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Genetica molecular

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  • 1. TEMA 17GENÉTICA MOLECULAR
  • 2. 1.- EL ADN COMO MATERIAL HEREDITARIOEl DNA fue aislado y estudiado por primera vez por el suizoFriedrich Miescher en 1869.Hacia 1890, el químico alemán Albrecht Kossel, hidrolizó el ácidonucleico, descubriendo la existencia de hidratos de carbono y deunos compuestos o bases nitrogenadas a las que dio los nombresde "adenina", "guanina", "citosina" y "timina".En 1911, el bioquímico estadounidense de origen ruso, TheodoreLeven, demostró que los hidratos de carbono eran pentosasPoco después, el británico Alexander R. Todd sintetizónucleótidos en situaciones controladas1928 F. Griffith, trabajando con dos cepas de neumococos, una deenvoltura lisa y otra de envoltura rugosa obtuvo la primeraevidencia de que el ADN era el material hereditario
  • 3. Cuando Griffith mezclababacterias rugosas vivascon bacterias lisasmuertas y esta mezcla seinyectaba en ratones, deéstos se obtenían bacteriaslisas vivas, lo cual sólo sepodía explicar si algo delas lisas muertas habíapasado a las rugosas vivasy las había transformado.La cuestión era averiguarla naturaleza de ese"algo".
  • 4. No sería hasta 1944 cuando Avery,McLeod y McCarthy repitieron losexperimentos de Griffith y demostraronque el "Principio transformante" queconvertía a las bacterias rugosas en lisasera, precisamente, el DNA,descubrimiento que marcó un hitoimportante en la historia de la Genética.. Otro experimento que apoya al ADN lo realizan Hersey y Chase . en 1952 usando virus bacteriófagos marcados con un isótopo de fósforo (32P), que es un elemento del ADN y con un isótopo de azufre (35S), elemento de las proteínas
  • 5. 2.- CONCEPTO MOLECULAR DE GEN Los estadounidenses, George W. Beadle y Edward L. Tatum, trabajando con hongos filamentosos, como Neurospora y Penicillium, descubrieron que los genes dirigían la formación de las enzimas a través de los polipéptidos que las constituyen, de tal forma que cada polipéptido está producido por un gen específico
  • 6. Este descubrimiento fue el origen de la hipótesisUN GEN = UNA ENZIMA.Posteriormente , puesto que no todas las proteínas son enzimas yque algunas proteínas están formadas por más de una cadenapolipeptídica, la hipótesis se transformó en UN GEN=UNACADENA POLIPEPTÍDICAUn GEN se define como la unidad mínima de información genéticaEn procariotas prácticamente todo el ADN se emplea comoinformación para la síntesis de proteínas, y el gen codificador secompone de una secuencia continua de nucleótidosEn eucariotas:- Existe un exceso de ADN, sólo el 10% se empleapara codificar proteínas
  • 7. - Casi la mitad del ADN es altamente repetitivo ( parece estarrelacionado con la estabilidad de la estructura de los cromosomas- Es frecuente que un gen esté constituido por varios fragmentosde DNA separados por secuencias sin sentido que no codificanninguna proteína. A las partes con sentido que sirven para fabricarla proteína se les llama EXONES, y a las partes sin sentidointercaladas en el gen INTRONES, que deben ser eliminados trasla transcripción.
  • 8. 3.- LA TRANSMISIÓN DE LA INFORMACIÓN: EL DOGMACENTRAL DE LA BIOLOGÍALos problemas que se plantearon, una vez conocida la estructuradel ADN, fueron: ¿cómo se transmite la información de una a lasiguiente generación celular? y ¿cómo el ADN puede dirigir laconstrucción y el funcionamiento de un ser vivo?La respuesta constituye lo que hoy se llama el dogma central de labiología. El ADN es capaz de autoduplicarse antes de una divisióncelular mediante un proceso de replicación además, transmite suinformación a una molécula de ARNm por el proceso detranscripcióny el ARNm lo transmite a una secuencia deaminoácidos de una proteína en el proceso denominado traducciónEste "dogma" se ha completado con dos nuevos procesos como sonla transcripción inversa y la autorreplicación del ARN ambosencontrados en ciertos grupos de virus que tienen como materialgenético ARN y no ADN.
  • 9. 4.- LA REPLICACIÓN DEL ADNEl primer proceso necesario para la transmisión de la informacióngenética es su duplicación, es decir, la realización de una copia quepueda ser transportada por los gametos hasta la fecundación y luegopueda ser utilizada por el nuevo individuo.La REPLICACIÓN es el proceso por el cual el DNA se copia parapoder ser transmitido a nuevos individuos. Ocurre en la fase Sde la interfase
  • 10. Con el modelo de la doble hélice de Watson y Crick se desarrolló la idea de que las hebras originales debían servir de patrón para hacer la copia, aunque en principio había tres posibles modelos de replicación:•Modelo conservativo: Proponía que tras la replicación semantenía la molécula original de DNA intacta, obteniéndoseuna molécula idéntica de DNA completamente nueva, es decir,con las dos hebras nuevas.•Modelo semiconservativo: Se obtienen dos moléculas deDNA hijas, formadas ambas por una hebra original y una hebranueva.•Modelo dispersivo: El resultado final son dos moléculasnuevas formadas por hebras en las que se mezclan fragmentosoriginales con fragmentos nuevos. Todo ello mezclado al azar,es decir, no se conservan hebras originales ni se fabrican hebrasnuevas, sino que aparecen ambas mezcladas.
  • 11. Meselson y Stahl demostraron en 1958 que el modelo válido era elsemiconservativo. Para ello utilizaron nucleótidos marcados connitrógeno pesado.Aunque existen pequeñas variaciones entre procariotas y eucariotas,el mecanismo básico es bastante similar:
  • 12. Aunque existen pequeñas variaciones entre procariotas yeucariotas, el mecanismo básico es bastante similar1.- Inicio de la replicación: Comienza en ciertas zonas del ADNdonde existen determinadas secuencias de nucleótidos (ORIGENDE REPLICACIÓN). En primer lugar interviene una enzima helicasa que separa las dos hebras del ADN al romper los puentes de hidrógeno entre bases complementarias Cuando la doble hélice se rompe se produce un desenrollamiento en esa zona que crea unas tensiones. La acción de enzimas como las girasas y las topoisomerasas evitan esas tensiones Las proteínas SSB se unen a las hebras molde e impiden que se vuelvan a enrollar
  • 13. En el lugar origen de la replicación se ha formado una burbuja dereplicación en el que hay zonas con forma de Y denomindashorquillas de replicación, donde se van a sintetizar las nuevashebras en ambos sentidos por ello decimos que la replicación esbidireccional2.- Formación de las nuevashebras:El proceso se lleva a cabomediente la enzima ADN polimerasaIII que presenta las siguientescaracterísticas:a) Necesita una hebra molde de ADNque recorre en sentido 3’-->5’b) Une los nucleótidos en sentido5’-->3’
  • 14. c) Utiliza nucleótidos trifosfato, los cuales proporcionan almismo tiempo la energía necesaria para la uniónd) No puede comenzar la síntesis por misma, pues sólo puedeañadir nucleótidos sobre el extremo 3’ libre de una cadenapolinucleótida. Por este motivo es necesario que exista unacadena corta de ARN, denominada ARN cebador o primer. Esteprimer es sintetizado por la enzima primasa que utiliza ADNcomo molde para sintetizar ARN
  • 15. Dado que el ADN polimerasa recorre la hebra molde en sentido3’-->5’ la síntesis de un de las hebras es continua y se le denominahebra conductora o líder. Sin embargo en la otra cadena( antiparalela) ; el ADN no puede unir los nucleótidos en esesentido.La síntesis en este caso es discontinua y se realiza en fragmentosseparados; esta cadena se le denomina hebra retardada y a lossegmentos se les denomina fragmentos de Okazaki.Cadafragmento requiere de un ARN cebador
  • 16. La enzima ADN polimerasa I elimina después los ARNcebadores de ambas cadenas ( actividad exonucleasa) y ellamisma se encarga de rellenar el hueco dejadoPosteriormente tras la eliminación de los ARN cebadores, losfragmentos se unen entre sí gracias a la acción de enzimasligasas
  • 17. 3.- Corrección de errores:Participan varias enzimas: Endonucleasas que detectan los erroresy cortan la cadena anómala; Exonucleasas que eliminan elfragmento incorrecto; ADN polimerasas que sintetizan la parte delsegmento eliminado( ADN polimerasa I ; que tb tiene unaactividad de exonucleasa); ADN ligasas que une el nuevosegmento al resto de la cadenaLas diferencias entre el proceso en procariotas y en eucariotas son:a) Como el ADN de eucariotas está asociado con histonas; alreplicarse éstas deben sintetizarse. Se ha comprobado que lashistonas viejas se mantienen en la hebra conductora; mientras quelas nuevas se unen a la hebra retardadab) El tamaño de los fragmentos de Okazaki es menor en eucariotasque en procariotas
  • 18. c) Existen tres ADN polimerasas en procariotas y cinco eneucariotasd) La replicación en procariotas tiene un único origen ( oriC)mientras que en eucariotas existen múltiples. Cada unidad dereplicación se denomina replicóne) La velocidad de replicación en cada replicón es menor eneucariotas que en procariotasEl proceso de replicación del ADN se va completando hastallegar al telómero. Cuando se elimina el último ARN cebador, lahebra retardada quedará incompleta ya que el ADN polimerasano podrá rellenar el hueco por no tener un extremo 3´ libreEste hecho hace que el telómero se vaya acortando un poco cadavez que la célula se divide , fenómeno que se asocia con elenvejecimiento y muerte celular
  • 19. 5.- TRANSCRIPCIÓNLa transcripción del DNA es un mecanismo fundamental para elcontrol celular y para la expresión de la información genética.Este mecanismo permite que la información del DNA llegue alresto de orgánulos celulares y salga del núcleo en el caso de loseucariotas. Para ello esa información debe copiarse en forma deARN.La TRANSCRIPCIÓN es el proceso de copia de un gen ofragmento de ADN utilizando ribonucléotidos y originándosediferentes tipos de ARN
  • 20. Ocurre en el núcleo en eucariotas y en el citoplasma en procariotas. Para realizarlo se necesita: a) un cadena de ADN que actue como molde. La otra no se transcribe ( hebra informativa) b) ARN polimerasas; en procariotas sólo interviene 1 mientras en eucariotas intervienen 3: ARN polimerasa I (formación de ARNr) ; II ( formación de ARNm) y III (ARNt y ARNr) c) Ribonucleótidos trifosfatoEl mecanismo de transcripciónconsta de tres etapas: iniciación,elongación y terminación trasellas viene una etapa demaduración
  • 21. 1.- INICIACIÓN En procariotas la ARN polimerasa se une a un cofactor σ ; cambia de conformación lo que permite su unión a una región del ADN llamada promotor, la cual posee una secuenciaa TATAAT ó TTGACA.Una vez fijada la ARN polimerasa elcofactor se libera y se produce eldesenrollamiento de la doble héliceEn eucariotas para el ARNm la ARNpolimerasa II se une a una zona del ADNllamada promotor (posee secuenciasCAAT y TATA); pero no necesitacofactor
  • 22. 2.- ELONGACIÓNEn procariotas la ARNpolimerasa recorre la hebra deADN hacia su extremo 5´sintetizando una hebra deARNm en dirección 5´-3´En eucariotas . Al poco ( 30ribonucleótidos )se añade unacaperuza (metil-guanosíntrifosfato) al extremo 5´
  • 23. 3.- TERMINACIÓNEn procariotas presenta dos variantes. En una interviene uncofactor "p" y en otra no interviene dicho cofactor. El procesofinaliza al llegar a una secuencia palindrómica rica en G y C (zonallamada operador) y que da lugar a un bucle que favorece laseparación del ADN . El ADN vuelve a su forma normal y elARNm queda libre.En eucariotas la señal de terminaciónparece que está relacionado con lasecuencia TTATTT. Ahora interviene unpoli-A polimerasa que añade una cola depoli-A al pre-ARNm (ARNhn)., queparece que interviene en los procesos demaduración y transporte
  • 24. 4.- MADURACIÓNEn procariotas si lo que se forma es un ARNm no hay maduración,pero si se trata de un ARNt o ARNr hay procesos de corte yempalme.En eucariotas se produce en el núcleo y la hace un enzimallamada RNPpn ( ribonucleoproteína pequeña nuclear) , Elproceso se denomina splicing y comienza cuando las secuenciasintrónicas forman unos bucles y se eliminan los intronesformados.Posteriormente las ARN ligasasempalman los exones (E) yforman el ARNm.Un mismo gen puede madurar dediferentes maneras dependiendode cómo se eliminen los intronesEl ARN t también se produce enel núcleo; mientras que el ARNrse produce en el nucleolo
  • 25. Los retrovirus son virus ARN, envueltos, que atacan a célulaseucariotas. Contienen transcriptasa inversa . Este enzima actúapor un mecanismo inverso a la transcripción normal, pues usandocomo molde al ARN viral genera ADN bicatenario,
  • 26. 6.- CODIGO GENÉTICOUno de los grandes misterios, una vez descubierto el ARNm, eracomprender cómo la información del ADN se transformaba en unasecuencia de aminoácidos en un polipéptido. Surge la necesidad deun código genético a modo de diccionario que establezca la relaciónentre la información del ARNm (sobre la base de 4 nucleótidos conbases diferentes) y el lenguaje de las proteínas (escrito con 20aminoácidos distintos).Después de muchos estudios (1955Severo Ochoa y Grumberg; 1961M.Nirenberg y H. Mattaei) se comprobóque a cada aminoácido la correspondentres bases nitrogenadas o tripletes (61tripletes codifican aminoácidos y trestripletes carecen de sentido e indicanterminación de mensaje).
  • 27. El código genético presenta las siguientes características: Es universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo existen algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias, protozoos y mitocondrias Está degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminoácido, es decir hay codones sinónimos.No presenta imperfecciones,no es. ambigüo, pues cada tripletetiene su propio significado y sólo uno Todos los tripletes tienensentido, bien codifican un aminoácido o bien indicanterminación de lectura.
  • 28. Carece de solapamiento,es decir los tripletes no comparten basesnitrogenadas; no existen espacios ni comas.. Es unidireccional,pues los tripletes se leen de manera continua en el sentido 5´-3desde el codón de iniciación al de terminación7.- TRADUCCIÓN.La TRADUCCIÓN es el proceso de síntesis de proteínas llevado acabo en los ribosomas, a partir de la información aportada por elRNA mensajero que es, a su vez, una copia de un gen.Las proteínas de los seres vivos se fabrican en los RIBOSOMAS,orgánulos celulares que se encuentran en el citoplasma de losprocariotas y en eucariotas, asociados al retículo endoplasmático. Elementos que intervienen en la traducción •RNA-m, RNA-t. •Ribosomas. •Aminoacil RNA-t sintetasa, translocasas, peptidasas.
  • 29. •GTP, factores de iniciación y terminación. •Aminoácidos.En el proceso de traducción intervienen de forma fundamental lostres tipos más frecuentes de ARN: •RNA-mensajero (RNA-m): es el encargado de transportar la información genética desde el núcleo hasta los ribosomas con el fin de que pueda ser expresada en forma de proteínas. •RNA-ribosómico (RNA-r): forma parte esencial de las dos subunidades que constituyen los ribosomas. •RNA-transferente (RNA-t): juega un papel fundamental transportando a los aminoácidos hasta los ribosomas en el orden correcto en que deben unirse para formar una proteína determinada, según la información genética.
  • 30. Los RNA-t son cadenascortas de ribonucleótidosarrolladas en el espacio detal forma que se produceapareamiento entre basescomplementarias quequedan próximas. Seorigina así unaconfiguración espacial enforma de "hoja de trébol",con cuatro brazos o buclesde RNA no apareado quecumplen diferentesfunciones: BRAZO ACEPTOR, formado por los extremos 3 y 5 de la cadena que se encuentran próximos. En el extremo 3’ es donde se unirá el aminoácido que debe ser transportado hasta el ribosoma.
  • 31. •BRAZO AMINOACIL RNA-t SINTETASA o TFIC, que interacciona con la enzima que va a unir al RNA-t con su aminoácido específico. •BRAZO ANTICODÓN: Es el más importante porque gracias a él el RNA-t se une a un aminoácido específico, según la secuencia de cada codón del RNA-m. El anticodón es una secuencia de tres bases complementaria de un codón o triplete de bases de un RNA-m. Según cual sea el codón, entrará al proceso de traducción un RNA-t u otro diferente. Es frecuente que la tercera base del anticodón sea una base rara (pseudouridina, metil guanosina, dihidrouridina, etc.)El mecanismo de la traducción es muy semejante en eucariotas yprocariotas. Antes de comenzar los aminoácidos deben estaractivados
  • 32. Activación de aminoácidos: Cada RNA-t busca a su aminoácidoespecífico según el triplete de su anticodón y se une a él por laacción de una enzima específica llamada aminoacil RNA-tsintetasa, que une al aminoácido con su RNA-t en el brazo aceptor,gastándose una molécula de ATP. De este modo, un gran número detransferentes se encuentran unidos a su aminoácido antes deiniciarse la traducción. La unión se realiza entre el grupo carboxilodel aminoácido y el grupo OH del extremo 3’ del ARNt1.-Iniciación. En eucariotas comienza por el triplete iniciador delARNm (AUG), que está próximo a la caperuza 5. Este triplete vaprecedido de la secuencia AGGAGG (secuencia de Shine-Dalgarno ) que es la zona de unión con el ribosoma.Se forma el complejo de iniciación con los factores de iniciación(FI) y la energía suministrada por el GTP, la subunidad menor delribosoma reconoce la caperuza y se une al ARNm en la zonapróxima al triplete o codón iniciador.
  • 33. Esta caperuza aporta el ARNt iniciador que a su vez aporta el aminoácido metionina. Este ARNt contiene un triplete complementario al AUG, es decir el UAC, llamado anticodón (la proteína sintetizada contiene en su extremo el aminoácido metionina)Una vez encajado elARNt-metionina, seliberan los FI y dejan pasoa la subunidad mayor delribosoma, formandose asíel ribosoma completo yfuncional. En él hay dossitios claves:- Sitio P (sitio peptidil) ocupado por el ARNt-metionina.- Sitio A (sitio aminoacil) que está libre para recibir un segundo ARNt(sólo el que su anticodón coincida con el del codón del ARNm) cargadocon un nuevo aminoácido
  • 34. En procariotas los factores de iniciación son diferentes y el primeraminoácido no es la metionina sino la formil-metionina2.- Elongación de la cadena peptídica: es un proceso catalizadopor el enzima peptidil transferasa, el cual, mediante enlacespeptídicos va uniendo aminoácidos a la cadena peptídica. El nuevoaminoácido entra en el sitio A. Se produce el enlace peptídico. Acontinuación se produce la liberación del ARNt y la translocacióndel ribosoma , es decir el desplazamiento del ribosoma a lo largodel ARNm en sentido 5’-->3’ y el nuevo peptidil ARNt pasa allugar P y así sucesivamente
  • 35. 3.- Terminación de la cadena peptídica: ocurre cuando apareceuno de los codones de terminación ( UAA,UAG,UGA ). En estemomento un factor proteico de terminación (RF) se une al codónde terminación e impide que algún ARNt con otro aminoácido(ARNt-aminoacil) se aloje en el sitio A. En este momento seproduce la hidrólisis de la cadena peptídica y se separan las dossubunidades del ribosoma.
  • 36. A medida que se van sintetizando las proteínas adquiern laestructura secundaria y terciaria que les correspondeTanto en procariotas como en eucariotas, si el ARNm que se tieneque traducir es lo suficientemente largo , puede ser leído por másde un ribosoma a la vez, formando un polirribosoma o polisomaEn procariotas, al no haber división entre núcleo y citoplasma, latraducción es simultanea a la transcripción: el ARNm comienza atraducirse antes que termine la transcripción•En eucariotas: se almacenan generalmente en el lumen del RER.Luego maduración en Golgi.