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    Rules of transgene Rules of transgene Presentation Transcript

    • VERSUCHSTIERKUNDLICHER BLOCKKURSEmbryotransferBlastozystentransferTransgene Tiere
    • TRANSGENE TIERE DefinitionenBegriff „transgen“erstmalig im Zusammenhang mit Labormäusen, in deren Genom fremdes genetischesMaterial mittels Vorkerninjektion übertragen wurde(Gordon JW, Ruddle FH; Science, 1981;214:1244-46)Gentechnisch modifizierter Organismen1. nach deutschem Gentechnikrecht (§3 GenTG, 1993): ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt mittels gentechnischer Verfahren: - Vorkerninjektion - homologer Rekombination - retroviraler Vektoren2. Palmiter und Brinster, 1985 (Transgenic Mice. Cell;41:343-345): Organismen, bei denen eine in vitro rekombinierte und experimentell übertragene DNA-Sequenz stabil ins Genom integriert ist und vererbt wird
    • Gesetzliche GrundlagenGentechnische Arbeiten:Die Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen.Die Vermehrung, Lagerung, Zerstörung oder Entsorgung sowie derinnerbetriebliche Transport gentechnisch veränderter Organismen....Gentechnikrecht Gentechnikgesetz (GenTG): Genehmigung des Betriebes der jeweiligen Anlage Gentechniksicherheitsverordnung (GenTSV) Sachkundenachweis für: Projektleiter Beauftragter für biol. Sicherheit §§ 15, 17 GenTSV
    • Tierschutzrechtliche Bestimmungen Tierschutzgesetz Herstellung und Haltung transgener Tiere Experimente mit transgenen Tieren1. Gewinnung von Embryonen: Organentnahme nach Töten der Spendertiere (ohne Superovulation!): nicht anzeige- oder genehmigungspflichtig2. Hormonelle Stimulation/Superovulation: für TVA als Halter und Züchter: eine biotechnolog. Zuchtmaßnahme für Wissenschaftler: im Rahmen Erstellung transgener Tiere genehmigungspflichtig!
    • Der Gentransfer:- Nutzung in vitro: kein Tierversuch § 7 Abs.1 TSchGhier aber: Weiterentwicklung zu lebenden Individuen zu Versuchszweckenalle notwendigen Tätigkeiten wie Superovulation Tötender Spendermäuse Gentransfer Vasektomie Embryotransfer Charaktersierunggenehmigungspflichtiger Tierversuch !4. Zucht/Haltung: Erlaubnis nach §11 TierSchG, Abschnitt1, Nr.1 TVA in Verbindung mit Anhang V der GenTSV5. Versuche mit transgenen Tieren: genehmigungs- oder anzeigenpflichtig
    • Techniken1. Mikroinjektion in den Vorkern (Maus) Herstellung klassischer Transgene: Expression zusätzlichen Gens2. Homologe Kombination in Embryonalen Stammzellen, (Maus) Herstellung von Knock out Tiere: Ausschalten Genfunktion3. Retrovirale Vektoren: zufällige Änderung im GenomHerstellung und Entwicklung transgener Tiere:Eingriffe an Embryonen unterschiedlichen Entwicklungsalters nötig Embryonen im 1 –2 Zellstadium Blastozysten
    • Embryonalentwicklung der Maus
    • Entwicklungsstadien der befruchteten EizellenTag 0.5 p.c. Einzeller Tag 1.5 p.c. ZweizellstadiumTag 2 p.c. Vierzellstadium Tag 2.5 p.c. Achtzellstadium Tag 3.5 p.c. Blastozyste
    • Gewinnung und Kultivierung von Embryonen bzw. Blaszozysten1. Superovulation der Spendertiere- ermöglicht höhere Ausbeute an entwickelten Eizellen- hormonell: PMSG (Pregnant Mare‘s Serum Gonadotropin) hCG (human chorionic Gonadotropin) 1. 5-10 IU PMSG i.p. nach 48 h 2. 5-10 IU hCG i.p. Zeitpunkt abh. vom Hell-Dunkel-Rhythmus des Tierraumes- nach hCG- Gabe Verpaarung- Kontrolle der Verpaarung: Kontrolle Vaginalpfropf- high ovulators z.B. C57BL/6- low ovulators z.B. BALB/c
    • 1. Spendertiere Embryonen: ausreichende Anzahl an Embryonen-Tiere: ♀ Alter 4-6 Wochen-Gewinnung der Embryonen an Tag 0.5 (Einzellstadium für Vorkerninjektion) an Tag 1.5 (2-Zellstadium für Hygienesanierung)2. Empfängertiere:Stämme: z.B. B6 x CBA F1 Hybriden, FVB Inzucht, NMRI Auszucht♀ Tag 0.5 – 1.5 ihrer PseudograviditätAnforderungen: Fellfarbenunterschied zwischen Empfänger- und Spendertier Empfängertiere sollten auch kleine Würfe großziehen3. Technik: Ovidukttransfer
    • Blastozystengewinnung:1. Spendertiere: zu beachten: - Fellfarbenunterschied zwischen ES-Zellen Spenderstamm und Empfängerstamm - Wirtsblastozyste geeigneter Empfänger für ES-Zelllinie - Manipulierbarkeit der Wirtsblastozyst - genügende Anzahl an injizierbaren Blastozysten - Superovulation bei 3 – 4 Wochen alter Tiere - Gewinnung der Blastozysten an Tag 3.5 2. Empfängertiere: ♀ Tag 2.5 ihrer Pseudogravidität3. Technik Uterustransfer
    • Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus-Töten der Tiere zum gewünschten Zeitpunkt 1- bzw. 2- Zell-Stadium: Tag 0.5-1.5 p.c. Blastozysten: Tag 3.5-4.5 p.c.- Entnahme von Eileiter: Gewinnung von Embryonen im1-Zell-Stadium Vorkerninjektion2-Zell-Stadium hygienische Sanierung- Entnahme von Uterus: Blastozystengewinnung Tag 3.5 p.c. ES-Zellen homologe Rekombination
    • Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus
    • a) Eileiterb) Uterus
    • Spülen des Eileiters
    • -überführen der Embryonen in M2-Medium -Spülen, ev. Zugabe von Hyaluronidase -Überführen in M16 Medium -Kultivieren über Nacht im Brutschrank möglich -Aufnehmen in Transferkapillare und M2-Medium -8-10/OviduktTransferkapillare mit Embryonen
    • Eileitertransfer
    • Uterustransfer
    • Vasektomie: Durchtrennung der Samenleiter Sexualverhalten aber noch vorhandenzur Erzeugung scheinträchtiger Weibchen: sexuell intakte Weibchen werden mit vasektomierten Männchen verpaart
    • 1. Mikroinjektion in den Vorkern:-Vorkerne: sichtbar in befruchteter Eizelle im Einzellstadium-befruchtete Eizelle: 2 Vorkerne 1 Polkörperchen-Injektion mittels Mikroinjektionsanlage in männlichen Vorkern-Fixation mittels Haltekapillare-Injektionskapillare durch Zona pellucida und Cytoplasma in Vorkern-Zugabe der DNA-Lösung (ca. 1-2 Picoliter) Anschwillen Vorkern-Waschen der Embryonen-Eileitertransfer
    • Vorkerninjektion:
    • 1. Mikroinjektion in den Vorkern
    • 2. Kultivierung Embryonaler Stammzellen für Blastozysteninjektion:ES von Mäusen = pluripotente Zellen gewonnen aus BlastocystenVorteil:Möglichkeit der gezielten Änderung eines Gens mit Hilfe homologer RekombinationIsolierung von ES Zellen:- aus Blastozysten- Embryonalstadium:Tag 3,5 Embryonalentwicklung- Entfernung des embryonalen Teils- Kultivierung der Zellen: auf Gelatine vorbehandelten Petrischalen enthalten Fibroblasten als Feeder- Schicht
    • DNA-Integration:- mittels Elektroporation Eintreten der DNA in die Zellen durch elektrischen PulsNachweis der homologen Rekombination-positive Selektion erforderlich-Verwendung eines Resistenzgens, z.B. Neomycin Resistenzgen-Selektion mit Geniticin-nach Selektion Isolierung der resistenten Kolonien-Injektion diese ES Zellen in Blastozysten Uterustransfer-Ergebnis: chimäre Tiere
    • Blastozysteninjektion/Injektion der ES-Zellen
    • 2. Blastozysteninjektion
    • 3. RetrovirusvektorenPrinzip: Infektion von Mausembryonen mit Retroviren durch Kontakt zwischenEizelle und Viruspartikel
    • Zucht/Zuchtaufbau1. Allgemeine Zielsetzung bei der Zucht transgener Tiere:- Keimbahnübertragung- stabile Integration des Transgens-Ausgangstier: transgenes Foundertier2. Rückkreuzung auf einen anderen genetischen Hintergrund (z.B. von 129 Sv auf C57BL/6)Problem: - starke Reduktion des Transgens möglich - Erreichen des gewünschten genetisch. Hintergrunds nach 10 GenerationenVorteil: Wurfgeschwister als Kontrolltiere nicht mehr notwendig
    • Vorkerninjektion:
    • ES-Zellen
    • Generationenverlauf bei einer Rückkreuzung: Genomische Homogenität und Heterogenität im Verlauf
    • Haltung und TransportHaltung:- Haltung und/oder Zucht gentechnisches Arbeiten- nur in behördlich zugelassenen gentechnischen Anlagen- Sicherheitsstufen (S1-S4, i.d.R. S1, S2)Empfängerlabor:- personelle und räumliche Vorraussetzungen (nach GenTG, GenTS-VO)Transport:- innerbetrieblich, zwischenbetrieblich- geschlossene Behälter, bei Bedarf doppelwandig- Käfig/Box gegen Bruch gesichert- Transportrisiken: Gefährdung des Personals Entfliehen transgener Tiere
    • Nomenklatur gentechnisch modifizierter Stämme:Transgene LinienTargeted Mutation (Knock out)Targeted Mutation (Double Knock out)Targeted Mutation (Knock in)-Symbol für Transgene: 1. Tg für Transgen 2. Offizielles Gensymbol der intergrierten DNA 3. Laborlinie/Gründerbezeichnung/fortlaufende Nummer 4. Registrierter Laborkode des UrsprungslaborsTgX = die angewandte transgene TechnikTgN = nicht homologe Insertion (Vorkernmikroinjektion)TgR = Insertion über retrovirale VektorenTgH = homologe Rekombination (ES-Zellen)
    • 1.Beispiel: Transgene Linien (Mikroinjektion):C75BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg:der CD8 Klon aus dem humanen Genomintegriert in C57BL/6 Mäuse aus dem Jackson Laboratory23. Maus, die im Labor von Jon W. Gordon etabliert wurde2. Beispiel: Targeted Mutation (Knock out) B6.129P2-TgHCftrtm1Unc: tm = targeted mutation Ziffer = Anzahl der gerichteten Mutation Laborcode erste gerichtete Mutation im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator homolog der University of North Carolina unter Verwendung von 129P2 ES Zellen, rückgekreuzt auf C57BL/6; RK noch nicht abgeschlossen, . RK abgeschlossenInzuchtmaus: z.B. C57BL/6 = C57BL/6NCrlAuszuchtmaus: z.B. NMRI = Crl:NMR(Han)
    • Einflussfaktoren auf den Phänotyp transgener Tiere (nach Rülicke und Mertens, 1999)genetische Faktoren Interaktion nichtgenetische Faktoren (biotische, abiotische Umwelt)direkte Wirkung indirekte Wirkung(Mutation) (genet. Hintergrund)Integrations-stellenAnzahl KopienStruktur des Transgens PHÄNOTYP
    • Auswirkung gentechnischer Manipulation- abhängig vom transgenen Modell- abhängig vom genetische Hintergrund- betroffen können sein: Wohlbefinden, Lebensfähigkeit, Fertilität, Phänotyp Genetischer Hintergrund: Beispiel: IL2 Knockouts* Linie genetischer Hintergrund Phänotyp B6;129-IL2tm gemischt: 50% Todesrate bei 4-9 Wochen C57bl/6 Splenomegalie, Anämie 129P2/OlaHsd B6.129-IL2tm C57BL/6 congen Tod im Alter von 3 – 6 Monaten hämolytische Anämie C3.129P2-IL2tm C3H/HeJ congen Tod im Alter von 7 Wochen hämolytische Anämie *Linder, 2001
    • Bedeutung Maus: Transgene Mausmodelle idealer Modellorganismus für genetische Analysen bei Säugern durch:- physiologische Ähnlichkeit zum Mensch- hohe Fruchtbarkeit schnell produzierbar- kurzes Generationsintervall- geringer Platzbedarf Bedeutung für Humangenetik durch umfassende genetische Charakterisierung der MausEinsatz zur:Aufklärung molekularer Ursachen von Krankheiten-Strategieentwicklung für Therapie-Gentherapie-Testsystem für toxikologische Untersuchungen(Abbildungen aus:Hogan et al. 1994. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor (NY)