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Clases De InmunohistoquíMica
 

Clases De InmunohistoquíMica

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    Clases De InmunohistoquíMica Clases De InmunohistoquíMica Presentation Transcript

    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      1
      Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      2
      Generalidades
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      3
      Características generales
      • Técnica versátil
      • Se puede demostrar la presencia de antígenos de ubicación subcelular
      • Doble marcado permite la detección simultánea de dos antígenos y por tanto hay una comparación relativa
      • En algunos casos se pueden usar asociado a técnicas histológicas convencionales
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      4
      Características generales
      • Permite detectar el tipo de organismo infeccioso, células progenitoras de una neoplasia, o presencia de respuesta inflamatoria
      • Puede ser medida la concentración aproximada de un antígeno (Softwares analizadores de imágenes)
      • Pueden detectar como mínimo 1000 moléculas de antígenos por célula
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      5
      Etapas
      • Obtención de las células o tejido
      • Fijación
      • Unión con anticuerpos
      • Detección de la reacción antígeno-anticuerpo
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      6
      Tipos de muestras
      • Cultivos celulares que crecen en un soporte de vidrio (tipo de cubreobjeto)
      • Centrifugado de células en suspensión colocadas en un portaobjetos
      • Frotis de tejido
      • Cortes de tejido
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      7
      Consideraciones
      Hay tres factores principales que determinan la facilidad de detección de un antígeno:
      1.- Concentración local de un antígeno
      2.- El tipo de fijador y anticuerpo usado
      3.- El método de detección empleado
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      8
      Fijación
      Ideal: Inmovilizar al antígeno sin modificarlo
      Mantener la estructura celular
      Permitir el acceso de los anticuerpos
      Realidad: Muchos epítopes son enmascarados o alterados y los anticuerpos pueden no reconocerlos (Tratamientos con tripsina)
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      9
      Fijadores más utilizados
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      10
      Anticuerpos policlonales
      • Un buen suero tiene múltiples anticuerpos contra diferentes epítopes
      • Producen una fuerte señal
      • El exceso de anticuerpos eventualmente puede producir una inhibición alostérica
      • Requiere controles
      • El suero puede contener anticuerpos irrelevantes de especificidad desconocida, lo cual incluye los propios del animal (Background)(Inhibe: Titulación, Adsorción con acetona, purificación por inmunoafinidad)
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      11
      Anticuerpos policlonales
      • Debido a que los anticuerpos son contra una variada cantidad de anticuerpos, lo que incluye los epitopes denaturados, esta técnica se puede utilizar en:
      Muestras demasiado fijadas
      Cortes incluidos en parafina
      Tejidos fijados en paraformaldehído
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      12
      Anticuerpos monoclonales
      • Produce un escaso background
      • Trabajan bien en células o tejidos bien fijados
      • La mayoría no funciona con paraformaldehído
      • Ocasionalmente existe reacción cruzada
      • Es mejor la obtención de anticuerpos de cultivo y no de líquido ascítico (Puede estar contaminado con anticuerpos=background)
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      13
      “Pool” de Anticuerpos monoclonales
      • Incrementa la intensidad de la reacción (señal)
      • Cada anticuerpo individual debe ser probado inicialmente
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      14
      Tipos de Técnica
      Directa: El marcador se acopla o conjuga directamente
      Indirecta: El marcador se acopla a un anticuerpo secundario
      De amplificación: Se agrega otro anticuerpo intermediario
      Método de la estreptoavidina/biotina
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      15
      Técnica Directa
      Anticuerpo primario
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      16
      Técnica Indirecta
      Anticuerpo Secundario
      Anticuerpo primario
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      17
      Pool de anticuerpos monoclonales
      Anticuerpos policlonales
      Anticuerpos Monoclonales
      Intensidad de la señal
      Excelente
      Regular a buena
      Excelente
      Excelente
      Especificidad
      Buena
      Excelente
      Cualidad
      Señal intensa
      Especificidad
      Especificidad
      Disponibilidad
      Desventaja
      Señal baja
      No reutilizable
      Background
      Titulación
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      18
      Agente patógeno
      Antígenos
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      19
      Portaobjeto
      Frotis o impronta
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      20
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      21
      Congelación
      Frotis o impronta
      Fijación en formalina
      Corte por congelación
      Inclusión en parafina
      Fijación
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      22
      Resumen de pasos para la obtención de una muestra
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      23
      Técnica de inmunofluorescencia
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      24
      FLUORESCENCIA
      Es la capacidad que tienen algunas moléculas de emitir luz mientras están siendo estimuladas de modo adecuado. No confundir con la fosforescencia que es la emisión de luz con posterioridad a la estimulación,cuando ésta última ha cesado. 
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      25
      Características
      • Requiere un microscopio de epifluorescencia
      • La radiación de excitación se transmite a través de los objetivos hacia la superficie de la muestra
      • La radiación absorbida por el fluorocromo hace que sus electrones salten a un nivel superior de energía, al volver a su estado normal libera energía como luz
      • Pueden observarse dos fluorocromos en la misma muestra
      • Fluoresceina y rodamina
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      26
      Camino recorrido por la luz de excitación (azul) y la luz emitida por el objeto fluorescente (verde oscuro). El espejo dicroico refleja la longitud de onda de excitación y deja pasar la de emisión. La luz emitida, tras pasar por el filtro,  solo abarca un rango estrecho de longitud de onda (verde intenso).
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      27
      Los fluorocromos(colorantes fluorescentes) al ser estimulados con fotones de una determinada longitud deonda, denominada de  absorción o excitación,  emiten otro fotón de mayor longitud de onda, es decircon  menor energía. El fluorocromo prototipo es la fluoresceína que al ser estimulada con luz azul (abs.máx. a495 nm) emite luz verde (emisión máxima a 520 nm).Tanto la excitación como la emisión no son exactas a esa longitud deonda: aunque la excitación de la fluoresceína sea máxima a495 nm, también es posible estimular (menos eficazmente) con 470 o con 510 nm, puesto que en realidad lalongitud de onda de excitación es una campana de Gauss (espectro de absorción). Siempre que se hable deexcitación y emisión de un fluorocromo se entiende que se está hablando de los valores máximos.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      28
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      29
      FUENTE DE LUZ 
          Los microscopios de fluorescencia convencionales y algunos citómetros de flujo antiguos tienen como fuente emisora de fotones a una lámpara de arco de mercurio. La longitud de onda de excitación se consigue con filtros ópticos que solo dejan salir el tipo de luz de excitación que deseemos. En la actualidad, prácticamente todos los modelos de citómetros y los microscopios confocales llevan una fuente emisora de luz coherente (láser).Cada tipo de láser emite los fotones en una o varias longitudes de onda determinadas  conocidas como líneas del láser. La energía de emisión que define una determinada línea se produce al caer un electrón electrón de una órbita alta a otra baja y por tanto vendrá determinada por la estructura atómica del gas contenido en el cañón láser.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      30
      FUENTE DE LUZ
      Los emisores láser más empleados son los de helio-neón (atómicos), argón-kriptón (iónicos) y helio-cadmio (moleculares). Recientemente se han empezado a introducir los basados en semiconductores (láser diodo) y en tecnología multifotón que permite estimular con mayor energía que la propia de la longitud de onda al hacer incidir, simultáneamente sobre el objeto, varios fotones que suman sus energías.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      31
      FLUOROCROMOS 
      Existen cientos de fluorocromos cada uno de ellos con diferentes rangos de excitación y emisión. Los que  más se usan son los que se excitan con la longitud de onda de emisión de los laseres que disponemos en los equipos de citometría de flujo y microscopía confocal.  Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u organelos tales como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas, etc.Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. 
       
       
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      32
      Propiedades de los fluorocromos más utilizados
      Excitación
      Emisión
      Fluorocromo
      Color
      DAPI
      365
      Sobre 420
      Azul
      Verde
      Fluoresceina
      495
      525
      Rodamina
      552
      570
      Rojo
      Rojo
      Texas red
      620
      596
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      33
      Espectros de emisión (visibles) de los fluorocromos más usados  
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      34
      Piscirickettsia salmonis
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      35
      P. salmonis mediante microscopía confocal
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      36
      Modificación de la técnica de inmunofluorescencia para la detección deP. salmonis mediante microondas (Larenas y col., 1996)
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      37
      Técnicas de inmunohistoquímica
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      38
      DAB
      AEC
      Fast red
      HRP
      HRP
      Fosf. Alc.
      Precipitado café
      Precipitado rojo
      Precipitado rojo
      3
      Precipitado
      coloreado
      Sustancia cromógena
      Peroxidasa (HRP)
      o Fosfatasa alcalina
      Enzima
      2
      Estreptoavidina
      Biotina
      Anticuerpo secundario marcado con biotina
      1
      Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja)
      Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      39
      Sistema de detección fosfatasa alcalina
      Precipitado
      rojo
      Fast red
      Fosfatasa
      alcalina
      Anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina
      2
      1
      Anticuerpo primario (Conejo)
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      40
      Sistema de detección APAAP
      Precipitado
      rojo
      Alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complex
      Fast red
      Fosfatasa
      alcalina
      Anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina
      3
      2
      Anticuerpo secundario (Anti-inmumoglobulina de ratón)
      1
      Anticuerpo primario (Ratón)
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      41
      Sistema de detección APAAP
      Precipitado
      rojo
      Alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complex
      Fast red
      Anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina
      Fosfatasa
      alcalina
      4
      Anticuerpo anti-ratón
      3
      Anticuerpo secundario (Anti-conejo)
      2
      1
      Anticuerpo primario (Conejo)
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      42
      Leiomioma: Fibra de actina específica de músculo liso. Inmunoperoxidasa (DAB)
      Melanoma: reconocimiento de antígeno de membrana intracelular específico del tumor. Inmunoperoxidasa (DAB)
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      43
      Mieloma: Detección de un antígeno específico de células B alteradas. Inmunoperoxidasa. DAB.
      Reconocimiento de macrófagos en un ganglio linfático. Inmunoperoxidasa. AEC.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      44
      TVT: Proliferación celular de linfocitos. Fosfatasa alcalina.
      Epitelio alveolar: Virus PI3 en pulmón de ovino. Epìtelio infectado. Inmunoperoxidasa. DAB.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      45
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      46
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      47
       
      Corte de ovario de trucha arco iris negativo a P. salmonis.Inmunoperoxidasa AEC. 100X.
       
      Tejido renal proveniente de una hembra trucha arco iris inoculada con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC 400X.
       
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      48
      Análisis de imágenes
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      49
      ANALISIS DE IMAGEN en biología y  medicina.
      Los sistemas de análisis de imagen  están diseñados para extraer información y transformarla en valores numéricos lo que nos permite exprimir la información contenida en la imagen, esta información puede sernos entregada en forma de imágenes retocadas o en falsos colores
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      50
      ANALISIS DE IMAGEN en biología y  medicina.
      Podemos obtener información, entre otras, sobre la forma, área y densidad óptica de los objetos. Existen magníficos sistemas de análisis de imágenes tanto comerciales como shareware. Los primeros tienen un costo excesivo y solo están al alcance de empresas y departamentos universitarios. Pero los sistemas shareware o de libre dominio son casi tan buenos como los comerciales y nos permiten aprender y adquirir experiencia sin necesidad de costosas inversiones entre ellos los mejores son:
      Image Tools (sólo para WIndows), NIH image (Para Mac y Windows) y TN-image (para MS-DOS y UNIX), este último aunque parezca anticuado, está muy bien programado tiene una gran potencia funcionando bajo MS-DOS.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      51
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      52
      PROCESAMIENTO DE MUESTRAS UTILIZADAS PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:
      • FIJACION CON PARAFORMALDEHIDO AL 2%, GLUTARALDEHIDO AL 0,2% , EN BUFFER PBS 0,1 M PARA INMUNOHISTOQUIMICA Y PARAFORMALDEHIDO AL 4% GLUTARALDEHIDO 2%, EN BUFFER CACODILATO DE Na 0,2 M PARA ULTRAESTRUCTURA.
      • PROCESADAS SEGÚN PROCEDIMIENTO ESTANDAR PARA INCLUSION DE CORTES HISTOLOGICOS EN RESINA LR WHITE Y EPON.
      Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      53
      PROTOCOLO DE INMUNOPEROXIDASA (POST EMBEDDING) PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:
      • INCUBAR LA GRILLA EN PEROXIDO DE HIDROGENO 5 min.
      • 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.
      • BLOQUEAR CON TBS/BSA 1% POR 30 min.
      • ESCURRIR LA GRILLA EN PAPEL FILTRO.
      • INCUBAR ANTICUERPO POLICLONAL ANTI P.salmonis (DESARROLLADO EN CONEJO) 1:50 POR 2 hrs.
      • 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .
      • INCUBAR ANTICUERPO ANTI CONEJO (CON BIOTINA) POR 1 hr.
      • 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .
      Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      54
      PROTOCOLO DE INMUNOPEROXIDASA PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:
      • INCUBAR CON ESTREPTOAVIDINA-HRP 30 min.
      • 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.
      • INCUBAR CON CROMOGENO AEC 10 min.
      • 2 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.
      • 2 LAVADOS CON AGUA BIDESTILADA POR 5 min.
      • TEÑIR CON ACETATO DE URANILO AL 4% EN AGUA DESTILADA 5 min. Y CITRATO DE Pb DE REYNOLDS POR 5 min.
      Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      55
      Microscopia electrónica de transmisión
      Técnica de inmuno-oro (P. salmonis)
      Anticuerpo marcado con oro
      Oro
      Anticuerpo primario
      Antígeno
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      56
      DAB
      AEC
      Fast red
      HRP
      HRP
      Fosf. Alc.
      Precipitado café
      Precipitado rojo
      Precipitado rojo
      3
      Precipitado
      coloreado
      Sustancia cromógena
      Peroxidasa (HRP)
      o Fosfatasa alcalina
      Enzima
      2
      Estreptoavidina
      Biotina
      Anticuerpo secundario marcado con biotina
      1
      Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja)
      Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      57
      Microscopia electrónica de transmisión
      1m
      1m
      Técnica de inmunoperoxidasa (P. salmonis)
      Control negativo. Células provenientes de cultivo de tejido CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 10200 X.
      Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      58
      1m
      1m
      RESULTADOS
      Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC 10200X.
      Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 7200X
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      59
      RESULTADOS
      1m
      Se observan varias P. salmonis unidas al corion de la
      ova mediante prolongaciones denominadas CAP. 6700x
      Control positivo células CHSE-214, infectadas con P. Salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X.
      Control positivo células CHSE-214, infectadas con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 15000X.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      60
      RESULTADOS
      1m
      1m
      Muestra de ovario día 20 p.i. Inmunoperoxidasa AEC. 27750X.
      Muestra de ovario día 10 p.i células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 4350X.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      61
    • Células CHSE-214
      Efecto citopático
      Piscirickettsia salmonis
      Piscirickettsia salmonis marcado con oro
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
      63
      INMUNODOT
    • Materiales y Métodos
      “dot-blot”
      • Activación de membrana de polivinildifluoruro (PVDF)
      • Instalación de membrana PVDF en Bio-Dot®
      • Conexión Bio-Dot® en bomba de vacío
      • Carga de muestras en pocillos del Bio-Dot®
    • Materiales y Métodos
      “dot-blot”
      Bloqueo de membrana
      Solución de leche
      descremada al 6%
      • Incubación con 1er anticuerpo
      • Incubación con 2º anticuerpo
      • IgG de Ratón anti-P. salmonis
      • Durante 2 horas
      • Anti IgG de ratón
      • Dilución 1:5.000
      • Durante 1 hora
      • Dilución 1:10.000
      • Ligada a peroxidasa
    • Materiales y Métodos
      “dot-blot”
      • Uso de sustrato
      • Generación de quimioluminiscencia
      • Exposición de membrana a película fotosensible, de 2 a 8 min.
      • Revelado
    • Materiales y Métodos
      Análisis de resultados
      DENSITOMETRÍA
      • Digitalización de películas
      • Conteo de píxeles de cada punto mediante un software (Un-Scan-It®)
    • Materiales y Métodos
      Análisis de resultados
      Comparación de cinéticas de infección
      • Análisis semi-cuantitativo, descriptivo en relación al tiempo y el porcentaje de adhesión e ingreso a la ova.
      • Cada muestra positiva genera Nº de Píxeles.
      • Estas se comparan porcentualmente entre ellas respecto a un 100% que sería número de píxeles generados por la muestra control positivo o suspensión bacteriana usada en el desafío de ovas.
      • En base estos datos se compararían las cinéticas de infección generadas en una misma especie de ova por las distintas cepas de P. salmonis.
      • También se compararían las cinéticas de infección generadas por una misma cepa bacteriana en las distintas especies de ovas de salmón.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
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      Fig. En la primera fila se aprecia la reacción inespecífica con las células CHSE-214 sin infectar. En la segunda fila se ve la reacción positiva a LF-89.
      Fig. En la primera columna se aprecia la reacción positiva con una suspensión de cultivo celular inoculada con P. salmonis, destacándose claramente de la muestra negativa en la segunda columna que corresponde a una muestra de ova sin infectar.
    • Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.
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      Gráfico: Detección mediante Dot Blot quimioluniscente de muestras en concentraciones crecientes de P. salmonis y cultivo celular sin infectar.