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Enzimas de diagnostico
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Enzimas de diagnostico

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  • 1. TEMA-22. ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA 1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico Mejor conocimiento molecular metabolismo Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas 2. Herramientas analíticas Purificación de enzimas 3. Terapia enzimática Industria Biotecnológica 8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos) Conocimiento estructural y funcional
  • 2. 1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico a) La enzima debe estar presente en fluido biológico b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlación con los valores patológicos. d) La enzima debe ser estableTipos de fluidos: Suero (Más común) y Orina LCF, Pleura, Sinovial, etc
  • 3. SUERO1. Enzimas específicas Enzimas su función radica en el plasma Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc2. Enzimas no específicas Enzimas que son secretadas por los tejidos. Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc. Enzimas intracelulares. Daño Tisular Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo. Proliferación Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente
  • 4. Enzima específica de tejidos (Raro)DIAGNOSTICO -Abundancia relativa Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos) - Patrón de enzimas característico - Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.
  • 5. ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía Creatina Quinasa Aspartato aminotransferasa Lactato deshidrogenasa Concentración en tejido Valor en plasma Velocidad del vertido Grado de degradación Vida media 10 –130 horas Test depende del tiempo del infartoCreatina Quinasa mas específicaLDH se puede diferenciar por electroforesis
  • 6. Creatina quinasa Músculo esquelético Músculo cardiaco (Mayor concentración) Cerebro No en el hígado Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B Músculo M-M (99%) y M-B (1%) Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%) Cerebro B-B (100%) Pequeño Infarto M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)
  • 7. Lactato deshidrogenasaHígado, CorazónInmunoblotting LDH-1Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.85 Normal >1 Enfermo Transaminasas (ALT y AST) Se utilizan poco actualmente Hígado AST/ALT (3-5) Corazón AST/ALT (20-25)
  • 8. ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS Aspartato aminotransferasa (AST ó GOT) Alanina aminotransferasa (AST ó GPT) Fosfatasa alcalina γ-Glutamil transferasa Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etc Transaminasas γ-Glutamil transferasa Fosfatasa alcalina 4-nitrofenil fosfato Visible Hepatitis Enfermedades hepáticas Crónicas Cirrosis Agúdas Tumores Intermitentes Obstrucción del conducto biliar
  • 9. USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS -Diagnóstico de enfermedades -Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas) -Seguimiento de operaciones hepáticas TRANSAMINASAS No específicas del plasma Células parenquimales Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Vertido al plasma Hepatitis, cirrosis Progreso de la enfermedad FOSFATASA ALCALINANo específicas del plasmaSuperficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, OsteoblastosISOENZIMASDaños en las células del conducto biliar Ratio Fosf.Alc/TransaminasasHepatitis 0,2-0,6Obstrucción del 10-20conducto biliar
  • 10. γ-GLUTAMIL TRANSFERASA Alcoholismo crónico Cirrosis Incremento síntesis y en la secreción GLUTATION TRANSFERASA CarcinogénicosCataliza reacciones de destoxificación Agentes de quimioterapiautilizando glutation Paracetamol Xenobióticos Contenido alto 5% Vida media corta 90 min Marcador muy rápido y sensible de daño hepático Tiempo de la ProtrombinaFunción hepáticaTiempo requerido para la activación de la protrombina en TrombinaIndica grado de funcionamiento hepáticoFactores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a lasangreTrombina Cataliza el proceso de coagulación
  • 11. OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO α-AMILASA Páncreas Glándulas salivaresSuero normal Baja actividadSuero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasaSuero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)Amilasa detección en orina debido a bajo Peso MolecularCREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASAIndicadores de desordenes en la musculatura esquelética Creatina quinasa Músculo esquelético, cardiaco, Cerebro Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso, infarto de miocardio, daño cerebral, etc ISOENZIMAS Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos) Significado clínico menor Precaución (contaminación Glb rojos)
  • 12. FOSFATASA ALCALINA Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar Enfermedades de huesos Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos) Osteomalacia Raquitismo Hiperparatiroidismo Enfermedad denominada hipofosfatasia Actividad Pirofosfatos inorgánico (substrato) Crecimiento cristales de hidroxiapatito No estrictamente Isoenzimas Osteoblastos, Hígado, Intestino, Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciación Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores, CalorFOSFATASA ACIDA Localización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc Diagnostico de carcinoma de Próstata Precaución en el muestreo - Lábil - Contaminación con FA de eritrocitos Diferenciación isoformas - Sensibilidad sustratos - Uso de inhibidores específicos: Formaldehido
  • 13. 2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE METABOLITOS Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analíticamente VentajasLa enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de otras sustanciasEvita la purificación necesaria en un análisis químicoSustancias lábiles Inconvenientes El costo de la enzimas Inmovilización Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc
  • 14. Puntos importantes para utilizar una enzima1. La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido Equilibrio no favorable a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa2. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km.3. La especificidad de la enzima debe ser conocida4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)
  • 15. Determinación de glucosaTest tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosa Métodos enzimáticos1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa NADPH Cambio 340 nm Especificidad segundo paso 2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa Visible (Más utilizado) Más interferencias productos sangre 3. Glucosa deshidrogenasa Determinación de ácido úrico Diagnóstico de la gota Método químico y enzimático Falta Actualmente sólo se utiliza el especificidad enzimático Absorbancia (293 nm) Alantoina; Consumo de O2 Acoplado a peroxidasa (H2O2)
  • 16. Determinación de ureaTest de la función renal: Suero y orina Capacidad de filtración glomerular UreasaUREA Carbonato amónico. NH4 Acoplado con glutamato DH NADH Determinación de colesterol y trigliceridos Colesterol Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio Método químico (colorimétrico) No específico, contaminante Esteresa Colesterol oxidasa Peroxidasa Absorción a 500 nm TrigliceridosSeguimiento: DiabetesMellitus, Nefrosis,obstrucción biliar, etc
  • 17. Otros metabolitos Creatina Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa Amonio Glutamato deshidrogenasa Tiamina difosfato en eritrocitosEnsayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminasEnsayo diagnostica deficiencia en vitaminasMalnutriciónEncefalopatía de Wernicke´sTransquetolasaSujetos normales: Actividad no cambia al añadir TiaminaEnfermos : Actividad al añadir Tiamina
  • 18. ENZIMA INMUNOENSAYOMétodo indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señalHormonas, drogas,proteínas, etc Identifican con un anticuerpo.Anticuerpos son unidos a una enzima: Fácilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. etc Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,
  • 19. 3. Terapia enzimáticaPrincipales áreas de trabajo - Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre - Enfermedades genéticas - CáncerDegradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina, Bromelaina, Hialuronidasa).Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadasForma de administraciónEliminación de metabolitos (sangre) Endógena: Estreptoquinasa Exógena: Ureasa Bilirrubina oxidasaPosibilidad de usar enzimas inmovilizadas
  • 20. Tratamiento de Enfermedades genéticasEnfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticasEnfermedad de Gauchers GlucosilceramidasaAcumula un glucocerebrosido en los macrófagosMacrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantesPancreatitisExtros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberanFibrosis císticaDefecto genético proteína transmembrana (1/2000).Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etcConducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitisTubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).Xeroderma pigmentosoDefecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UVDefecto mecanismo reparador del ADNTratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas
  • 21. CáncerAsparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica Leucemia aguda granulocíticaTumores Necesitan asparraginaEnzima en plantas, animales y bacteriasAusente del suero de los mamiferosTratamiento en combinación con quimioterapiaFuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.Glutaminasa ExperimentaciónSerina hidratasa posibles agentesFenilalanino amonio liasa anticancerígenosLeucina dehidrogenasa Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero
  • 22. Activación de prodrogasProdrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hastaque son específicamente activadas.Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicasMetrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector
  • 23. 4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos Más de 400 deficiencias Identificación de un metabolito Ej. Fenilcetonuria Fenilpiruvato Biopsia del tejido y medida de la actividad Pruebas en el ADN
  • 24. FENILCETONURIA Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa Retraso mental Prevención dieta Detección precoz es muy importante
  • 25. INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasaHipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre Inhibición de la xantina oxidasa Gota Niveles de ácido úrico Metabolismo de las Purinas Xantina Ácido úrico Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa
  • 26. Inhibidores antiretrovirales Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA. Enzima proteasa cataliza la ruptura de la nhibidores de la proteasa. poliproteína que encápsula el virus. Necesarios para completar su proceso de replicación dando lugar a nuevos virus Dimero de 99 aminoacidos
  • 27. Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasaCentro activo en el centrode la molécula Inhibidores análogos del substrato Cambio en el enlace peptídico por un isoester
  • 28. Conclusiones Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico Enzimas estimación de metabolitos Equipamiento más sofisticado gran automatización Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN Procesos tecnológicos: Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc Terapia enzimática Tecnología de ADNEstudios estructurales Diseño de inhibidores

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