UNIVERSIDAD DE LA HABANA          INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS     CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS“Eva...
AGRADECIMIENTOSEscribir los agradecimientos es la parte más difícil porque debo resumir en pocas palabras la ayuda, la ami...
Al Dr. Eduardo Martínez, Maria del Carmen, Dinorah, Lázara e Inalvis, de la División de Desarrollo del CIGB, porsu disposi...
DEDICATORIA              A mis padres, por el amor y la educación que recibí de ellos, en              especial a mi madre...
ABREVIATURAS•   ADN        ácido desoxirribonucleico•   amp        ampicillina•   amp-r      resistencia o resistente a am...
INDICE1 INTRODUCCIÓN.........................................................................................................
3.4.1.1 Procedimientos para obtener plasmidios que codifiquen para el IFNα2b         fusionado al LipA-sp....................
4.3.4 Potencialidades de S. lividans como hospedero para la obtención de la SKC-2....... 895 DISCUSION GENERAL ..............
SÍNTESISLos hospederos heterólogos se utilizan frecuentemente para la producción de proteínas deinterés biofarmacéutico co...
Capítulo 1                                                                         Introducción1 INTRODUCCIÓNLos sistemas ...
Capítulo 1                                                                          Introducciónhidrolíticas y en los últi...
Capítulo 1                                                                              Introducciónen su forma trimérica ...
Capítulo 1                                                                           Introducciónsistema de búsqueda de pr...
Capítulo 1                                                                           Introducciónpotencialmente inmunogéni...
Capítulo 1                                                                             Introducciónpor glicosilación o deg...
Capítulo 1                                                                            Introducción           a) péptido se...
Capítulo 1                                                                       Introducción   4. La utilización del pépt...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográfica2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficalos estreptomicetos61. A...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficaindependientemente68. Re...
Capítulo 2                                                                   Revisión Bibliográficaser transportados indep...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficaha dado lugar a la regla...
Capítulo 2                                                                   Revisión Bibliográficalos nuevos polipéptidos...
Capítulo 2                                                                 Revisión Bibliográficaposterior se demostró que...
Capítulo 2                                                                Revisión Bibliográficaes aún limitado y la maner...
Capítulo 2                                                                 Revisión BibliográficaTat en Streptomyces se de...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficamembrana y media la inse...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficamás importante en el pro...
Capítulo 2                                                                 Revisión Bibliográfica2.3 Streptomyces como hos...
Capítulo 2                                                                  Revisión BibliográficaPara la expresión de gen...
Capítulo 2                                                                       Revisión Bibliográficatendamistat utiliza...
Capítulo 2                                                                  Revisión BibliográficaLa fusión de un péptido ...
Capítulo 2                                                                  Revisión Bibliográficaindiferenciadas (SCF) y ...
Capítulo 2                                                                 Revisión Bibliográficaosmolitos fueron utilizad...
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Elsa pimienta
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Elsa pimienta

547

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
547
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
6
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Elsa pimienta

  1. 1. UNIVERSIDAD DE LA HABANA INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS“Evaluación de Streptomyces lividans como hospedero para la expresión de interferón alfa 2b y estreptoquinasa” Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias de la Salud Autor: Lic. Elsa T. Pimienta Rodríguez Tutores: Dr. Carlos Vallín Plous Dr. Jozef Anné Ciudad de La Habana 2009
  2. 2. AGRADECIMIENTOSEscribir los agradecimientos es la parte más difícil porque debo resumir en pocas palabras la ayuda, la amistad, elcompañerismo, el cariño o el amor de las personas que me han acompañado por tantos años o en momentos muyoportunos. Trataré de no olvidar mencionar a todos los que me han ayudado.Quisiera agradecer a mis amigos del lab Cary, Leo, Jony, Julito, Mónica y Sandra por compartir todos estos añosjuntos, su paciencia y ayudarme a terminar; y también a Yanelis, Aniurka, Loreta, Ricardo, Yane, Tai y otros que yano están.A Vallín por ser mi tutor, por darme la oportunidad de recibir entrenamientos en otros laboratorios y por incidir tantoen que termine la tesis.A mis amigos del antiguo CQF, en especial a Ulises, René, Dagmar Patricia y Ritsie por escucharme,comprenderme y animarme a terminar.A mis queridos amigos del antiguo lab de cólera del CENIC y a todos los nuevos que se han incorporado por estardispuestos siempre a ayudar y hacerme sentir en una gran familia: Karen, Javier, Fando, Edicilla, Talena, Celso,Elsa, Boris, Luly, Betty, Ernesto, Lino, Ludis, Mayrin y Orlando.A mis queridos Alina y Andy por brindarme su amistad y su laboratorio como si fuera el mío para la purificación dela SKC-2.A Raudel, Yamilé, Neida, Nieves y a todos los que trabajaron en Control de Procesos del CIGB el año que estuvecon ellos, por brindarme su alegría y ayuda. A Abrisleida por ayudarme en la realización de muchos de los ELISAsque se hicieron en el trabajo de IFNα2b. En especial a Julio César por su amistad y por estar siempre dispuesto aescucharme y ayudarme.A los oponentes de predefensa Drs. Rafael Fando y Javier Campos por el cuidado, los conocimientos y el esmeroen la revisión del documento de tesis. Gracias a ellos la tesis dio un salto increíble en organización y calidad.A la Dra. Gisela Cañedo, a los miembros del Dpto. de Postgrado y al Consejo Científico de Biotecnología delCENIC por la ayuda prestada en el acto de predefensa.A mis amigos Karen, Celso, Alina y Dagmar por revisar el documento de tesis y por las magníficas sugerencias.A Luciano Hernández por estar siempre dispuesto a apoyarme y ayudarme desde el primer momento que le pedísu opinión sobre la tesis.A Chang por ser mi amigo y ayudarme tanto en las fermentaciones de Streptomyces.Al Profe Higginson, Dannelis, Crislene y Nelson por estar siempre dispuestos a apoyarme y animarme cada vezque les pedí ayuda y por hacerme sentir en su laboratorio como en el mío.Al Profe Anné, Wesley, Smitha, Sophie, Kristof, Nick, Elke, Eef, y en especial a Lieve por contribuir notablemente ami formación el tiempo que estuve en el Instituto Rega y al regresar.A mis queridos Gina, Paul, Jeannine y Rik por su cariño, toda la ayuda que me brindaron y por hacerme sentir enLovaina como en casa.Al Dr. Gustavo Sierra por su disposición a orientarme y ayudarme desde el primer momento en que lo conocí.A mi amigo Ariel por ser incondicional cada vez que necesite mandar correspondencias, fotocopiar, imprimirdocumentos. Eres especial.A Loany por su paciencia, tiempo, ayuda y todos los consejos electrónicos en tiempos de dudas.A Leonardo por su amistad y ayuda en un momento muy importante de la tesis.Al Prof. Paul Proost del Instituto Rega por realizar las secuencias amino terminal de la SKC-2. i
  3. 3. Al Dr. Eduardo Martínez, Maria del Carmen, Dinorah, Lázara e Inalvis, de la División de Desarrollo del CIGB, porsu disposición a realizar las determinaciones de ELISA y actividad biológica de la SKC-2.A Jorge Valdés por su valiosa y oportuna ayuda en un momento muy importante de la tesis.A Joel Ferrero y Mayda Martínez del Dpto. de Control de la Calidad del CIGB por la realización de los ensayos deactividad antiviral del IFNα2b y el ensayo in vitro de lisis del coágulo de fibrina para la SKC-2.A mis profesores del Instituto de Farmacia y Alimentos, a los que están y a los que ya no se encuentran, por suformación inicial que me permitió llegar aquí. Al Dr. Oscar Ros por su comprensión y ayuda.A Maillo, Ivón y Elenita por ayudarme en la impresión de los documentos de la tesis.A Pipo, por los años de ayuda incondicional a encontrar reactivos; artículos, documentos y hacer presentaciones.Por su apoyo y ayuda cuando estuve en Bélgica y por editar e imprimir los documentos de tesis y resumen depredefensa como si fueran suyos. Su ayuda fue muy valiosa.A mi mamá, por ser ante todo mi amiga, por su amor y apoyo incondicional y por no dejarme renunciar nunca. A mihermano Herminito y mi sobrinito Eddy por su cariño, a Ivón, a Daysi, Tony y a mi familia por su apoyo y cariño.A mi querido Dios por ayudarme y sostenerme tantas veces antes de ni siquiera pensar en llegar hasta aquí. ii
  4. 4. DEDICATORIA A mis padres, por el amor y la educación que recibí de ellos, en especial a mi madre por su ternura y ayuda incondicional. A mi hermano Herminito por su cariño y a mi sobrino Eddy por su alegría y momentos felices. iii
  5. 5. ABREVIATURAS• ADN ácido desoxirribonucleico• amp ampicillina• amp-r resistencia o resistente a ampicillina• ARN ácido ribonucleico• ELISA ensayo inmunoenzimático (por sus siglas en inglés, Enzyme Linked Immunosorbent Assay)• EDTA ácido etilendiaminotetracético• FDA órgano regulatorio para medicamentos y alimentos de EE. UU. (por sus siglas en inglés, Food and Drug Administration)• IFNα2b interferón alfa 2b• kb kilobase• LPS lipopolisacáridos• min minutos• pb par de bases nucleotídicas• PBS solución salina tamponada con fosfato (por sus siglas en inglés, Phosphate Buffered Saline)• PBS-T PBS suplementado con tween 20 al 0,05%.• PCR reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction)• PEG polietilenglicol• Plg plasminógeno• RBS sitio de unión al ribosoma (por sus siglas en inglés, Ribosome Binding Site)• rpm revoluciones por minuto• SDS dodecil sulfato de sodio (por sus siglas en Inglés, Sodium Dodecil Sulfate)• SDS-PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (por sus siglas en inglés, SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)• SN sobrenadante de cultivo• tsr tioestreptona• tsr-r resistencia o resistente a tioestreptona• Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano iv
  6. 6. INDICE1 INTRODUCCIÓN........................................................................................................12 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.....................................................................................9 2.1 Fisiología y genética de Streptomyces ............................................................................... 9 2.2 Translocación de proteínas en bacterias........................................................................... 11 2.2.1 Señales de translocación............................................................................................ 12 2.2.2. Procesos de translocación Sec y Tat en bacterias .................................................... 13 2.2.2.1 Sistema de secreción Sec en bacterias................................................................ 13 2.2.2.2 Sistema de secreción Tat en bacterias ................................................................ 15 2.2.3 Componentes que intervienen en eventos post-traduccionales ................................. 18 2.2.3.1 Peptidasas señales .............................................................................................. 18 2.2.3.2 Enzimas que asisten en el plegamiento de las proteínas .................................... 19 2.3 Streptomyces como hospedero para la producción de proteínas heterólogas................... 20 2.3. 1 Elección de la cepa hospedera.................................................................................. 20 2.3. 2 Vectores de clonación .............................................................................................. 20 2.3. 3 Elección del promotor .............................................................................................. 20 2.3. 4 Terminadores de la transcripción ............................................................................. 21 2.3. 5 Sitio de unión al ribosoma........................................................................................ 22 2.3. 6 Uso de codones......................................................................................................... 22 2.3. 7 Péptido señal ............................................................................................................ 22 2.3. 8 Sitio de corte de la peptidasa señal........................................................................... 23 2.3. 9 Condiciones de cultivo y proteasas del hospedero................................................... 24 2.3.10 Aplicaciones y rendimientos de producción ........................................................... 25 2.4 Proteínas de interés biofarmacéutico................................................................................ 27 2.4.1 Interferón α 2b humano ............................................................................................ 27 2.4.1.1 Estructura y propiedades físico-químicas del IFNα2b....................................... 27 2.4.1.2 Mecanismo de acción y actividad biológica del IFNα2b................................... 27 2.4.1.3 Obtención de IFNα2b en hospederos heterólogos ............................................. 28 2.4.2 Estreptoquinasa ......................................................................................................... 30 2.4.2.1 Estructura y propiedades físico-químicas de la SKC ......................................... 30 2.4.2.2 Mecanismo de acción de la SKC........................................................................ 31 2.4.2.3 Ventajas y desventajas de la SKC ...................................................................... 32 2.4.2.4 Obtención de la SKC.......................................................................................... 333 MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................36 3.1 Cepas bacterianas empleadas ........................................................................................... 36 3.2 Medios de cultivo para el crecimiento bacteriano y procedimientos utilizados en el trabajo con S. lividans ........................................................................................................ 37 3.2.1 Medios de cultivo, soluciones y procedimientos utilizados en el trabajo con S. lividans ........................................................................................................................... 37 3.3 Procedimientos generales................................................................................................. 40 3.3.1 Procedimientos utilizados en el trabajo con ADN .................................................... 40 3.3.2 Procedimientos utilizados en el trabajo con proteínas .............................................. 42 3.4 Procedimientos para obtener cepas recombinantes de S. lividans TK24 ......................... 43 3.4.1 Procedimientos para obtener plasmidios replicativos que codifiquen para el IFNα2b fusionado al LipA-sp o al Vsi-sp o al XlnC-sp .............................................................. 43 v
  7. 7. 3.4.1.1 Procedimientos para obtener plasmidios que codifiquen para el IFNα2b fusionado al LipA-sp.................................................................................................. 43 3.4.1.2 Procedimientos para obtener plasmidios que codifiquen para el IFNα2b fusionado al Vsi-sp o al XlnC-sp ............................................................................... 48 3.4.2. Procedimientos para obtener plasmidios replicativos que codifiquen para la SKC-2 fusionada al LipA-sp o al Vsi-sp o al XlnC-sp .............................................................. 52 3.4.2.1 Procedimiento para obtener una construcción genética que permita fusionar el gen skc-2 en el marco de lectura de lipA-ss, vsi-ss o xlnC-ss..................................... 52 3.4.2.2 Procedimiento para obtener un plasmidio que codifique para la SKC-2 fusionada al LipA-sp................................................................................................................... 53 3.4.2.3 Procedimiento para obtener un plasmidio que codifique para la SKC-2 fusionada al Vsi-sp...................................................................................................................... 54 3.4.2.4 Procedimiento para obtener un plasmidio que codifique para la SKC-2 fusionada al XlnC-sp .................................................................................................................. 55 3.4.3 Introducción de los plasmidios recombinantes en S. lividans TK24......................... 56 3.5 Procedimientos para evaluar la expresión y secreción del IFNα2b o la SKC-2 por las cepas de S. lividans recombinantes .................................................................................... 56 3.5.1 Procedimientos para evaluar la expresión y secreción del IFNα2b .......................... 56 3.5.2 Procedimientos para evaluar la expresión y secreción de la SKC-2 ......................... 58 3.6 Procedimientos para la purificación y caracterización de la SKC-2 recombinante ......... 59 3.6.1 Purificación de la SKC-2 recombinante.................................................................... 59 3.6.1.1 Cromatografía de intercambio aniónico............................................................. 59 3.6.1.2 Cromatografía de interacciones hidrofóbicas..................................................... 60 3.6.2 Procedimientos para la caracterización de la SKC-2 purificada ............................... 614 RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................63 4.1 Obtención de cepas de S. lividans TK24 que portan plasmidios replicativos que codifican para el IFNα2b o la SKC-2 ................................................................................................ 63 4.1.1 Obtención de plasmidios replicativos que codifican para el IFNα2b en S. lividans. 63 4.1.1.1 Obtención de plasmidios que codifican para el IFNα2b fusionado al LipA-sp. 63 4.1.1.2 Obtención de un plasmidio que codifica para el IFNα2b fusionado al Vsi-sp .. 66 4.1.1.3 Obtención de un plasmidio que codifica para el IFNα2b fusionado al XlnC-sp 67 4.1.2 Obtención de plasmidios replicativos que codifican para la SKC-2 en S. lividans .. 68 4.1.2.1 Obtención de un plasmidio que codifica para la SKC-2 fusionada al LipA-sp . 68 4.1.2.2 Obtención de un plasmidio que codifica para la SKC-2 fusionada al Vsi-sp .... 69 4.1.2.3 Obtención de un plasmidio que codifica para la SKC-2 fusionada al XlnC-sp . 70 4.1.3 Obtención de las cepas de S. lividans TK24 recombinantes ..................................... 70 4.2 Evaluación de la secreción del IFNα2b o la SKC-2 por S. lividans ................................ 71 4.2.1 Expresión secretoria del IFNα2b en S. lividans........................................................ 71 4.2.1.1 Proceso de secreción que utiliza el LipA-sp para mediar la translocación del IFNα2b en S. lividans ................................................................................................ 76 4.2.2 Expresión secretoria de la SKC-2 en S. lividans....................................................... 77 4.3 Purificación de la SKC-2 secretada por S. lividans.......................................................... 80 4.3.1 Selección de un medio de cultivo adecuado para la producción secretoria y purificación de la SKC-2................................................................................................ 80 4.3.2 Purificación de la SKC-2........................................................................................... 82 4.3.3 Análisis físico- químico y biológico de la SKC-2 purificada ................................... 88 vi
  8. 8. 4.3.4 Potencialidades de S. lividans como hospedero para la obtención de la SKC-2....... 895 DISCUSION GENERAL ...........................................................................................936 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...........................................................97 CONCLUSIONES................................................................................................................ 97 RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 987 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................998 AUTOBIBLIOGRAFÍA ...........................................................................................1149 ANEXOS ................................................................................................................118 vii
  9. 9. SÍNTESISLos hospederos heterólogos se utilizan frecuentemente para la producción de proteínas deinterés biofarmacéutico como una alternativa eficaz al aislamiento a partir de su fuentenatural. Escherichia coli ha sido el hospedero heterólogo más utilizado. Sin embargo, muchasproteínas se acumulan en cuerpos de inclusión, lo cual dificulta los procesos dereplegamiento de estas en su conformación nativa. En contraste, las bacterias grampositivascomo Streptomyces lividans ofrecen la ventaja de secretar las proteínas al medio de cultivo yesto favorece su correcto plegamiento y facilita su purificación. En este trabajo se evalúa lautilidad de S. lividans TK24 para secretar interferón α 2b humano (IFNα2b) y estreptoquinasade Streptococcus equisimilis ATCC9542 (SKC-2) biológicamente activos al medio de cultivo.Para mediar la secreción de ambas proteínas se seleccionaron los péptidos señales delinhibidor de subtilisina de Streptomyces venezuelae CBS762.70 (Vsi-sp) –dependiente de lavía Sec-, de la xilanasa C de Streptomyces lividans –dependiente de la vía Tat- y el de lalipasa A de Streptomyces exfoliatus M11 (LipA-sp), el cual no había sido utilizado conanterioridad. S. lividans TK24 secretó la SKC-2, fusionada al Vsi-sp, biológicamente activa almedio de cultivo hasta 4 mg l-1. La SKC-2 fue purificada a escala de laboratorio mediante lascromatografías de intercambio iónico e interacciones hidrofóbicas; lo que permitió aumentarsu pureza hasta el 90%. La SKC-2 purificada tuvo una actividad específica de 35 928 UI mg–1y su identidad fue verificada mediante la secuenciación de su extremo amino. Además, laproteína purificada tuvo un máximo de absorción UV característico a los 277 nm. Los nivelesde la SKC-2 secretada aumentaron hasta 15 mg l-1 cuando la cepa recombinante fue cultivadasiguiendo un procedimiento de fermentación por lote no optimizado a escala de banco. Esteincremento en la cantidad secretada de la SKC-2 muestra el potencial que tiene laoptimización de la fermentación de S. lividans para la obtención soluble de la estreptoquinasaSKC-2.El IFNα2b fue secretado biológicamente activo al medio extracelular de S. lividans TK24cuando se fusionó al Vsi-sp o al LipA-sp a niveles <1 mg l-1. Estos niveles de expresión sonbajos, pero aún quedan posibilidades por explorar para incrementar la cantidad del IFNα2b;entre ellas, la evaluación de otros péptidos señales para dirigir la secreción de estabiomolécula.S. lividans TK24 es un hospedero bacteriano no patógeno, que no posee LPS en suestructura celular. Estas propiedades lo hacen más atractivo para la obtención biológicamenteactiva de la SKC-2, una proteína de gran utilidad en la práctica clínica. viii
  10. 10. Capítulo 1 Introducción1 INTRODUCCIÓNLos sistemas de expresión heteróloga se utilizan frecuentemente para la producción deproteínas de importancia biofarmacéutica debido a que pueden alcanzar mayores niveles deproducción que la fuente original. Se han empleado sistemas de expresión efectivos queincluyen las bacterias, levaduras, células de mamíferos, plantas y animales transgénicos parala obtención de proteínas a gran escala con fines industriales o a pequeña escala paraestudiar su función. La elección de un sistema en particular depende de varios factores comotiempo de producción, costos, aplicaciones, características de la proteína de interés,expresión intracelular o extracelular, modificaciones post-traduccionales, actividad biológica,entre otros. Los rendimientos de las proteínas recombinantes varían dependiendo de laproteína específica y del sistema de expresión seleccionado.Dentro de la amplia variedad de herramientas disponibles para expresar proteínas de origenheterólogo, las bacterias son, en muchos casos, los hospederos más atractivos debido a suscaracterísticas de crecimiento y los bajos costos relativos asociados. Son especialmente útilescuando las proteínas de interés no requieren modificaciones post-traduccionales para quesean biológicamente activas. Escherichia coli continúa siendo el hospedero bacteriano másutilizado debido a su rápido crecimiento en sustratos relativamente baratos, su genética biencaracterizada y la disponibilidad comercial de gran cantidad de vectores de clonación y cepasmejoradas1. En general, en este microorganismo, las proteínas recombinantes sobre-expresadas se acumulan en el citoplasma o en el espacio periplasmático. Con mayorfrecuencia, el citoplasma es la primera elección debido a que se obtienen generalmenterendimientos más altos, pero la acumulación intracelular de las proteínas en cuerpos deinclusión requiere de procesos de extracción de las proteínas con agentes fuertes y derenaturalización para el replegamiento adecuado de las proteínas, los cuales pueden afectarsu actividad biológica. Esos procesos suelen ser laboriosos, caros y con consecuencias parael medio ambiente1,2.Por tales razones, algunos géneros de bacterias grampositivas están siendo evaluados comohospederos para la producción de proteínas heterólogas debido a que estas bacteriassecretan directamente las proteínas al medio extracelular. La posibilidad de purificar laproteína del medio de cultivo es una ventaja importante pues el material de partida tienemayor pureza que el material soluble intracelular y por ende, el número de pasos del procesode purificación es menor. Ciertas especies de Lactococcus y Corynebacterium, utilizadastambién en la industria alimenticia, parecen prometedoras como hospederos3-6. Algunasespecies de bacilos o estreptomicetos secretan naturalmente grandes cantidades de enzimas 1
  11. 11. Capítulo 1 Introducciónhidrolíticas y en los últimos años han sido investigadas para la producción secretoria deproteínas heterólogas7-9.Los estreptomicetos se conocen por producir más de la mitad de 10 000 compuestosbioactivos documentados y se consideran una reserva de productos naturales10-13. El géneroStreptomyces ha sido de interés a la investigación académica por producir dos tercios de losantibióticos obtenidos por vía natural y una amplia gama de metabolitos con actividadantifúngica, antitumoral, antihelmíntica o herbicidas, entre otros11,13. Además, varias especiesde este género secretan eficientemente proteínas y enzimas extracelulares, dentro de las quese destacan celulasas, amilasas, xilanasas, proteasas, endonucleasas de restricción ylipasas12.Debido a la gran diversidad de biomoléculas que secreta el género Streptomyces también hasido de interés a la industria; y por más de 50 años se han comercializado fundamentalmenteantibióticos y enzimas extracelulares producidas por estas bacterias12,14. Como resultado delos años de experimentación se dispone de experiencia en la optimización de lasfermentaciones de Streptomyces para incrementar los rendimientos de las biomoléculas deinterés, 12,14.Entre los Streptomyces, Streptomyces lividans es el que ha sido generalmente utilizado parala expresión de genes13; y en los últimos años, su capacidad natural de secretar proteínas –tales como xilanasas (A, B y C), quitinasa, endoglucanasas (A y B), β-galactosidasa, esterasa,entre otras- ha sido evaluada para la obtención de proteínas recombinantes7,14-16. S. lividansno posee un extenso sistema de restricción-modificación al ADN foráneo, no se ha informadosobre la ocurrencia de cuerpos de inclusión en su citoplasma y es considerado un organismono patógeno a humanos (nivel de contención 1)13. Particularmente, el derivado S. lividansTK24 ha sido frecuentemente utilizado ya que posee relativamente baja actividad deproteasas extracelulares, las cuales pueden afectar la integridad y los rendimientos de lasproteínas12,14.Cuando se ha utilizado a S. lividans para la producción de proteínas recombinantes, laestrategia ha sido fusionar el gen de interés a la secuencia señal de una proteína homólogaabundantemente secretada a través de la vía de secreción Sec12,14. Uno de los ejemplos mássobresalientes ha sido la obtención del factor α de necrosis tumoral murino (mTNFα) a nivelesde 300 mg l-1 de sobrenadante de cultivo (SN) cuando se utilizaron las señales reguladoras yde secreción del inhibidor de subtilisina de Streptomyces venezuelae CBS762.70 (Vsi)17.Posteriormente, el mTNFα fue secretado entre 200 y 300 mg l-1 al medio de cultivo cuando lacepa recombinante fue crecida en el caldo TSB a escala piloto18. Esta citocina fue purificada 2
  12. 12. Capítulo 1 Introducciónen su forma trimérica nativa a partir de Streptomyces y fue significativamente más activa quela forma dimérica obtenida a partir de E. coli18. Actualmente el mTNFα es comercializado porMinotech Biotechnology (Creta, Grecia). Este resultado sugiere que las señales reguladoras yde secreción del vsi pueden ser eficientes en dirigir la expresión y translocación de otrasproteínas heterólogas en S. lividans TK24.En general, los estreptomicetos tienen gran potencial como fuente de nuevas proteínasextracelulares y, por consiguiente, de nuevas señales reguladoras y de secreción para serevaluadas en la expresión de proteínas de interés biofarmacéutico. Particularmente, algunasespecies del género Streptomyces con conocidas por secretar abundantemente enzimaslipolíticas, de las cuales no se ha informado sobre la utilización de sus señales de secreciónpara dirigir la translocación de proteínas heterólogas en S. lividans. Por lo antes expuesto, esatractivo evaluar el péptido señal de una lipasa, como el de la lipasa A de Streptomycesexfoliatus M1119,20 (LipA), para dirigir la translocación de proteínas de interés en S. lividans.Recientemente se informó sobre la funcionalidad del proceso de translocación “twin-arginine”(Tat) en S. lividans TK24; que, a diferencia del proceso Sec, secreta proteínas de variadasdimensiones que han adquirido algún grado de estructura terciaria en el citoplasma21. Esteproceso de secreción fue recientemente evaluado para la expresión del factor α de necrosistumoral humano (hTNFα) y la interleucina 10 humana (IL-10) en S. lividans TK24. Ambasproteínas fueron fusionadas, por separado, al péptido señal de la xilanasa C de S. lividans(XlnC-sp) o al de la tirosinasa de Streptomyces antibioticus (MelC1-sp). La xilanasa C y latirosinasa son únicamente translocadas a través del proceso Tat, puesto que su secreción sebloqueó en mutantes de S. lividans TK24 en los genes tatB y tatC21,22. El hTNFα y la IL-10 sesecretaron a través de la vía Tat en S. lividans, pero los rendimientos fueron menorescomparados con los obtenidos por la vía Sec, cuando las dos proteínas se fusionaron porseparado al péptido señal del Vsi (Vsi-sp)23.El péptido señal de MelC1 también ha sido utilizado para dirigir la translocación del TNFαhumano24, la fofatasa alcalina de E. coli24, la linfotóxina humana24 y la calcitoína de salmón25antes de que se informara que la proteína nativa es secretada exclusivamente a través de lavía Tat en Streptomyces. Particularmente, la calcitoína de salmón fue obtenida a niveles de30 mg l-1 cuando la cepa recombinante fue cultivada en el medio de la caseína en unfermentador25. Este péptido fue recobrado con una actividad y conformación equivalente alestándar sintético.En el año 2006, Widdick y cols aportaron evidencias sobre la utilización del proceso Tat comouna vía general de secreción de proteínas en Streptomyces coelicolor26 y desarrollaron un 3
  13. 13. Capítulo 1 Introducciónsistema de búsqueda de proteínas secretadas exclusivamente por la vía Tat que empleó laagarasa de S. coelicolor como proteína reportera de la secreción Tat. Cerca del 30% de lasproteínas secretadas por S. coelicolor fueron identificadas como sustratos translocadosúnicamente por la vía Tat26. Esta ruta puede, como consecuencia, ser una alternativa valiosapara la secreción de proteínas “incompatibles con el sistema Sec” en Streptomyces.La optimización del medio de cultivo y de los parámetros de la fermentación ha sido unaalternativa muy utilizada para incrementar los rendimientos de las proteínas nativas yheterólogas producidas por S. lividans8,18,27. Particularmente, el incremento de la osmolaridaddel medio de cultivo ha sido efectivo para aumentar los rendimientos de varias enzimasexpresadas por S. lividans27,28. Ali y cols reportaron que al incrementar la osmolaridad delmedio de cultivo hubo cambios en el super-enrrollamiento negativo del ADN e incrementossignificativos de las cantidades de las enzimas expresadas28. En ese estudio, al medio decultivo TSB completo (TSB suplementado con extracto de levadura) se le adicionaron lososmolitos sacarosa (BTSB)29 o NaCl28. DeSanti y cols reportaron niveles de 2 mg l-1 deendostatina humana secretada por S. lividans cuando fue cultivado en caldo TSB completosuplementado con sacarosa, los cuales fueron similares a las cantidades de otras proteínas 14,30de origen humano secretadas por S. lividans . Erpicum y cols también reportaron unincremento significativo en las cantidades de tres β-lactamasas secretadas por S. lividanscuando las cepas recombinantes fueron cultivadas en presencia de sacarosa27.Para estudiar la secreción de proteínas heterólogas a través de las vías Sec y Tat en S.lividans TK24, se analizaron las propiedades terapéuticas y las fuentes de obtención delinterferón α 2b humano (IFNα2b) y la estreptoquinasa de Streptococcus equisimilis (SKC). ElIFNα2b ha sido utilizado satisfactoriamente en el tratamiento de hepatitis B y C, papilomatosisrespiratoria, esclerosis múltiple, condilomas, conjuntivitis hemorrágica, esquizofrenia y otrasenfermedades, incluyendo 14 tipos de cáncer31-33. La SKC fue la primera droga introducidacomo terapia para el infarto agudo del miocardio hace más de 40 años34 y es un agentefibrinolítico de elección, principalmente en países en vías de desarrollo. Actualmente formaparte de la Lista Modelo de los Medicamentos Esenciales propuesta por la OrganizaciónMundial de la Salud35.La obtención por vía recombinante de estas dos biomoléculas ha sido extensamenteinvestigada considerando, en ambos casos, las limitaciones de obtención a partir de la fuentenatural. El IFNα2b es una proteína secretada naturalmente por los leucocitos humanos,mientras que la SKC es secretada por Streptococcus equisimilis al medio de cultivo a bajosniveles. Esta bacteria grampositiva secreta varias toxinas al medio extracelular que son 4
  14. 14. Capítulo 1 Introducciónpotencialmente inmunogénicas en humanos. Por ello, la producción comercial actual de laSKC a partir de su fuente natural requiere de condiciones estrictas de bioseguridad y uncontrol de calidad riguroso del producto manufacturado35,36.En Cuba se reportó la expresión del IFNα2b en E. coli por primera vez por Silva y cols en198837. Posteriormente se informó la expresión a altos niveles de la estreptoquinasa mutanteSKC-2 por Estrada y cols38. Desde hace varios años estas dos proteínas se producen enCuba como productos recombinantes obtenidos a partir de E. coli. Sin embargo, ambasmoléculas se acumulan inactivas en cuerpos de inclusión en el citoplasma, lo cual tiene ladesventaja de requerir procesos de extracción y renaturalización para la solubilización y elreplegamiento adecuado de las proteínas39-41. Durante el proceso de renaturalización ocurrenpérdidas considerables, como en el caso del IFNα2b que se reportan mermas del 50%39. Delmaterial que se recupera del proceso de renaturalización se pueden obtener moléculasacetiladas, con aminoácidos oxidados, con una metionina en el extremo amino, agregadosmoleculares y en el caso del IFNα2b con cisteínas parcial o completamente reducidas o conpuentes disulfuro malformados. Algunas de estas especies moleculares tienen baja actividadespecífica y pueden ser responsables de reacciones adversas e inmunogénicas40.Para facilitar el recobrado del IFN2αb se ha estudiado su expresión secretoria en Bacillussubtilis y Saccharomyces cerevisiae42,43. B. subtilis expresó el IFNα2b fusionado al péptidoseñal de la α amilasa de Bacillus amyloliquefaciens con rendimientos entre 0,5 y 1 mg l-1 yuna actividad antiviral semejante al IFNα2b nativo (108 UI l-1)42. Niveles similares de actividadantiviral fueron obtenidos cuando el IFNα2b se fusionó a su péptido señal nativo o a unhíbrido compuesto por los péptidos señales del interferón alfa 1 y 2 y se utilizó a S. cerevisiaecomo hospedero. En este caso, se detectó heterogeneidad en el extremo amino del IFNα2b43.En el caso de la SKC, su expresión secretoria ha sido estudiada extensamente en varioshospederos bacterianos y en las levaduras Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe. Elgen skc de S. equisimilis H46A fue inicialmente clonado en E. coli44 y se han informado variasestrategias para incrementar la productividad de la SKC como su fusión a péptidos señales deproteínas secretadas en E. coli45-49. B. subtilis también fue utilizado como hospedero para laexpresión secretoria de la SKC y los mejores resultados se obtuvieron con la cepa WB600,deficiente en seis proteasas extracelulares50. Lactococcus lactis fue otro hospederobacteriano utilizado para la obtención de la SKC, pero esta fue degradada por proteasas delhospedero a productos inactivos51. Cuando P. pastoris fue utilizada como hospedero, la SKCfue secretada al medio de cultivo pero fue modificada post-traduccionalmente por N-glicosilación52. En S. pombe, se reportó la expresión secretoria de la SKC sin modificaciones 5
  15. 15. Capítulo 1 Introducciónpor glicosilación o degradación significativa. Sin embargo, la SKC solamente se secretó alperiplasma53. La secreción de la estreptoquinasa SKC-2 de Streptococcus equisimilisATCC9542 ha sido estudiada en E. coli y P. pastoris45,54-56. Los rendimientos de la SKC-2alcanzaron hasta 5 000 UI ml-1 cuando dicha proteína fue fusionada a la secuencia señalompA de E. coli. Sin embargo, cerca del 95% de la SKC-2 fue secretada principalmente alperiplasma de E. coli45. Estrada y cols ensayaron la expresión extracelular de la SKC-2 en P.pastoris, pero la proteína fue modificada por glicosilación56. Por lo antes reportado se justificala búsqueda de un nuevo hospedero para la expresión secretoria de la estreptoquinasa.S. lividans es una bacteria grampositiva que secreta directamente las proteínas al medioextracelular y ha sido satisfactoriamente utilizada para la expresión de proteínas de origeneucariota14,18,25,57 y procariota8,15,58 correctamente plegadas, no glicosiladas y bioactivas en elmedio de cultivo. Ello ha simplificado el recobrado de la proteína de interés.Teniendo en consideración lo antes expuesto y que en Cuba hay disponibilidad de sistemasanalíticos establecidos para la detección, cuantificación y caracterización de las proteínasIFNα2b y la SKC-2, la hipótesis de este trabajo fue la siguiente:“Streptomyces lividans TK24 secreta al medio extracelular el interferón alfa 2b o laestreptoquinasa SKC-2 biológicamente activos, cuando los expresa fusionados al péptidoseñal del inhibidor de la subtilisina de S. venezuelae, de la lipasa A de S. exfoliatus M11 o dela xilanasa C de S. lividans”.Para probar o refutar la hipótesis se planteó el siguiente Objetivo general:Evaluar si Streptomyces lividans TK24 transformado con plasmidios que codifican proteínasde fusión entre el péptido señal del inhibidor de la subtilisina de S. venezuelae, de la lipasa Ade S. exfoliatus M11 o de la xilanasa C de S. lividans y el interferón alfa 2b o laestreptoquinasa SKC-2 secreta las biomoléculas en estado biológico activo.Objetivos específicos1. Obtener cepas de S. lividans TK24 transformadas con plasmidios replicativos que codifiquen para proteínas de fusión entre cada péptido señal y interferón alfa 2b o a la SKC-2.Tareas:1.1 Construcción de plasmidios replicativos que codifiquen para el IFNα2b fusionado al: a) péptido señal del inhibidor de subtilisina de S. venezuelae CBS762.70 b) péptido señal de la xilanasa C de S. lividans c) péptido señal de la lipasa A de S. exfoliatus M11.1.2 Construcción de plasmidios replicativos que codifiquen para la SKC-2 fusionada al: 6
  16. 16. Capítulo 1 Introducción a) péptido señal del inhibidor de subtilisina de S. venezuelae CBS762.70 b) péptido señal de la xilanasa C de S. lividans c) péptido señal de la lipasa A de S. exfoliatus M11. Transformación de S. lividans TK24 con cada plasmidio obtenido por separado.2. Evaluar si las cepas de S. lividans TK24 recombinantes secretan al cultivo el interferón alfa 2b o la estreptoquinasa SKC-2 y si las biomoléculas secretadas son biológicamente activas.Tareas:2.1 Inmunodetección por Western blotting e inmunocuantificación por ELISA del producto génico IFNα2b o SKC-2 expresado por la cepa recombinante crecida en zaranda en el medio de cultivo BTSB.2.2 Cuantificación de la actividad biológica antiviral del IFNα2b expresado por S. lividans TK24 en las condiciones indicadas en 2.1.2.3 Detección por zimografía de la actividad amidolítica de la SKC-2 expresada por S. lividans TK24 en las condiciones indicadas en 2.1.3. Purificar las proteínas IFNα2b o SKC-2, si alguna de ellas se secreta al medio de cultivo en forma biológicamente activa y alcanza una concentración ≥ 2,0 mg l-1Tareas:3.1 Inmunocuantificación por ELISA e Inmunodetección por Western blotting del IFNα2b o la SKC-2 expresado por la cepa recombinante crecida en zaranda en los medios de cultivo BTSB, TSB y en el medio de la caseína.3.2 Purificación del IFNα2b o la SKC-2 mediante técnicas cromatográficas convencionales.3.3 Análisis físico, químico y biológico del producto purificado mediante espectrofotometría UV, secuenciación del extremo amino y actividad biológica.3.4 Evaluación del potencial de S. lividans para la expresión del IFNα2b o la SKC-2 mediante su cultivo en un fermentador a escala de banco.Novedad científica Este trabajo de tesis informa por primera vez a la comunidad científica: 1. La secreción del interferón alfa 2b humano biológicamente activo al medio extracelular en Streptomyces lividans. 2. La secreción de la estreptoquinasa SKC-2 de Streptococcus equisimilis ATCC9542 biológicamente activa al medio extracelular en Streptomyces lividans. 3. La purificación de la estreptoquinasa SKC-2 de Streptococcus equisimilis ATCC9542 bioactiva a partir del medio de cultivo de Streptomyces lividans. 7
  17. 17. Capítulo 1 Introducción 4. La utilización del péptido señal de la lipasa A de Streptomyces exfoliatus M11 para promover la secreción de proteínas heterólogas al medio extracelular de Streptomyces lividans.Importancia teórica 1. Se demuestra que el péptido señal de la lipasa A de Streptomyces exfoliatus M11 promueve la translocación de proteínas a través de un proceso no dependiente de la vía Tat en Streptomyces lividans. 2. El conjunto de técnicas empleadas constituye un aporte metodológico al estudio de la secreción de proteínas heterólogas por Streptomyces lividans en Cuba.Importancia práctica Al fusionar la SKC-2 al péptido señal del inhibidor de subtilisina de Streptomyces venezuelae CBS762.70, ésta fue secretada por Streptomyces lividans al medio de cultivo en cantidades que permitieron purificarla a escala de laboratorio y caracterizar satisfactoriamente su actividad biológica. El incremento en las cantidades de la SKC-2 cuando la cepa recombinante fue crecida en un fermentador a escala de banco muestra el potencial que tiene su optimización para la obtención soluble de la estreptoquinasa SKC- 2. En consecuencia, este sistema puede servir de punto de partida para el establecimiento de una producción a mayor escala. La estreptoquinasa es el más económico de los trombolíticos empleados actualmente y si se lograse un proceso de producción más seguro al personal productor o más sencillo pudiera bajar el costo de su producción y llegar a ser más accesible a los pacientes que la necesiten. 8
  18. 18. Capítulo 2 Revisión Bibliográfica2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA2.1 Fisiología y genética de StreptomycesEl género Streptomyces pertenece al orden Actinomycetales, los cuales fueron consideradospor mucho tiempo un grupo inusual de hongos. Análisis químicos y de microscopía electrónicarevelaron que ellos son realmente bacterias grampositivas procariotas. Los estreptomicetosson únicos dentro de las bacterias considerando su ciclo de vida a partir de la germinación deuna espora y la consiguiente formación de micelio, lo cual involucra una compleja regulaciónde la expresión génica. En medio agarizado (Figura 1A, 1B) las colonias de Streptomycesestán altamente diferenciadas. La parte más baja de la colonia consiste de hifas de miceliovegetativo sustrato ramificado que penetran en el medio y su superficie está cubierta de hifasaéreas que se forman utilizando nutrientes primarios procedentes de la hidrólisis del miceliosustrato más viejo. El estado final del desarrollo es la conversión de micelio aéreo en esporas(Figura 1C) y esto ocurre en la parte más alta del micelio aéreo, donde se forman septos.Finalmente estas esporas pueden dispersarse y restaurar el ciclo de vida59.Durante su crecimiento, los estreptomicetos no sólo adaptan su morfología celulardiferenciada, sino también experimentan cambios dramáticos en el metabolismo celular. Porello, la diferenciación celular y sus mecanismos regulatorios se han convertido en un tema deinvestigación en progreso. La secreción de una amplia variedad de metabolitos secundariosocurre de manera coordinada con cambios de morfología del micelio sustrato al micelio aéreo.Ejemplos tipos son S. lividans y S. coelicolor que producen micelio aéreo rojo y esporaspimentadas en azul como consecuencia de la producción de los metabolitos secundariosundecilprodigiosina y actinorrodina, respectivamente (Figura 1A, 1B)60. A B CFigura 1. (A) Vista panorámica de la morfología de las colonias de S. lividans 66 y (B) de S.coelicolor A3(2), incluyendo el antibiótico actinorrodina, de color azul, secretado en el medio yen la superficie hidrofóbica de la colonia como gotas azules. (C) Micelio aéreo y esporas de S.coelicolor A3(2)60.Los miembros de este género producen gran cantidad de metabolitos secundarios, lo cualhace de estos microorganismos uno de los grupos más importantes para la industriabiofarmacéutica. Alrededor de dos tercios de los antibióticos conocidos son sintetizados por 9
  19. 19. Capítulo 2 Revisión Bibliográficalos estreptomicetos61. Además, la producción de agentes farmacológicamente activos comomedicamentos antitumorales, inmunosupresores y anti-infecciosos han establecido unimportante papel en la biotecnología. Se considera que los Streptomyces estánexcepcionalmente concebidos para la “guerra bioquímica” ya que pueden eliminarcompetidores como las bacterias y los hongos en los ecosistemas del suelo60. Ellos tambiénson una fuente de herbicidas62 y enzimas industrialmente importantes utilizadas en laalimentación63 y en la industria del papel64.Adicionalmente, los Streptomyces exhiben una versatilidad nutricional basada en sucapacidad de degradar materiales orgánicos complejos en el medio ambiente. La mayoría deellos son biopolímeros insolubles de origen animal o vegetal. En correspondencia, se hanidentificado una amplia variedad de enzimas extracelulares como: celulasas, amilasas,hemicelulasas y xilanasas, las cuales hidrolizan proteínas y carbohidratos complejos12,65. Enlos últimos años se ha informado que algunas especies del género Streptomyces producenenzimas lipolíticas66, como es el caso de S. exfoliatus M11 que secreta abundantemente lalipasa A de 28 kDa al medio extracelular por intermedio de un péptido señal (LipA-sp)19,20. LosStreptomyces también secretan enzimas proteolíticas e inhibidores enzimáticos en grandescantidades al medio extracelular12. Por todas estas propiedades, los Streptomyces sonconsiderados un sistema crucial para el ecosistema del suelo.El interés de la biotecnología y otras ramas en los estreptomicetos hacen de ellos blancospara la Ingeniería Genética. S. coelicolor A3(2) es el estreptomiceto modelo para el estudio dela síntesis de antibióticos y diferenciación y es el miembro genéticamente mejor estudiado delgénero11. Con la disponibilidad de la secuencia de su genoma en el año 2001, se conoció queeste microorganismo tiene un cromosoma lineal grande con un origen de replicaciónlocalizado en el centro (oriC) y en ambos extremos largas regiones invertidas67. La mayoríade los genes esenciales y de mantenimiento están localizados en la región central delcromosoma, mientras que los “brazos” del cromosoma contienen genes de mayor variabilidad.El análisis de este genoma de 8 667 507 pb, el cual fue físicamente mapeado13, mostró 7825posibles genes, de los cuales muchos están probablemente relacionados con su estilo de vidade sobrevivir y competir en el ambiente del suelo. El mismo es casi dos veces más grandeque el genoma de E. coli y de B. subtilis67. Por lo demás, el ADN de S. coelicolor tiene un altocontenido de G+C de 72,12%, el cual es característico de todos los genomas de losactinomicetos67. En el año 2003, la secuencia de un segundo genoma de Streptomyces sehizo pública: Streptomyces avermitilis. Este contiene una región central similar a S. coelicolor,pero brazos casi completamente diferentes que probablemente han evolucionado 10
  20. 20. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaindependientemente68. Recientemente, se informó sobre la secuencia del genoma deStreptomyces griseus IFO 13350 que produce el antibiótico antituberculoso estreptomicina69.El cromosoma lineal consiste de 8 545 929 pb con un contenido de G+C de 72,2% y posee 7138 marcos de lectura abiertos. Al compararlo con los otros dos genomas de Streptomycessecuenciados se evidenció la existencia de 24 proteínas específicas de Streptomyces.2.2 Translocación de proteínas en bacteriasEl proceso de translocación de proteínas a través de las membranas hidrofóbicas es esencialpara las células. Los sistemas de transporte, los cuales actúan en un modo co- o post-traduccional, han evolucionado y aseguran la localización de las proteínas desde elcitoplasma a su lugar de acción, incluyendo las membranas citoplasmáticas, la pared celular oel ambiente extracelular. Este transporte activo de proteínas a su destino final es denominadosecreción de proteínas. Debido a las diferencias en la organización de la pared celular, elpaso de proteínas secretadas ocurre a través de diferentes grupos de mecanismos detransporte en las bacterias.En las bacterias grampositivas, las proteínas pueden ser translocadas hacia o a través de lamembrana citoplasmática, mediante una ruta de translocación dependiente de una extensiónen su extremo amino denominada péptido señal. Además de esta ruta de secreción se hadescrito otro proceso de translocación activa, el cual se ha denominado proceso tipo I o decasete de unión a ATP (ABC, por sus siglas en inglés, ATP-binding cassette-pathway)70.En las bacterias gramnegativas, las proteínas se pueden insertar en o pasar a través de lamembrana interna y ser liberadas en el periplasma a través de las rutas de translocacióndependiente de péptido señal70. En los sistemas de secreción tipo II y tipo VI, el tránsito através de la membrana externa ocurre por la formación de un poro por determinadasproteínas de membrana interna y externa (tipo II) o por la región carboxilo terminal delsustrato (tipo VI). La secreción tipo II es el proceso principal para la secreción de proteínasextracelulares por la bacteria70. El sistema de secreción tipo VI comprende un grupo de auto-transportadores, los cuales forman un poro en la membrana externa a través del cual pasa eldominio “pasajero”. El subsiguiente corte auto-proteolítico de la región carboxilo terminallibera la proteína en el medio extracelular. Para el proceso de secreción “two-partner” (tipo V),el dominio “pasajero” y el dominio formador del poro son dos proteínas separadas. Otroproceso de secreción para el transporte de proteínas a través de la membrana externa es elsistema tipo IV. La maquinaria de secreción del sistema tipo IV consiste de un canal y un piluspara la asociación con la célula receptora. Sin embargo, además del transporte dependientede péptido señal a través de la membrana interna, algunos sustratos tipo IV pueden también 11
  21. 21. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaser transportados independientemente de péptidos señales en un paso a través de lamembrana interna y externa70. Además, las proteínas que no tienen péptido señal pueden sertransportadas mediante los mecanismos de secreción tipo I o tipo III. La secreción tipo Isecreta proteínas directamente a través de la membrana bacteriana en el medio extracelularsin una parada periplasmática71. El sistema de secreción tipo III (T3S) permite a la bacteriagramnegativa, en proximidad cercana con la célula eucariota hospedera, inyectar proteínasdirectamente desde su citoplasma hasta el citosol de las células blanco72.2.2.1 Señales de translocaciónEn bacterias, la mayoría de las proteínas son translocadas a través de la membranacitoplasmática mediante el proceso II, del cual sólo se han informado dos tipos: el procesoSec y el proceso de translocación “twin-arginine” (Tat). La característica fundamental de lasproteínas transportadas a través del proceso II es que son sintetizadas en el citoplasma conun péptido señal removible por su extremo amino. En general, los péptidos señales muestranmuy poca similitud en la secuencia aminoacídica. Sin embargo, se distinguen tres dominiosseparados: un dominio amino denominado N, un dominio H central y un dominio C carboxilo(Anexo 1)73.El dominio N tiene generalmente una carga neta positiva debido a la presencia de variosresiduos de aminoácidos Lys o Arg. La sustitución de estos aminoácidos cargadospositivamente por residuos cargados negativamente reduce significativamente latranslocación del precursor. Los residuos cargados positivamente probablemente aumentan lasecreción de las proteínas por la unión a la superficie cargada negativamente de la bicapalipídica de las membranas citoplasmáticas74. Además, se considera que las cargas positivasde la región N orientan al péptido señal dentro de la bicapa lipídica75.El dominio H constituye el centro hidrofóbico del péptido señal y es la parte más importanterequerida para la localización e inserción de la pre-proteína en la membrana. Esto se hailustrado a través del incremento en la hidrofobicidad de este dominio, lo cual puedecompensar mutaciones realizadas en otras regiones del péptido señal76. Los residuos en eldominio H tienden a formar una α hélice. Frecuentemente, un residuo interruptor de hélices(Gly o Pro) se encuentra en el medio de la región H, lo cual permite al péptido señal formaruna estructura tipo horquilla que se puede insertar en la bicapa lipídica. El péptido señalprobablemente se inserta en la membrana citoplasmática desenrollando esta horquilla74.El dominio C incluye el sitio de corte de la peptidasa señal (SPase) y es la única región delpéptido señal que demanda cierta especificidad de la secuencia primaria de los aminoácidos.El análisis estadístico de los residuos de aminoácidos cercanos al sitio de corte de la SPase 12
  22. 22. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaha dado lugar a la regla denominada (-3 -1), donde los residuos en las posiciones -3 y -1,relativos a la proteína madura, generalmente son residuos pequeños y neutros como: Ala,Gly, Ser y Thr con una fuerte preferencia por Ala (Ala-X-Ala)77. En contraste, las posiciones -2pueden ser ocupadas por casi cualquier aminoácido, aunque la presencie de Met en esaposición es muy rara78. Los residuos que interrumpen estructuras secundarias como Pro o Glyaparecen frecuentemente en la posición -6, definiendo la transición de la región H hidrofóbicaal dominio C75.Los péptidos señales bacterianos pueden variar significativamente en longitud entrediferentes especies79. Los péptidos señales de Streptomyces tienen un promedio de 35,5 ±7,9 aminoácidos, mientras la longitud promedio de los péptidos señales de otras bacteriasgrampositivas es 29,2 ± 5,6 y los de las bacterias gramnegativas es 23,6 ± 3,4 aminoácidos80.2.2.2. Procesos de translocación Sec y Tat en bacterias2.2.2.1 Sistema de secreción Sec en bacteriasLa mayoría de las proteínas transportadas a través de la membrana interna de las bacteriasgramnegativas son translocadas a través del proceso Sec. La característica distintiva delaparato Sec es que las proteínas son secretadas en una conformación extendida y se unenfrecuentemente a chaperonas. En E. coli, el aparato Sec consiste de la proteína SecA demembrana y del complejo proteico SecYEGDF. También tiene un papel importante la proteínaSecB que reconoce a la proteína precursora, la mantiene en una conformación no plegada ycompetente para la translocación y promueve su interacción con SecA, la cual reconoce elpéptido señal del precursor, su región madura no plegada y a SecB81. SecA tiene actividadATPasa e interacciona con los fosfolípidos de la membrana y con la translocasa hexamérica,la cual consiste de SecY, E, G, D, F y YajC. El dominio SecYE es suficiente para que al unirsea SecA se active la translocasa, pero una translocación eficiente requiere de SecG y demiembros del operón secD (SecD, SecF y YajC)81. La translocasa media la secreción deprecursores a través de la membrana utilizando ATP y la fuerza motriz transportadora deprotones. SecA puede alternar entre formas de proteína periférica e integral de membranadurante la translocación82.Además de las proteínas Sec, las chaperonas pueden interactuar con las moléculasprecursoras. Ellas interactúan con conformaciones no plegadas de los precursores para evitarla agregación de la nueva proteína. Estas interacciones tienen un papel importante enmantener a los precursores en una forma competente para la secreción y en el plegamientode la proteína en su estructura nativa. Las proteínas de inducción por estrés térmico de lasfamilias GroE y DnaK actúan como chaperonas moleculares y asisten en el plegamiento de 13
  23. 23. Capítulo 2 Revisión Bibliográficalos nuevos polipéptidos sintetizados. La sobre-expresión y co-expresión regulada de losoperones groE y dnaK puede aumentar la producción de una proteína en E. coli83.La localización hacia el translocón Sec ocurre en un modo post-traduccional, con laintervención de las chaperonas, o a través del proceso que utiliza la Partícula deReconocimiento de Señal SRP (por sus siglas en inglés, Signal Recognition Particle), comose ilustra en la Figura 2. El sistema SRP es esencial y bien conservado en todas las bacteriasconocidas. En ninguna bacteria grampositiva, que su secuencia genómica se hayacompletado, se ha encontrado un homólogo de SecB que sustente la translocación post-traduccional; lo cual sugiere un papel importante del sistema SRP y que puede ser capaz desustituir la deficiencia de SecB en la translocación de proteínas en bacterias grampositivas84.Se considera que la hidrofobicidad de las pre-proteínas es la determinante primaria para sureconocimiento por las chaperonas o la SRP. Figura 2. Secreción de proteínas a través del proceso Sec en bacterias grampositivas. Las proteínas puedes ser translocadas co-traduccionalmente hacia el translocón Sec por el proceso SRP o post-traduccionalmente mediante chaperonas. La maquinaria Sec está integrada por el motor SecA y el complejo SecYEG que forma un canal en la 73 membrana (adaptado de Tjalsma y cols) .Homólogos de SecA, SecY, SecE, SecD y SecF se han encontrado en Streptomyces. SecGno ha sido reportado en Streptomyces pero se supone que una proteína homóloga a dichofactor debe existir85. Un profundo análisis de la secuencia genómica de S. coelicolor reveló laausencia del gen secB y en S. lividans parece estar ausente también86.Los genes que codifican para los componentes de la SRP de S. lividans se clonaron y secaracterizaron recientemente. La SRP en S. lividans está integrada por Ffh -un homólogo dela proteína 54SRP de mamíferos-, por un ARN de talla pequeña (82 nucleótidos) y por elreceptor FtsY, el cual tiene homología con el receptor de SRP de mamíferos. En un estudio 14
  24. 24. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaposterior se demostró que el receptor FtSY estaba asociado con la SRP en el citoplasma deS. lividans y que estaba involucrado en la translocación de proteínas86. Se realizaron variosintentos para obtener mutantes en algunos de los genes correspondientes al sistema SRP ylos intentos fueron fallidos, lo cual sugirió la posible naturaleza esencial de los componentesdel sistema SRP en S. lividans87.2.2.2.2 Sistema de secreción Tat en bacteriasHace varios años se descubrió un proceso alternativo de secreción, dependiente de péptidoseñal, para el transporte de las proteínas a través de la membrana citoplasmática enprocariontes, el cual es similar al sistema de importación dependiente de ∆pH en lasmembranas de los tilacoides de los cloroplastos y se denominó proceso Tat (del inglés, Twinarginine translocation)88. La característica fundamental del transporte Tat es que exportaproteínas de variadas dimensiones que ya adquirieron algún grado de estructura terciaria enel citoplasma previo a la secreción por asociación con cofactores. La estructura general deestos péptidos señales es similar a los utilizados para transportar proteínas por el procesoSec, pero se diferencian fundamentalmente en que contienen una secuencia consenso S/T-R-R-x-F-L-K en la vecindad de la regiones N y H. Estudios de mutagénesis en esta secuenciaconsenso en E. coli han esclarecido que la primera Arg puede ser sustituida por una Lys, y lasegunda Arg puede ser sustituida por Gln o Asn, así como por Lys con variada eficiencia89,90.La sustitución de los dos residuos de Arg por Lys bloqueó completamente la secreción Tat. Laregión H de los péptidos señales Tat es marcadamente menos hidrofóbica que la de lospéptidos señales Sec, como consecuencia de la presencia de más residuos de glicinas ytreonina91. Los péptidos señales Tat frecuentemente contienen un residuo básico en la regiónC que es muy raro en los péptidos señales Sec y que puede servir como una secuenciamotivo efectiva para evitar los componentes del sistema Sec91. En general, en E. coli, lospéptidos señales Tat son más largos que los péptidos señales Sec con una longitud promediode 38 aminoácidos contra 24 de los péptidos Sec, debido a la región N extendida91.En adición a los péptidos señales Tat, hay señales dentro de la proteína madura que parecenafectar su transporte. Un análisis reciente de los péptidos señales de E. coli reveló que laselectividad del sistema Tat está influenciada por la carga neta de la región C junto con elamino terminal de la proteína madura. De esta forma una carga neta de +2 o mayor resultó enespecificidad para el sistema Tat92.Los componentes mínimos de la translocasa Tat de E. coli son TatA, TatB y TatC, los cualesestán ensamblados en la membrana93,94. TatA y TatB son proteínas que tienen estructurassimilares pero tienen diferentes funciones. El conocimiento actual del proceso Tat en E. coli 15
  25. 25. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaes aún limitado y la manera en que estos componentes actúan juntos para transportarproteínas plegadas a través de la membrana interna todavía se está investigando. Uno de losprimeros eventos que ocurre es la interacción de la membrana con las pre-proteínas. Estainteracción se estabiliza por contribuciones de las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas,seguido de la difusión lateral de la pre-proteína a través de la superficie de la membranabuscando el translocón Tat95. El paso posterior es el reconocimiento del péptido señal Tat porlas interacciones proteína-proteína con la translocasa. Evidencias recientes sugieren que lassubunidades TatA y TatC forman el sitio inicial de unión al péptido señal y específicamenteTatC contiene probablemente el sitio de unión primario al péptido señal Tat, ya que se hanencontrado evidencias de que complejos que contienen sólo TatC son capaces de interactuarcon los péptidos señales Tat96.Por otro lado, se ha sugerido que la translocasa Tat de E. coli monitorea el estado deplegamiento de los sustratos Tat antes de su translocación. Se ha propuesto un modelo en elcual después de la unión del péptido señal a TatC, el dominio maduro del sustrato es llevadoen estrecha proximidad a TatB y el dominio citoplasmático de TatB puede detectar el estadoplegado del precursor. De esta manera, el sistema Tat puede discriminar conformacionesplegadas de las incorrectamente plegadas y en consecuencia decide cual transporte debecontinuar o cual debe ser abortado. El fundamento de este modelo procede de estudiosrecientes de unión cruzada que mostraron una interacción proteína-proteína entre la porciónmadura de una pre-proteína (dependiente de Tat) y TatB, sin la intervención de los otroscomponentes del sistema Tat97.El tamaño del complejo TatABC se ha estimado en 130 Å en su dimensión más grande, perose considera pequeño para formar un canal y acomodar el tránsito de todas las proteínasplegadas98. Por ello se cree que subunidades o complejos adicionales de TatA se reclutanhacia el complejo primario TatABC en un paso dependiente de la energía de la fuerza motrizprotónica97. Evidencias estructurales como la presencia de grandes complejos oligoméricosde TatA en la membrana de E. coli sugieren que TatA forma el canal que conduce laproteína99.Hace pocos años, tres genes que codifican para TatA, TatB y TatC fueron identificados en elgenoma de S. lividans, basados en las proteínas homólogas Tat de E. coli. Este hallazgodiferenció estructuralmente el proceso Tat de Streptomyces de la generalidad de las bacteriasgrampositivas que sólo tienen dos tipos de componentes Tat. Inicialmente se determinó quelos genes tatA y tatC en S. lividans están organizados en una estructura agrupada y tatBforma una unidad transcripcional independiente21. La funcionalidad del proceso de secreción 16
  26. 26. Capítulo 2 Revisión BibliográficaTat en Streptomyces se demostró inicialmente cuando el transporte de la tirosinasa de S.antibioticus fue bloqueado en una cepa de S. lividans con una deleción en el gen tatC21.Las proteínas TatA y TatB están relacionadas por secuencia, tienen una estructura común yson individualmente prescindibles, mientras que TatC es muy hidrofóbica y esencial para lasecreción Tat en Streptomyces. La caracterización inicial del proceso Tat en S. lividans revelóuna localización dual de TatA y TatB como proteínas solubles y asociadas a la membrana, porlo que el sistema de transporte Tat en Streptomyces puede ser diferente del proceso Tat de E.coli, donde no se ha detectado ningún componente soluble100. TatA y TatB participan en eltransporte de la pre-proteína hacia la translocasa y también en la translocación a través de lamembrana citoplasmática. Los componentes TatA y TatB solubles se encontraron comoheterodímeros TatAB en el citoplasma y ambos componentes solubles mostraron afinidadsimilar para unirse a dos pre-proteínas (XlnC y MelC1). Por otra parte, los complejos TatABsolubles tienen afinidad exclusivamente por TatC, la cual es la única proteína con localizaciónde membrana del aparato Tat y por ello se le ha asignado un papel esencial para la inserciónde TatAB en la membrana101.Una característica distintiva del sistema Tat de Streptomyces fue el hallazgo de que TatA yTatB solubles se unían preferentemente a los péptidos señales Tat antes de su interaccióncon la translocasa Tat, lo que indicó que TatC no es el sitio de reconocimiento primario paralas pre-proteínas dependientes de Tat como lo es en E. coli101. El sitio de reconocimientoinicial para la unión de TatAB soluble está probablemente situado en el motivo “twin-arginine”101.Un resultado importante se obtuvo cuando se estudió la afinidad de unión de una pre-proteínatípica dependiente del sistema Sec a los componentes TatA/B solubles de Streptomyces y seencontraron interacciones subóptimas en un rango entre 100 y 1000 veces menos afines quelas encontradas para las pre-proteínas dependientes de Tat. Estas observacionesevidenciaron que TatA/B se unen preferentemente a sustratos dependientes de Tat. De estamanera, a pesar de que los péptidos señales Tat tienen una estructura similar tripartitasemejante a los péptidos señales Sec, el sistema Tat parece que evita interacciones con lossustratos Sec101.Experimentos in vitro evidenciaron la unión de los sustratos Tat a TatA, localizada en lamembrana, lo cual sugiere que TatA desempeña un papel principal en la formación del canalde translocación Tat en S. lividans101. De Keersmaeker propuso un modelo para el sistemaTat en Streptomyces que se ilustra en la Figura 3. En dicho modelo, el complejo TatABsoluble lleva el sustrato directamente hacia TatC, que se encuentra embebido en la 17
  27. 27. Capítulo 2 Revisión Bibliográficamembrana y media la inserción del complejo Tat-precursor en la membrana. Posteriormente,después de la reorganización de los componentes Tat en la membrana citoplasmática, elcomplejo Tat-precursor recluta complejos adicionales TatA o TatAB para formar un sistema detranslocación funcional que contiene a TatABC. Esta asociación puede ser temporal yconcluye una vez que el sustrato es translocado102. Figura 3. Modelo de translocación del sistema Tat en S. lividans. TatA y TatB como heterodímeros o hetero- oligómeros, se unen a los péptidos señales para reclutar los sustratos para la translocasa. TatC, como monómero o parte del complejo TatABC, es el sitio más probable de inserción del complejo TatAB- sustrato. Con el reclutamiento de complejos adicionales TatA o TatAB se forma una translocasa TatABC activa. Las proteínas TatA, TatB y TatC aparecen en azul, verde y rojo, respectivamente. El péptido señal “twin arginine” de los sustratos Tat es indicado por un rectángulo negro. Tomado de De Keersmaeker y modificado por el autor102.En un estudio reciente se identificaron 27 proteínas secretadas exclusivamente por la vía Taten S. coelicolor utilizando a la agarasa de S. coelicolor como proteína reportera de latranslocación Tat. Este número representó el 30% de todas las proteínas detectadas en lapared celular e informó que el sistema Tat es una ruta general de translocación de proteínasen Streptomyces26. Las proteínas identificadas representaron un amplio rango de clasesfuncionales. Algunas se predice que están involucradas en el metabolismo de carbohidratos,fosfatos, lípidos, polímeros, transporte de nutrientes y metabolismo secundario26. Estasevidencias destacan el potencial que tiene el sistema Tat en Streptomyces para la producciónde proteínas heterólogas.2.2.3 Componentes que intervienen en eventos post-traduccionales2.2.3.1 Peptidasas señalesLas peptidasas señales (SPases) cortan los péptidos señales de las proteínas pre-secretadasdurante o momentos antes de su translocación. Solamente después, la parte madura de lasproteínas secretadas pueden ser liberada al ambiente extracelular103. En todas las bacteriasestudiadas, este tipo de SPases (tipo I) son esenciales para la viabilidad celular. Laeliminación de las SPases conlleva a la acumulación de proteínas precursoras en lamembrana citoplasmática y posteriormente, a la muerte celular104,105. S. lividans contiene almenos cuatro SPases tipo I: SipW, X, Y, Z106-108. SipY es la SPase que desempeña el papel 18
  28. 28. Capítulo 2 Revisión Bibliográficamás importante en el procesamiento de las pre-proteínas y su deficiencia puede sercompensada con alguna de las otras SPases109.2.2.3.2 Enzimas que asisten en el plegamiento de las proteínasEl plegamiento de las proteínas maduras en su estado nativo es realizado por lasoxidoreductasas tiol/disulfuro (proteínas Dsb), las isomerasas de enlaces disulfuro (proteínasPDI) y las peptidil propil cis/trans isomerasas (PPIases). Las proteínas Dsb y las PDI son lasresponsables de la formación, plegamiento e isomerización de los enlaces disulfuro, mientrasque las proteínas PPIases catalizan la isomerización de los enlaces X-prolina. En E. coli, sehan reportado seis óxidoreductasas: DsbA-E y DsbG110.La formación de los puentes disulfuro es un proceso esencial para la actividad y estabilidadde muchas proteínas, los cuales se forman generalmente en el periplasma debido a que elcitoplasma es mantenido en un ambiente muy reductor110. En Streptomyces no se haexaminado todavía las enzimas que intervienen en el plegamiento de proteínas producidaspor la maquinaria celular. Sin embargo, los Streptomyces secretan numerosas proteínas queposeen puentes disulfuro entre las que se encuentra el inhibidor tendamistat de S. tendae,que tiene dos puentes disulfuro y exhibe un comportamiento de plegamiento de dos estadosque no se ha informado en otra proteína que contenga dos puentes disulfuro111. Las lipasas ylas esterasas secretadas por Streptomyces frecuentemente contienen uno o dos residuos decisteínas cerca de otro residuo de cisteína involucrados en la formación de puentesdisulfuro112,113. También se ha descrito que los inhibidores de subtilisina, los cuales sesecretan a altos niveles en Streptomyces, tienen cuatro residuos de cisteínas conservadosinvolucrados en la formación de dos puentes disulfuro114.El ambiente reductor del citoplasma bacteriano es mantenido por el sistema de lastioredoxinas, el cual está integrado por la reductasa de tioredoxina TrxR y el sustrato de laproteína tioredoxina activa redox Trx, que se encuentra desde las bacterias hasta loshumanos. La tioredoxina reducida es la reductasa principal de puentes disulfuro celular y sirvecomo un donante de electrones para enzimas específicas del metabolismo primario. Ademásdel sistema clásico tioredoxina-tioredoxina reductasa, la mayoría de los organismos vivientesposeen un sistema de glutatión y coexisten ambos sistemas redox en el citoplasma celular115.Se ha informado que los estreptomicetos no sintetizan glutatión y el estado tiol-disulfuro de lasproteínas es mantenido por las tioredoxinas. Recientemente, se clonaron los genes trxA ytrxR y se caracterizaron parcialmente las correspondientes proteínas de S. coelicolor, ya quepuede servir como modelo para estudiar el sistema tioredoxina115. 19
  29. 29. Capítulo 2 Revisión Bibliográfica2.3 Streptomyces como hospedero para la producción de proteínas heterólogasEn Streptomyces, como en otros sistemas hospederos, una expresión y secreción eficienterequiere de una sucesión de eventos coordinados. A continuación se describen los factores yelementos moleculares más importantes que pueden influir en la producción secretoria deproteínas en Streptomyces.2.3.1 Elección de la cepa hospederaA pesar de que S. coelicolor A3(2) es la especie mejor caracterizada desde el punto de vistagenético dentro del género; la especie S. lividans 66 ha sido más utilizada para la expresióngénica debido a que no posee un extenso sistema de restricción-modificación116. S. lividanses considerado un organismo no patógeno a humanos (nivel de contención 1)13 yparticularmente el derivado S. lividans TK24 secreta relativamente bajas cantidades deproteasas extracelulares, las cuales pueden afectar los rendimientos de las proteínassecretadas117,118. Existen pocos reportes de la utilización de otras cepas de Streptomycescomo hospedero de proteínas heterólogas12.2.3.2 Vectores de clonaciónLos vectores de clonación en Streptomyces pueden dividirse en dos clases: los plasmidiosreplicativos y los integrativos. Vectores de bajo número de copias por célula, basados en elreplicon SLP1.2, así como derivados del plasmidio pIJ101, de alto número de copias, se hanutilizado en la clonación de genes y casetes de expresión-secreción. El plasmidio pIJ702,derivado de pIJ101, se mantiene establemente en la célula entre 40 y 300 copias, aún en laausencia de la presión selectiva del marcador de selección116. El marcador de selecciónutilizado preferentemente ha sido el gen de resistencia a tioestreptona de S. azureus. Elorigen de replicación de pIJ101 también ha servido para la construcción de vectoresbifuncionales Streptomyces - E. coli, los cuales simplifican apreciablemente la construcción deplasmidios, aunque se han descrito ocasionalmente como inestables en S. lividans13.2.3.3 Elección del promotorEn Streptomyces se han descrito dos clases de promotores: los promotores consensos de E.coli, reconocidos por las ARN polimerasas de E. coli como la dependiente del factor σ70, y lospromotores que no tienen las regiones típicas conservadas -10 y –35119. Los estreptomicetoscontiene varios factores σ para formar diferentes holoenzimas ARN polimerasas, las cualesreconocen específicamente promotores regulados. El sitio de inicio de la transcripción degenes en los estreptomicetos generalmente comienza entre 9 y 345 nucleótidos cadena arribade la región codificante120. 20
  30. 30. Capítulo 2 Revisión BibliográficaPara la expresión de genes homólogos en S. lividans algunas veces el promotor nativo fuereemplazado por otro con propósitos de optimización. Por ejemplo, la cantidad extracelular deα-amilasa de S. griseus se incrementó dieciséis veces cuando se reemplazó el promotornativo por el promotor saf de S. griseus121. En el caso de genes heterólogos, el promotornativo fue generalmente reemplazado por un promotor eficiente de Streptomyces como elpromotor aph (gen de la aminoglucósido fosfotransferasa de S. fradiae), el promotor ermEp*(promotor mutante del gen de resistencia a eritromicina de Saccharopolyspora erythrea), elpromotor saf, el promotor vsi o el promotor de la β-galactosidasa de S. lividans12. Solamenteen pocos estudios se ha comparado el efecto de varios promotores para dirigir la expresión deun gen heterólogo específico. Chang y Chang reportaron un incremento de cuatro veces en laproducción del hTNFα cuando el promotor ermEp* fue utilizado en lugar del promotor aph24.En un estudio realizado por Van Mellaert y cols se comparó la eficiencia del promotor vsi conlos promotores aph de S. fradiae y ermEp* de S. erythrea en iniciar la transcripción del gen dela neomicina de S. fradiae ATCC1074. El promotor vsi tuvo una capacidad de inicio de latranscripción 1,5 y 1,9 veces mayor que los promotores aph y ermEp*, respectivamente114.Los promotores regulados son de gran interés para la expresión de genes heterólogos debidoa que ellos pueden contribuir a una expresión génica más controlada. En Streptomyces, estospromotores están usualmente involucrados en la biosíntesis de antibióticos, lo cual estágeneralmente asociado al metabolismo secundario. A pesar de que estos promotores parecenestar estrictamente regulados, no son apropiados para controlar la expresión génicaheteróloga debido a la ausencia de un inductor bien establecido, dificultad en lograr cultivoshomogéneos en la fase estacionaria y alta actividad de proteasas asociadas con la etapa delmetabolismo secundario122. Los promotores regulables que más atención han recibido son elpromotor inducible por tioestreptona tipA123 y el promotor gal-P1 inducible por galactosa124.2.3.4 Terminadores de la transcripciónEn general, los terminadores de la transcripción de Streptomyces son semejantes a losencontrados en bacterias y contienen secuencias repetidas invertidas largas e imperfectascon potencial para formar estructuras de horquillas. Ellos son similares a los terminadores rhono dependientes de E. coli pero generalmente carecen de secuencias típicas ricas entimidina. La presencia de un terminador de la transcripción puede contribuir a la estabilidaddel ARNm y como consecuencia, al rendimiento final de la proteína12. Pulido y Jiménezmostraron que la inserción del terminador de la transcripción aph cadena abajo del gen ifnα2bconllevó un aumento de cuatro veces en el rendimiento de la expresión intracelular delinterferón125. Sin embargo, no se obtuvo ese efecto en el caso de la producción del 21
  31. 31. Capítulo 2 Revisión Bibliográficatendamistat utilizando el mismo terminador126. En el caso de la producción de péptidosheterólogos como proteínas de fusión con el gen ssi (Streptomyces subtilisin inhibitor) de S.albogriseolus, la remoción de uno de los dos terminadores tuvo un efecto positivo sobre la 127,128producción de la proteína de fusión en S. lividans . El efecto de un terminador sobre losrendimientos de producción depende del gen específico, por lo que se recomienda ensayarloexperimentalmente.2.3.5 Sitio de unión al ribosomaLa secuencia Shine-Dalgarno (SD) o RBS (por sus siglas en inglés, Ribosome Binding Site) deStreptomyces fue identificada por Strohl (a/g-G-G-A-G-G) con una localización de 5 a 12nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de la traducción (ATG/GTG)119. Las secuenciasRBS de Streptomyces no requieren un alto grado de complementariedad con el ARNr 16S (5-CUGGAUCACCUCCUUUCU-3’)129. Algunos genes de Streptomyces, que codifican paraproteínas secretadas, contienen secuencias señales largas con dos codones de inicio de latraducción, cada uno antecedido por un motivo SD. Cuando dichas señales se usaron paradirigir la síntesis de la xilanasa A, los rendimientos aumentaron entre 1,5 a 2,5 veces. Esto fueexplicado por el uso concomitante de dos RBS consecutivos130.2.3.6 Uso de codonesDebido a que los estreptomicetos tienen un genoma con alto contenido de GC, el uso decodones se caracteriza por el uso preferencial de estos dos nucleótidos en la terceraposición131, lo cual está reflejado en las moléculas de ARNt presentes en las células. Comoconsecuencia, este uso de codones puede influir en el nivel de traducción de un genheterólogo con menor contenido de GC. Se han informado varios estudios relacionados con elefecto de cambios en codones minoritarios de genes heterólogos para adaptarlos al uso decodones de Streptomyces. Dentro de estos estudios se destaca el informado por Lammertyn ycols, en el que se cambiaron cinco codones minoritarios consecutivos en la región 5´ del genmtnfα por codones de uso preferenciado en Streptomyces. Los niveles de expresión delmTNFα disminuyeron y se encontró una fuerte correlación entre la cantidad de ARNm y losrendimientos de la proteína secretada132.2.3.7 Péptido señalEl alto contenido de GC del genoma de Streptomyces tiene efectos sobre la composición dela región N de los péptidos señales. Debido a que los codones que codifican para Arg sonmás ricos en GC que los de Lys, la Arg es usada preferentemente en los péptidos señales deStreptomyces, los cuales tienen una carga neta promedio de +3,5. Este valor es mayor que elde los péptidos señales de las bacterias grampositivas (+2,9) o de los de E. coli (+2)79. 22
  32. 32. Capítulo 2 Revisión BibliográficaLa fusión de un péptido señal a una proteína constituye una unidad de translocación únicaque ha sido utilizada como herramienta molecular para optimizar los rendimientos de lasproteínas secretadas. En este sentido, se obtuvieron mayores rendimientos de mTNFαcuando el gen mtnfα fue fusionado a la secuencia señal de vsi (vsi-ss) (300 mg l-1) quecuando fue fusionado a la secuencia señal de la α-amilasa (1-10 mg l-1), manteniendo elmismo promotor y las otras regiones reguladoras intactas17,133. Pagé y cols analizaron lasecreción de la xilanasa A (XlnA) en S. lividans cuando el gen xlnA fue fusionado a seissecuencias señales de proteínas nativas de Streptomyces y se obtuvo una amplia variaciónde la producción de la XlnA134.La mutagénesis de las secuencias señales también ha sido una estrategia utilizada paraaumentar el rendimiento de las proteínas sintetizadas. Este fue el caso de la mutagénesisrealizada en la región amino del péptido señal del inhibidor de subtilisina de S. venezuelaeCBS762.70, que cuando se disminuyó la carga neta positiva de esa región de +3 (proteínasalvaje) a +2 se obtuvo un incremento de 2 a 10 veces en la cantidad del mTNFα secretado17.2.3.8 Sitio de corte de la peptidasa señalVarios autores utilizaron como estrategia la inserción de un péptido espaciador entre elpéptido señal y la proteína madura de interés con el objetivo de favorecer el corte preciso delpéptido señal por las SPases de Streptomyces. Fornwald y cols insertaron una secuenciapequeña entre el sitio de corte de las SPases y el extremo amino de un derivado D1D2 deCD4, debido a que el extremo amino de esa proteína tenía varios residuos Lys; los cualesprobablemente interfirieron en la remoción del péptido señal. Las cantidades de D1D2, con elextremo amino nativo, constituyeron solo el 5% en comparación cuando se utilizó el péptidoespaciador135.Se ha descrito que cuando ciertos aminoácidos se localizan en o cerca del extremo amino delas proteínas pueden bloquear o reducir considerablemente la eficiencia de las SPases y sehan obtenido bajas cantidades de las proteínas secretadas. El ejemplo más representativo loconstituye las cisteínas involucradas en la formación de puentes disulfuro136,137. Se hainformado que las cisteínas pueden causar impedimento estérico a las SPases y por ende,afectar el corte proteolítico y la subsiguiente liberación de la proteína madura. En ese caso, laeficiencia de la remoción del péptido señal fue mejorada mediante la inserción de un péptidoespaciador de tres o seis aminoácidos que probablemente proporcionó una estructura másflexible entre el péptido señal y el extremo amino de la proteína madura. Esta práctica fuefavorable para la secreción de las proteínas interleucina-7 (IL-7), el factor de células 23
  33. 33. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaindiferenciadas (SCF) y la eritropoietina humana (EPO), las cuales tienen enlaces disulfuroque involucran al segundo, cuarto y séptimo aminoácido de la proteína, respectivamente136,137.2.3.9 Condiciones de cultivo y proteasas del hospederoVarios estudios han informado sobre diferencias significativas en los patrones de las proteínasnativas o heterólogas secretadas por S. lividans cuando fue crecido en diferentes fuentes decarbono y condiciones de cultivo. Estos hallazgos han indicado que las condiciones decrecimiento ejercen regulación sobre los genes de las proteínas secretadas o de los genes delos procesos de secreción en Streptomyces, lo cual no ha sido informado en E. coli138-142.Además, se ha reportado la ocurrencia de cambios morfológicos en S. lividans cuando fuecrecido en medio líquido en la presencia de altas concentraciones de glucosa o fructuosa143.Parro y Mellado informaron sobre el efecto represor de la glucosa (5%) sobre la secreción dela agarasa de S. coelicolor, el cual afectó más a nivel de la secreción que en la transcripción.Además, en la presencia de glucosa la secreción general de las proteasas disminuyóconsiderablemente en S. lividans y S. coelicolor140. En un reporte posterior, Isiegas y colsobservaron un efecto represor de la glucosa (5%) sobre la secreción de la β-lactamasa TEMde E. coli cuando fue fusionada al péptido señal de la agarasa de S. lividans, lo cual fuerevertido cuando la cepa recombinante fue cultivada en concentraciones limitantes defosfato144.En S. lividans se estudió los niveles de los ARNm de los genes sec en función de latemperatura de crecimiento y la concentración de la fuente de carbono utilizada: glucosa yxilano145. En presencia de glucosa, las xilanasas y las celulasas no son producidasnormalmente por S. lividans, lo cual indicó una fuerte represión catabólica de la glucosa sobrela expresión de los genes relacionados146. Para ambos sustratos, los niveles de ARNm desecA, secD, secE, secF y secY dependieron de la fase de crecimiento y se transcribieronactivamente durante el proceso de diferenciación celular. Además, los niveles de expresión delos genes sec fueron entre 1,5 y 2 veces mayores en presencia de xilano que de glucosa, locual indicó que S. lividans era capaz de incrementar sus niveles de expresión en respuesta ala demanda de enzimas extracelulares para degradar el xilano. Por otra parte, no dependieronde temperaturas entre 28 y 40°C.El incremento de la osmolaridad del medio de cultivo ha sido utilizado para aumentar losrendimientos de varias enzimas expresadas por S. lividans27,28. En un estudio informado porAli y cols, el incremento de la osmolaridad del medio de cultivo fue correlacionado concambios en el super-enrrollamiento negativo del ADN y el incremento de las cantidades de lasenzimas reporteras luciferasa y kanamicina fosfotransferasa del transposon Tn528. Como 24
  34. 34. Capítulo 2 Revisión Bibliográficaosmolitos fueron utilizados la sacarosa y el NaCl28. Erpicum y cols también reportaron unincremento significativo en las cantidades de tres β-lactamasas homológas secretadas por S.lividans cuando las cepas recombinantes fueron cultivadas en presencia de 34% desacarosa27. DeSanti y cols reportaron niveles de 2 mg l-1 de endostatina humana secretadapor S. lividans cuando fue cultivado en caldo TSB completo suplementado con sacarosa30.Como en otras bacterias, el rendimiento de las proteínas heterólogas expresadas por cepasrecombinantes de S. lividans es, en ocasiones, afectado por la acción de las proteasas delhospedero147. La actividad de las proteasas extracelulares de S. lividans fue inicialmentedescrita por Aretz y cols118. En ese estudio se identificaron cuatro endopeptidasas y tresaminopeptidasas. Otro componente importante identificado de la actividad proteolíticaextracelular de S. lividans fue una tripeptidilaminopeptidasa denominada Tap que remuevetripéptidos como APA, APM y APS de los extremos aminos de las proteínas148,149. El gen tapfue delecionado del cromosoma de S. lividans 66 y se obtuvo la cepa mutante con capacidaddisminuida de remover tripéptidos del extremo amino de las proteínas150. La utilización deeste tipo de cepas como hospederos heterólogos forma parte de una tecnología patentada deCangene (Canadá) denominada CANGENUS™, la cual produce fundamentalmente dosproteínas bioactivas, no glicosiladas y correctamente plegadas136. Estas proteínas son lahormona de crecimiento humano, la cual fue aprobada recientemente por la FDA, y el factorestimulante de colonias de macrófagos-granulocitos. Ambas se comercializan actualmentebajo las marcas de AccretropinTM y Leucotropin™, respectivamente(http://www.cangene.com/products-cangenus.htm).2.3.10 Aplicaciones y rendimientos de producciónSe han informado varios ejemplos sobresalientes de la expresión secretoria de proteínas deorigen procariota en S. lividans12,151. El estudio más reciente describió la clonación del genque codifica para la xiloglucanasa de Jonesia sp. (Xg) bajo el control del promotor y lasecuencia señal del vsi. Xg fue secretada a altos niveles (100 - 150 mg l-1) en S. lividans, adiferencia de hospederos como E. coli y B. subtilis en los cuales no se expresó la proteína.Este estudio demostró que S. lividans es capaz de secretar polipéptidos heterólogos de másde 100 kDa a través del mecanismo Sec8.La secreción de proteínas eucariotas ha sido también evaluada a través de la vía Sec en S.lividans. Sin embargo, los rendimientos no han sido altos en todos los casos. Uno de losresultados más exitosos, sobrepasando los 300 mg l-1, fueron obtenidos con un derivadoD1D2 soluble del receptor CD4 de células T humanas cuando el gen correspondiente fueexpresado bajo el control de las señales reguladoras y de secreción del gen del inhibidor de la 25

×