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Laboratorio de espectrofotometría (1)

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  • 1. LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA Juan David Grisales Cardona Juan David Jaramillo Orozco Darío Ricardo Ortega Jaramillo María Camila Zuleta Gonzales John Querubín Franco Aguirre INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA I UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA MEDELLÍN 2013
  • 2. OBJETIVOS 1. Reconocer el adecuado funcionamiento del espectrofotómetro. 2. Determinar experimentalmente la longitud de onda óptima de tres soluciones coloreadas por medio de la realización de una curva espectral. 3. Analizar los datos obtenidos en las pruebas de precisión y exactitud. 4. Comprender el funcionamiento del espectrofotómetro en calidad del tiempo. 5. Relacionar el uso de la espectrofotometría con el campo de estudio de la microbiología. 1- MARCO REFERENCIAL La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida dependen de forma lineal de la concentración. Además es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un material o sustancia, esto último permite, seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos nucleicos. [1] Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, como ya sabemos es un equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por medio de una longitud de onda especifica. La cantidad de luz absorbida por un medio es proporcional a la concentración del soluto presente, es entonces así que la concentración de un soluto colorido en solución puede ser determinada en el laboratorio mediante la medición de su absorción de luz a una longitud de onda específica. Las muestras en estos equipos se utilizan en estado líquido y se colocan en el compartimiento de las muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y materiales.
  • 3. En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm). La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm. La transmitancia(T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y l a absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, Ley de Lambert-Beer Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución: A = log I/Io = ε·c·l La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración – a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará- ; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo
  • 4. 2- ESPECIFICACIONES TÉCNICAS DEL EQUIPO: Interfaz estándar de interfaz serial: RS-232-C Rango de medición: 0 a 2500 A Exactitud fotométrica: < ± 0.005 A 0 a 0.500 A < ±1 % 0.501 a 2500 A Precisión fotométrica < ± 0.003 A 0 a 0.600 A < ±0.5 % 0.601 a 2500 A Deriva: 0.003 A en 30 en 30 min Rango de longitud de onda: precisión alta en los 7 filtros 340, 405, 500, 5046, 578,620, 670 nm Paso de banda: Rango UV (340 nm) = 10 nm Rango visible (405-670 nm) < 6 nm Compartimiento de cubeta: para la celda de flujo y cubetas desechables, temperatura controlada. Control de temperatura: usa regulador de temperatura 25 °C 30°C o 37 °C ; estabilidad < ± 0.1 °C hasta 20 °C. Temperatura ambiente, estabilidad < ± 0.2 °C hasta 15 °C – 32 °C
  • 5. Cubetas: utilice solamente, AMES Semi –microcuvettes 500 a 2100 microlitros AMES microcuvettes Aspirasiónprogrammable de volume(500 a 6000 microlitros) 3- TABLAS Y GRAFICOS 1. LECTURA ESPECTRO DE ABSORCION PARA SOLUCIONES COLOREADAS: LONGITUD DE ONDA SOLUCION AMARILLO- VERDE SOLUCION ROJA SOLUCION AZUL 340 0.296 0.254 0.114 405 1.426 0.138 0.194 500 0.072 0.518 0.232 546 -0.005 0.410 0.615 578 -0.001 0.188 0.838 620 0.001 0.006 0.265 670 -0.003 0.001 -0.002 Tabla 1
  • 6. Gráfico 1 Gráfico 2 Grafico 3 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 340 405 500 546 578 620 670 Absorbancia Longitud de onda Espectro de la solución amarillo-verde -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 340 405 500 546 578 620 670 Absorbancia Longitud de onda Espectro de la solución azul 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 340 405 500 546 578 620 670 Absorbancia Longitud de onda Espectro de la solución roja
  • 7. 2. CONTROL DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA LONGITUD DE ONDA ABSORBANCIA DS 6.99 x10-4 500nm 0.403 0.404 0.404 0.405 0.405 X: 0.404 0.405 0.405 0.404 0.404 0.405 Tabla 2 3. CONTROL DE ESTABILIDAD FOTOMETRICA Tabla3 Gráfico 4 0.4024 0.4026 0.4028 0.403 0.4032 0.4034 0.4036 0.4038 0.404 0.4042 0 30 60 90 120150180210240270300330360390420450480510540570600 Absorbanciaenlongituddeonda de500nm tiempo en segundos Estabilidad fotométrica ABSORBANCIAS EN 500 nm 0,404 0,404 0,404 0,404 0,404 0,404 0,404 0,404 0,403 0,404 0,404 0,403 0,404 0,404 0,403 0,404 0,404 0,403 0,404 0,403 0,403 X 0.4037 DS 4.63 x10 -4
  • 8. 4- CALCULOS: A. EXACTITUD Y PRECISION %Inexactitud = (Absorbancia hallada-Absorbancia Esperada) * 100 Absorbancia Esperada = 0.404 – 0.408 * 100 0.408 = -0.98 % Imprecisión CV = DS * 100 X CV = 6.99 x10-4 *100 = 0.17 % 0.404 B. ESTABILIDAD Deriva = (Absorbancia final- Absorbancia inicial) *100 Absorbancia inicial = 0.403 -0.404 *100 = - 0.2 % 0.404 Ruido CV = DS * 100 X CV = 4.63 x10-4 *100 = 0.115 % 0.4037
  • 9. 5- METODOS METODO PARA MYB Bilirrubina: método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total en suero y otros líquidos biológicos. [2] La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfaníli-codiazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azo-bilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a una longitud de onda de 530 nm.Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamen-te con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta)requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilitesu reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubinatotal (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debeagregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. La bilirrubina es un producto de desecho derivado del grupo hemo de la hemoglobina de los eritrocitos dañados osenescentes, que son destruidos en las células retículoendoteliales. Una vez producida, la bilirrubina se transporta alhígado en asociación con la albúmina. La bilirrubina en el hepatocito se conjuga con el ácido glucorónico y se excretaen la bilis. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a la producción, captación,metabolismo y excreción de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia. [3] METODO PARA MIA Determinación de fosfatos en aguas por espectrofotometría: Para la determinación del contenido de fosfatos solubles enuna muestra de agua mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. Se aplica el método de adición estándar para eliminar interferencias con otros compuestos. El método propuesto para determinar fosfatos se basa en la formación de unheteropoliácido con el reactivo vanado-molíbdico (de color amarillo y soluble
  • 10. en agua) cuyaabsorción de luz se mide a 420 nm. Para el ortofosfato, la formación de este complejo tienelugar según la reacción: (PO4)3− + (VO3)− + 11(MoO4)2− + 22 H+ ↔ P(VMo11O40)3− + 11 H2O (1) En esta identificación interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato yarseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la longitud de ondautilizada (420 nm, absorción del P(VMo11O40)3−). Para eliminar dicha interferencia sepreparará un blanco (sin fosfato) cuya absorbancia se restará de la del resto de las muestras.Adicionalmente, es posible que la absorbancia del complejo se vea afectada por efectos de matriz. La matriz puede potenciar o atenuar la absorbancia de luz por el complejo,lo cual puede conducir a resultados erróneos. Para minimizar este efecto, aplicaremos elmétodo de adiciones estándar, que consiste en la adición de cantidades crecientes del analitode interés (fosfato en nuestro caso) a una cantidad fija de muestra. Éste procedimiento resultamás efectivo que un calibrado externo(recta de calibrado con disoluciones patrón) cuando lamatriz interfiere en la detección. En esta práctica estudiaremos la importancia de los efectosde matriz, determinando la concentración de fosfato mediante ambos métodos y comparandolos resultados. 5- ANALISIS En el experimento de lectura del espectro de absorción para soluciones coloreadas, se obtuvieron datos que correspondieron debidamente a cada rango de longitud de onda óptima de cada color indicado por la teoría. Estos fueron (referencie tabla 1): Para la solución amarrilla (esta solución se torna un poco amarillo verdoso) en la longitud de onda que se determinó mayor absorbancia (1.426)fue en 405 nm, y en el gráfico 1 se puede evidenciar más puntalmente; por ende la longitud de onda optima para una solución amarilla es de 404 nm. Para la solución de color azul se demostró que la longitud de onda optima es 578 nm, ya que se presentó una absorbancia mayor (0,838) con respecto a las demás.
  • 11. (Gráfico 2).Aunque la longitud de onda óptima para el color azul es de 580, el espectrofotómetro utilizado no la tiene, en su reemplazo nos permite utilizar la de 578 nm. En la solución de color rojo en la longitud de onda que alcanza una mayor absorbancia es en 500 nm, a esta longitud de registró 0.518 de absorbancia. (Gráfico 3). En la prueba de control precisión y exactitud fotométrica (referencie tabla 2), los datos arrojados por el instrumento están dentro de los limites de aceptabilidad, puesto que al hacer los cálculos se confirma una inexactitud de -0.98 % y el %inexactitud aceptado es de +-3 %. El instrumento tiene exactitud. Al calcular la impresión del instrumento obtenemos un coeficiente de variación menor de 1.5 % el cual fue de 0.17%, podremos decir entonces que el instrumento presenta precisión. En el experimento de estabilidad fotométrica se observa una deriva del - 0.2 % y un ruido del 0.115 %, por lo anterior se puede deducir que la medición presentó más ruido que deriva pero en un porcentaje muy bajo encontrado dentro de los criterios de aceptabilidad. 6- CONCLUSIONES El conocer el adecuado uso del espectrofotómetro permitió obtener en el laboratorio resultados con alta calidad analítica en las mediciones que son emitidas por éste. Se determinó la longitud de onda óptima a las tres soluciones coloreadas teniendo como resultados las siguientes: solución amarilla 404 nm, para solución de color azul 578, y para la solución de color rojo una longitud de onda de 500 nm, concluyendo que los datos obtenidos experimentalmente, se encuentran dentro de los datos teóricos. Se identificó que el equipo presenta una adecuada precisión y exactitud determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.
  • 12. Se conocieron algunas aplicaciones (medición de fosfatos en agua- determinación de bilirrubina en sueros) que tiene la espectrofotometría en el campo de estudio de la microbiología tanto industrial-ambiental como en el bioanálisis. CIBERGRAFIA [1] Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol- mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf [2]http://es.scribd.com/doc/8510425/Tecnica-de-bilirrubina [3]http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/QUIMICA%20CLINICA/11515%20115 11%2011510.pdf

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