Caso 6

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Caso 6

  1. 1. INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR 1. Identifique y/o los problemas de salud ᵌ Leucocitosis ( 16 000 / mm ) Anemia (9.5 mg / dl) ᵌ Trombocitopenia (90 000 / mm ) lo cual trae como consecuencia epistaxis y equimosis. 2. Analice en este problema la relación del desarrollo del los linfocitos B en este trastornoLa leucocitosis se ve reflejada en la acumulación de linfocitos B neoplasicos, ocacionando unadisminución en el desarrollo de la serie mieloide, que salta la vista con la anemia (Hb baja por menornúmero de eritrocitos) y trombocitopenia (menor número de plaquetas las cuales causa la epistaxis yequimosis) 3. Analice en este problema la competencia de los linfocitos B en este trastorno y su respuesta en la inmunidad adaptativa humoralEl aumento de los linfocitos B neoplásicos se van a infiltrar y activar en los diversos tejidos ocasionandoesplenomegalia, adenomegalia y hepatomegalia. Además la respuesta humoral de los linfocitos B puedeocasionar una anemia hemolítica autoinmunitaria, ya que las producciones de anticuerpos reconocerána los glóbulos rojos como cuerpos extraños. 4. Explique las consecuencias de este trastorno del desarrollo de los linfocitos BLa leucemia linfocítica causa un incremento lento en el número de glóbulos blancos llamadoslinfocitos B o células B en la médula ósea. Las células cancerosas se diseminan desde la médulaósea hasta la sangre y también pueden afectar los ganglios linfáticos y otros órganos como elhígado y el bazo. Este tipo de leucemia finalmente provoca insuficiencia de la médula ósea,ocasionando bajos conteos sanguíneos, y debilita el sistema inmunitario.
  2. 2. BMP-6 inhibe el crecimiento de células B maduras humanos; inducción de lafosforilación y Smad upregulation de Id1BioMed CentralChristian Kersten (christian.kersten @ sshf.no) [1], Einar A Sivertsen (einar.sivertsen @labmed.uio.no) [1], Marit E Hystad (mehystad@ulrik.uio.no) [1], Lise Forfang (lise.forfang @labmed.uio.no) [1], Erlend B Smeland (erlend.smeland @ labmed.uio.no) [1], junio HMyklebust (junehm@ulrik.uio.no) [1][1] Department of Immunology, Institute for Cancer Research, The Norwegian RadiumHospital, Montebello, 0310 Oslo, Norway[2] La Facultad División noruega Radium Hospital de la Universidad de Oslo, NoruegaCopyright © 2005 Kersten et al; licenciatario BioMed Central LtdResumenAntecedentesProteína morfogenética de hueso (BMPs) pertenecen a la superfamilia de TGF-β y sesecretan proteínas con funciones pleiotrópicas en muchos diferentes tipos de células. Unpapel potencial de BMP-6 en el sistema inmune ha sido implicado en diversos estudios delos malignos y las enfermedades reumáticas. En el presente estudio, hemos explorado elpapel de BMP-6 humano normal en la sangre periférica de células B.ResultadosLas células B se encontraron para expresar BMP tipo I y tipo II y los receptores BMP-6inducida rápidamente fosforilación de Smad1/5/8. Además, la fosforilación de Smad fueseguido por upregulation de Id1 mRNA y proteína Id1, Id2 y que Id3 expresión no se vioafectada. Además, se encontró que BMP-6 tuvo un efecto antiproliferativo en tanto ingenuo(CD19 + CD27 -) y la memoria de las células B (CD19 + CD27 +) estimulados con anti-IgMsolo o la acción combinada de IgM y anti-CD40L. Además, el BMP-6 induce la muertecelular en las células B de memoria activada. Es importante destacar que el efectoantiproliferativo de la BMP-6 en las células B fue completamente neutralizado por elantagonista natural, noggin. Además, las células B se demostró que upregulate BMP-6 mRNA a la estimulación con anti-IgM.ConclusiónEn las células B maduras humanos, BMP-6 inhibe el crecimiento celular, y rápidamenteinducida por fosforilación de Smad1/5/8 seguida de un upregulation de Id1.
  3. 3. AntecedentesLos miembros del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) superfamilia teniendoimportancia fundamental en el control de la proliferación celular, la diferenciación, lamigración y la apoptosis [1]. Estas citocinas pueden dividirse en tres subgrupos: TGF-β, laactivinas / inhibins, y las proteínas morfogénica de hueso (BMPs), de los cuales este últimoconstituyen la familia más grande. 30-38 kDa BMPs son hetero-o homodimeric proteínasidentificadas inicialmente por su capacidad de inducir ectópica de cartílago y la formaciónde hueso [2, 3]. Varios estudios han demostrado una función esencial de estas proteínasdurante la embriogénesis, y más recientemente, también en tejidos adultos [1]. TGF-β hasido intensamente estudiado, en condiciones normales y malignas de las célulashematopoyéticas y es uno de los más potentes de los reguladores endógenos negativosconocidos a la fecha. [4]. En cambio, el efecto de BMPs en el sistema inmunitario no hasido ampliamente investigado. En ese sentido, BMP-2, -4 y -7 se han encontrado para elcontrol de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas [5] y principios dedesarrollo de las células T [6, 7]. BMP-6 se ha informado a reducir el número de adoquinesde la zona de formación de las células de las células hematopoyéticas normales humanos[8]. Por otra parte, BMP-2, -4, 6 y -7 tenido un antiproliferativo y un efecto proapoptóticosobre el mieloma múltiple las células [9 - 11]. Además, por la expresión de genes deperfiles, BMP-6 aumentó significativamente el valor predictivo para una firma de variosgenes de prueba y se asoció con un mal resultado en difusas los linfomas de células Bgrandes (LBDCG) [12].BMP-6, al igual que los demás miembros de BMP, y las señales a través de la ligadura deheterodimerzation BMP tipo I [activin-como-kinasa (ALK)] y del tipo II threonine kinasaserina-receptores, que posteriormente se propaga la señal abajo por fosforilantes proteínasSmad. BMP-6 puede señal a través de la ligadura de los receptores tipo I de la Ley RIA,BMP-RIA, y BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-RII, Ley-RIIA-RIIB y de la Ley, quellevan a la fosforilación de los receptores Smads (Smad-1, Smad-5, y Smad-8). El R-Smadsentonces forman complejos con el co-Smad (Smad4) y se trasladaron en el núcleo en elque ejerza la regulación de genes [1, 13].Dada la función informó de BMP-6 en células B malignas y células progenitorashematopoyéticas, quisimos explorar su papel potencial en humanos de células B normales.Se estudiaron los efectos de BMP-6 en la proliferación y la apoptosis en reposo yestimulado células B. Además, la expresión de los receptores BMP y BMP-6 inducida por laactivación de la vía de señalización Smad con la consiguiente regulación de los genesdiana Id1-Id4, se resolvieron. Finalmente, se investigó si las células B también son capacesde producir BMP-6.ResultadosBMP-6 inhibe inducida por IgM anti-proliferación de las células BhumanosLos efectos de BMP-6 normales y neoplásicas en células hematopoyéticas, nos llevó ainvestigar los efectos de BMP-6 en las células B normales humanos. Todos los
  4. 4. experimentos en este estudio fueron realizadas en el marco de suero libre de condicionesque los FCS se ha demostrado que interfiere con la señalización BMP-[14] (propiasobservaciones). Para estudiar el efecto de las BMP-6 en la proliferación, las células B devoluntarios sanos fueron estimuladas con anti-IgM y / o CD40L en la presencia o ausenciade BMP-6 durante tres días. Se encontró que BMP-6 condujo a una reducción media del35% de IgM anti-síntesis de ADN inducida (n = 8; p ≤ 0,0002, Figura 1A]. Se obtuvieronresultados similares para las células B tratados con anti-IgM y CD40L (26% de reducciónmedia, n = 6, p ≤ 0.023). El BMP-6 inducida por la inhibición de la proliferación esdependiente de la dosis en los dos células B periféricas (Figura 1B] y el linfoma de BurkittRamos línea celular (40% de reducción de la síntesis de ADN, la figura1C]. El BMP-6efectos podrían ser contrarrestados por la adición de un inhibidor extracelular Noggin(Figura 1D]. Del mismo modo, una combinación de los receptores solubles BMP BMP-RIB-BMP-Fc y Fc RII-también neutralizar los efectos de BMP-6 (datos no presentados). Acontinuación, queríamos probar si BMP-6 tienen diferentes efectos sobre ingenuo y célulasB de memoria. Naïve (CD19 + CD27 -) y la memoria (CD19 + CD27 +), células B se aislaronde sangre periférica de células de la clasificación de immunobead-aisladas célulasCD19 + B [15], y la prueba de su capacidad de proliferar en presencia de BMP - 6. Sinembargo, BMP-6 inhibido IgM anti-síntesis de ADN inducida en las dos subpoblaciones auna medida similar, con una media de reducción de la síntesis de ADN de 45% (n = 5, p ≤0.004) para ingenuo células B y 48% (n = 5, p ≤ 0.001) de las células B de memoria(Figura 1E].BMP-6 induce la muerte celular en las células B de memoriahumana y células RamosA continuación, hemos querido establecer si BMP-6 también podría afectar a la viabilidadde las células B normales. Viabilidad celular se determinó por yoduro de propidio (PI),después de la tinción de la cultura, con o sin BMP-6 durante 48 horas. Curiosamente, BMP-6 mostraron una pequeña pero reproducible aumento medio de la muerte de la célula del17 al 23% (n = 5, p ≤ 0.003) en estimulado IgM anti-CD27 + células B de memoria. Por otraparte, Ramos células mostró un incremento medio en la muerte de la célula del 20 al 50%(n = 3, p <0001, la figura 3] BMP-6 después del tratamiento. En cambio, la muerte de lascélulas CD19 + del total de células (n = 6, p ≤ 0,32; datos no presentados) o CD27 - IgG - ingenuo células B no se vio afectada significativamente (n = 5, p ≤ 0,65, la figura 2 ).Humanos células B expresan receptores BMP-6El conocimiento detallado acerca de la expresión de diferentes receptores de BMP encélulas B no está disponible actualmente. Para aclarar aún más el papel de los BMPshumanos en las células B, se realizó occidental blot para el tipo I y tipo II receptores BMP.Este análisis reveló que la Ley de los receptores tipo I-RIA, BMP-RIB y el tipo II dereceptores BMP-IRD y de la Ley de RIIb se expresan en reposo humanos de células B(Figura 4]. Ramos células expresaron la Ley de los receptores tipo I-RIA, débilmente BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-IRD, pero más débilmente de lo normal de células B(Figura 4]. HL60 células fueron utilizados para la comparación y débilmente expresado Ley-RIA y BMP-RII.
  5. 5. En conjunto, estos datos muestran que las células B normales humanos y Ramos célulasexpresan un conjunto de los receptores BMP, previamente de obligar a BMP-6 [16].BMP-6 induce la fosforilación de Smad1/5/8Al vinculante ligando, el receptor transphosphorylates tipo II y tipo I activa el receptor. Tipo Ipuede receptores de señales a través de varias vías. Se examinó el efecto de las BMP-6en la fosforilación Smad, como la activación de Smad se considera como una importantevía de señalización por BMPs [17]. B células se cultivaron en el suero libre de los mediosde comunicación durante la noche y luego tratadas con BMP-6 para varios tiempos.Proteínas totales se prepararon lisados, y los importes de las formas de fosforiladosSmad1/5/8 fueron determinados por el oeste blot. Curiosamente, el tratamiento con 500 ng/ ml BMP-6 induce la fosforilación de Smad. El BMP-6 induce la fosforilación fue elevado ala mayor brevedad punto a prueba (15 minutos), y se mantuvo alta durante al menos 48horas (Figura 5]. Una fosforilación similar se observó en células Ramos, pero no en célulasHL60 (Figura 6]. Además, la prueba también conocida abajo si otras vías de señalizaciónde BMP-6 podría ser activado por BMP-6 en las células B humanos. Sin embargo, noobservamos cambios significativos en el nivel de fosfato STAT3 o fosfato p38 a BMP-6tratamiento de las células B (datos no presentados).BMP-6 induce upregulation de Id1A continuación, queríamos explorar si la BMP-6 induce la fosforilación de Smad 1/5/8también podría inducir cambios transcripcional de genes diana. En este sentido, losinhibidores de las proteínas de ADN obligatorio (ID) se consideran algunos de losprincipales destinatarios de los genes de señalización Smad [17]. Por lo tanto, las células Bse pre-incubaron durante la noche en VIVO X-15, y luego cultivadas en el medio por sísolas o en presencia de BMP-6 para varios tiempos antes de la preparación del total deARN. El importe de Id1-Id4 ARNm se cuantificó en tiempo real RT-PCR. Curiosamente, seobservó una específica de cuatro veces upregulation de Id1 mRNA en BMP-6-B, las célulastratadas (Figura 7]. La sobre regulación de mRNA Id1 era característica de una tempranade genes inducibles, con upregulation máximo dos horas después de la adición de BMP-6 yregresó a la línea de base después de 24 horas. En cambio, no se observaron cambiossignificativos para Id2 y Id3 ARNm, mientras que Id4-transcripciones no eran detectables(Figura 7, los datos no presentados).Western blot reveló que el BMP-6 inducida upregulation de Id1 mRNA también secorrelacionó con upregulation de proteína Id1 también. El aumento en el nivel de proteínaId1 fue detectable después de una hora y el aumento de hasta 24 horas después de BMP-6Además, que muestran un 16 veces upregulation comparación con t0 (p ≤ 0,020, n = 4)(Figura 8 y 9]. De acuerdo con el ARNm de datos, no en consonancia cambio en lacantidad de Id2 y Id3 proteína se observó (Figura 8 y 9]. Hemos sido capaces de bloquearla Id1 específicas banda con un bloqueo de péptido (datos no presentados). En conjunto,estos datos sugieren que Id1 podría ser un posible objetivo de genes para mediar losefectos de BMP-6 en las células humanas B, mientras que Id2 y Id3 no parecen estarinvolucrados.
  6. 6. BMP-6 en la producción de células BEl hecho de que BMP-6 se ha informado a actuar como un estimulador autocrino encondrocitos [18] y ovarium [19], nos llevó a investigar si las células B normales humanospodría producir BMP-6 a la estimulación. Ramos células, que se han descrito paraexpresar BMP-6 mRNA endógena [20], y la línea celular Jurkat T, sirvió como controlespositivos y negativos, respectivamente. Endógena BMP-6 niveles de mRNA en las célulasB normales se han cuantificado en tiempo real RT-PCR después de la estimulación conanti-IgM para diferentes puntos temporales. Curiosamente, la sobre regulación de BMP-6 mRNA fue característica de la pronta a intermedio de genes inducibles con máximaupregulation cuatro horas después de la adición de anti-IgM. El nivel de BMP-6 mRNA fuede nuevo a la base de referencia después de 24 horas tras la estimulación (Figura 10].Además, ambos FCS y humanos AB-suero se asociaron con una upregulation de BMP-6 mRNA (Figura 11]. Curiosamente, en otro estudio hemos encontrado que las células Thumano normal no expresan BMP-6 mRNA después de la activación (Sivertsen et al,manuscrito en preparación). A continuación, hemos querido detectar las proteínas BMP-6en las células B normales y probado diversos anticuerpos disponibles comercialmente. Sinembargo, en nuestras manos estos anti-BMP-6 anticuerpos no sólo reconocer larecombinante de proteínas BMP-6 y no la proteína nativa.DiscusiónEstudios recientes han demostrado un importante papel de los miembros de BMPsuperfamilia de las células madre hematopoyéticas, a principios timocitos [6, 7], y células Bmalignas [8, 11, 12], pero una función para BMPs humanos normales en células B no hasido previamente . El presente estudio demostró un significativo efecto antiproliferativo dela BMP-6 en la sangre periférica de células B CD19 +. Además, el BMP-6 inducida por lamuerte de las células CD27 + en las células B de memoria, así como en una línea celularde linfoma de Burkitt (Ramos). Es importante destacar que, BMP-6 indujo una rápida ynotable aumento de la fosforilación Smad-1/5/8. Además, el BMP-6 inducida Smadfosforilación fue seguido por una selectiva upregulation de Id1 mRNA y la posterior Id1proteína.En el presente estudio, el demostrado efecto antiproliferativo de la BMP-6 en el tratamientode IgM anti-células B fue significativa y dependiente de la dosis. Es importante destacarque el efecto anti-proliferativo de BMP-6 podría ser completamente neutralizadas por el usode un inhibidor natural, Noggin. Esto está en consonancia con otros, que muestran queNoggin puede funcionar como un antagonista de BMP-6 [21, 22]. Además, la combinaciónde soluble BMP-RIB-BMP-Fc y Fc RII-proteínas de fusión también neutralizar el efecto anti-proliferativo de BMP-6 en las células B humanos. Curiosamente, como para otrosmiembros de la familia TGF, bifuncional efectos también se han demostrado para losBMPs. Considerando que varios de los BMPs se ha demostrado que promover laproliferación en diversos tipos de células incluyendo condrocytes [23], [24] el hígado y lascélulas de la granulosa [25], antiproliferativa y efectos de inducción de la apoptosis ha sidoreportado en B y las células T linaje. Efectos similares como se demuestra por BMP-6 enlas células B humanos en el presente estudio, se demostró por BMP-2, 4, 6 y -7 en célulasde mieloma humano [9 - 11]. Otros miembros de la familia BMP-También se ha informado
  7. 7. de inducir la apoptosis, incluyendo ratón en el linaje de células B [26]. Además, BMP-4inhibe la proliferación thymocyte [6]. En conjunto, estos datos sugieren que el papel de losBMPs en la regulación de la proliferación y la apoptosis de células tipo es altamentedependiente.Para examinar la forma en BMP-6 ejerce sus efectos funcionales en las células B,analizamos la expresión del receptor de BMP occidental blot. Humanos de las células Bperiféricas se encontraron para expresar el BMP Ley de los receptores tipo I-RIA y BMP-RIB, y la tipo II y los receptores BMP-IRD y de la Ley RIIb-, que después de la señal devarios BMPs vinculantes, incluyendo BMP-6 [16, 13]. Para seguir estudiando BMP-6inducida de señalización, de la activación de varios trayectos es posible. La principal vía deseñalización se conoce hasta el momento, es la activación de los R-Smads [13, 27]. En esesentido, BMPs han demostrado ejercer efectos antiproliferativos en células B linaje a travésde la fosforilación de Smad-R [11, 28]. Además, el BMP-2 se ha demostrado que induce laactivación de STAT3 en células de mieloma [9]. Sin embargo, la fosforilación de R-Smadno se investigó en ese estudio. BMP-2 también ha demostrado inducir la fosforilación dep38 [29]. Por lo tanto, la fosforilación de p38, STAT3 y Smad1/5/8 BMP-representanimportantes vías de señalización mediada que los efectos de los BMPs e incluso hablarcruzadas entre estas vías se ha comunicado [29, 30]. En el presente estudio, no hemospodido detectar BMP-6-inducida por los cambios en el estado de fosforilación de la STAT3o p38 en células B periféricas humanos. En lugar de ello, una rápida y marcada defosforilación de Smad1/5/8 fue revelado. En un estudio paralelo, hemos encontrado queotras BMPs también indujo la fosforilación de Smad1/5/8 periférica en células B (datos nopresentados). Estamos actualmente estudios de microarrays para identificar las vías deseñalización y de genes objetivo diferente que se rige por las diferentes BMPs humanos encélulas B.Upregulation de Id1 través Smad1/5/8 fosforilación es un mecanismo conocido para BMP-6señalización en otros sistemas celulares [31, 32] y la regulación de las proteínas Id-sepiensa que es un mecanismo importante para Smad de señalización [17]. En el presenteestudio, en tiempo real RT-PCR experimentos reveló un cuádruple upregulation para Id1enBMP-6-B, las células tratadas, en tanto que la suma de Id2-Id4 sigue siendo la misma. Deacuerdo con este, el oeste blot demostró una upregulation de proteína Id1, mientras que lacantidad de Id2 y Id3 los niveles de proteína se mantuvo sin cambios. Anteriormente, Id1 seha considerado que no se expresa en las etapas posteriores de desarrollo de las célulaspro-B [33, 34], y su expresión constitutiva ha informado de que afecte el desarrollo de lascélulas B del ratón [35]. Por lo tanto, nuestra demostración de la función del tiempoupregulation de Id1 ARNm y proteínas en la madurez normal de las células B humanos esde particular interés. En este sentido, cabe destacar que la señalización TGF-β y madura aprincipios de células B induce tanto Id2 y Id3 expresión [36, 37], pero no Id1 (datos nopresentados). Curiosamente, estos resultados ponen de manifiesto que varios miembros dela familia TGF-β regulan ID de proteínas diferente. Id2 y Id3 se consideran principalmenteel ID de proteínas expresadas en las células B maduras [38]. El presente estudio tambiénencontró Id2 y Id3 proteína en las células B, que se expresó más que Id1 células B enreposo. Sin embargo, BMP-6 no indujo cambios significativos en la expresión de la proteínade Id2 y Id3. Se cree que las proteínas Id bloque de promover la proliferación ydiferenciación en diversos tipos de células [39, 33]. Id proteínas actuar como dominantenegativo de los inhibidores de E-Pax5 función de las proteínas y por la formación de
  8. 8. dímeros con estas proteínas, lo que los hace incapaces de obligar a ADN. Se ha propuestoque el equilibrio entre E-proteínas, y Pax5 Id proteínas podrían tener un papel importanteen activar células B [38]. En ese sentido, E-proteínas han estado implicados en lapromoción y la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de células en diferentespuntos de linfocitos en desarrollo [40]. La muerte y antiproliferativa efecto inductor de BMP-6 en las células B, con la consiguiente upregulation de Id1 proteína es, por lo tanto, enlínea con la opinión de que la ID de proteínas son necesarios para la inducción de ladetención del crecimiento y la apoptosis de los linfocitos B-progenitores por TGF-β [40 ].Además, la ID de proteínas se conocen como partes importantes de vías de señalizaciónimplicadas en el desarrollo, ciclo celular y tumorigénesis [32]. Es bien sabido que variosmiembros de la familia Id se sobreexpresa en una variedad de tumores humanos y, engeneral, Id1 parece ser el miembro de la familia que más se sobreexpresa en una variedadde tumores malignos humanos [41], incluyendo el mieloma múltiple [42, 32] . Además,nuestras conclusiones de que BMP-6 activa vías de señalización intracelular en las célulasB humanos podría ser de potencial importancia fisiopatológica en el linfoma y lainflamación. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG Se ha demostrado que secorrelaciona con resultados desfavorables [12]. En este sentido, es de interés que laexpresión de Id1 dirigidos a los linfocitos B-aberrante resultado en el desarrollo de lascélulas B, la apoptosis masiva, y el posterior desarrollo de linfomas de células B [35]. Porotra parte, BMP-6 ha sugerido que desempeñar un papel en la artritis reumatoide (AR)[43, 44] y niveles elevados de Id1 y Id3 se han encontrado en la synovia de la AR-pacientes[45]. En conjunto, estos resultados apuntan a un papel importante para el ID de proteínasen la regulación de la homeostasis de células B normales y en las enfermedades, en dondelas células B están implicadas. Por lo tanto, será aún más importante para dilucidar el papelde Id-1 en humanos de células B selectivo por más de la inhibición de la expresión o Id-1 laexpresión génica.Teniendo en cuenta el rol de BMP-6 en las células B maduras humanos demostrado aquí,la identificación de BMP-6 la producción de las células in vivo con la posibilidad deinteracción con la ingenua y la memoria células B podría contribuir a la comprensión de labiología de células B maduras. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG se ha detectadopor la expresión de genes de perfiles [12]. Además, la producción de BMP-6 transcripciones de las células B normales activado se detectó en el mismo estudio. Denota, un autocrina BMP-6 bucle ha sido informado por otros en los condrocitos y en elovarium [46, 19, 18]. Por lo tanto, hemos querido explorar la posibilidad de que unautocrina BMP-6 bucle de las células B en humanos. Analizamos la expresión de BMP-6 mRNA en la sangre periférica de células B por PCR en tiempo real, y aquí el informe deupregulation endógeno BMP-6 transcripciones después de la estimulación con FCS, suerohumano AB-y, lo que es más importante, anti-IgM. Sin embargo, nuestros intentos deestudio BMP-6 niveles de proteína no tuvieron éxito debido a los problemas coninespecíficos vinculante de la anti-BMP-6 a prueba de anticuerpos, y la falta de tinciónespecífica en el control de las células conocidas para expresar BMP-6 mRNA. Por elcontrario, la proteína recombinante fue fácilmente detectado. En ese sentido, algunosinvestigadores han detectado proteínas BMP-6 en los seres humanos, sobre todo en eltejido no patógena. La posibilidad de BMP-6 humanos en la producción de las células Bestá en línea con un trabajo reciente que informó de la producción de BMP-6 en las célulasB del ratón, la infiltración de la médula ósea de ratones con artritis inflamatoria [43]. En este
  9. 9. estudio, un papel para inflammatoric BMPs en el proceso de la artritis se sugirió. Elupregulation del BMP-6-después de las transcripciones IgM-crosslinking es fisiopatológicosde interés [12]. Una pérdida de TGF-β-respuesta ha sugerido a ser una contribuciónfundamental para la transformación maligna [47, 48] y similares mecanismos oncogénicosse han postulado para BMPs. Líneas de pruebas [49] sugieren que en las primeras etapasde la carcinogénesis, BMP-6 no es un promotor del tumor, pero suprime los tumoresbenignos y malignos resultado. Estos resultados están en buen acuerdo con resultadosanteriores de otros TGF-β miembros de la familia, incluido el TGF-β1, y BMP-4 [50], lo queindica que celulares BMP contexto de la meta de células podría definir los diferentesefectos observados. En contraste con el upregulation BMP-6 de transcripción en las célulasB, no hemos podido detectar BMP-6 transcripciones en sangre periférica humana CD4 + océlulas T CD8 + (reposo o estimulación con anti-CD3 y anti-CD28; datos no Muestra), enconsonancia con las conclusiones de líneas de células T [20] y de las células T en ratones[43]. Otras posibles fuentes de BMP-6 para madurar las células B in vivo pueden ser otrascélulas del sistema inmunitario o de tejidos con el contacto con el sistema hematopoyético.Una fuente bien reconocida por BMP-6 es la producción de huesos humanos y de lamédula ósea estroma [51, 8]. Por otra parte, cabe destacar que la vena umbilical humanacélulas endoteliales (HUVEC) altamente expresar BMP-6 mRNA [52], y el endoteliovascular ha informado a producir BMP-6 [53]. Estos estudios podrían implicar un papel paraBMP-6 en transendothelial migración de las células B. BMP-6 mRNA se ha demostrado enlíneas celulares de macrófagos murinos, pero no en los seres humanos [54]. De acuerdocon estos resultados, otras líneas celulares humanas de los neutrófilos y monocitos origense han descrito como negativa para el BMP-6 transcripción [20]. Que sepamos, no hayactualmente ningún informe acerca de BMP-6 producción de las células dendríticashumanas.ConclusiónEn conclusión, nuestros resultados muestran que BMP-6 induce la activación de laseñalización intracelular Smad maduras en humanos de células B consecutivos con laproducción de la proteína Id1. Además, nos informan de que BMP-6 tiene un efectoantiproliferativo en células B estimuladas con anti-IgM solo o la acción combinada de IgM yanti-CD40L. Además, el BMP-6 induce la muerte celular en las células B de memoriaactivada y Ramos células. En conjunto, estos resultados proporcionan un fundamento deexaminar más a fondo la función de señalización de BMP-6 en células B normales de labiología, así como en condiciones patológicas como células B malignas y trastornosautoinmunes.MétodosCultivo de célulasSi no se especifica, todas las células se cultivaron en VIVO X-15 ™ (BioWhittaker, Verviers,Bélgica) en suero libre de medio a 37 ° Cy 5% de CO 2 en el aire.Sangre periférica fue proporcionada por el Banco de Sangre en el Hospital Regional deBuskerud con el acuerdo formal por los pacientes, y la aprobación por el comité
  10. 10. de éticaregional. Altamente purificada descanso humanos de los linfocitos B (célulasCD19 +) fueron aisladas de la sangre periférica por rosetting inmunomagnética con piedras(Dynabeads M450; Dynal, Oslo, Noruega), tal como se describe [55]. Este procedimientoproduce menos del 0,5% de las células T, las células NK 0,1%, 0,5% y monocitos comojuzgados por la tinción de inmunofluorescencia indirecta.Las siguientes líneas de células humanas de neoplasias linfoides se mantuvieron en RPMI1640 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) suplementado con 10% de suero fetalbovino (FCS), 100 unidades / ml penicilina G, y 100 unidades / ml de sulfato deestreptomicina, pero - Suero de hambre durante al menos cuatro horas y cultivadas enVIVO X-15 ™ cuando se incluyen en los experimentos: EBV negativos-BL líneas celularesRamos (ECACC 85030802), HL60 (JCRB0085).Factores de crecimiento / suplementosLos siguientes son los reactivos utilizados en las concentraciones indicadas: recombinantehumana (rhu) BMP-6 (1 μ g / ml, si no se especifica otra cosa), rhu BMP-RIB/ALK-6/FcQuimera (5 μ g / ml), rhu BMPR - II / Fc Quimera (5 μ g / ml), y el ratón Nogginrecombinante (5 μ g / ml) fueron adquiridos de los sistemas de I + D (Abingdon, ReinoUnido); Anti-IgM F (ab) 2 fragmentos de anticuerpos policlonales de conejo a la cadenapesada de IgM (37,5 μ g / ml) se obtuvo de Dako, Copenhagen, Dinamarca y rhu CD40ligando (CD40L, 10 ng / ml) fue un regalo de Immunex Corp (Seattle, WA).Los anticuerpos utilizados para el análisis de citometría de flujo yanálisis de inmunoblotAnticuerpos humanos contra la Ley de los receptores BMP-RIA-, BMP-RIB, BMPR-II, la Leyy la Ley-RIIA-RIIb se compraron de R & D Systems (Abingdon, Reino Unido). Detección dela BMP-6-proteína se ha probado con los siguientes anticuerpos: cabra policlonal anti-BMP-6 (Santa Cruz, San Diego, CA, EE.UU.), mouse monoclonal anti-BMP-6 y cabra policlonalanti-BMP-6 De R & D Systems (Abingdon, Reino Unido), y mouse monoclonal anti-BMP-6(Chemicon International Inc, Temecula, CA, EE.UU.).BMP-Caracterización de vías de señalización se hace mediante el uso de anti-fosfatoSmad1, -5, y 8-anticuerpo policlonal (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). Los niveles deexpresión de Id1-3 proteínas se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo y ladetección fue bloqueado con el bloqueo péptido Biotecnología de Santa Cruz (Santa Cruz,San Diego, CA, EE.UU.). Como secundaria de anticuerpos anti-ratón sirve, la lucha contrala cabra o IgG anti-conejo-peroxidasa de rábano (HRP) de Dakocytomation AS(Copenhague, Dinamarca) para el análisis de inmunoblot. Anti-β-actina fue de Santa-Cruz.De Becton Dickinson (San Jose, CA), que compró anti-CD19-PE, anti-CD19-FITC. Losanticuerpos utilizados para la selección de células CD19 eran anti-PC5 de Immunotech SA(Marsella, Francia) y anti-CD27 PE de Becton Dickinson, Pharmingen Biosciences (SanDiego, CA, EE.UU.).Cell sorting
  11. 11. Altamente purificada CD19 + CD27 - o CD19 + CD27 + células se obtuvieron mediante latinción de células CD19 + con anti-CD27 y CD19 PE PC5 mAbs durante 30 minutos a 4 ° C,seguido de un lavado con PBS y la clasificación sobre FACS DiVa de Becton Dickinson.Western-blotB células de sangre periférica o de las líneas de células cultivadas fueron lisadas en bufferde lisis (10% de glicerol, β-mercaptoetanol 5%, 0,0625 M Tris-HCL [pH 6,8], dodecil sulfatode sodio [SDS] 2,5% w / vol). Proteínas totales (30-100 μ g) de cada muestra, se haejecutado el 10% o 12% SDS / poliacrilamida (SDS / PAGE) geles y borró en filtros denitrocelulosa (Protran; Schleicher y Schuell GmbH, Dassel, Alemania). Bloqueo, laincubación y el lavado de los filtros con anticuerpos primarios se realizaron de acuerdo conlos protocolos del fabricante a temperatura ambiente (RT). Después de un lavado conTBS/0.1% de Tween-20 (TBS-T), los filtros se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP)junto a la secundaria de anticuerpos (véase más arriba) durante 60 minutos a TA. Laactividad enzimática fue visualizado por el mayor sistema de quimioluminiscencia,ECL +PLUS (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Densitométrica análisis se realizómediante el escaneo de una hyperfilms Personal Densitometer SI (Molecular Dynamics,Sunnyvale, CA). Cuantificación de Id1, Id2 y Id3 proteína se calculó por la normalización dela proteína específica a bandas de β-actina usando el software Image Quant 5,5 (MolecularDynamics).Análisis de las BMP-6 ARN mensajero (ARNm) de expresiónEndógena expresión de los genes BMP-6 fue examinado por transcripción inversa-reacciónen cadena de polimerasa. Total RNA se aisló ARN usando Absolutamente ™ RT-PCRMiniprep Kit (Stratagene Europa, Amsterdam, Países Bajos), con arreglo a lasinstrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN total aislado se logró mediante eluso de espectrofotométrico OD 260 mediciones. Igual cantidad de ARN se transcribe acontinuación, invertir cDNA con TaqMan ® Reactivos Transcripción Reversa (AppliedBiosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para medir la expresión de mRNA BMP6, Id1-Id4 yPGK1 PCR se llevaron a cabo con TaqMan ® universal maestro de la mezcla. Primers ysondas fueron proporcionados por ensayo-on-Demand (Applied Biosystems). Lasreacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 μ l (BMP-6) o 20 μ l (ID1). ElcDNA añade a cada reacción fue equivalente a la aportación de 20 ng de RNA total. Laexpresión genética se cuantificó utilizando el método estándar de la curva (BMP6), o elmétodo comparativo C T (Id1) como se describe en el Boletín ABI7700 usuario 2 (AppliedBiosystems). La expresión fue normalizado a nivel de la expresión PGK1. PGK1 se eligió,porque se ha demostrado que tiene un nivel bajo de expresión variabilidad de losespecímenes de linfocitos [56]. Los niveles de expresión en las células B son entoncesrelacionadas con los niveles de expresión en las células Ramos.La proliferación de las célulasPara la estimación de la síntesis de ADN, las células CD19 + (7,5 × 10 4 cells/0.2 ml) oRamos células (1 × 10 4 cells/0.2 ml) se cultivaron en microtiter triplicado en los pozos. Lascélulas fueron pulsados con el 3,7 × 10 4 Bq [3 H] timidina (Amersham, Buckinghamshire,
  12. 12. Reino Unido) de los últimos 16 h de un 72-h de incubación. Las células fueron recolectadasutilizando una cosechadora automática de células (Instrumento Packard Company,Meriden, CT, EE.UU.), y [3 H] timidina incorporación se determinó en un contadorscintillation (TopCount, Packard Instrument Company Inc, Meriden, CT).Determinación de la muerte celularMuerte celular se midió por el colorante vital exclusión de prueba por la tinción de lascélulas con 5 μ g / ml de yoduro de propidio ([PI]; Calbiochem Corp; La Jolla, CA; 5 mg /ml) durante un minuto en hielo. Por lo menos 1000 células por muestra se ejecutan en unflujo FACSCalibur BD cytometer.Análisis estadísticoLa significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó a través de lospares de dos colas con técnicas de prueba de Wilcoxon, mediante la aplicación deSPSS10.1 software (SPSS Inc, Chicago, IL, EE.UU.). Los valores de p inferior a 0,05 seconsideró significativo.Lista de abreviaturasBMP, la proteína morfogénica óseaLBDCG, difuso de células B grandes linfomaId, inhibidor de la ADN obligatorioSmad, el nombre Smad se origina a partir de la proteína de Drosophila, MAD yel Caenorhabditis elegans proteínas, pequeñas-2, 3 y 4STAT, transductor de señales y activador de la transcripciónContribuciones de los autoresCK diseñado y llevado a cabo experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel.EAS diseñó y llevó a cabo experimentos, supervisó la investigación. MEH diseñado yllevado a cabo experimentos, supervisó la investigación. LF diseñado y llevado a caboexperimentos. EBS diseñado experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel.JHM designed and conducted experiments, oversaw research, and wrote paper.
  13. 13. COMENTARIOEl artículo sobre el BMP-6, que inhibe la proliferación de linfocitos B, activauna serie de reacciones que terminan en la inhibición de la proliferación deesta célula, también a través de la inhibición de las inmunoglobulinas M,además de CD 40L, no solo eso, sino que estimula a la eliminación de lascélulas B de memoria. El BMP no solo es inducido por células neoplasicassino también puede ser administrado para el uso aplicativo de contraalgunas enfermedades ya que como hemos visto interactúa con la célulade maneras diferentes.
  14. 14. RODRIGUEZ ANTUNEZ JUAN1109000569

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