Italia y después aChina considerado como el segundo centro de diversificación. Posteriormente4Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet; Report of thecucurbit working group.14
  • 15. esta especie fue introducida a Francia en el siglo IX, a Inglaterra en el siglo XIVy a Norte América a mediados del siglo XVI.5Cucumis sativusINFORMACIÓN TAXONÓMICAREINO : PlantaeDIVISIÓN : MagnoliophytaCLASE : MagnoliopsidaORDEN : ViolalesFAMILIA : CucurbitaceaeGÉNERO : Cucumis L., 1753ESPECIE : sativus L., 1753SINÓNIMOSCucumis esculentus Salisb., 1796Cucumis muricatus Willd., 1805Cucumis sativus chiar Forssk., 1775CARACTERÍSTICAS ECOGEOGRÁFICASINTERVALO ALTITUDINALEsta especie se cultiva primordialmente en zonas con climas cálidos, desde elnivel del mar a 1500 (-2000) msnm6.HÁBITATSe encuentra en cultivares, agrosistemas y en huertos familiares, generalmenteabarcando climas cálidos7.VEGETACIÓNCuando es escapada al cultivo, forma parte de vegetación secundaria y ruderal,derivados de bosques tropicales, aunque también se encuentra en matorrales,5Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet.6Nee, 1993, p.29.7Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.15
  • 16. vegetación de dunas costeras, bosques de galería, pastizales y bosques deencino8.SUELOEl pepino puede cultivarse en cualquier tipo de suelo de estructura suelta, biendrenado y con suficiente materia orgánica. Es una planta medianamentetolerante a la salinidad (algo menos que el melón), de forma que si laconcentración de sales en el suelo es demasiado elevada las plantas absorbencon dificultad el agua de riego, el crecimiento es más lento, el tallo se debilita,las hojas son más pequeñas y de color oscuro y los frutos obtenidos serántorcidos. Si la concentración de sales es demasiado baja el resultado seinvertirá, dando plantas más frondosas, que presentan mayor sensibilidad adiversas enfermedades. El pH óptimo oscila entre 5,5 y 7. 9CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIEDESCRIPCIÓN DE LA ESPECIEHierbas anuales, postradas. Tallos angulosos, híspidos. Zarcillos simples,densa o esparcidamente hispídulos. Hojas pecioladas, pecíolos 4.0-7.0 cmlargo, híspidos; láminas 8.0-12.0 cm largo, 6.0-11.0 cm ancho, cordado-triangulares, angulosamente 3-5-lobadas, el lóbulo Terminal triangular,acuminado, ambas superficies híspidas10.3.2.2. Antioxidante8Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.9Plants for a future: Cucumis sativus; AgroNet.10Nee, 1993, p.28-29; Krístková et al., 2003, p.16-19.16
  • 17. Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades queprovocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por laacción de otras moléculas en estos procesos tóxicos en el organismo, losllamados sistemas antioxidantes defensivos. Se ha demostrado que elorganismo posee un numero de mecanismos a través de los cuales produce ya la vez limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso deradicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso seencuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la incidencia deenfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes.Un antioxidante es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación deotras moléculas. El sistema de defensa antioxidante está constituido porcompuestos de naturaleza enzimática como: superóxido dismutasa, catalasa,glutation peroxidasa, y compuestos de naturaleza no enzimática como:vitamina E, beta-caroteno, vitamina C, glutation reducido, albúmina, flavonoidesy metales de transición como Se, Cu, Zn, entre otros.El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedadeshumanas, es por ello que el uso de antioxidantes en farmacología es estudiadode forma intensiva, particularmente como tratamiento para accidentescerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas.Actualmente existen diversos métodos para determinar la actividadantioxidante, los cuales se basan en su capacidad para captar radicales libres.Entre ellos se pueden mencionar el uso del 2,2-difenil-1-picril hidrailo (DPPH),ácido 2,2´, azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6- sulfónico (ABTS), la reacción con elóxido nitroso (test NO), dicloridrato de N,N-Dimetilp-fenilendiamina (DMPD),generación de radicales peroxilo, superóxido e hidroxilo, y otros Los alimentos,al igual que las células del organismo humano, también pueden generarradicales libres; sin embargo también pueden contener sustancias17
  • 18. antioxidantes y ejercer una actividad antioxidante, al igual que las plantasmedicinales11.Sistemas de defensa antioxidanteEl sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustanciasque al estar presente en concentraciones bajas con respecto al sustratooxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de este. Comosustrato oxidable se pueden considerar casi todas las moléculas orgánicas oinorgánicas que se encuentran en las células vivas, como proteínas, lípidos,hidratos de carbono y las moléculas de ADN.29 Los antioxidantes impiden queotras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar-interactuar más rápido conlos radicales libres del oxígeno y las especies reactivas del oxígeno que con elresto de las moléculas presentes, en un determinado microambiente-membrana plasmática, citosol, núcleo o líquido extracelular (tabla 1). La accióndel antioxidante es de sacrificio de su propia integridad molecular para evitaralteraciones de moléculas -lípidos, proteínas, ADN, etc.- funcionalmente vitaleso más importantes.30 Su acción la realizan tanto en medios hidrofílicos comohidrofóbicos.31 Actúan como eliminadoras (Scavengers), con el objetivo demantener el equilibrio prooxidante/antioxidante a favor de estos últimos (tabla2). Los antioxidantes exógenos actúan como moléculas suicidas, ya que seoxidan al neutralizar al radical libre, por lo que la reposición de ellos debe sercontinua, mediante la ingestión de los nutrientes que los contienen.Tabla 1. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen suacciónIntracelular Membrana ExtracelularSuperóxido dismutasa Vitamina E CeruloplasminaCatalasa Betacarotenos TransferinasPeroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferinas11Centro de Investigación de Medicina Tradicional, Instituto de Investigación, Facultad deMedicina Humana, Universidad San Martín de Porres.18
  • 19. DT-deafarasa AlbúminasGSH HaptoglobinasProteínas que ligan metales Vitamina CSistemas proteolíticos Ácido úricoVitamina C Vitamina ETabla 2. Clasificación de los antioxidantes, según origenOrigen Acción1. ExógenosVitamina E - Neutraliza el oxígeno singlete- Captura radicales libres hidroxilo- Captura O2- Neutraliza peróxidosVitamina C - Neutraliza el oxígeno singlete- Captura radicales libres de hidroxilo- Captura O2- Regenera la forma oxidada de lavitamina EBetacarotenos Neutraliza el oxígeno singleteFlavonoides,Licopenos2. EndógenosEnzimáticos CofactorSuperóxidodismutasa (SOD)Cobre, sodio, manganeseCatalasa (CAT) HierroGlutatiónperoxidasa (GPx)Selenio3. No enzimáticosGlutatiónBarreras fisiológicas que enfrenta eloxígeno a su paso desde el aire hastalas célulasCoenzima QÁcido Tioctico Transportadores de metales19
  • 20. (transferrina y ceruloplasmina)12.3.2.3. Actividad antioxidantePor definición la actividad antioxidante es la capacidad de un compuesto deinhibir la degradación oxidativa (Roginsky y Lissi, 2005). Una de las estrategiasmás aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de uncompuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad delantioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical; la pérdidade color ocurre de forma proporcional con la concentración. No obstante, lasdeterminaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro muestran tansolo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo.La medición de la actividad antioxidante en un ensayo individual, refleja solo lareactividad química bajo ciertas condiciones de la prueba, por lo que esinapropiado generalizar los datos de un método de medición en particular,como indicador de actividad antioxidante totalMétodos de cuantificación de la capacidad antioxidante1.5.1 Métodos in vitroLos métodos para determinar la capacidad antioxidante se pueden dividir endos grandes categorías, los basados en la reacción de transferencia de átomohidrógeno (HAT) y los basados en las reacciones de transferencia de un soloelectrón (ET). Los últimos involucran una reacción redox con el oxidante comoun indicador del final de la reacción, mientras que losmétodos HAT,generalmente usan un compuesto generador de radicales libres, un indicadormolecular oxidable y un antioxidante12Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” Daño oxidativo, radicales libres yantioxidantes20
  • 21. - Método de inhibición de consumo de oxígeno (IOU).Este método usa como sustrato estireno y como radical iniciadorazoisobutironitrilo. Se mide el consumo de oxígeno en presencia o ausencia detocoferoles en clorobenceno usando un sistema transductor de presión bajouna atmósfera de presión de oxígeno. Este método no tiene una aplicaciónamplia debido a que las condiciones de trabajo de presión de oxígeno sonirreales y las muestras de alimentos tienen baja concentración de antioxidantespor lo que la sensibilidad del método no es suficiente (Huang et al., 2005).- Inhibición de autoxidación lipídica.Este método induce artificialmente la autoxidación de ácido linoleico por Cu (II)o un iniciador azo. El progreso de la autoxidación es monitoreado porabsorbencia UV a 234 nm, para detectar peróxidos conjugados de dieno. Estemétodo es más sensible que el método de inhibición de consumo de oxígeno,sin embargo, muchos compuestos orgánicos de alimentos absorben a 234 nmpor lo que no es una medición exacta (Huang et al., 2005).- Capacidad de absorbencia del radical oxígeno (ORAC).Originalmente, la primera versión del ORAC usaba la proteína fluorescente B-Ficoeritrina (B-PE) como prueba. Su fluorescencia decaía como indicador deldaño producido por la reacción con radical peroxilo. Sin embargo, se encontróque la B-PE representaba grandes desventajas para la medición de capacidadantioxidante, ya que tiene gran variabilidad, es fotosensible e interacciona conpolifenoles de manera inespecífica perdiendo fluorescencia aun sin agregar elradical generador. Para resolver este problema, se reemplazó la B-PE confluoresceína que es sintética y cubre las limitaciones de B-PE. La pruebaORAC provee una medición directa de la capacidad antioxidante hidrofílica ylipofílica contra radicales peroxilo21
  • 22. - Método de blanqueamiento de Crocina.Este método mide la capacidad de protección de los antioxidantes frente a ungenerador de radicales libres en el blanqueamiento de crocina que es underivado carotenoide. El progreso de la reacción es monitoreado porespectrofotómetro UV-vis a una longitud de onda de 443 nm, durante 10 min. Elmétodo de blanqueamiento de crocina tiene limitaciones en alimentos ya quevarían las constantes de reacción entre ROO● y fitoquímicos, muchospigmentos de alimentos absorben a la misma longitud de onda y la crocina alser una mezcla natural de pigmentos extraídos del azafrán tiene muchavariabilidad (Huang et al., 2005).- Parámetro total del atrapamiento de radicales por antioxidantes.Este parámetro usa R-ficoeritrina como muestra fluorescente. El progreso de lareacción con iniciador azo es monitoreado fluorométricamente (λcx = 495 nm yλcm = 575 nm). La capacidad antioxidante es expresada en equivalentesTrolox (Huang et al., 2005).- Fenoles totales por reactivo Folin-Ciocalteu.Mide la capacidad de reducción de una muestra. El reactivo de Folin-Ciocalteues color amarillo, la contaminación con reductores le da un color verde,mientras que los oxidantes le regresan su color amarillo. El reactivo no esespecífico a compuestos fenólicos, por lo que puede ser reducido porcompuestos no fenólicos. Los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivosolo bajo condiciones alcalinas. La disociación de protones fenólicos genera unanión fenolato que es capaz de reducir al reactivo.Métodos in vivo22
  • 23. Las técnicas ex vivo están tomando importancia como alternativas a laspruebas de toxicidad animal, ya que disminuye el uso de animalesexperimentales y el costo, además tienen gran especificidad y rapidez (Asensioet al., 2007).- Evaluación de efecto citotóxico.Los ensayos de citotoxicidad miden las alteraciones inducidas por drogas enrutas metabólicas o integridad estructural, la cual puede o no ser relacionadadirectamente a la muerte celular, sin embargo, los ensayos de supervivenciamiden el final de los resultados de tales perturbaciones metabólicas los cualespueden ser tanto recuperación celular o muerte celular. Teóricamente el únicoíndice de supervivencia en la proliferación celular es la demostración de laintegridad reproductiva (Freshney, 1992).- Absorción de rojo neutro (NRU).Este método es utilizado para probar nuevos productos terapéuticos parapadecimientos agudos y para evaluación de toxicidad crónica (Ndhlala, 2010).El método de absorción de rojo neutro evalúa células viables o sobrevivientesbasadas en la capacidad que tienen para incorporar o unir rojo neutro, una tintasupravital. El rojo neutro es una tinta catiónica débil que penetra la membranacelular por difusión y se acumula intracelularmente en los lisosomas. Lasalteraciones en las membranas lisosomales provocan fragilidad y otros dañosirreversibles. Estos daños reducen la absorción de rojo neutro, es por esto quees posible distinguir entre células viables, dañadas o muertas (Repetto et al.,2008).- Evaluación de oxidación de lípidos in vivo.Las especies reactivas del oxígeno son mediadores importantes del dañocelular alterando membranas o actividad enzimática. Los ácidos grasospoliinsaturados son particularmente susceptibles al ataque de radicales libres,formándose hidroperóxidos lipídicos, hidróxidos y aldehídos como productos dela degradación (El Haffidi y Baños, 1997).23
  • 24. El Fe(III) y Fe(II) catalizan reacciones de peroxidación lipídica por la generaciónde especies reactivas del oxígeno, por lo que en este análisis, se induceperoxidación lipídica por inyección intraperitoneal de hierro-dextan in vivo aratas. La peroxidación se evalúa por el método de sustancias reactivas delácido tiobarbitúrico en suero sanguíneo (El Haffidi y Baños, 1997).3.4. Hipótesis3.4.1. Hipótesis General“Las hojas poseen componentes orgánicos como la vitamina C, que a su vezesta vitamina posee actividad antioxidante. Por lo tanto es posible que permitala evaluación de la capacidad antioxidante en la hoja de pepino “Cucumissativus L.”.3.4.2. Hipótesis Nula“No se podrá evaluar la capacidad antioxidante mediante el métodoespectofométrico de la hoja de Pepino (cucumis sativus L.)”.3.5. Sistemas de Variables3.5.1. Variables dependientesa. Solventes (etanol, metanol, agua destilada)b. Tiempo de extracción (30, 60 y 90 minutos)c. Temperatura de extracción (25, 50 y 75ºC)Definición Conceptual:24
  • 25. Solventes: Son compuestos orgánicos basados en el elemento químicoCarbono. Ellos producen efectos similares a los del alcohol o los anestésicos.Estos efectos se producen a través de la inhalación de sus vapores.Algunos de ellos tienen aplicaciones industriales como los pegamentos,pinturas, barnices y fluidos de limpieza. Otros son utilizados como gases enaerosoles, extinguidores de fuego o encendedores para cigarrillos.Extracción: es un procedimiento de separación de una sustancia que puededisolverse en dos disolventes no miscibles entre sí, con distinto grado desolubilidad y que están en contacto a través de una interfase. La relación de lasconcentraciones de dicha sustancia en cada uno de los disolventes, a unatemperatura determinada, es constante.3.5.2. Variables independientesa. Concentración (Vit. A, Vit. C, polifenoles y antioxidantes)Definición Conceptual:a. Concentración La concentración de aceite se refiere a la cantidad (volumen)que se obtiene, producto de la aplicación de un método de extracción.3.5.3Variables constantesa. Temperatura ambientalb. Humedad relativac. Presión atmosférico 540 mm.HgDefinición Conceptual:a. Temperatura ambiental: es la temperatura que se puede medir con untermómetro y que se toma del ambiente actual, por lo que, si se toma de variospuntos en un área a un mismo tiempo puede variar.Esto es debido a que una temperatura tomada en un ambiente tan frío como loes el Polo Norte, donde la temperatura sería bajo cero (si se mide en grados25
  • 26. Fahrenheit o en Centígrados), no será igual a una tomada en un lugar tancálido como un desierto donde la temperatura estaría muy por encima del cero.b. Humedad relativa: La humedad relativa es la humedad que contiene unamasa de aire, en relación con la máxima humedad absoluta que podría admitirsin producirse condensación, conservando las mismas condiciones detemperatura y presión atmosférica.c. Presión atmosférica: La presión atmosférica es la presión ejercida por elaire atmosférico en cualquier punto de la atmósfera. Normalmente se refiere ala presión atmosférica terrestre, pero el término es generalizable a la atmósferade cualquier planeta o satélite.La presión atmosférica en un punto representa el peso de una columna de airede área de sección recta unitaria que se extiende desde ese punto hasta ellímite superior de la atmósfera. Como la densidad del aire disminuye cuandonos elevamos, no podemos calcular ese peso a menos que seamos capacesde expresar la densidad del aire ρ en función de la altitud z o de la presión p.Por ello, no resulta fácil hacer un cálculo exacto de la presión atmosférica sobrela superficie terrestre; por el contrario, es muy fácil medirla.CAPÍTULO 4: METODOLOGÍA4.1. Tipo y Nivel de Investigación4.1.1. Tipo de InvestigaciónLa presente es una investigación de tipo descriptiva explicativa, la cual seencarga de cuantificar la capacidad antioxidante extraído de la hoja de pepino(Cucumis sativus L.).26
  • 27. 4.1.2. Nivel de InvestigaciónEl presente proyecto de tesis, de acuerdo a la naturaleza del estudio de lainvestigación, reúne por sus características una investigación descriptivaexplicativa.4.2. Método de la Investigación4.2.1. Cuantificación de la Vitamina C:Se determinará cuantitativamente por el método espetofométrico, basado en lareducción del colorante 2-6 diclorofenolindofenol por medio de una solución deácido ascórbico a una longitud de onda de 515 nm, (AOAC 1995)4.2.2. Cuantificación de Compuestos FenólicosSe determinará con el reactivo Folin- Cicoalteu, usado como estándar el ácidoclorogénico, desarrollado por el método de Brand Williams.4.2.3. Cuantificación de la Capacidad Antioxidante (AOA)Método espectofotométrico basado en una reacción con el 2,2- Diphenil-1-picrilhidracil (DPPH), a una longitud de onda de 515 nm.4.3. Diseño de la InvestigaciónEl presente proyecto de tesis corresponde a un diseño tranversal, esto implicaque se realizan la toma de datos en un momento único en el tiempo midiendovariables de manera individual y se reportan estas mediciones entre variables,son correlacionales y si establecen procesos de causalidad entre variables soncorrelacionales/causales.4.4. Población y Muestra27
  • 28. 4.4.1. PoblaciónLa población de la hoja de pepino (Cucumis sativus L.) a estudiar por elpresente proyecto de tesis, es la que se encuentra de manera silvestre en loscampos agrícolas de la región.4.4.2. MuestraLa muestra seleccionada será al 100% de la muestra total recolectada en unsolo día de faena.4.5. Técnica de Recolección de DatosLa principal técnica que se utiliza en este proyecto de tesis, es el análisis decontenido apoyándose en la observación del investigador y el análisisdocumental, ya que el la técnica más usada, recopilando datos de la fuentesecundaria como libros, informes, y otros documentos que son indispensablescomo fuente de datos de toda investigación actual.4.6. Tratamiento Estadístico4.6. Diseño ExperimentalUnidad experimental (hoja de pepino)28
  • 29. LEYENDA:S1, S2, S3 : Solvente 1, 2, 3Θ1, Θ2, Θ3 : Tiempo 1, 2, 3T1, T2, T3 : Temperatura 1, 2, 34.6. Tratamiento EstadísticoDiseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial de 3x3x3.Ajuste de tukey (α =0.1)SASInterpretación de resultadosCAPÍTULO 5: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS5.1. Asignación de Recursos5.1.1. Recursos Humanos5.1.1.1. Personal de Apoyo29
  • 30. - Tabuladores- Programador de estadísticas5.1.1.2. Personal Especializado- Asesores- consultorías5.1.2. Recursos Materiales5.1.2.1. Equipos- Espectrofotómetro Smart Spectro- Balanza Analítica- Estufa- Computadora- Empacadora5.1.2.2. Materiales- Tamiz- Matraces- Fiolas- Micropipetas- Bolsas de polipropileno- Vasos de precipitación5.1.2.3. Reactivos- Etanol- Metanol- Colorante 2-6 diclorofenolindofenol- Folin- Cicoalteu30
  • 31. - 2,2- Diphenil-1-picrilhidracil (DPPH)5.1.2.4. InsumoHoja de pepino (Cucumis sativus L.).5.2. PresupuestoITEM Unidadesde MedidaCantidad PrecioUnitario s/.MontoTotal1) Elaboración del Proyectode tesis- Papel bond A4- Cuadernillo de Apunte- Internet- Lapiz- Lapiceros2) Adquisición de equipos ymateriales*Equipos- Espectrofotómetro- Balanza Analítica- Estufa- Computadora- Empacadora*Materiales- Tamiz- Matraces- Fiolas- Micropipetas- Bolsas de polipropileno- Vasos de precipitación31
  • 32. * Reactivos- Etanol- Metanol- Colorante 2-6diclorofenolindofenol- Folin- Cicoalteu- 2,2- Diphenil-1-picrilhidracil (DPPH)3) Elaboración del Informefinal- Papel bond A4- Impresiones- AnilladoTotal5.3. CronogramaMeses y SemanasActividadesOctubre Noviembre Diciembre EneroElaboración del Proyecto de32
  • 33. TesisRecopilación de DatosFuentes primariosRecopilación de DatosFuentes secundariosPresentación del Proyecto deTesisSustentación del Proyecto deTesisRecepción de Materia PrimaRecepción de Insumos yReactivosProceso de Cuantificación deactividad antioxidante, VitaminaC y Compuestos FenólicosRecopilación de DatosProcesamiento de DatosAnálisis de DatosElaboración de Informe FinalSustentación de Informe FinalCAPÍTULO 6: BIBLIOGRAFÍA1. Pratico D., Delanty N. (2000) Oxidative injury in diseases of the centralnervous system: focus on Alzheimer’s disease. Am. J. Med. 109: 577-5852. Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L (2006) Silvia KlinarB., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L. Evaluación de la actividadantioxidante de Lactuca sativa L. (Lechuga).3. FITOICA, Año 1- Número 1- Enero del 20064. María Serrano Maldonado. 2010. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDADANTIOXIDANTE PARA EL APROVECHAMIENTO DEL MUÉRDAGOQUE INFESTA LA ZONA CHINAMPERA DE XOCHIMILCO. México,D.F. julio5. Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino;AgroNet; Report of the cucurbit working group.33
  • 34. 6. Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino;AgroNet.7. Nee, 1993, p.29.8. Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.9. Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.10.Plants for a future: Cucumis sativus; AgroNet.11.Nee, 1993, p.28-29; Krístková et al., 2003, p.16-19.12.Centro de Investigación de Medicina Tradicional, Instituto deInvestigación, Facultad de Medicina Humana, Universidad San Martín dePorres.13.Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” Daño oxidativo,radicales libres y antioxidantes34