Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung vonTramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Chemiker Carsten Griebel aus Niebüll Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais Universitätsprofessor Dr. D. Enders Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 amInstitut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen TechnischenHochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.

„Wenn wir wüßten, was wir tun,würden wir das nicht Forschung nennen.“ (Albert Einstein)

DanksagungIch möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemieder RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für dieengagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregendenDiskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. AllenArbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftlicheArbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ichHerrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahlvon Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührtauch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-Trennungen.Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, FrauGlensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklungorganisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und HerrnDr. Geibel.Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihrepräparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereitunterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seineengagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, HerrnDr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nichtzuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzenzur Verfügung gestellt werden konnten.Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freundenbedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.

Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in: Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 917-928. Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl- Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais, DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr. 2001, 135, 179820.

InhaltsverzeichnisABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 11.1 Opioide Analgetika 31.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 71.3 Zielsetzung 112 THEORETISCHER TEIL 132.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 132.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 162.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 242.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 262.3.1 Kinetische Racematspaltungen 262.3.1.1 Der E-Wert 292.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 352.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Hydrolyse 382.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Transacylierung 392.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 422.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 422.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 492.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 592.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 632.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 732.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 752.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 772.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 822.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 932.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104

VERZEICHNISSE II2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)- 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 1082.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 1132.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 1202.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 1382.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen Maßstab 1402.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 1442.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 1542.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 1552.5 Zusammenfassung 1582.6 Ausblick 1633 EXPERIMENTELLER TEIL 1643.1 Allgemeine Vorbemerkungen 1653.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 1653.1.2 Analytische Methoden und Geräte 1653.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 1703.1.4 Verwendete Proteine 1703.1.5 Besondere Arbeitstechniken 1733.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 1743.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 1743.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 1743.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 1763.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 1763.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 1763.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen (AAV 2) 1763.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 1773.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den racemischen Basen (AAV 4) 1773.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 1783.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexanol (rac-7) 178

III VERZEICHNISSE3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)- phenol (rac-8) 1793.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)- phenol (rac-11) 1803.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 1813.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 1833.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 1843.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 1853.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 1853.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 1863.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy- 1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 1873.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 1893.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 1903.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy- cyclohexyl)-phenol (rac-20) 1913.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 1933.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 1943.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 1953.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 1973.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 1983.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der enzymatischen Transacylierung 1993.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) 1993.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) 200

VERZEICHNISSE IV3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 2013.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 2033.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 2043.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 2043.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 2053.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 2073.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen Substrat Ester (AAV 5) 2073.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 2073.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 2073.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 2083.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 2083.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 2093.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 2103.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen Medium 2143.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 2143.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen System (AAV 6) 2143.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasen System (AAV 7) 2143.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen Lösungsmitteln (AAV 8) 2153.6.2 Berechnung des E-Werts 2163.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 2173.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 2173.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2173.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15 2183.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2193.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2193.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2203.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2203.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221

V VERZEICHNISSE3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2213.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2223.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 2223.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit roher CRL 2233.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit aufgereinigter CRL 2243.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 2243.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir roher CRL 2243.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 7.0 2253.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 8.0 2253.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 2263.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung verschiedener Lipasen 2263.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2273.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2283.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2293.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 2303.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 2303.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 2313.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem 2313.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 2323.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung verschiedener Lipasen 2323.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 2333.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2333.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2343.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2353.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit extraktiver Aufarbeitung 236

VERZEICHNISSE VI3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2373.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen- system 2373.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 2383.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 2383.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 2383.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 2393.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 2413.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 2423.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 2433.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 2443.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 2443.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem 2453.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen- system 2463.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 2463.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen 2463.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 2473.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin 2483.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 2493.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2493.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2493.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2503.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2503.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 2513.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2513.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 252

VII VERZEICHNISSE3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 2523.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2533.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2533.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2543.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung 2553.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 2563.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2563.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 2573.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 2583.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 2613.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen- system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 2613.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 2623.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 2623.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 2633.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 2643.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 2673.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 2673.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 2683.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 2683.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 2693.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen Einphasensystem 2693.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 2693.7 Anhang zum experimentellen Teil 2713.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von Buttersäureethylester 2714 LITERATUR 272

VERZEICHNISSE VIII Abkürzungsverzeichnis AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift Abb. Abbildung AChE Acetylcholinesterase abs. absolut APT attached proton test Äq. Äquivalent BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin) BCL Burkholderia cepacia Lipase c Umsatz (conversion) d Duplett d Tag dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B CE Cholesterolesterase CRL Candida rugosa Lipase CVL Chromobacterium viscosum Lipase Da Dalton DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih (Enantiomeric Ratio) ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess) EE Essigsäureethylester Et Ethyl EtOH Ethanol GC Gaschromatographie ges. gesättigt h Stunde HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase) HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HV Hochvakuum J Kopplungskonstante

IX VERZEICHNISSE KOtBu Kalium-tert-butylat log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser m Multiplett MeOH Methanol Min. Minuten MPEG Polyethylenglykolmonomethylether MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly- ethylenglykolmonomethylether MTBE tert-Butyl-methylether MW Molekulargewicht n. b. nicht bestimmt NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase) PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly- ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum- Albumin PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase) ppm parts per million Pr Propyl PrOH Propanol Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts) Rfl. Rückfluß RT Raumtemperatur s Singulett Smp. Schmelzpunkt TEA Triethylamin TMS Tetramethylsilan t Triplett tR Retentionszeit U Aktivitätseinheit (Units) wfr. Wasserfrei

1 Einleitung und ZielsetzungEnzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen derpräparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozessemit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatischeRacematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile vonBiokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damitverbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildungvon Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- undStereoselektivität katalysieren.Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind fürtechnische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziellerhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuellzu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrumakzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese vonEstern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist dieStabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung derBetriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei derabsatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methodenzur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelteQuervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zunennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägernstellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse denZugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch derEinsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rollespielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einemanschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaftenidentifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezieltvorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäurenidentifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23

2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGDie Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet fürbiokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mitunterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 EinRacemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beideEnantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effektezwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikamentzugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischenBedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischenBedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26 1522 Wirkstoffe 426 (28 %) 1096 (72 %) Naturstoffe Synthetika 422 (99 %) 4 (1 %) 422 (38 %) 674 (62 %) enantiomerenrein achiral oder racemisch chiral achiral 52 (12 %) 370 (88 %) enantiomerenrein racemischAbb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffenuntersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und derenDerivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheitwerden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemateingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich diesesVerhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarktnoch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsenderAnteil vorhergesagt.29Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler 30Gesundheitsbehörden , welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen

3Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie einvermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtlicheÜberlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfristeines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann(chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suchenach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei derEntwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Syntheseenantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrischeSynthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durchChromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektiveKristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischenSynthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennungder racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielenbiokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 ExtracelluläreLipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetischeVerfahren.9,371.1 Opioide AnalgetikaDie Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Esbesteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien füreine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werdenseit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphinähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wieSucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und 39Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ista algos (griech.) = Schmerz

4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGdaher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nichtaber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärunggefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkendenPeptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieserRezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat dieFunktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismusseine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt.Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auchpostsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystemsfindet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm. 41 Wie bei anderenNeurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedeneSubtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seitkurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid-Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabeiist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Beider supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor einedominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmteNebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiateausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eineunterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variableWirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden.Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auchheute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Strukturdes Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 vonGATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auchdie Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keinepraktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49b Endo-Morphinec Morpheus = griech. Gott des Schlafs

OPIOIDE ANALGETIKA 5 R1O OH O H O N CH3 Me N R2O OH Morphin (1): R1 = R2 = H 1 Codein (2): R1 = Me, R2 = H Heroin (3): R1 = R2 = AcetylAbb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und in einer Stereoformel (rechts).Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetikazur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suchenach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältigvariiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typischmorphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf demMorphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematischeStrukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischerWirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, dasDiacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächerwirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Herointrifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26 CH3 O O CH3 N O O CH3 CH3 N H 3C N N CH3 CH3 4 (-)-5 6 Pethidin Levomethadon FentanylAbb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch

6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGVariation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetischeMethadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sichherausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetischeWirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2)eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure ausMethadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapieeingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in derErsatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadonbesitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins.Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44,jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreichtworden.Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der amstärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seinerrelativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in derNeuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem einNeuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert unddadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. Sokönnen kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperativeAnalgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohenMißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungenstarker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beimMorphin.Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin-Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioidenAnalgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuterVergiftung.41,47

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 71.2 Tramadol und analgetisch aktive AnalogaTramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eineSonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die fürOpioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, inDeutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHALGmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTHORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patientenempfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigstenzentralwirksamen Schmerzmittel.59 OH OH (S) (R) OCH3 H3CO (R) (S) H3C N N CH3 CH3 H3C (+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-TramadolAbb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadolhydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 derdes Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigteine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eineInhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme derNeurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT).Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)-Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist.Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischenKombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteiltsind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierunggebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhereµ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,

8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG OH OH O H3C HO CH3 N N OH CH3 (−)-1 (+)-8Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivatedes physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall vonRinganteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5).Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesenRezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zurStruktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktivesMolekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion amPhenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistischeWirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgrößehat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion amquarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetischeWirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, beiVeresterung geht sie völlig verloren.57Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einenMethylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für dieAnalgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9 HO HO O OH O OH N N CH2 O O Naloxon (9) Naltrexon (10)Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard-Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich-Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhaltenwird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird einecis /trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wirddurch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans-Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langemdokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomerenSalzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68,Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. DieAnwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativenMaßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated movingbed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato-graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durchKapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie inGegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren.GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittelseines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich-Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante vonSCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethyletherhergestellt (s. Abb. 1.7).

10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1) TMSCl, TEA O O CH3 2) ClCH2OEt O N N H OTMS CH3 57 % RMgBr H3CO OH H3CO (H3C)2N 1) MeOTf OH 2) TEA O N rac-7, de = 92 % CH3Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadolverfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe vonELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP)funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vompolymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit demGrignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nurmit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Danach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivitätdargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich-Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren. O O O O O O O OCH3 OCH3 N N H OCH3 67 % (H3C)2N CH2I OH 1) THF / verd. HCl O O O OCH3 N(CH3)2 2) Extraktion + N 3) 3 Äq. RMgBr N(CH3)2 (+)-7, 78 % de 38 % eeAbb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.

111.3 ZielsetzungIn einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkungals auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralenMolekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie inAbb. 1.9 dargestellt zusammenfassen. Einführung zusätzlicher Eliminierung oder Substitution sekundärer OH-Gruppen der tertiären OH-Gruppe OH O CH3 Aromaten- N substitution offenkettige Strukturen H3C CH3 oder -variationAbb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol- Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH.Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol-Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auchfür die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden.Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroutesehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungenist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mitGrignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltungnotwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag.Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisationdiastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zurPrädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zueinem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit denKristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiralerstationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis10 g) geeignet.

12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGZiel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHALGmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysiertekinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. MöglicheFunktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eineHydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt. Zusätzliche sekundäre tertiäre OH-Funtion OH-Funktionen OH phenolische OH-Funktion O CH3 N offenkettige Strukturen H3C CH3Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tramadol-Analoga.Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits ineigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols(rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine möglicheOptimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadolsdienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzlicheHydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlichsubstituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen-katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppecyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysiertekinetische Racematspaltung sein.In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichenVerfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholenoder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester.Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einflußverschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind:Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien unddie Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung sollweitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion ingrößeren Maßstäben realisieren läßt.

2 Theoretischer Teil2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE- Katalysator PräparationEs ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringeAktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daßdurch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycolsie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischenAktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLEerweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLEmit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nichtnotwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEGwerden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einerAktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, diefür die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche desEnzyms gebunden sind, bereitstellen.Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methodedargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und diezurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nachvollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren unddanach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbaresPulver in quantitativer Ausbeute.Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daßdiese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber dieReaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten

14 THEORETISCHER TEILbeispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, derdurch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºCdurchgeführt wird.87Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichenmit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei derLyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 -50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat ausPLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprachder des MPEG/PLE-Colyophilisats.Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität derMPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung istbekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischenTransacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen dasAcylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da beider enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäureentsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und sozur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierunggebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugtgebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einerSelektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentienunter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zuhydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zuvermeiden.Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmtworden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch denGewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweiteMethode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmungdadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und

DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenzkommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbarenMPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknungunterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur eingrober Anhaltspunkt sein.90Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichenWassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysatorvorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.

16 THEORETISCHER TEIL2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-AnalogaIm Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatischeReaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischerAlkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester(s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen.Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und denentsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol undAnalogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einerzusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols undden dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität derphenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen inden folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert.Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu denSubstraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetztenVerbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehendenVerbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführtenSyntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1näher eingegangen.Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regelin Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt.Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechendenO-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Allebereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil.Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese ineiner Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe vonäquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- 1. Freisetzen der Base rac-7cyclohexanol (rac-8): aus dem Hydrochlorid. OH 2. O-Demethylierung von rac-7 OH mit DiBAl-H. Me2N(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OH Me2N(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2N(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13): Freisetzen der Base aus OH OH dem Hydrochlorid. OMe Me2N(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2NDas phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden ausrac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch alsMethylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen

18 THEORETISCHER TEILdes Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwartvon Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung derphenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durchReaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in gutenbis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung amStickstoff war in keinem Fall zu beobachten.Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgtedurch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegebenReaktionsbedingungen (Tabelle 2.2).Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Me Essigsäureanhydrid. Me2N O(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 11 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 19Fortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- Darstellung des Alkoholats3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18): aus 12⋅HCl mit KOtBu und O OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats O aus 13 mit KOtBu und Acylierung mit Buttersäure- Pr O OH OMe chlorid bei –10 ºC. Me2N(±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1. O-Demethylierung von 131,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21): mit DiBAl-H zum Phenol 20. 2. Darstellung des Phenolats OH OH O Pr aus 20 mit NaHCO3-Lsg. und Veresterung mit Butter- Me2N O säureanhydrid.(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N O(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Hexansäure- C5H11 O chlorid bei RT. Me2N O

20 THEORETISCHER TEILFortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Essigsäure- Me O chlorid bei RT. Me2N O(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester Pyridin katalysierte(rac-25): O O Veresterung von 13 mit Pr O O Pr Buttersäureanhydrid. OMe Me2NAllgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion tratin manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung dertertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mitButtersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur istdiese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezuquantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoesterder sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zuvernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. Indiesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung vonMonoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen derMethoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließund somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einererneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden dieReaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-zuwirken.

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 21Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektivenAcylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unterPhasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelangbei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheitsekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 ÄquivalentenButtersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyseeingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendetenReaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nichtEnzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatischeAutohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während derEnzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert desProdukts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalysevortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtigeVoraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Esterder Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bispH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse.Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eineunbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist beiverschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3).Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer- Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol. pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8

22 THEORETISCHER TEILEs zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen anHydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merklicheAutohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stundenbeobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenigsinnvoll.Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen beiRaumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernendeVerunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein haltenzu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolysezu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- undflüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse-bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate undProdukte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eineeindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb.2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmungder Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischenReaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit denjeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie anchiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenenBedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals dieracemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, anentsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signalebeider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogrammbasisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 23 OH OMe Pr O Me2N O rac-22 OH OMe HO Me2N rac-14Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3- methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester (rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule. Me2N OH OMe O O Pr (−)-22 OH OMe Pr O Me2N Me2N OH O (+)-22 OMe HO (−)-14 OH OMe HO Me2N (+)-14Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4- hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von (+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan- 1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer Phase.Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nachAbtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere

24 THEORETISCHER TEILAufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sichdetaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischenReaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung dercyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HClbasieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß vieleErfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werdenkonnten. O CH3 1) BrMg OMe O N Cl H 3C N(Me)2 O THF O O H 3C Cl O O 2) Trennung der Diastereomeren MeCN 3) H OH OH OMe NaBH4 OMe HO O Me2N Me2N rac-27 rac-14Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle vonCyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur dasgewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Dieerhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mitdem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällencis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrenntwurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 25rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurdenanschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. ImFalle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen dasgewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. EineBildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Aufdiesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einerReaktion zu erhalten (Abb. 2.4). 1) CH3 O H 2C N Cl 1) Trennung der O OH CH3 Diastereomeren O OMe 2) 2) H Me2N O BrMg OMe 26 rac-28 OH OH OH NaBH4 OMe OMe HO + Me2N Me2N 32 % 45 % rac-12 rac-13Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und rac-13.

26 THEORETISCHER TEIL2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse2.3.1 Kinetische RacematspaltungenDer Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend demvon Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade imaktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin(His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschiedenstabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen allebisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, dasα/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu paralleleβ-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102 Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices (Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade und einem Bereich zur Stabilisierung von Oxyanionen.Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A)nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Imentscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischenÜbergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und demAcylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladeneÜbergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 272.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eineUmesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar. (A) (B) (C) Ser Ser Ser O O O O H R1 OR2 R1 OR2 R1 O + R2OH O Ser Ser Ser O O O O R1 OR3 H R1 O + R3OH R1 OR3 O (D) (E) (F)Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einemNukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu demfreien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure(Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pongMechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung desAcylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielleReaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung undkinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).

28 THEORETISCHER TEIL Kinetische Dynamische-kinetische Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung schnell schnell R P R P schnell P kR kR + + krac + A + langsam langsam S Q S Q langsam Q kS kSProdukt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P R, S: Enantiomere des Substrats P, Q: Enantiomere des Produkts kR, kS: individuelle Geschwindigkeitskonstanten (kR >> kS) krac: Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung (krac ≥ kR)Abb. 2.7: Prinzipien der Racematspaltung und Desymmetrisierung.In Desymmetrisierungs-Reaktionen104 (s. Abb. 2.7) werden prochirale Substrateeingesetzt, wie beispielsweise meso-konfigurierte Diester. Diese können entwederzum Produkt P oder seinem Enantiomer Q umgesetzt werden. Das Verhältnis derProdukte wird durch die Reaktionsgeschwindigkeiten beider Reaktionen bestimmt.Es ist somit unabhängig vom Umsatz und wird nur durch den Grad der enantiotopen-Differenzierung des Enzyms beeinflußt. Daher ist es möglich, Produkte sowohl inhohen Ausbeuten als auch mit hohen Enantiomerenüberschüssen zu isolieren.In kinetischen Racematspaltungen (s. Abb. 2.7) dagegen wird ein racemischesSubstrat eingesetzt und in einer Enantiomer-differenzierenden Reaktion vom Enzymumgesetzt. In dem Idealfall einer hohen Selektivität wird das eine Enantiomer R desSubstrats vollständig umgesetzt und das andere Enantiomer S nicht. In diesem Fallkann sowohl das nicht-reagierende Enantiomer des Substrats (S) und dasEnantiomer des Produkts (P) mit Ausbeuten bis zu 50 % isoliert werden. Derentscheidende Nachteil einer kinetischen Racematspaltung ist, daß die theoretischmögliche Ausbeute jedes Enantiomers 50 % nicht überschreitet. Zudem ist eineTrennung des Reaktionsprodukts von dem nicht umgesetzten Substrat notwendig. Inder Mehrzahl der Prozesse ist nur eines der Reaktionsprodukte gewünscht, so daßdas andere racemisiert oder in einer enantiokonvergenten Weise umgesetzt werdenmuß, was einen Mehraufwand bedeutet. Wenn möglich wird daher in solchen Fällendie kinetische Racematspaltung um einen Schritt, eine schnelle in-situ

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 29Racemisierung des Substrates, erweitert.105 In einer solchen dynamischen-kinetischen Racematspaltung (s. Abb. 2.7, S. 28) kann das Produkt P ebenfallsenantiomerenrein mit 100 % Ausbeute erhalten werden. In der Aufgabenstellungdieser Arbeit ist aber gerade die Darstellung beider Enantiomere gewünscht, so daßdas Anfallen beider enantiomerer Reaktionsprodukte, wenn auch in Form einesEsters und eines Alkohols, als ein Vorteil der kinetischen Racematspaltung für dieseArbeit gewertet werden kann.2.3.1.1 Der E-WertIn einer kinetischen Racematspaltung ist der Grad der Enantiomerenanreicherungvon Substrat und Produkt abhängig vom Umsatz. Daher ist ein Vergleich vonkinetischen Racematspaltungen hinsichtlicht ihrer Selektivität nur bei gleichemUmsatz sinnvoll. Um eine allgemeinere Vergleichbarkeit zu erreichen, ist von CHEN 106,107und SIH der dimensionslose Selektivitätsparameter E eingeführt worden. DerE-Wert einer Reaktion entspricht dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstantender Reaktionen der beiden Enantiomere (E = kR / kS) und ist unabhängig vonSubstratkonzentration und Umsatz. Auf die Voraussetzungen bei der Definition desE-Werts und deren Gültigkeit wird auf Seite 31 näher eingegangen. Bei bekanntemE-Wert lassen sich somit die ee-Werte von Substrat und Produkt in Abhängigkeitvom Umsatz bestimmen und graphisch auftragen (s. Abb. 2.8).Abb. 2.8: Abhängigkeit der ee-Werte von Substraten (S) und Produkten (P) bei drei kinetischen Racematspaltungen mit verschieden Selektivitäten.

30 THEORETISCHER TEILAus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat-spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten derAusbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kannnur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezuenantiomerenrein erhalten werden.Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert desSubstrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführtenFormeln eingesetzt werden6,107,108: ln [1− c(1+ eeP )]Formel 2.1: E= , für c < 50 % ln [1 − c(1− eeP )] ln [(1− c)(1− ee S )]Formel 2.2: E= , für c > 50 % ln [(1− c)(1+ ee S )]  1− ee S   ee P (1− ee S )  ln   ln  (ee + ee )  1 + (eeS /ee P )   S  E=  = PFormel 2.3:  1 + ee S   ee P (1+ ee S )  ln   ln   1 + (eeS /ee P )   ee P + ee S ) (mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)KAZLAUSKAS et al. haben eine schnelle photospektroskopische Methode zurBestimmung des E-Werts entwickelt, die auf der Umsetzung der einzelnenEnantiomeren basiert (“Quick E-Wert“).109 Häufig stehen gerade diese aber nicht zurVerfügung.E-Werte sind für sehr kleine und sehr große Umsätze mit einem großen Fehlerbehaftet. Entweder läßt sich c nur mit beschränkter Genauigkeit bestimmen oder diegefundenen ee-Werte sind sehr groß, so daß relativ kleine Fehler bei Bestimmungenvon c, eeS oder eeP einen großen Einfluß auf den berechneten E-Wert haben, da sielogarithmisch in die Berechnung eingehen.6,21,108,110 Die Angabe von E-Wertengrößer als 100 ist aus demselben Grund wenig sinnvoll, da hier ebenfalls der Einflußkleiner Meßfehler sehr groß ist.6,108,110,111 In einigen Fällen können sogar E-Werte umdie 50 nur mit einer Genauigkeit von ± 10 angegeben werden (Angabe als E ≈ 50).6Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer alsdie Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 31wie Ester und Alkohol bestimmt werden muß, in diesen Fällen ist zur Berechnungvon E Formel 2.3 die geeignetste.6 Im Rahmen dieser Arbeit wurde generell daraufverzichtet E-Werte basierend auf Umsatzbestimmungen zu berechnen. Vielmehrwurden alle E-Werte mittels Enantiomerenüberschüssen des Substrats und desProdukts nach Formel 2.3 berechnet.Bei der Definition von E wird vorausgesetzt, daß eine Michaelis-Menten Kinetik alsReaktionsmechanismus vorliegt, daß die Reaktion irreversibel ist, daß keineProduktinhibierung vorliegt, daß nur eine Katalysatorspezies vorliegt und daß dieReaktionslösung homogen ist.6,106,106,112 Auf diese Voraussetzungen soll imfolgenden näher eingegangen werden:a) Reaktionsmechanismus nach Michaelis-Menten:Es konnte gezeigt werden, daß Lipasen katalysierte Reaktionen nach einem ping-pong-bi-bi-Mechanismus verlaufen.113 Kinetische Racematspaltungen nach einem bi-bi-Mechanismus verlaufen allgemein unter Involvierung eines nicht-chiralen undeines chiralen Substrates sowie Produktes.103 CHEN et al. setzen aber für ihreHerleitung des E-Werts eine Michaelis-Menten Kinetik nach einem uni-uni-Mechanismus voraus und betrachten formal nicht die Involvierung mehrererSubstrate und Produkte. Von STRAATHOF et al. werden unter Berücksichtigungmehrerer möglicher bi-bi-Meachanismen bis zu acht verschiedene Formeln zurBerechung von E vorgeschlagen.103 Diese haben sich jedoch nicht durchgesetzt, dasich vielfach die häufig nur geringen Abweichungen von einem uni-uni-Mechanismuserst bei hohen Umsätzen beobachten lassen.103 Für Esterhydrolysen im wäßrigenMedium ist zudem die Näherung einer Michaelis-Menten Kinetik meist gut erfüllt.114b) Reversibilität:Allgemein wird davon ausgegangen, daß enzymatische Hydrolysen aufgrund derhohen Konzentration des Lösungsmittels Wasser (55.5 M) irreversibel verlaufen. Beienzymatischen Transacylierungen unter Einsatz von Enolestern mit hinreichendhohem Überschuß des Acyldonors und geringen Wassergehalten spielt eineRückreaktion des gebildeten Esters ebenfalls keine Rolle.107 Der gebildete Esterkann prinzipiell allerdings als Acyldondor fungieren, wodurch der zweite Teilschrittder Transacylierung reversibel wird.115 Ebenfalls können geringe Mengen Wasser zu

32 THEORETISCHER TEILHydrolysereaktionen führen.116 Für Gleichgewichtsreaktionen wurde von CHEN undSIH ebenfalls eine Methode zur Bestimmung von E unter Kenntnis derGleichgewichtskonstanten K entwickelt (Formel 2.4).107 Wie aus Abb. 2.9 hervorgeht,fallen bei reversiblen, kinetischen Racematspaltungen die ee-Werte des Substratsbei Umsätzen über 50 % deutlich ab. Nicht umgesetztes Substrat kann also im Falleeiner reversiblen Reaktion nicht mehr enantiomerenrein erhalten werden. Hoheee-Werte des Substrats bei großen Umsätzen deuten hingegen auf eine extremeGleichgewichtslage (K ≈ 0, Fall a in Abb. 2.9) hin. ln [1 − (1 + K)(c + ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 + eeP )]Formel 2.4: E= = ln [1 − (1 + K)(c − ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 - eeP )](mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5).ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt,indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS-und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117c) Substrat- oder ProduktinhibierungBei dem Vorliegen von Produktinhibierung kann sich der E-Wert über denReaktionsverlauf ändern.118,119 Um den E-Wert zu beeinflussen, muß allerdings eineenantioselektive Inhibierung vorliegen118, die sogar eine Rückreaktion des Produkts

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 33begünstigen kann119. In verdünnten Lösungen sind diese Effekte jedoch als geringeinzuschätzen.112b)d) Reinheit des Biokatalysators:Besteht ein Enzym aus verschieden Isoenzymen oder enthält ein EnzymVerunreinigungen anderer Enzyme, wie häufig in kommerziellen nur rohaufgereinigten Präparationen, so stellt der E-Wert ein gewichtetes Mittel allerBiokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar. KARNERVA et al. habenbeispielsweise unterschiedliche Selektivitäten für Isoenzyme der Candida rugosaLipase in Hydrolysereaktionen beobachtet.120 Auch für die Schweineleber-Esterasewerden in verschiedenen Publikationen unterschiedliche Selektivitäten der einzelnenIsoenzyme postuliert.130,131 Im Falle der Candida antarctica Lipase sind zweiIsoenzyme bekannt, die signifikante unterschiedliche katalytische Eigenschaften auf-weisen. Ausgewählte physikalische Eigenschaften der Isoenzyme CAL-A und CAL-B,welche die Unterschiedlichkeit beider Katalysatoren verdeutlichen, sind in Tabelle 2.4aufgeführt.121Tabelle 2.4: Charakteristika der Isoenzyme der Candida antarctica Lipase CAL-A CAL-B Molekulargewicht122 45 kD 33 kD Isoelektrischer Punkt (pI)122 7.5 6.0 pH-Optimum123 7 7 spezifische Aktivität123 420 LU/mg 435 LU/mg pH-Stabilität122 6-9 7-10 Grenzflächenaktivierung123 schwach nein

34 THEORETISCHER TEILEin allgemein deutliches Anzeichen für ein Abweichen der angenommenenVoraussetzungen ist eine Änderung des E-Werts über den Verlauf der Reaktion.124Auch liefert ein Vergleich des experimentell bestimmten Umsatzes mit dem nachFormel 2.5 berechneten Umsatz114 Hinweise auf die Konsistenz der durchgeführtenBerechnungen. ee SFormel 2.5: Umsatz ber = ee S + ee PIm allgemeinen werden für enzymatische Reaktionen E-Werte nach CHEN und SIHzur übergreifenden Vergleichbarkeit angegeben, ohne explizit anzugeben, ob diekinetischen Voraussetzungen erfüllt sind. Von STRAATHOF et al. wird sogar generelldie Gültigkeit der Formel 2.1 und Formel 2.2 für Reaktionen nach einem bi-bi-Mechanismus bestritten.103 Vor diesem Hintergrund sollen im Rahmen dieser Arbeitverschiedene enzymatische Hydrolysen und Transacylierungen möglichst einfachuntereinander verglichen werden. Obwohl nicht alle Voraussetzung für die formaleGültigkeit der Formeln zur Berechnung von E erfüllt sind, werden in dieser ArbeitE-Werte nach CHEN und SIH zu einer einfachen und übersichtlichen Vergleichbarkeitangegeben, da eine Angabe von ee-Werten über den Umsatz wenig sinnvollerscheint und außerdem keine Untersuchungen zur Kinetik durchgeführt werdensollen.Für präparative Zwecke interessant und somit das angestrebte Ziel in dieser Arbeitsind kinetische Racematspaltungen mit einem E-Wert größer 20, denn sie können inder Synthese genutzt werden (Abb. 2.10).6,110 Aus den Kurven für die Abhängigkeitder ee-Werte vom Umsatz kann man bestimmen, bei welchem Umsatz eine Reaktionabzubrechen ist, um Produkt oder Substrat mit möglichst hohem Enanantiomeren-überschuß und möglichst großer Ausbeute zu erhalten (Abb. 2.10).

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 35Abb. 2.10: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (S) und Produkt (P) in einer kinetischen Racematspaltung bei einer Selektivität von E = 21. Eingezeichnet ist ein Umsatz von 63 %, ab dem das Substrat (S) enantiomerenrein vorliegt.2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und ReaktionsmedienHydrolasen sind in großer Anzahl kommerziell erhältlich.4 Allerdings werden in derorganische Synthese davon vorwiegend nur einige wenige, empirisch ausgewählteeingesetzt.5,6,21 Diese Enzyme sind besonders gut untersucht und über einen langenZeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar. Im einzelnensind diese Enzyme in Tabelle 2.5 aufgeführt.

36 THEORETISCHER TEILTabelle 2.5: Wichtige Hydrolasen mit ausgewählten EigenschaftenSchweinepankreas- Molekulargewicht: 50 kDalipase (PPL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre AlkoholeBurkholderia ehemals: Pseudomonas cepacia Lipase (PCL)cepacia Lipase Molekulargewicht: 33 kDa(BCL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Amine Protein kann rekombinant aus Pseudomonas Spezien gewonnen werden.Candida rugosa Molekulargewicht: 63 kDaLipase (CRL) Substrate: große cyclische, sekundäre Alkohole Präparationen können ein bis fünf Isoenzyme 120,125, die in Reaktivität und Selektivität variieren, aber die gleiche Enantiopräferenz120 zeigen, enthalten.Lipase B aus Molekulargewicht: 33 kDaCandida antarctica Substrate: kleine sekundäre Alkohole, primäre Amine(CAL-B) Protein wird rekombinant aus Aspergillus oryzae produziert.126,127Schweineleber- Molekulargewicht: 165 kDa (Trimer)128Esterase (PLE) Substrate: Carbonsäuren, sterisch gehinderte Alkohole PLE ist eine Mischung mehrerer Isoenzyme mit komplexer Mikroheterogenität.128,129 Die Isoenzyme können signifikante Unterschiede in Aktivität und Selektivität, sowie in ihrer Enantiopräferenz zeigen.130,131 Die Gewinnung einer rekombinanten, isoenzymeinheitlichen PLE ist seit kurzem bekannt.131a),b)Angabe der bevorzugten Substrate nach NAEMURA et al.132,6 6Angabe des Molekulargewichts, außer für PLE, nach BORNSCHEUER und KAZLAUSKAS.An das Enzym eines möglichen technischen Prozesses zur Darstellung einesTramadol-Analogons, der einen enzymatischen Zwischenschritt beinhaltet, werdenfolgende Ansprüche gestellt: es katalysiert die gegebene Reaktion mit hoher Aktivitätund Selektivität, es ist unter den Reaktionsbedingungen stabil und es ist möglichst

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 37lange in gleicher Qualität und Präparation zu einem annehmbaren Preis kommerziellverfügbar. Dies trifft im besonderen auf die obengenannten Enzyme zu, die daher indieser Arbeit besondere Beachtung finden.Es ist wohlbekannt, daß Lipasen sowohl in wässrigen als auch in unpolaren Medienkatalytisch aktiv sind und eine breite Palette auch nicht natürlicher Substrateakzeptieren. Dies liegt an der Flexibilität der Proteinkette, die eine Vielzahl vonKonformationen annehmen kann, um Substrate aufzunehmen, weshalb Lipasenauch als „induced fit“ Enzyme bezeichnet werden. Jedoch macht diese Eigenschafteine Vorhersage der stereochemischen Wechselwirkung von Enzym und Substratschwierig. Viele Enzyme zeigen im wäßrigen Ein- oder Zweiphasensystem ihregrößte katalytische Aktivität, da sie im wässerigen Medium ihrem optimalenpH-Bereich und ihrer optimale Solvatation ausgesetzt sind.133 Aufgrund der erhöhtenFlexibilität von Enzymen im wässerigen Medium können Substrate akzeptiertwerden, die im organischen Medium nur unzureichend umgesetzt werden. VerlaufenHydrolysen jedoch mit schlechter Enantioselektivität, so sollte die Enzymkatalyse aufdie entsprechende Transacylierung im organischen Medium erweitert werden. Imorganischen Medium haben hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, sodaß hier Substrate eingesetzt werden können, die nicht im wässerigen Milieuumgesetzt werden können. Eine Umsetzung hydrolyselabiler Verbindungen ist einweiterer Vorteil.Zusätzlich verhalten sich Hydrolyse und Transacylierung unter dem Blickpunkt derasymmetrischen Synthese enantiokomplementär, so daß durch einen Wechsel desReaktionsmediums ebenfalls beide Enantiomere dargestellt werden können.Im Rahmen dieser Arbeit sollen daher beide Möglichkeiten des Reaktionsmediumsder enzymatischen Racematspaltung untersucht werden, um eine möglichst breiteGrundlage zur Gewinnung von enantiomeren Tramadol-Analoga zu schaffen.

38 THEORETISCHER TEIL2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen HydrolyseBei den in die enzymatische Hydrolyse einzusetzenden Verbindungen handelt essich um Tramadol-Analoga mit einer phenolischen oder sekundären Hydroxylgruppe,die durch eine geeignete Wahl des Acylrestes in Ester überführt werden und so alsSubstrate eingesetzt werden können.Üblicherweise werden für Lipasen-katalysierte Hydrolysen langkettige Ester vonFettsäuren bevorzugt, die dem Vorbild der Triglyceride entsprechen. Dagegenwerden Esterase-katalysierte Hydrolysen am besten mit Estern kurzkettigerCarbonsäuren durchgeführt.6,110,101 Um bei der Wahl der Acylgruppe sowohl denLipasen als auch den Esterasen ein Substrat zu bieten, daß umgesetzt werden kann,wurde die Butyratgruppe als Standard gewählt, da Buttersäureester sowohl vonLipasen als auch Esterasen als Substrate akzeptiert werden.So gelang COOPE et al. beispielsweise die PLE-katalysierte Hydrolyse eines tertiärenQuinclidinol Esters nur im Falle eines Butyrats als Acylgruppe mit ausreichenderAktivität.134 In anderen Beispielen konnten KAZLAUSKAS135 et al. sowie WHITESIDES136et al. für einige Fälle Lipasen-katalysierter Hydrolysen zeigen, daß bei einemWechsel der Acylgruppe vom Acetat zum Butyrat ein Anstieg der Selektivität zubeobachten war. In der Umkehrreaktion zu Hydrolyse, der PLE-katalysiertenTransacylierung racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und-butyrat, konnten GAIS et al. ebenfalls beobachten, daß bei größerer Kettenlänge desAcyldonors eine Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität auftritt.81,84Zur Verbesserung der Löslichkeit von Substraten im wäßrigen Medium ist dieZugabe von Cosolventien wie Aceton, Methanol, tert-Butanol oder DMSO möglich,diese werden dabei in Konzentrationen bis zu 20 % toleriert.5,6,8,137,138 BeiUntersuchungen zum Einfluß des Cosolvens auf die PLE-katalysierten Hydrolyse vonmeso-Diestern konnten GUANTI et al. zeigten, daß die besten Ergebnisse hinsichtlichAusbeute und Selektivität durch einen Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvenserreicht wurden.138 Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für die im Rahmen dieserArbeit durchgeführten enzymatische Hydrolysen im wäßrigen Einphasensystemstandardmäßig ein Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt. Einemögliche Nebenreaktionen der Alkoholyse des Cosolvens, also der enzymatischenAcylierung des Cosolvens statt des Wassers, ist aufgrund der tertiären Hydroxyl-gruppe am tert-Butanol nicht möglich.

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 392.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen TransacylierungLipasen katalysierte Transacylierungen mit aktivierten Acyldonoren (Abb. 2.11)verlaufen im allgemeinen schnell und das Gleichgewicht der Transacylierung liegt aufder Seite der Produkte. Aktivierte Ester: Anhydride: O O O O O O N C3H7 O CF3 C7H15 S O O 29 30 31 Enolester: O O O O OEt O O O O 32 33 34 35Abb. 2.11: Beispiele für gebräuchliche Klassen von aktivierten Acyldonoren zur irreversiblen enzymatischen Transacylierung.Die bedeutensten aktivierten Acyldonoren sind Enolester, wie Vinylacetat (32) oderIsopropenylacetat (34). Der aus Enolestern entstehende Alkohol tautomerisiert zurCarbonylverbindung, wodurch das Gleichgewicht der Transacylierung auf der Seiteder Produkte liegt. Die meisten Lipasen tolerieren die Anwesenheit von Acetaldehyd.CRL bildet hier eine bekannte Ausnahme 139,140,141. Neuere Untersuchungen gehenvon einer Reaktion des Acetaldehyds mit Lysin-Resten des Proteins unter Bildungeiner Schiff´schen Base aus, wodurch eine positive Ladung von derProteinoberfläche entfernet wird und zur Deaktivierung des Enzyms führt (Abb.2.12).140,142,143,144,145 Als Alternative bieten sich hier die AcylierungsmittelIsopropenylacetat (34) und 1-Ethoxyvinylacetat142,146 (35) an, da die aus diesenReagentien gebildeten Alkohole zu den weniger reaktiven Verbindungen Aceton bzw.Essigsäureethylester tautomerisieren. 1-Ethoxyvinylester sind allerdings schwerzugänglich.

40 THEORETISCHER TEIL H O Lys NH3 Lys N - H3OAbb. 2.12: Deaktivierung von Proteinen durch Acetaldehyd.Im Falle der Enolester und Anhydride verläuft die Transacylierung praktischirreversibel. Eine möglichst extreme Gleichgewichtslage ist in kinetischenRacematspaltungen von entscheidender Bedeutung, da eine mögliche Rückreaktionden Enantiomerenüberschuß des verbleibenden Substrats und somit den E-Wert derReaktion herabsetzt (s. Kap. 2.3.1.1).165 Es wurden daher in den im Rahmen dieserArbeit durchgeführten Transacylierungen nur Enolester als Acylierungsmitteleingesetzt. Alle Acylierungsmittel sind vor ihrer Verwendung über Na2CO3 destilliertworden, um die Anwesenheit von Säurespuren, die eine nicht-enzymatischeReaktion katalysieren könnten, auszuschließen.In einer großen Zahl an Veröffentlichungen wird beschrieben, daßProteineigenschaften, wie die Enantioselektivität von Enzymen, durch die Art desLösungsmittels, das als Reaktionsmedium eingesetzt wird, beeinflußt werdenkönnen.147,148 Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß unpolare Lösungsmittelbesser für eine Enzymkatalyse geeignet sind, da das an das Enzym gebundene undzur Entfaltung der Aktivität notwendige Wasser nicht entfernt wird.149 Starkhydrophile Lösungsmittel können das aktive Zentrum dehydratisieren und sind daherzur Enzymkatalyse nur bedingt geeignet. Neben der Aktivität wird auch dieSelektivität von Enzymen stark durch die Eigenschaften des Lösungsmittelsbeeinflußt. Mehrere Hypothesen zur Erklärung dieses Phänomens wurden bereitsformuliert. So kann nach KLIBANOV et al. die Enzymkonformation durch die Polaritätdes Lösungsmittels modifiziert werden und so den molekularen Erkennungsprozeßzwischen Enzym und Substrat beeinflussen.150 Nach einer weiteren Hypothese hängtdie Selektivität von der Energetik der Substratsolvatisierung ab.151 Eine andereTheorie beruht auf der Vorstellung, daß Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrumbinden und bei der Assoziierung des Substrats interferieren.152 Allerdings sind dieseHypothesen hinsichtlich ihres Vorhersagewertes unbefriedigend. Sie scheinenentweder nur für das jeweils betrachtete Enzym und Substrat gültig zu sein, oder es

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 41ist, wie im Falle von Lösungsmittel-Enzym-Komplexen, überhaupt keineVerallgemeinerung möglich.Zusammenfassend scheint weiterhin gegenwärtig keine Gemeinsamkeit zwischenden verschiedenen Hypothesen zu existieren, obgleich es wahrscheinlich ist, daßdas Lösungsmittel die enzymatische Selektivität über mehr als einen Mechanismusbeeinflußt. Eine allgemeingültige Aussage über das optimale Medium für eineEnzymkatalyse unter bestimmten Bedingungen ist daher nicht möglich. Daraus läßtsich folgern, daß für jede Reaktion eine Optimierung der Lösungsmitteleigenschaftendurchzuführen ist.153Um diese Möglichkeit der Veränderung von Enzymeigenschaften durch denLösungsmitteleinfluß zu beschreiben, wird der Ausdruck „Medium-Engineering“verwendet, um damit eine Alternative zum oder auch eine Vervollständigung des„Protein-Engineering“ zu bezeichnen.147 Die bislang publizierten Ergebnisse habengezeigt, daß für eine Modifizierung oder Verbesserung der Enzymselektivität dasMedium-Engineering eine gute Alternative zum Protein-Engineering und zurzeitaufwendigen Suche nach neuen Katalysatoren ist.

42 THEORETISCHER TEIL2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer HydroxylfunktionenDa nur ein kleiner Teil der bekannten Wirkstoffe eine sekundären Hydroxyfunktionenthält, ist der weitaus größere Anteil kein klassisches Substrat für die bisheretablierten enzymatischen Racematspaltungen. Viele Wirkstoffe haben zwar eineAminofunktion mittels derer eine Aminoacylasen-katalysierte Racematspaltungdurchgeführt werden könnte154, die Aminogruppe kann aber wie im Beispiel vonrac-7 einer solchen Reaktion unzugänglich sein. Ein neuerer Ansatz, der bereits ineigenen Vorarbeiten verfolgt wurde80, ist die in Wirkstoffen weitaus häufigerephenolische Hydroxylgruppe in einer Hydrolasen-katalysierten Racematspaltung zunutzen. Dieser Ansatz bietet neue Herausforderungen, da die Distanz zuvorhandenen Chiralitätszentren beträchtlich erhöht ist.Hydrolasen-katalysierte Umsetzungen von phenolischen Estern sind in derSchutzgruppentechnik bereits etabliert.155 Enzyme ermöglichen eine gezielteEntfernung enzymlabiler Schutzfunktionen unter milden Reaktionsbedingungen, wiebeispielhaft an der enzymatischen Hydrolyse des phenolischen Acetats an einem4-Acetoxybenzyloxycarbonyl Urethan mit anschließender Fragmentierung gezeigt ist(Abb. 2.13)156. O Acetyl- OR esterase R N O O N O R NH2 H pH 7.0, H O 45 ºC O R = LipoproteinAbb. 2.13: Enzymatische Spaltung der 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl-Schutzgruppe.In mehreren Untersuchungen konnte bereits auch gezeigt werden, daß Hydrolasen inder Lage sind, Reaktionen von Phenolen oder Phenylestern sowohl mit hoherRegio-157,158 als auch Chemoselektivität157,159 zu katalysieren. Aufgrund dessen

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 43empfehlen sich Enzym-katalysierte Hydrolysen von Phenylestern nicht nur fürSchutzgruppenoperationen, sondern auch allgemein für die organische Synthese.Um den Ansprüchen der modernen organischen Synthese voll gerecht zu werden,sollte die Methodik der Enzym-katalysierten Transformation der Phenolgruppeallerdings auch in einer enantioselektive Art möglich sein.Für enzymatische Enantiomeren-differenzierende Racematspaltungen von Phenol-derivaten sind jedoch bis heute nur wenige Beispiele bekannt.Ein gut untersuchtes Substrat mit axialer Chiralität ist das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol(rac-36) bzw. dessen Ester. MIYANO et al. beschrieben 1987 die Schweinepankreas-lipase katalysierte Hydrolyse eines Divaleriansäureesters (rac-37a) mit sehr guterSelektivität (Abb. 2.14).160 Die Hydrolyse eines solchen Diesters bezieht zwei Stufenenzymatischer Racematspaltungen ein. Solche zweistufigen Hydrolysen lassen inder Theorie einen höheren ee-Wert der Produkte als einstufige Reaktionenerwarten161. Der als primäres Produkt entstehende Monoester konnte nur in geringenMengen nachgewiesen werden, da er umgehend vom Enzym weiter umgesetzt wird.Wird ein Monoester direkt als Substrat eingesetzt, verläuft eine Lipasen-katalysierteHydrolyse ebenfalls mit hoher Selektivität (E > 100).162,163 Einer Schweineleber-Esterasen-katalysierten Hydrolyse ist das entsprechende Butyrat rac-37b nichtzugänglich164. Des weiteren konnte von INAGAKI et al. demonstriert werden, daß das1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) auch direkt als Substrat in eine Lipasen-katalysierte Transacylierung eingesetzt werden kann, die mit guter Selektivitätverläuft (E > 60) und auf der Stufe des monoacylierten Produkts stehen bleibt.162Allerdings zeigte die von INAGAKI et al. eingesetzte Lipase aus Pseudomonas sp. einezu den bisherigen eingesetzten Lipasen entgegengesetzte Enantiopräferenz. WANGet al. war es zuvor nicht gelungen rac-36 mit verschiedenen Lipasen sowie derCholesterolesterase zu acylieren.165 O O O R Enzym OH O R + O R H2O OH O R O O rac-37 a = nBu (−)-(aS)-36 (+)-(aR)-37 a b = nPr bAbb. 2.14: Enzymatische Hydrolyse von Estern des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols.

44 THEORETISCHER TEILKAZLAUSKAS konnte weiterhin unter Verwendung des Enzyms Cholesterolesterasezeigen, daß nicht nur substituierte 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diole, sondern auchentfernte Derivate mit sehr guten Selektivitäten hydrolysiert werden und somit einallgemeiner Zugang zu enantiomerenreinen Verbindungen diesen Typs existiert.166In systematischen Untersuchungen zur Lipasen-katalysierten Hydrolyse vonverschiedenen substituierten racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern konnten HOSHINO et al. zeigen, daß Ester vonPhenolen, bei denen das Chiralitätszentrum mehrere C-Atome von der Phenolgruppeentfernt ist, Substrate für eine enzymatische kinetische Racematspaltung sind. Unteranderem zeigte sich hierbei die Lipase aus Candida rugosa als geeigneterKatalysator. Somit stellt die Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung vonphenolischen Substraten eine Möglichkeit zur Gewinnung von enantiomerenreinenVerbindungen dar. Die erzielten Selektivitäten in den Lipasen-katalysiertenReaktionen waren allerdings niedrig, es konnten E-Werte im Bereich von 2 bismaximal 11 erreicht werden.167 AcO HO AcO MeO Lipase MeO MeO NMe NMe NMe H2O gesättigtes H + H n organisches n n LösungsmittelMeO MeO MeO OMe OMe OMe (S) (R)Abb. 2.15: Enzymatische Hydrolyse von racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern.ACHIWA et al. stellten einen neuen Zugang zu (R)-α-Tocopherol vor, indem sie eineam aromatischen Ring demethylierte Vorstufe in eine Lipasen-katalysierte kinetischeRacematspaltung einsetzten (Abb. 2.16). Auch hier war die Selektivität der Hydrolysedes phenolischen Esters, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund des entferntenstereogenen Zentrums, gering (E ≤ 10).168 Eine enzymatische Hydrolyse der amaromatischen Ring permethylierten Verbindung, dem α-Tocopherol, war aufgrundvon sterischen Hinderungen nicht möglich. Von ZAMMATTIO et al. wird die Lipasen-

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 45katalysierte Hydrolyse eines ähnlich aufgebauten phenolischen Substrats, mit einem2H-Benzopyrangerüst, ebenfalls mit geringer Selektivität beschrieben (Abb. 2.17links).169 AcO HO AcO CRL R + O R H 2O O O R (S) (R) R=Abb. 2.16: Lipase-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tocolacetat.Höhere Selektivitäten mit E-Werten von 24 bis 60 beobachten HUTCHINSON et al. beider PLE-katalysierten Hydrolyse von phenolischen Estern bei denen dasChiralitätszentrum im Säureanteil des Moleküls und somit näher an der vom Enzymangegriffenen Bindung lokalisiert ist (Abb. 2.17 rechts).170 Interessanterweise wurdehier aus Löslichkeitsgründen nicht das freie Amin sondern das Hydrochlorid der Baseals Substrat eingesetzt. AcO O O N(CH2CH2OCH3)2 ⋅HCl R1 O R2 O n OMe n = 1,2 R1 = H, Me, R2 = Et, nPrAbb. 2.17: Racemische Substrate mit aromatischer Hydroxylgruppe, die in Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltungen eingesetzt worden sind.Ebenfalls sehr gute Selektivitäten konnten LIU et al. in der enzymatischen Hydrolyseeines phenolischen Esters mit dem Chiralitätszentrum im phenolischen Teil desMoleküls erzielen. Sie erzielten E-Wert bis zu 60 bei der Cholesterolesterasen-katalysierten Hydrolyse von Essigsäureestern des Lasofoxifene (Abb. 2.18).171

46 THEORETISCHER TEIL N O CE + H2O AcO HO AcO (5R,6S) (5S,6R) LasofoxifeneAbb. 2.18: CE-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von Lasofoxifene.Zusammenfassend kann nach Kenntnisstand der Literatur zu Beginn dieser Arbeitfestgestellt werden, daß Ester von aromatischen Alkoholen von Enzymen alsSubstrate akzeptiert werden. Die erzielten Selektivitäten waren zu jenem Zeitpunktaber sehr niedrig und präparativ nicht nutzbar. Erst in jüngster Zeit ist vermehrt inPublikationen über Enantiomeren-differenzierende Hydrolysen von Phenylestern mitpräparativ nutzbaren Enantiomerenüberschüssen berichtet worden.In eigenen Vorarbeiten wurde das O-Desmethyltramadol (rac-8, M1) als Substrat mitaromatischer Hydroxylgruppe für eine Enzym-katalysierte Racematspaltungausgewählt. Das O-Desmethyltramadol, ein Hauptmetabolit des Wirkstoffs Tramadol,und seine einzelnen Enantiomere sind für die Pharmakokinetik des Tramadols vonBedeutung. Zudem bieten die Enantiomere dieser Verbindung nach MethylierungZugang zu den Enantiomeren des Tramadols.Daß Ester des O-Desmethyltramadols, wie der (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15), als Substratevon dem Enzym PLE akzeptiert werden, konnte bereits in diesen Vorarbeitendemonstriert werden (Abb. 2.19).80

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 47 OH O Pr OH PLE O Me2N O Pr Phosphatpuffer- Lösung (pH 8.0) (+)-15 Me2N O + 10 % Cosolvens rac-15 Me2N OH RT OH (−)-8Abb. 2.19: PLE-katalysierte Hydrolyse von (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15).In der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 unter Zusatz von 10 % tert-Butanolals Cosolvens konnte der enantiomerenreine Ester (+)-15 bei hohen Umsätzenerhalten werden (Tabelle 2.6). Die Selektivität der Reaktion war insgesamt sehrniedrig (E = 7). Unter Verwendung von 10 % Methanol als Cosolvens konnte eineSteigerung der Aktivität und der Selektivität des Enzyms PLE beobachtet werden(E = 11).Tabelle 2.6: Zusammenfassung der Ergebnisse eigener Vorarbeiten zur PLE- katalysierten Hydrolyse von rac-15 Reaktionsbedingungen E-Wert Umsatz (nach 1.5 h) 23 %9.0 U/ml; pH 8.0; ee Ester (+)-15 76 % 710 % tert-Butanol ee Phenol (−)-8 51 % Umsatz (nach 0.5 h) 20 %3.9 U/ml; pH 8.0; ee Ester (+)-15 17 % 1110 % Methanol ee Phenol (−)-8 81 %Es konnte somit gezeigt werden, daß in den Enzym-katalysiertenRacematspaltungen mit Verbindungen auf Basis des Tramadols eine für ersteLaborsynthesen zur Gewinnung von Enantiomeren ausreichende Selektivität erzieltwerden kann, und dies, obwohl die Chiralitätszentren nicht direkt an der zu

48 THEORETISCHER TEILhydrolysierenden Estergruppe lokalisiert sind. Des weiteren konnte belegt werden,daß das zugesetzte Cosolvens einen entscheidenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Tramadol-Analoga ausübt.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 492.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15)Ausgehend von den vorgestellten eigenen Vorarbeiten wurden weitergehendeUntersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischenTramadol-Analoga durchgeführt. Im Vordergrund stand hierbei die Suche nachReaktionsbedingungen für ein in einem präparativen Maßstab nutzbaren Verfahrenzur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischerHydroxylgruppe.Die Schweineleber-Esterase (PLE) benötigt, wie andere Hydrolasen auch, keinCoenzym oder Cofaktor, ist kommerziell verfügbar und verbindet eine geringeSubstratspezifität mit hoher Enantioselektivität.5 PLE ist eine der am erfolgreichsteneingesetzten Hydrolasen in der enantiotopos-differenzierenden Hydrolyse vonDicarbonsäure-diestern und von Diacetaten von Diolen5, welche bereits exemplarischin einem 100 mol Maßstab durchgeführt worden sind172. Aus diesen Gründenerscheint die PLE als ein zweckmäßiges Enzym und wurde zunächst alsBiokatalysator für die Hydrolyse von Tramadol-Analoga beibehalten.Da das Cosolvens in der enzymatischen Hydrolyse einen entscheidenden Einflußausüben kann, wurde neben den bisher verwendeten Lösungsmitteln tert-Butanolund Methanol ebenfalls der Einfluß von Aceton als Cosolvens auf die PLE-katalysierte Hydrolyse des (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) untersucht (Tabelle 2.7).Aceton ist ein übliches Cosolvens in der PLE-katalysierten Hydrolyse von Estern.5Häufig kann ein aktivitäts- und selektivitätssteigernder Einfluß des Acetons auf diePLE-Katalyse beobachtet werden. So berichten beispielsweise TAMM et al. voneinem Anstieg der Selektivität in einigen Fällen der PLE-katalysiertenDesymmetrisierung, wenn sie statt keinem 10 % Aceton als Cosolvensverwendeten.173 PIETZSCH et al. untersuchten den Einfluß der Konzentration desCosolvens Aceton auf die Aktivität von PLE unter Standardaktivitätstest-bedingungen.174 Sie beobachten bei einer Konzentration von 3 – 5 % Aceton eineAktivitätssteigerung der PLE von 75 % im Vergleich zur Aktivität der PLE ohneCosolvens. Sie berichten ebenfalls von einer Steigerung der Selektivität in der PLE-

50 THEORETISCHER TEILkatalysierten kinetischen Racematspaltung von Allenen bei Zusatz von 3 % Acetonals Cosolvens.Tabelle 2.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von 10 % Aceton als Cosolvens (3.3 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0)Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert 5 Min 52 % 27 % 46 % 4Aus Tabelle 2.7 geht hervor, daß Aceton als Cosolvens im Vergleich zu denCosolventien tert-Butanol und Methanol (Tabelle 2.6) zu einer weiteren Steigerungder Aktivität der PLE führt, da die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich zunimmt.Dieser Einfluß auf die Reaktionsgeschwindigkeit geht allerdings mit Einbußen in derSelektivität der Reaktion einher. Die Selektivität ist so gering, daß keine weiterenVersuche in der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischerHydroxylgruppe mit Aceton als Cosolvens unternommen wurden. Für andereSubstrate, bei denen die Selektivität der enzymatischen Hydrolyse hoch genug ist,kann sich die Verwendung von Aceton als Cosolvens zu einer Steigerung derReaktionsgeschwindigkeit anbieten.Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten Hydrolyse vonSubstraten mit aromatischer Hydroxylgruppe zu demonstrieren, wurde die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-15 in einem 3.5 mmol Maßstab durchgeführt. Eswurden die bereits optimierten und bewährten Reaktionsbedingungen pH 8.0 und10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt (Tabelle 2.9).Um die einzusetzenden Lösungsmittelmengen zu reduzieren wurde für dieseVersuche in einem präparativen Maßstab eine erhöhte Substratkonzentration von ca.0.09 mol/l statt der bisher verwendeten 0.025 mol/l gewählt. Nachdem ein Umsatzvon ca. 50 % erzielt worden war, wurde die Reaktion durch kontinuierliche Extraktionmit Dichlormethan für mindestens 24 Stunden abgebrochen. In Vorversuchen hattesich die kontinuierliche Extraktion als effektivste Methode zur Aufarbeitung undExtraktion herausgestellt, da sich das gebildete Phenol (−)-8 aufgrund seineramphoteren Eigenschaften63 sonst nur mit Verlusten in der Ausbeute erhalten läßt.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 51LINTZ et al. erhielten ebenfalls zum Teil sehr schlechte Ausbeuten bei der Extraktiondes O-Desmethyltramadols (rac-8) bei nicht kontinuierlicher Weise (Tabelle 2.8).63Tabelle 2.8: Extraktionsausbeuten für O-Desmethyltramadol (rac-8) beim Ausschütteln wäßriger Lösungen mit organischen Lösungsmitteln (Verhältnis 1 : 1) in Abhängigkeit vom pH-Wert63 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0Chloroform 5% 7% 88 % 70 %Essigsäureethylester 6% 28 % 72 % n. b.Nach kontinuierlicher Extraktion lassen sich das gebildete Phenol (−)-8 und der nichtumgesetzte Ester (+)-15 durch Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1) anKieselgel trennen. Das (1S,2S)-konfigurierte Phenol (−)-8 konnte so in 49 %Ausbeute mit einem ee-Wert von 76 % und der (1R,2R)-konfigurierte, nichtumgesetzte Ester (+)-15 in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 62 % erhaltenwerden (Tabelle 2.9, S. 52).Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzesvon 52 % die maximal erreichbare Ausbeute des Phenols 52 % und die des Esters48 % beträgt.Die Selektivität der Reaktion läßt sich entsprechend durch einen E-Wert von 13beschreiben. Der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt überden Umsatz der Reaktion ist in Abb. 2.20 dargestellt. Aus ihr geht hervor, daß abeinem Umsatz von ca. 70 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenreinvorliegt. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten kinetischenRacematspaltung zu demonstrieren, wurde daher in einem weiteren Versuch ineinem präparativen Maßstab (+)-15 enantiomerenrein dargestellt.

52 THEORETISCHER TEILAbb. 2.20: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P) bei einer Selektivität von E = 13.Dazu wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor gewählt, nur diesmal dieReaktion nicht bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen, sondern erst, wie aus Abb.2.20 bestimmt, bei einem Umsatz von ca. 80 % (Tabelle 2.9 ). Der nicht umgesetzteEster (+)-15 konnte nach Aufarbeitung so in einer Ausbeute von 10 %enantiomerenrein erhalten werden. Hiermit wurden sich die prinzipielle Möglichkeiteiner kinetischen Racematspaltung zu nutze gemacht, daß das nicht umgesetzteSubstrat selbst bei einer relativ schlechten Selektivität der Reaktion bei genügendhohem Umsatz, und somit auf kosten der Ausbeute, enantiomerenrein erhaltenwerden kann.Tabelle 2.9: PLE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-15 im 3.5 mmol Maßstab (6.5 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute Umsatz E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 2h 52 % 62 % 47 % 76 % 49 % 13 3h 85 % ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7Da zu Beginn der beiden Reaktionen jeweils eine starke Trübung zu beobachtenwar, die im Laufe der Reaktion verschwand, ist davon auszugehen, daß aufgrund der

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 53geringen Löslichkeit des Esters rac-15, bei einem pH-Wert von 8.0, dieSubstratkonzentration nicht mehr wesentlich erhöht werden kann. Häufig stellengeringe Löslichkeiten von Substraten in Prozessen, die im wäßrigen Mediumdurchgeführt werden, eine Limitierung der Substratkonzentration dar, obwohl es aucheinige hervorstechende Beispiele mit sehr hohen Substratkonzentrationen inbiokatalytischen Prozessen gibt.175Auffällig in Tabelle 2.9 ist auch, daß der ermittelte E-Wert für beide Reaktionen untergleichen Reaktionsbedingungen mit steigendem Umsatz fällt, da dieser nach den inKap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen für eine gegebene Reaktion konstant seinsollte. Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eineAbweichungen von den gemachten Voraussetzungen dar. Eine Möglichkeit zurErklärung dieses Verhaltens ist, daß die Vorraussetzung daß nur ein Enzym (aktivesZentrum) an der Reaktion beteiligt ist, nicht erfüllt ist. Der E-Wert stellt in diesem Fallein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar.PLE besteht aus mehreren Isoenzymen, die alle in der Hydrolyse von rac-15 beteiligtsein können und unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten zeigen. Ähnlichhaben PIETZSCH et al. auch schon zur Erklärung von schwankenden E-Werten in derPLE-katalysierten Hydrolysen von Allen-Derivaten argumentiert.174Zusammenfassend konnten die präparativen Möglichkeiten einer Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von phenolischen Tramadol-Analoga amBeispiel der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 gezeigt werden. Das EnzymPLE zeigt eine hinreichend gute Aktivität hinsichtlich dieses nicht natürlichenSubstrates und katalysiert dessen Hydrolyse innerhalb von Stunden. Die Selektivitätder Reaktion ist allerdings noch nicht zufriedenstellend. Bei einem E-Wert von 13läßt sich der nicht umgesetzte Ester (+)-15 in Ausbeuten von maximal 30 %enantiomerenrein erhalten und das enantiomere Phenol (−)-8 läßt sich gar nicht mitee-Wert von über 90 % erhalten. Eine entscheidende Verbesserung der Selektivitätder PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 konnte auch durch Variation desCosolvens nicht erreicht werden.Um eine weitere Verbesserung in der Selektivität der Enzym-katalysierten Hydrolysevon rac-15 zu erreichen, wurde auf den Versuch verzichtet, die PLE-katalysierte

54 THEORETISCHER TEILReaktion zu Optimieren, da hier die Aussicht durch eine weitere Variation desCosolvens oder der Reaktionstemperatur zu einer gesteigerten Selektivität zukommen, als gering betrachtet wurde. Vielmehr wurde die Möglichkeit untersucht,daß es eine oder sogar mehrere weitere Hydrolasen gibt, welche die Hydrolyse vonrac-15 mit einer höheren Selektivität katalysieren (Abb. 2.21). OH O Pr OH Enzym O Me2N O Pr Phosphatpuffer- (+)-15 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens rac-15 RT Me2N OH OH (−)-8Abb. 2.21: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15.Es wurde daher ein „Enzymscreening“ mit kommerziell verfügbaren Hydrolasendurchgeführt. Dazu wurden 5 Lipasen und drei weitere Esterasen in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 eingesetzt. Die Auswahl der Enzyme erfolgte aufBasis eines Lipasen-Screening Grundkits. Es wurde beachtet, daß die vorwiegend inder organischen Synthese verwendeten Enzyme (s. Kap. 2.3.2, S. 35) in dieserAuswahl vertreten sind. Als Standardbedingungen wurde ein wäßrigenEinphasensystem aus Phosphatpuffer, pH 7.0, mit 10 % tert-Butanol als Cosolvensverwendet (Tabelle 2.10). Somit lassen sich erzielte Ergebnisse auch mit denen derbereits durchgeführten PLE-Katalyse vergleichen.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 55Tabelle 2.10: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Enzym Umsatz E-Wert zeit (+)-15 (−)-8Acetylcholinesterase 7.5 h 3% n. b. n. b. -(AChE; 145 U/ml); pH 8.0Candida antarctica Lipase 3.8 h 8% 3% 3% 1.1(CAL; 0.8 U/ml)Mucor miehei Lipase 19.5 h 25 % 11 % 30 % 2(MML; 0.7 U/ml)Horse liver esterase 4.0 h 31 % 17 % 51 % 4(HLE; 0.3 U/ml)Cholesterolesterase 24.0 h 90 % 72 % 39 % 5(CE; 22 U/ml)Porcine pancreatic Lipase 2.5 h 66 % 19 % 78 % 10(PPL; 21 U/ml)Burkholderia cepacia 22.0 h 35 % 75 % 67 % 11Lipase (BCL; 15 U/ml)Candida rugosa Lipase 3.0 h 64 % 98 % 45 % 10(CRL; 3 U/ml)Wie aus Tabelle 2.10 hervorgeht, wird die Hydrolyse des Esters rac-15 von denmeisten eingesetzten Hydrolasen mit einer ausreichend hohen Reaktions-geschwindigkeit katalysiert.In diesem Enzym-Screening zeigten alle katalytisch aktiven Enzyme die gleicheEnantiopräferenz, es wurde, wie schon zuvor in der PLE-Katalyse beobachtet,bevorzugt das (−)-Enantiomer des Esters zum aromatischen Alkohol umgesetzt.Die Selektivitäten, die unter den Standardbedingungen des Enzym-Screeningserreicht werden konnten, waren allerdings gering und für eine angestrebteRacematspaltung im präparativen Maßstab zu niedrig. Nur drei Lipasen katalysierendie Reaktion mit einer ähnlichen Selektivität wie die zuvor getestete PLE.Von mehreren Autoren wird beschrieben, daß in Reaktionen mit Horse liver esterase(HLE) als Katalysator geringfügig höhere ee-Werte als in der entsprechendenKatalyse mit PLE erreicht werden können.176 In der Katalyse der Hydrolyse des

56 THEORETISCHER TEILEsters rac-15 konnte diese Beobachtung allerdings nicht bestätigt werden, da die inder HLE-katalysierten Reaktion erzielte Selektivität geringer ist, als die der PLEkatalysierten Reaktion.Eine höhere Selektivität, die eine in einem präparativ nutzbaren Rahmendurchführbare Racematspaltung zulassen würde, war insgesamt nicht zubeobachten. Ein weiteres Austesten von neuen Hydrolasen wurde nichtdurchgeführt, da die bisher getesteten Hydrolasen als repräsentativ betrachtetwurden. Natürlich ist nicht auszuschließen, daß unter den kommerziell oderandersseitig verfügbaren Enzymen welche sind, die eine höhere Selektivität zeigen,doch sollte ein Enzym nach den in Kap. 2.3.2 (S. 35) gemachten Voraussetzungenüber einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziellverfügbar sein. Diese Voraussetzung wurde für weitere Enzyme nicht ohne weiteresals erfüllt betrachtet.Statt dessen wurde daraufhin versucht die Reaktionsbedingungen für eine Lipasen-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 zu optimieren.Schon 1958 beschrieben SARDA und DESNUELLE das für Lipasen typische Phänomender „Grenzflächenaktivierung“.177 Lipasen haben im allgemeinen nur eine geringeAktivität gegenüber nichtassoziierten Substraten, die oberhalb der kritischenMicellenkonzentration des Substrats steil ansteigt. Lipasen benötigen zur Aktivierungalso häufig aggregierte Moleküle, wie sie in einer Emulsion oder einer mizellarenLösung vorliegen. 1990 konnte durch Röntgenstrukturanalyse der beiden erstenLipasenstrukturen der Mechanismus aufgeklärt werden178: Die „Grenzflächen-aktivierung“ der Lipasen beruht auf einem amphiphilen Peptidsegment, das wie einDeckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt.179 Dieser scheint in Gegenwarteiner Grenzfläche im Zuge einer Konformationsänderung aufzuklappen und so demSubstrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen.180 Außerdem entstehtbeim Öffnen des Deckels eine große hydrophobe Fläche, an die das Substrat bindenkann.181 Allerdings zeigen nicht alle Lipasen diese Grenzflächenaktivierung.Beispielsweise weist zwar die Candida antarctica Lipase (Typ B), derenTertiärstruktur bekannt ist, eine amphiphilen Deckelstruktur auf, aber keine Grenz-flächenaktivierung.182Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde daher statt eines wäßrigenEinphasensystems eine Emulsion aus Wasser und organischem Lösungsmittel, ein

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 57wäßrig-organisches Zweiphasensystem, als Reaktionsmedium für eine Lipasen-katalysierte Reaktion ausgewählt. Ein häufig in der Literatur verwendetes wäßrig-organisches Zweiphasensystem besteht aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether im Verhältnis 1 : 1. Die Verwendung des tert-Butyl-methylethers hat denVorteil, daß dieser Ether keine Peroxide bildet und somit verhältnismäßig gefahrloseingesetzt werden kann.In einer feinen Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether wurdedaraufhin eine Candida rugosa Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15durchgeführt (Tabelle 2.11). Die Reaktionsgeschwindigkeit und somit die Aktivität derCandida rugosa Lipase im wäßrig-organischen Zweiphasensystem ist ähnlich der imwäßrigen Einphasensystem. Eine Aktivierung in Form einer erhöhtenReaktionsgeschwindigkeit ist also nicht zu beobachten. Die Selektivität der Reaktionist aber wesentlich größer als im Einphasensystem. So konnte das gebildete Phenol(−)-8 mit einem ee-Wert 85 % in 30 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester(+)-15 mit ee-Wert 75 % in 64 %Ausbeute isoliert werden. Dies entspricht einerSelektivität von E = 27. Dieser Wert erreicht nahezu den angestrebten Bereich einesWertes von E ≥ 30, welcher für eine präparativ nutzbare Reaktion Voraussetzung ist.Diese erhöhte Selektivität kann auf eine geringe Konformationsänderung der Lipasein der Grenzfläche zurückgeführt werden. Diese Konformationsänderung bewirkt inerster Linie, das sich der Deckel über dem aktiven Zentrum öffnet180, sie bewirkt aberauch eine Veränderung der Polaritäten im aktiven Zentrum und somit der potentiellenBindungsstellen für das Substrat.181Der vorhergehende Versuch wurde mit einer Candida rugosa Lipase durchgeführt,die eine spezifische Aktivität von 2.4 U/mg hatte. Dieser Wert stellt für dieses Enzymeinen niedrigen dar und bedeutet, daß in dieser Enzym-Präparation neben der CRLauch andere Enzyme und nicht katalytisch-aktive Proteine vorliegen, die auf dieKatalyse Einfluß nehmen können. Um einen etwaigen Einfluß anderer Proteineauszuschließen oder wenigstens zu minimieren, wurde daraufhin eine weiteraufgereinigte Präparation der Candida rugosa Lipase mit einer spezifischen Aktivitätvon 37.0 U/mg in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.11). Diese aufgereinigteCandida rugosa Lipase ist ebenfalls kommerziell verfügbar.

58 THEORETISCHER TEILTabelle 2.11: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (2.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1)spezifische Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert Aktivität 2.4 U/mg 3.25 h 51 % 75 % 85% 27 37.0 U/mg 5.25 h 33 % 58 % 90 % 34Aus dieser Reaktion konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 90 % in27 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 58 % in 58 %Ausbeute isoliert werden. Die Selektivität dieser Reaktion kann mit einem E-Wert von34 beschrieben werden. Diese weitere Erhöhung der Selektivität kann durch denAusschluß von Nebenaktivitäten in der Enzympräparation erklärt werden. In Abb.2.22 ist der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt für diesenE-Wert gegen den Umsatz aufgetragen.Abb. 2.22: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P) bei einer Selektivität von E = 34.Die erzielte Selektivität von E = 34 ist die höchste, die in einer Enzym-katalysiertenkinetischen Racematspaltung von Tramadol-Anolga mit phenolischer Hydroxylgruppebisher erreicht worden ist. Sie liegt zudem in dem angestrebten Bereich von E ≥ 30.Dies bedeutet, wie auch in Abb. 2.22 zu erkennen ist, daß ab einem Umsatz von ca.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 5960 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt und in einermaximalen Ausbeute von ca. 40 % erhalten werden kann.Es konnte somit gezeigt werden, daß eine Enzym-katalysierte Hydrolyse einesEsters auf Tramadol-Basis unter Einbezug einer phenolischer Hydroxylgruppe mithoher Selektivität und Aktivität möglich ist. Dies, obwohl die vom Enzymanzugreifende phenolische Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereo-zentren der Verbindungen entfernt ist.Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 8 erfolgtedurch Vergleich der Drehwerte mit bereits publizierten.91,183 Von der GrünenthalGmbH ist für das Hydrochlorid des (+)-(R,R)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenols ein Drehwert von [α ] 20 = + 5.4º (c = 1.0, MeOH) veröffentlicht Dworden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durchRöntgenstrukuranalyse erfolgt.184Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogiezu der des Phenols 8.2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Esterndes O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe desSubstrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion vonInteresse.Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptiertenSubstratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllenderAcylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatischeAcylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185

60 THEORETISCHER TEILIm Gegensatz zu Lipasen akzeptiert die PLE als Esterase keine stark hydrophobenSubstrate wie z.B. Triglyceride, sondern idealerweise wasserlösliche Ester. Daherergibt sich hinsichtlich der Substratstruktur für die PLE die Einschränkung kurzkettigelineare aliphatische Acylgruppen einzusetzen. So werden Acetate von Alkoholen amhäufigsten von der PLE hydrolysiert. Längerkettige Acylgruppen werden nur inAusnahmefällen als Substrate akzeptiert.Dieser Unterschied in dem Substratspektrum zeigt auch das sicherste Merkmal, umeine Esterase als „Lipase“ zu klassifizieren: die Fähigkeit langkettige Glycerinester zuhydrolysieren.101,185,186Ebenfalls unter dem Aspekt der Wirtschaftlichkeit eines möglichen enzymatischenTeilschrittes in der industriellen Synthese eines Tramadol-Analogons sollte die zuverwendende Acylgruppe möglichst kurz sein. Denn das Substrat muß zuvor ineinem separaten Schritt verestert werden, wobei eine kürzere Acylgruppe einegeringere einzusetzende Menge bedeutet. In der anschließenden Racematspaltungwird der enzymatisch hydrolysierte Acylrest verworfen, dabei reduziert eine kürzereAcylgruppe die zuverwerfende Masse.Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurde daher der (±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) synthetisiert.Wie bereits in Kap. 2.2 auf S. 21 dargestellt wurde, ist rac-16 im Vergleich zu rac-15hydrolyselabil. Die Stabilität gegen Autohydrolyse bei pH 7.0 ist noch ausreichendgroß, hingegen bei pH 8.0 nicht mehr. Es können erhebliche Mengen anHydrolyseprodukt nach 16 h detektiert werden (Tabelle 2.12).Tabelle 2.12: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer- Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8Das Substrat rac-16 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Racematspaltungeingesetzt (Abb. 2.23). Aufgrund der mangelnden Hydrolysestabilität von rac-16

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 61wurde ein pH-Wert von 7.0 gewählt und zur Vergleichbarkeit mit den bisherigenErgebnissen als Reaktionsmedium das wäßrige Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens. Als Enzyme wurden zunächst PLE und CRL aufgrund derbisher mit diesen Enzymen erzielten Ergebnisse eingesetzt (Tabelle 2.13, Zeilen 1und 2). OH O OH Enzym O Me2N O Phosphatpuffer- (+)-16 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens rac-16 RT Me2N OH OH (−)-8Abb. 2.23: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16.Aus Tabelle 2.13 geht hervor, daß die CRL-katalysierte Reaktion wenig langsamerverläuft, als die des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 (Tabelle 2.10). DieSelektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse von rac-16, ausgedrückt in einemE-Wert von 2, ist erheblich geringer als die Selektivität, die mit dem Ester rac-15 alsSubstrat beobachtet wurde. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß langkettigereAcylreste, wie in dem Ester rac-15 vorhanden, bevorzugt von dieser Lipaseumgesetzt werden. Auf eine Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystemals Reaktionsmedium wurde daraufhin verzichtet.Die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 7.0 verläuft mit ähnlicherReaktionsgeschwindigkeit wie die Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 bei pH 8.0nur mit geringerer Selektivität. Die Aktivität des Enzyms PLE ist unterstandardisierten Aktivitätstestbedingungen allerdings auch bei pH 8.0 größer als beipH 7.0. Aus diesem Grund wurde auch eine PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16bei pH 8.0 durchgeführt, obwohl das Substrat bei diesem pH-Wert entsprechendhydrolyselabiler ist (Tabelle 2.13, Zeile 3).

62 THEORETISCHER TEILTabelle 2.13: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-16 (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions ee Ester ee Phenol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-16 (−)-8Candida rugosa Lipase 7.25 h 45 % 4% 26 % 2(CRL; 2.4 U/ml) pH 7.0Schweineleber-Esterase 1.75 h 36 % 35 % 52 % 4(PLE; 3.3 U/ml), pH 7.0Schweineleber-Esterase 0.75 h 31 % 50 % 74 % 10(PLE; 2.6 U/ml), pH 8.0Bei pH 8.0 verläuft die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 entsprechend derhöheren Aktivität des Enzyms auch schneller als bei pH 7.0. Nach einerReaktionszeit von 0.75 h werden ca. 30 % Umsatz erreicht, bei pH 7.0 wurde zumErreichen des entsprechenden Umsatzes ca. 1 h länger benötigt.Die kurze Reaktionszeit begünstigt einen höheren Enantiomerenüberschuß desgebildeten Phenols (−)-8, da die Autohydrolyse von rac-16 vergleichsweise langsamist und somit bei kurzen Reaktionszeiten wenig racemisches Phenol entsteht (<1 %in 1 h nach Tabelle 2.12). Somit ist auch trotz der geringen Hydrolysestabilität vonrac-16 eine relativ hohe Selektivität von E = 10 in dieser Reaktion möglich. Diebeobachtete Selektivität liegt im Rahmen der Selektivität, die auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 erzielt wurde(Tabelle 2.6). Verglichen mit der Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 verläuft dieHydrolyse des kurzkettigeren Acetats rac-16 aber mit einer höheren Aktivität. DiesErgebnis bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß Acetate aufgrund ihres kurzenAcylrests und der damit erhöhten Polarität eine größere Ähnlichkeit mit dennatürlichen Substraten besitzen und somit die geeigneteren Substrate für die PLE-katalysierte Hydrolyse sind.Es wurden allerdings keine weiteren Untersuchungen zur Enzym-katalysiertenHydrolyse des Essigsäureesters rac-16 durchgeführt. Trotz der Hydrolyselabilitätdieser Verbindung lassen sich zwar enzymatische Reaktionen mit einer Selektivitätim Rahmen von hydrolysestabilen Substraten im Labormaßstab durchführen, abereine Umsetzung in einen größeren Maßstab ist nicht sinnvoll. Hier würde der Enzym-

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 63katalysierten kinetischen Racematspaltung von stabilen Verbindungen wie rac-15,die einen Zugang zu dem gleichen Phenol (−)-8 gestatten, der Vorzug gegeben.Zusammenfassend stellt der Buttersäureester (C4) von O-Desmethyltramadol(rac-15) ein Substrat dar, welches gleichermaßen von Lipasen und Esterasenakzeptiert und umgesetzt wird. Ausgehend von diesem Substrat führen kurzkettigereEster wie Essigsäureester (C2) rac-16 zu Substraten, die von der Esterase PLE mitgrößerer Aktivität bei ähnlicher Selektivität wie der Buttersäureester umgesetztwerden, da es sich um einen bevorzugteren Acylrest im Substrat handelt. VonLipasen, wie der CRL, werden diese Substrate allerdings mit geringerer Aktivität undauch Selektivität umgesetzt, da es sich nicht um für Lipasen typische Acylrestehandelt. Des weiteren sind diese Ester schon so aktiviert, daß sie nur eine begrenzteStabilität gegen Autohydrolysereaktionen aufweisen, welches gerade im Hinblick aufeine Racematspaltung in einem präparativen Maßstab ein entscheidender Nachteilist.Eine weitere Verlängerung der Acylgruppe über die C4-Säure hinaus, würde zwar zuvon Lipasen bevorzugteren Substraten führen, aber auch den Nachteil einerungünstigeren Bilanz für die enzymatische kinetische Racematspaltung beinhalten.Aus anwendungsbezogener Sicht ist daher ein möglichst einfacher kurzer Acylrest zuverwenden.Oft haben auch aktivierte Ester wie Halogen- oder Methoxycarbonsäureester einengünstigen aktivierenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse. DieDarstellung eines Choressigsäureesters von O-Desmethyltramadol gelang abernicht, da diese Verbindung so reaktiv war, daß sie unter gaschromatographischenund flüssigchromatographischen Bedingungen nicht stabil war.2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3- (2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)Die Hydrolyse eines Esters von rac-8 zur Gewinnung der Enantiomeren setzt dieDarstellung dieser Verbindung voraus, was einen, wenn auch geringen, Aufwand

64 THEORETISCHER TEILdarstellt. Einfacher wäre eine direkte enzymatische Acylierung von rac-8. Diesvermag die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium zu leisten.Zudem kann auch in diesem Medium eine Racematspaltung von Verbindungengelingen, deren Ester hydrolyselabil sind. Auch haben im organischen Mediumhydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetztwerden können, die sonst nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Einweiterer interessanter Aspekt ist, daß in der enzymatischen Transacylierungbevorzugt das Enantiomer acyliert wird, welches in der Umkehrreaktion derenzymatischen Hydrolyse bevorzugt hydrolysiert wird. Somit sollte in derenzymatischen Transacylierung von rac-8 bevorzugt das (−)-Enantiomer acyliertwerden, da in der hydrolytischen Reaktion (−)-8 gebildet worden ist (Abb. 2.21).Neben dem (−)-Ester bleibt das nicht umgesetzte (+)-8 in der Reaktion als Produktzurück (Abb. 2.25). Enzym-katalysierte Transacylierung und Hydrolyse sind daherunter dem Blickpunkt der Synthese enantiokomplementär.Unter diesen Gesichtspunkten ist die Entwicklung einer Methodik zur enzymatischenTransacylierung von rac-8, obwohl Bedingungen zu einer selektiven Enzym-katalysierten Hydrolyse bekannt sind, durchaus von großem Interesse und auchanwendungsbezogen.Da die Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols durch verschiedeneHydrolasen katalysiert wird, sollte die Umkehrreaktion, die Transacylierung imorganischen Medium, ebenfalls von diesen Enzymen, bei Wahl der richtigenReaktionsbedingungen, katalysiert werden können. In eigenen Vorarbeiten gelang esallerdings nicht, rac-8 in einer PLE-katalysierten Reaktion mit Vinylbutyrat (4 Äquiv.)in Toluol als Lösungsmittel zu acylieren (Abb. 2.24).80 Es wurde zwar in dieserReaktion eine Katalysatorspezies aus MPEG/PLE gewählt, die eine höhere Aktivitätim organischen Lösungsmittel besitzt als native PLE81,82, doch ist das Enzym PLE imallgemeinen wesentlich weniger aktiv im organischen Medium als Lipasen.5,6 EineLipasen-katalysierte Transacylierung von rac-8 sollte daher trotz dieser Ergebnissesmöglich sein.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 65 Me2N OH O Pr OH MPEG/PLE OH O (−)-15 Vinylbutyrat + Me2N Toluol OH rac-8 RT OH Me2N (+)-8Abb. 2.24: Versuch zur PLE-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8.INAGAKI et al. führten die bereits auf S. 43 erwähnte enzymatische Acylierung des1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols (rac-36) mit 20 Äquiv. eines Vinylesters in Diisopropyl-ether mit 10 % Aceton als Lösungsmittel mit guter Selektivität (E > 60) durch.162 DerZusatz an Aceton wurde benötigt, um das Substrat zu lösen, welches in reinemDiisopropylether nur mäßig löslich war. Von einem Einfluß des Acetons auf dieAktivität des Enzyms oder die Selektivität der Reaktion wird nicht berichtet.Von diesen Reaktionsbedingungen ausgehend wurden für eine Enzym-katalysierteTransacylierung des Substrats rac-8 2 Äquiv. Vinylpropionat als Acylierungsmittelund das Lösungsmittel Diethylether als Reaktionsbedingungen ausgewählt (Abb.2.25). Me2N OH O Et OH Lipase OH O Vinylpropionat (−)-15 + Me2N Diethylether RT OH rac-8 OH Me2N (+)-8Abb. 2.25: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8.Es wurden sieben Lipasen in die enzymatische Transacylierung unter den genanntenBedingungen eingesetzt (Tabelle 2.14). Um den Verbrauch an Substrat undeingesetzten Reagenzien möglichst gering zu halten, wurden alle Reaktionen ineinem 0.25 mmol Maßstab in 5 ml Lösungsmittel durchgeführt.

66 THEORETISCHER TEILTabelle 2.14: Versuche zur Transacylierung des Phenols rac-8 in Diethylether Reaktionsbedingungen Reaktions-Enzym Umsatz (Äquiv.) zeitPorcine pancreatic Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(PPL; 335 U/ml)Burkholderia cepacia Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(BCL, 120 U/ml)Candida rugosa Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 2%(CRL; 29 U/ml)Rhizopus niveus Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(0.026 U/ml)Candida antarctica Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(CAL; 3.2 U/ml)Rhizopus arrhizus Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(0.02 U/ml)Aspergillus niger Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0%(1 U/ml)Keine der in Tabelle 2.14 eingesetzten Lipasen katalysiert die Transacylierung vonrac-8 unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Da die Enzyme CRL, BCL undPPL in der Hydrolyse von rac-15 eine hohe Aktivität und eine moderate Selektivitätzeigen, ist davon auszugehen, daß diese Enzyme auch in der Acylierung von rac-8aktiv sein sollten. Dies deutet daraufhin, daß für das Enzymscreening in Tabelle 2.14ungeeignet Reaktionsbedingungen gewählt wurden. Hiervon ausgehend wurdedaraufhin, um bessere Bedingungen zu finden, eine ausgewählte Lipase (PPL) mit5 Äquiv. Vinylacetat in verschiedenen Lösungsmitteln eingesetzt (Tabelle 2.15).

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 67Tabelle 2.15: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 unter verschiedenen Reaktionsbedingungen (335 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)Vinylacetat (5), 28 d 2%Dichlormethan (H2O ges.)Vinylacetat (5), 28 d 1%Trichlormethan (H2O ges.)Vinylacetat als Solvens 12 d 6%Aus Tabelle 2.15 geht hervor, daß in den polaren Lösungsmitteln Dichlormethan undTrichlormethan ebenfalls keine nennenswerte Acylierung zu beobachten ist. Inreinem Vinylacetat als Transacylierungsmittel und Lösungsmittel, was einemÜberschuß von 252 Äquiv. entspricht, ist eine geringe Enzym-katalysierte Bildungdes Acetats 16 nach 2 Wochen zu beobachten. Aufgrund des geringen Umsatzeswurde keine Enantiomerenüberschußbestimmung durchgeführt. Die in Vinylacetatals Solvens erzielte enzymatische Acylierung von O-Desmethyltramadol bestätigt diezuvor gemachte Aussage, daß eine Acylierung von rac-8 unter geeignetenBedingungen möglich ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber extrem langsam. Eswurden daher die beiden Lipasen BCL (Tabelle 2.16) und CRL (Tabelle 2.17 undTabelle 2.18), die in der Hydrolyse von rac-15 die größten Selektivitäten erreichten,ebenfalls unter diesen Reaktionsbedingungen in die Transacylierung von rac-8eingesetzt.

68 THEORETISCHER TEILTabelle 2.16: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 (120 U/ml) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 28 d Umsatz 3%Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 -Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 18 %Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 10 % 1.2 ee Phenol (+)-8 2%Wie in der PPL-katalysierten Transacylierung von rac-8 wird auch mit dem EnzymBCL eine Transacylierung mit Vinylacetat als Lösungsmittel beobachtet.Entsprechend dem zuvor erzielten Ergebnis verläuft auch die BCL-katalysierteTransacylierung mit einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Umsatz von 18 %ist erst nach 3 Wochen zu beobachten (Tabelle 2.16). Es wird der (1S,2S)-konfigurierte Ester (−)-16 mit einem ee-Wert von 10 % gebildet. Die Racemat-spaltung verläuft allerdings unselektiv (E = 1.2).Mit dem Enzym CRL wurden in der Hydrolyse von rac-15 die besten Ergebnisseerzielt. In der enzymatischen Transacylierung ist, wie bei allen zuvor getestetenEnzymen, kein nennenswerter Umsatz von rac-8 in den als Lösungsmitteleingesetzten Ethern MTBE und Diisopropylether zu beobachten (Tabelle 2.17). InVinylacetat als Lösungsmittel ist ein Umsatz von 36 % nach 3 Wochen zubeobachten. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz, sondernauch als Solvens, führt somit bei allen eingesetzten Lipasen zu einer Acylierung desPhenols rac-8, wenn auch mit relativ langsamer Reaktionsgeschwindigkeit. Die indieser Reaktion erzielte Selektivität ist zwar die bisher höchste, die zu beobachtenwar, sie ist aber ausgedrückt in einem E-Wert von 3 als schlecht zu bewerten.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 69Tabelle 2.17: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl- acetat als Acylierungsmittel (14 U/ml) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 28 d Umsatz 2%Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 -Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 8%Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 -MTBE ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 36 %Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 38 % 3.0 ee Phenol (+)-8 21 % Umsatz 66 %Vinylacetat (5), 33 % ee Ester (−)-16 2.5Dichlormethan ee Phenol (+)-8 26 %Interessanterweise kann mit dem Lösungsmittel Dichlormethan in der CRL-katalysierten Transacylierung von rac-8 mit Vinylacetat die größte Aktivität desEnzyms beobachtet werden. Unter diesen Bedingungen werden 66 % Umsatz nach3 Wochen erreicht. Eine Steigerung der Selektivität der CRL-katalysiertenTransacylierung verglichen mit dem Solvens Vinylacetat ist aber nicht zubeobachten.Von GAIS et al. ist in Untersuchungen zur MPEG/PLE-katalysierten Transacylierungracemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und –butyrat beobachtetworden, daß mit zunehmender Kettenlänge des Acyldonors die Geschwindigkeit unddie Selektivität der Transacylierung zunehmen.81,84 Aus diesem Grund wurdeVinylbutyrat als Acylierungsmittel in die CRL-katalysierte Transacylierung von rac-8unter den bisher geeigneten Bedingungen, Acylierungsmittel oder Dichlormethan alsLösungsmittel, eingesetzt (Tabelle 2.18). Mit Dichlormethan als Solvens und

70 THEORETISCHER TEILVinylbutyrat als Acylierungsmittel ist allerdings nicht wie zuvor im Falle desVinylacetats ein Umsatz zu beobachten. Die CRL-katalysierte Reaktion mitVinylbutyrat als Acylierungs- und Lösungsmittel hingegen verläuft mit einer ähnlichengeringen Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität wie die Reaktion in Vinylacetat.Eine Steigerung wie im Falle der sekundären Alkohole in der MPEG/PLE-Katalyse istnicht zu beobachten.Tabelle 2.18: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl- butyrat als Acylierungsmittel (37 U/ml) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 17 d Umsatz 4%Vinylbutyrat (5), n. b. ee Ester (−)-15 -Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 15 %Vinylbutyrat als Solvens ee Ester (−)-15 28 % 2 ee Phenol (+)-8 15 %Mit dem Acylierungsmittel als Solvens ist eine Reaktionsbedingung gefundenworden, in der eine Lipasen-katalysierte Transacylierung möglich ist, wenn auch mitgeringer Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Es lag nun nahe die PLEebenfalls unter diesen neuen Reaktionsbedingungen einzusetzen. Zusätzlich wurdenneben dem Acylierungsmittel noch Di- und Trichlormethan als Lösungsmitteleingesetzt (Tabelle 2.19). Da native PLE im organischen Medium nur eine geringeAktivität besitzt, wurde MPEG/PLE als Katalysatorpräparation eingesetzt (vgl.Kap. 2.1). Wie aus Tabelle 2.19 hervorgeht ist eine PLE-katalysierte Acylierung vonrac-8 in Di- oder Trichlormethan als Lösungsmittel nicht durchführbar. InVinylpropionat als Solvens ist eine PLE-katalysierte Transacylierung zu beobachten.Somit ist es prinzipiell gelungen die für Lipasen gefundenen Reaktionsbedingungenauf die PLE zu übertragen, allerdings ist die Reaktionsgeschwindigkeit wie in Fall derLipasen äußert gering.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 71Tabelle 2.19: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)Vinylpropionat (5), 21 d 0%DichlormethanVinylpropionat (5), 21 d 0%TrichlormethanVinylpropionat als Solvens 4d 5%Zusammenfassend ist es gelungen, Reaktionsbedingungen zu finden, unter deneneine Enzym-katalysierte Acylierung des Phenols rac-8 durchführbar ist. DieReaktionsgeschwindigkeit ist allerdings in allen Fällen sehr langsam. Die bishererzielten Reaktionszeiten von mehreren Wochen sind wenig ansprechend und füreine präparative Racematspaltung nicht akzeptabel. Zudem sind keine geeignetenReaktionsbedingungen für eine selektive enzymatische Racematspaltung desPhenols rac-8 gefunden worden. Die bisher erzielten Selektivitäten mit E-Werten von1 bis 3 sind ebenfalls nicht für eine Racematspaltung des Phenols rac-8 impräparativen Sinne verwendbar.Die höchste Selektivität in der enzymatischen Acylierung von rac-8 wird mit derCandida rugosa Lipase beobachtet, die somit nicht nur in der Hydrolyse desButtersäureesters von rac-8 das geeigneteste Enzym darstellt, sondern auch das fürdie Umkehrreaktion, die Transacylierung von rac-8.Daß die enzymatischen Hydrolysen mit hoher Selektivität katalysiert werden, dieTransacylierungen im organischen Medium jedoch nicht, kann gerade im Hinblick aufdie zusätzlich noch sehr langsame Reaktion dadurch erklärt werden, daß dieeingesetzten Enzyme im wäßrigen Medium flexibler sind. Eine Anpassung derStruktur des aktiven Zentrums an unterschiedliche Strukturmerkmale des Substratsbei der Bildung des Substrat-Enzym-Komplexes im Sinne eines „induced fit“ ist imwäßrigen Milieu erleichtert, da Wassermoleküle als „molekulares Schmiermittel“fungieren können.150,187,188 Auch kann die unterschiedliche Solvatation vonReaktanden, hier gerade des sehr polaren Phenols, und von Übergangszuständen

72 THEORETISCHER TEILim organischen und wäßrigen Medium ein Grund für die unterschiedlichenSelektivitäten sein.Die in der enzymatischen Transacylierung erzielten Ergebnisse sind auch unter demBlickpunkt zu sehen, daß die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reaktionenerst einen Anfang in der Untersuchung der enzymatischen Acylierung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe darstellen. UmfassendereUntersuchungen zu Reaktionsparametern wie Acylierungsreagenz (s. Kap. 2.3.2.2),Lösungsmitteleinfluß und Wasseraktivität können Reaktionsbedingungen aufzeigen,unter denen eine selektive Enzym-katalysierte Racematspaltung von phenolischenSubstraten wie rac-8 durchaus möglich ist.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 732.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)Ein neues Tramadol-Analoga, dessen Entwicklung in der GRÜNENTHAL GmbH mitvielversprechenden Resultaten betrieben wird, ist das (±)-(2RS,3RS)-4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-2-ol (rac-38, Abb. 2.26).189 Esunterscheidet sich vom Tramadol (rac-7) dadurch, daß es statt einem Cyclohexylringeine offenkettige Struktur besitzt. Über die analgetische Aktivität offenkettigerTramadolderivate ist jüngst von BUSCHMANN, SUNDERMANN und MAUL berichtetworden.46 Sie stellen Untersuchungen über die Aktivität der Enantiomeren des3-(3-Dimethylamino-1-ethyl-1-hydroxy-2-methyl-propyl)-phenols vor. Diese Wirkstoffeunterscheiden sich von rac-38 durch eine um ein C-Atom verlängerte Kette an dertertiären OH-Gruppe. Außerdem wird direkt das Phenol untersucht, welches im Falledes rac-38 wahrscheinlich ebenfalls in vivo als Metabolit gebildet wird. OH OMe Me2N rac-38Abb. 2.26: Racemisches 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan- 2-ol, ein Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH mit offenkettiger Struktur.Die Struktur des rac-38 bietet ebenso wie das Tramadol keinen direkten Angriffs-punkt für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung. Nach O-Demethylierung stehtaber auch hier die aromatische Hydroxylgruppe zur Verfügung. Es sollte daherversucht werden, eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung mit diesemoffenkettigem Phenol (rac-11) durchzuführen.Zuerst wurde die enzymatische Hydrolyse des Buttersäureesters von rac-11untersucht, da im Falle des O-Desmethyltramadols in der Hydrolyse die bestenErgebnisse in der Racematspaltung erzielt worden waren. Es wurde der racemischeButtersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.27). Als Reaktions-

74 THEORETISCHER TEILbedingungen wurden die bisherigen Standardreaktionsbedingungen, wäßrigesEinphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens bei Raumtemperatur, gewählt.Als Enzyme wurden zunächst die bisher in der Hydrolyse von Estern desO-Desmethyltramadols erfolgreich angewendeten Hydrolasen Schweineleber-Esterase und Candida rugosa Lipase eingesetzt (Tabelle 2.20). Me2N OH O Pr OH Enzym O Pr O Phosphatpuffer- 17 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens OH rac-17 RT OH Me2N 11Abb. 2.27: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17.Die Ergebnisse der enzymatischen Hydrolysen von rac-17 sind in Tabelle 2.20zusammengefaßt. Rac-17 wird von beiden eingesetzten Enzymen als Substratakzeptiert und beide Hydrolasen zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse desEsters. Es ist allerdings nahezu keine Enantiomer-Differenzierung der beidenEnzyme zu beobachten. Beide Reaktionen verlaufen unselektiv.Tabelle 2.20: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-17 (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Enzym Umsatz E-Wert zeit 17 11Schweineleber-Esterase 25 Min. 69 % 7% 1% 1.1(PLE; 1.3 U/ml), pH 8.0Candida rugosa Lipase 2.5 h 17 % 1% 3% 1.1(CRL; 2.4 U/ml), pH 7.0Der Grund für die mangelnde Selektivität der enzymatischen Reaktionen kann nur inder Molekülstruktur des Substrates liegen. In Molekül rac-17 fehlt die geschlossenenRingstruktur des Tramadol-Moleküls, daher ist das Molekül und besonders dieDimethylaminomethyl-Seitenkette viel flexibler. Von der angreifenden Seringruppe im

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 75Enzym gesehen, liegen die Stereozentren am „anderen Ende“ der angegriffenenAcylgruppe. Ihr Einfluß auf die Enantiomer-Differenzierbarkeit des Enzyms istaufgrund der erhöhten Flexibilität viel geringer als beispielsweise bei rac-15.Den Versuch rac-17 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischemZweiphasensystem einzusetzen, wurde nach den bisherigen Erfahrungen wenigErfolg in Aussicht gestellt und daher nicht durchgeführt.2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)- 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)Es wurde ebenfalls in einem „Enzymscreening“ untersucht, ob eine Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11 möglich ist und ob diese unterUmständen selektiver verläuft als die entsprechende enzymatische Hydrolyse.Für diese Versuchsreihe wurde allerdings Diethylether als Lösungsmittel, nachReaktionsbedingungen von INAGAKI et al 162, gewählt, da zu dem Zeitpunkt dieserUntersuchungen noch nicht bekannt war, daß das Transacylierungsreagenz eingeeignetes Reaktionsmedium für die enzymatische Acylierung von Phenolendarstellt. Um eine eventuelle enzymatische Reaktion günstig zu beeinflussen, wurdeVinyllaurat als Acylierungsmittel gewählt (Abb. 2.28), da dies aufgrund seinererhöhten Kettenlänge in eine Lipasen-katalysierte Reaktion bevorzugter alsVinylpropionat (vgl. Tabelle 2.14) umgesetzt werden könnte. Me2N OH OH OH Enzym OH 11 Vinyllaurat Me2N Diethylether + RT OH rac-11 O C11H23 Me2N O 44Abb. 2.28: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11.

76 THEORETISCHER TEILAllerdings, wie aus den Versuchen zur Transacylierung des O-Desmethyltramadolsin Diethylether zu erwarten war, ist auch bei allen in die Transacylierung von rac-11eingesetzten Lipasen keine Reaktion zu beobachten (Tabelle 2.21).Tabelle 2.21: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-11 in Diethylether Reaktionsbedingungen Reaktions-Enzym Umsatz (Äquiv.) zeitBurkholderia cepacia Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0%(BCL, 800 U/ml)Candida rugosa Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0%(CRL; 29 U/ml)Candida antarctica Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0%(CAL; 16 U/ml)Rhizopus arrhizus Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0%(0.02 U/ml)Aspergillus niger Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0%(0.001 U/ml)Eine Enzym-katalysierte Acylierung von rac-11 wäre sicherlich unter den für dasO-Desmethyltramadol (rac-8) gefundenen Bedingungen möglich, doch wird auch hiernach den bisherigen Ergebnissen sowohl in der Acylierung von rac-8 als auch in derHydrolyse von rac-17 keine Enantiomer-Differenzierung der Enzyme zu beobachtensein.Das offenkettige, phenolische Tramadol-Analogon rac-11 ist somit kein geeignetesSubstrat für eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung vonEnantiomeren. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität desMoleküls vergleichen mit dem Tramadol-Molekül der Fall. Zur Darstellung derEnantiomeren kann ausgehend von Verbindung 38 aber auf ein Verfahren zurthermodynamischen oder klassischen Racematspaltung mit Weinsäurederivatenzurückgegriffen werden.Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 11 erfolgtedurch Vergleich der Drehwerte mit bereits in der Literatur publizierten Drehwerten derHydrochloride der Enantiomeren von 11.189

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 772.4.2 Substrate auf Basis sekundärer HydroxylfunktionenWährend es sich bei dem Substrat O-Desmethyltramadol (rac-8) noch um einenMetaboliten des Tramadols und daher um eine Substanz mit seit längerembekannten pharmakologischen Profil handelt, stellt die Gruppe der Tramadol-Analoga mit zusätzlicher sekundärer Hydroxylfunktion, eine Gruppe vonVerbindungen mit bisher noch nicht erschlossenen Potential in der Schmerztherapiedar. Entdeckt wurde diese interessante Gruppe von Verbindungen von derGRÜNENTHAL GmbH bei systematischen Strukturvariationen des Tramadol-Grund-gerüsts auf der Suche nach neuen analgetisch aktiven Verbindungen.In die, im Rahmen dieser Arbeit, untersuchten enzymatischen Racematspaltungenwurden die in Abb. 2.29 dargestellten hydroxylsubstituierten Tramadol-Analogaeingesetzt. Sie leiten sich vom Tramadol dadurch ab, daß in 4- bzw. 5-Position desTramadols eine Hydroxylgruppe in den Cyclohexylring eingefügt worden ist. DerSyntheseweg dieser Verbindungen wurde bereits in Kap. 2.2.1 auf S. 24 dargestellt.Das zur Verbindung rac-14 epimere (±)-(1RS,2RS,4RS)-1,4-Diol ist nicht mehr imRahmen dieser Arbeit bearbeitet worden, obwohl die pharmakologischenEigenschaften dieser Verbindung ebenfalls untersucht werden. OH OH OH 3 1 OMe 3 1 OMe 1,3-Diole: HO 6 6 Me2N Me2N (±)-(1RS,3SR,6RS)-12 (±)-(1RS,3RS,6RS)-13 OH 1 OMe 1,4-Diol: HO 2 4 Me2N (±)-(1RS,2RS,4SR)-14Abb. 2.29: Hydroxysubstiutierte Tramadol-Analoga, die in der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung als Substrate untersucht werden.Sekundäre Alkohole sind die idealen, fast klassischen Substrate für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung. Aufgrund der Vielzahl der einsetzbarenEnzyme und deren geringer Substratspezifität bei trotzdem hoher Selektivität hatdiese Methode eine große Anwendungsbreite erlangt. Gerade bei unterschiedlicher

78 THEORETISCHER TEILGröße der Substituenten am Chiralitätszentrum werden häufig sehr hoheSelektivitäten in der Enantiomer-Differenzierung des Enzyms beobachtet und sehrgute Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt. Daher gibt es in der Literatur aucheine monatlich wachsende Zahl von Beispielen. Ebenso gibt es bis heute eineVielzahl von Beispielen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung vonsubstituierten Cyclohexanolderivaten als einen Sonderfall der sekundärenAlkohole.190,191,192Exemplarisch seien hier die Enzym-katalysierte Racematspaltung von trans-2-substituierten Cyclohexanolen191 (39, Abb. 2.30) und trans-2-substituierten2-Cylohexenolen192 (40, Abb. 2.30) im organischen Medium erwähnt, welche sehrgut untersuchte Reaktionen darstellen. Sie verlaufen im allgemeinen mit sehr guterSelektivität und können so zur Synthese einer Vielzahl synthetisch wertvollerIntermediate herangezogen werden. OH OH OH OH R R OMe N OMe 39 40 rac-41 rac-42R = Me, Ph, SPh R = H, Br, SPh I, Br, Cl, CN NHPh, NO2, N3 OTs, OMe, OAc CH2SPh, CH2COPh, CO2EtAbb. 2.30: Beispiele von bereits in Lipasen-katalysierte Racematspaltungen im organischen Medium eingesetzten Substraten auf Cyclohexanolbasis. Dargestellt ist das bevorzugt umgesetzte Enantiomer.Es wurden ebenfalls sterisch anspruchsvollere Verbindung wie beispielsweise rac-41und rac-42 (Abb. 2.30) in die Lipasen-katalysierte Transacylierung eingesetzt. In derCRL-katalysierten Acylierung von rac-41 mit Vinylacetat als Acyldonor undDiisopropylether als Solvens konnte nach 22 h bei 50 % Umsatz (+)-41 mit einemee-Wert von 83 % und das entstandene Acetat mit einem ee-Wert von 94 % (E = 72)erhalten werden.193 Die Acylierung von rac-42 wird ebenfalls von der Candida rugosaLipase katalysiert und verläuft mit noch höherer Selektivität. Der zurückbleibende

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 79Alkohol kann mit 93 % ee und das erhaltene Acetat mit 94 % ee erhalten werden(E = 110).194In Analogie zu den Tramadol-Analoga ist in der Verbindung 42 ein tertiäresStickstoffatom vorhanden. Das cyclohexanolische Substrate, die wie das TramadolDimethylaminomethyl-substituiert sind, ebenfalls von Hydrolasen als Substrateakzeptiert werden, konnten KANERVA et al. zeigen. NMe2 Lipase PS NMe2 NMe2 + Vinylacetat OH Diethylether OCOR OH (−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S) 38 %, 99 % ee 49 %, 96 % ee CAL-B NMe2 (Novozym 435) NMe2 NMe2 + Vinylacetat OH OCOR OH Diethylether (+)-(1R,2S) (−)-(1S,2R) 42 %, 98 % ee 34 %, 96 % eeAbb. 2.31: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von 2-Dimethylaminomethyl- cyclohexanolen im organischen Medium.KANERVA et al. gelang die Lipasen-katalysierte Acylierung von verschiedenen2-Dialkylaminomethyl-cyclohexanolen mit hoher Selektivität. Sowohl für die cis- alsauch für die trans-konfigurierte Dimethylaminomethyl-substituierte Verbindungwurden E-Werte größer 200 erreicht (Abb. 2.31).195 Im Falle der cis-konfiguriertenVerbindung verläuft die Novozym 435-katalysierte Acylierung äußerst langsam, dieLipase PS-katalysierte Reaktion verläuft hingegen mit hoher Aktivität und Selektivität.Von GOTOR et al. ist das am Stickstoffatom unsubstituierte racemische trans-2-Aminocyclohexanol in die CAL-katalysierte Acylierung eingesetzt worden.196Allerdings wurde bevorzugt eine Acylierung am Stickstoffatom beobachtet, die mitmittelmäßiger bis guter Selektivität verlief. Eine Enzym-katalysierte Acylierung amSauerstoffatom konnte mit hoher Selektivität erreicht werden, indem dieN-Benzyloxycarbonyl geschützte Verbindung in die Pseudomonas cepacia Lipase(BCL) katalysierte Transacylierung eingesetzt wurde (Abb. 2.32).

80 THEORETISCHER TEIL H N O Ph NHCbz NHCbz BCL O + Vinylacetat OH 1,4-Dioxan OCOMe OH (−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S) 31 %, 99 % ee 63 %, 49 % ee H N O Ph NHCbz NHCbz CAL + O Vinylacetat OH MTBE OCOMe OH (−)-(1R,2S) (+)-(1S,2R) 43 %, 96 % ee 43 %, 96 % eeAbb. 2.32: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von N-Benzyloxycarbonyl geschützten 2-Aminocyclohexanolen im organischen Medium.In diesem Fall ließ sich das entsprechende cis-konfigurierte Isomer in der CAL-katalysierten Transacylierung mit hoher Aktivität und Selektivität umsetzten (Abb.2.32).197 Racemische 2-Methylamino-cyclohexanole lassen sind ebenfalls unterdiesen Bedingungen mit sehr guten Ergebnissen in die enzymatischeRacematspaltung einsetzten, wenn die freie Valenz am Stickstoff mit einerButoxycarbonyl-Gruppe (Boc) geschützt wird.198Von SEKAR et al. wurden Untersuchungen zur Umkehrreaktion im wäßrigen Mediumdurchgeführt. Es wurden Acetate von N-Aryl-substituierten 2-Aminocyclohexanolen indie PLE-katalysierten Hydrolyse eingesetzt, die ebenfalls hochselektiv verlaufen.199NAEMURA et al. berichten von Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungenvon cis- und trans-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol.200 Verbindungen, die dem Tramadolebenfalls strukturell ähnlich sind. Interessanterweise zeigen die EnzymeCandida rugosa Lipase und Schweineleber-Esterase eine entgegengesetzteEnantiopräferenz hinsichtlich der cis-konfigurierten Verbindung: In der Hydrolyse desAcetats wird so von der PLE bevorzugt das (+)-Enantiomer bevorzugt zum 1R,2R-konfigurierten (+)-Diol umgesetzt, von der CRL hingegen das (−)-Enantiomer (Abb.2.33). Obwohl in der PLE-katalysierten Hydrolyse das (+)-Diol nur mit einem ee-Wert

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 81von 84 % erhalten worden ist, konnte die enantiomerenreine Verbindung durchanschließende Umkristallisation erhalten werden. Ph Ph Ph PLE OH OH OH (±) - Phosphatpuffer- + OAc Lösung (pH 8.0) OH OAc H 1 % EtOH H H (+)-(1R,2R) (−)-(1S,2S) 46 %, 84 % ee 46 %, 85 % ee Ph Ph Ph CRL OH OH OH (±) - Phosphatpuffer- + OAc Lösung (pH 7.5) OH OAc H Cosolvens H H (−)-(1S,2S) (+)-(1R,2R) 46 %, 27 % ee 46 %, 26 % eeAbb. 2.33: Enzymatische Racematspaltungen von 1-Phenylcyclohexan-1,2-diolen.Hinsichtlich der trans-konfigurierten Verbindung zeigen beide Enzyme die gleicheEnantiopräferenz, beide Enzyme hydrolysieren das (−)-1S,2R-Enantiomer schneller.

82 THEORETISCHER TEIL2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4- dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)Ausgehend von den Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse des (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) wurde für dasSubstrat rac-18 wiederum das Butyrat als Acylrest gewählt, welches nach den zuvorgemachten Aussagen für Lipasen und Esterasen gleichermaßen ein geeignetesSubstrat darstellen sollte. Ebenfalls werden, auch zu einer besseren Vergleichbarkeitmit den bisherigen Ergebnissen, die Standardreaktionsbedingungen beibehalten.Auf den bisherigen Erfahrungen in der Enzym-katalysierten Racematspaltungaufbauend wurde darauf verzichtet, eine große Anzahl von Enzymen zuuntersuchen. Vielmehr wurden die Enzyme eingesetzt, die bereits gute katalytischeEigenschaften hinsichtlich der Tramadol-Analoga als Substrate gezeigt hatten.Eins dieser Enzyme ist die Schweineleber-Esterase, die sich als Enzym zurkinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga bewährt hat, daher wurderac-18 in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.34). Me2N OH OMe O O OH O PLE OMe Pr (−)-18 Pr O Phosphatpuffer- + Me2 N Lösung 10 % Cosolvens OH rac-18 RT OMe HO Me2N (+)-12Abb. 2.34: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.Die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 verlief mit hoher Aktivität desEnzyms hinsichtlich der Hydrolyse des Substrates. So wurde nach 5.75 Stunden einUmsatz von ca. 40 % erreicht und anschließend die Reaktion durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach anschließenderSäulenchromatographie mit Essigsäureethylester und Methanol im Verhältnis 1 : 1an Kieselgel konnte der 1R,3S,6R-konfigurierte Alkohol (+)-12 in 30 % Ausbeute mit

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 8394 % ee isoliert werden. Der 1S,3R,6S-konfigurierte Ester (−)-18 konnte in 47 %Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 % erhalten werden (Tabelle 2.22).Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzesvon ca. 40 % die maximal zu erreichende Ausbeute des Alkohols bei 40 % und diedes Esters bei 60 % liegt.Tabelle 2.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (1.6 U/ml; Phosphat- puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12 5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89Die beobachtete Selektivität der Reaktion läßt sich durch einen E-Wert von 89ausdrücken. Die in der Hydrolyse des Esters rac-18 erzielte Selektivität ist direktsehr hoch. Wie aus Abb. 2.35 hervorgeht liegt der nicht umgesetzte Ester (−)-18 abeinem Umsatz von ca. 53 % enantiomerenrein vor und kann daher in hohenAusbeuten erhalten werden. Auch der gebildete Alkohol (+)-12 kann bis zu einemUmsatz von ca. 40 % in der enzymatischen Hydrolyse mit guten ee-Werten isoliertwerden.Es ist daher möglich beide Enantiomere in guter Ausbeute und mit guten bis sehrguten Enantiomerenüberschüssen zu erhalten. Je nachdem, welches Enantiomergewünscht ist, kann die Reaktion bei einem Umsatz von ca. 40 % gestopt und der(+)-Alkohol isoliert werden. Oder die Reaktion wird erst bei einem Umsatz von ca.55 % aufgearbeitet und der (−)-Ester mit hohen Enantiomerenüberschüssenerhalten, der dann noch anschließend zum (−)-Alkohol hydrolysiert werden muß.

84 THEORETISCHER TEILAbb. 2.35: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (−)-18 (S) und Produkt (+)-12 (P) bei einer Selektivität von E = 89.Wie zu erwarten war, ist die zu erzielende Selektivität in der Hydrolyse eines Estersvon einem sekundären Alkohol, wie rac-18, höher als die Selektivität in derHydrolyse eines phenolischen Esters, wie z.B. bei rac-15.Interessanterweise wird bei der PLE-katalysierten Hydrolyse des Phenylestersrac-15 das (−)-1S,2S-konfigurierte Enantiomer schneller hydrolysiert und im Fall derPLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 das (+)-1R,3S,6R-konfigurierteEnantiomer. Diese Substratspezifität läßt sich durch ein Selektivitätsmodelveranschaulichen.Da aufgrund der mikroheterogenen Zusammensetzung der PLE keineRöntgenstrukturanalyse dieses Enzyms existiert, wurden die Strukturen von überhundert Substraten verglichen, um daraus Rückschlüsse auf die dreidimensionaleStruktur des aktiven Zentrums zu ziehen. Daraus wurden trotz der kompliziertenZusammensetzung der PLE Selektivitätsmodelle zur Erklärung von Substratspezifitätund Selektivität entworfen. So wurden bereits in den 80er Jahren Modelle zurVorhersage der Selektivität der PLE entworfen.201,202 1990 entwickelten JONES et al.daraus ein Würfelmodell, das schematisch den Aufbau des aktiven Zentrums derPLE wiedergeben soll (Abb. 2.36).204 Durch weitere Untersuchungen wurde es in denfolgenden Jahren modifiziert.203,204,205 Mit Hilfe dieses deduktiven Modells gelang es,Voraussagen über potentielle neue Substrate zu treffen. Es werden jedoch nur

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 85Hydrolysen von Carbonsäuremethylestern bzw. Dicarbonsäuredimethylesternberücksichtigt.204 PB Ser HL: große, hydrophobe Tasche HS HS: kleine, hydrophobe Tasche HL PF: vordere, polare Tasche PB: hintere, polare Tasche PF Ser: Serin-RestAbb. 2.36: Modell für das aktive Zentrum der PLE nach JONES et al.Um die Substratspezifität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse der Substrate rac-15und rac-18 erklären zu können, sind im Abb. 2.37 in der oberen Reihe die bevorzugtumgesetzten Enantiomeren zur Vereinfachung als Alkohole nochmals dargestellt. Me2N OH OH OH OMe HO (−)-8 (+)-12 Me2N OH OH MeO NMe2 OH NMe2 OHAbb. 2.37: Von der PLE bevorzugt umgesetzte Enantiomere.In der unteren Reihe in Abb. 2.37 sind beide Moleküle so gedreht, daß die vom Serindes Enzyms angegriffene Hydroxylgruppe in die Richtung des Serinrestes imKastenmodell nach JONES et al. zeigt. Die für die Selektivität der PLE notwendigeDimethylaminomethyl-Gruppe80 beider Moleküle kann so in Wechselwirkung mit dervorderen polaren Tasche treten. Der wenig flexible Cylohexylring mit dem Aromatenbefindet sich in der großen, hydrophoben Tasche. Die räumliche Anordnung dieserGruppen ist in beiden Molekülen gleich, was die Selektivität der PLE hinsichtlichbeider Moleküle zu erklären vermag.

86 THEORETISCHER TEILDie Candida rugosa Lipase zeigte in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 vonallen eingesetzten Enzymen die höchste Selektivität und auch größte Aktivitäthinsichtlich des Substrats. Zudem sind große, cyclische sekundäre AlkoholeStandardsubstrate für dieses Enzym (s. Kap. 2.3.2). Daher wurde rac-18 in die CRL-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.38). Als erstes Reaktionsmedium wurdezum Vergleich mit der PLE-katalysierten Reaktion das wäßrige Einphasensystemausgewählt. O OH OMe Pr O O OH Me2N CRL OMe (+)-18 Pr O Phosphatpuffer- Lösung + Me2N RT Me2N OH rac-18 OMe HO (−)-12Abb. 2.38: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.Die CRL zeigt, verglichen mit der PLE, eine etwas größere Aktivität hinsichtlich desSubstrats rac-18. So wurde nach 4.75 Stunden ein Umsatz von ca. 49 % erreicht.Nach Aufarbeitung und anschließender Säulenchromatographie mit Diisopropyletherund Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierteAlkohol (−)-12 in 41 % Ausbeute mit 95 % ee isoliert werden. Der 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 41 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 %erhalten werden (Tabelle 2.23).Bei der Chromatographie der Reaktionsprodukte sind die isolierten Ausbeuten indem Laufmittel Diisopropylether und Methanol ein wenig besser als in dem LaufmittelEssigsäureethylester und Methanol.Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem läßtsich zusammenfassend durch einen E-Wert von 133 ausdrücken. Sie verläuft damitselektiver als die entsprechende PLE-katalysierte Reaktion.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 87Tabelle 2.23: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert- Butanol)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133Aus den Drehwerten der Produkte geht hervor, daß die CRL interessanterweise einezur PLE entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt. Während in der PLE-katalysiertenHydrolyse bevorzugt das (+)-Enantiomer hydrolysiert wird, setzt das Enzym CRLbevorzugt das (−)-Enantiomer um.Das die Enzyme PLE und CRL hinsichtlich eines Substrats wie rac-15 die gleicheEnantiopräferenz zeigen und bei einem strukturell verwandten Substrat wie rac-18eine entgegengesetzte, ist in ähnlicher Form ebenfalls von NAEMURA et al.beobachtet worden. Wie aus Abb. 2.33 auf Seite 81 hervorgeht zeigen PLE und CRLhinsichtlich des cis-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol ebenfalls eine entgegengesetzteEnantiopräferenz, wohingegen bei der entsprechenden trans-konfiguriertenVerbindung beide Enzyme das gleiche Enantiomer bevorzugt umsetzten (Abb.2.39).200 OH OH OH OH cis-konfiguriertes Racemat trans-konfiguriertes Racemat entgegengesetzte Enantiopräferenz gleiche EnantiopräferenzAbb. 2.39: Relative Enantiopräferenzen der Enzyme PLE und CRL hinsichtlich der beiden isomeren 1-Phenylcyclohexan-1,2-diole.Um den Einfluß einer möglichen Grenzflächenaktivierung, wie es schon beimSubstrat rac-15 zu beobachten war, zu untersuchen, wurde das wäßrig-organischeZweiphasensystem als Reaktionsmedium für die CRL-katalysierte Hydrolyse vonrac-18 verwendet.

88 THEORETISCHER TEILUm eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde die Reaktion in einer feinenEmulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether (MTBE) durchgeführt. Nachca. 6 Stunden wurde ein Umsatz von ca. 45 % beobachtet. Eine Verlängerung derReaktionszeit auf 72 Stunden führte zu keiner weiteren Hydrolyse. Die Reaktions-lösung wurde dann aufgearbeitet und nach Chromatographie mit Diisopropyletherund Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierteAlkohol (−)-12 in 39 % Ausbeute enantiomerenrein (≥98 % ee) erhalten werden. Vondem 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 40 % Ausbeute auch ebenfalls dieenantiomerenreine Verbindung (≥98 % ee) erhalten werden (Tabelle 2.24). DieEnantiomer-Differenzierung der Candida rugosa Lipase unter diesen Reaktions-bedingungen ist also so hoch, daß das nicht favorisierte Enantiomer praktisch nichtumgesetzt wird, selbst bei einer Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden. Eskann also eine nahezu perfekte kinetische Racematspaltung beobachtet werden,was sich durch einen E-Wert von größer 200 ausdrückt. Ein Wechsel bei derKatalyse mit CRL vom Ein- zum Zweiphasensystem führte wie schon beimPhenylester rac-15 zu einer Steigerung der Selektivität in der enzymatischenHydrolyse.Tabelle 2.24: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (4.4 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; MTBE; 1 : 1)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 72 h ≥98 % 40 % ≥98 % 39 % >200Zusammenfassend sind somit Reaktionsbedingungen gefunden worden, die optimaleVoraussetzungen für eine Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im präparativenMaßstab bieten. Die Selektivität der Reaktion ist so hoch, daß neben einerReaktionsführung in einem satzweisen Verfahren (batch) auch eine kontinuierlicheReaktionsführung (CSTR) möglich ist.Eine kontinuierliche Reaktionsführung zeichnet sich allgemein gegenüber dem Satz-oder Chargen-Betrieb durch höhere Raum-Zeit-Ausbeuten und besser kontrollierbareReaktionsbedingungen aus. Ebenso reduzieren sich die produktspezifischen

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 89Enzymkosten.206 Nachteil eines kontinuierlichen Verfahrens ist, daß der ee-Wert desisolierten nicht umgesetzten Substrates bei gleichem Umsatz nicht so hoch ist, wie ineinem satzweisen Verfahren. Dies ist der Fall, da ein Teil des kontinuierlichzugeführten racemischen Substrates wieder direkt den Reaktor verläßt und so denee-Wert der erhaltenen Produkte herabsenkt.207 Von RAKELS et al. ist der Verlauf desee-Wertes des nicht umgesetzten Substrates in einem satzweisen und einemkontinuierlichen Reaktor über den Verlauf des Umsatzes für verschiedene E-Wertetheoretisch berechnet und aufgetragen worden (Abb. 2.40). Hierbei fällt auch auf,daß in einem kontinuierlichen Verfahren selbst bei einer hohen Selektivität vonE = 100 gegen Ende der Reaktion der zurückbleibende Ester nicht enantiomerenreinanfällt. (A) satzweiser Reaktor (B) kontinuierlicher ReaktorAbb. 2.40: Verlauf des Enantiomerenüberschusses des zurückbleibenden Substrats als Funktion des Umsatzes in einer kinetischen Racematspaltung für verschiedene E-Werte (E = 5, 10, 25, 100).Diese reaktionstechnischen Voraussetzungen erfordern eine hohe Selektivität in derEnzym-katalysierten Reaktion, damit eine kontinuierlichen Reaktionsführung alsVerfahren einsetzbar ist. Die CRL-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem wird diesen erhöhten Ansprüchen gegenüber einemsatzweisen Verfahren gerecht.

90 THEORETISCHER TEILFür ein mögliches Verfahren zur Darstellung von Tramadol-Analoga in einempräparativen Maßstab stellt die Art der Aufarbeitung der Reaktionsmischung vonAlkohol und Ester in den bisher vorgestellten Reaktionen einen entscheidendenNachteil dar. Kontinuierliche Extraktion und Chromatographie stellen für eineSynthese im Labormaßstab die üblichen Methoden zur Trennung dar, doch in einemgrößeren Maßstab sind sie nicht kosteneffizient durchführbar und somit nur schwerumzusetzen. Daher wird eine effiziente Methode zur Aufarbeitung benötigt, die auchin einen größeren Maßstab übertragbar ist.Bei Untersuchungen zu dem racemischen Substrat Buttersäure-3-dimethyl-aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22), die inKap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 vorgestellt werden, ist in Kooperation mit derGRÜNENTHAL GmbH eine solche Methode gefunden worden. Bei dieser Methodegelingt die Trennung, indem direkt am Ende der Reaktion selektiv der Ester aufgrundseiner Polarität bei pH 7.0 aus der wäßrigen Reaktionslösung mit Diethylether oderauch MTBE extrahiert wird. Der Alkohol läßt sich noch nicht bei diesem pH-Wertextrahieren. Erst nachdem mit Na2CO3 ein pH-Wert von ca. 10 eingestellt worden ist,ist auch die Löslichkeit des Alkohols soweit herabgesetzt, daß er mit Dichlormethanaus der Reaktionslösung extrahiert werden kann. Der Unterschied in der Polaritätvon Ester und Alkohol läßt sich durch genügend große Unterschiede im log P-Wert208von Alkohol und Ester zeigen. Messungen zum log P-Wert sind für das Substrat(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-ester (rac-22) und den korrespondierenden Alkohol durchgeführt worden und werdenin Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 näher diskutiert. Insgesamt stellt dieseAufarbeitung eine einfache und effiziente Methode dar mittels der auf einchromatographisches Trennverfahren verzichtet werden kann.Um die Effizienz der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung mitAufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu demonstrieren,wurde der Ester rac-18 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischenZweiphasensystem eingesetzt. Anschließend wurde die Aufarbeitung durchExtraktion bei verschiedenen pH-Werten auf das Zweiphasensystem übertragen.Nachdem ein Umsatz von ca. 50 % in der enzymatischen Hydrolyse des Estersrac-18 erreicht war, wurde die Reaktionslösung mit MTBE und Diethyletherextrahiert. Der nicht umgesetzte Ester (+)-18 konnte so in 51 % Ausbeute mit einem

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 91ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Anschließend wurde die verbliebeneReaktionslösung von Lösungsmittelresten befreit und auf pH 10 eingestellt. DerAlkohohl (−)-12 konnte daraufhin mit Dichlormethan in 46 % Ausbeute mit 97 % eeextrahiert werden (Tabelle 2.25). Somit konnten mittels dieser Methode sowohl Esterals auch Alkohol in sehr guten Ausbeuten und Reinheiten extrahiert werden. Dieebenfalls hohen Enantiomerenüberschüsse in Alkohol und Ester zeigen, daß einepartielle Racemisierung während der Aufarbeitung nicht beobachtet werden kann.Tabelle 2.25: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen Zweiphasensystem im 1.5 mmol Maßstab mit extraktiver Aufarbeitung (6.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.2; MTBE; 1 : 1)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200Insgesamt konnte somit eine effiziente Enzym-katalysierte kinetische Racemat-spaltung von rac-18 durchgeführt werden. Die CRL-katalysierte Hydrolyse diesesEsters verläuft mit einer nahezu perfekten Selektivität und ermöglicht so deneinfachen Zugang zu beiden Enantiomeren des Alkohols 12. Für eine Darstellungdes Alkohols (+)-12 ist die Hydrolyse des nicht umgesetzten Esters notwendig. Diesbedeutet einen zusätzlichen Reaktionsschritt, der dadurch umgangen werden kann,daß zur Darstellung von (+)-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18durchgeführt wird. Da die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte Enantio-präferenz hinsichtlich dieses Substrates zeigen, wird von der PLE bevorzugt das(+)-Enantiomer zum Alkohol (+)-12 hydrolysiert. Somit ermöglicht eine geeigneteWahl des Enzym die Darstellung beider enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.Neben einem chromatographischen Trennverfahren steht auch die Methode derExtraktion bei verschiedenen pH-Werten zur einfachen Aufarbeitung derReaktionsmischung aus Alkohol und Ester zur Verfügung. Diese Methode hat denVorteil einfach, effizient und leicht in einen größeren Maßstab, wie einen späterenProduktionsprozeß, übertragbar zu sein.

92 THEORETISCHER TEILIn der Enzym-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 zeigte die Candidaantarctica Lipase Typ B bemerkenswerte katalytische Eigenschaften. DieseErgebnisse werden in Kap. 2.4.2.9 beginnend aus Seite 144 diskutiert. Aufgrund derin der Novozym 435-katalysierten Transacylierung von rac-14 beobachteten Aktivitätund Selektivität dieses Enzyms, wurde diese Katalysatorpräparation auch in dieenzymatische Hydrolyse von rac-18 eingesetzt. Allerdings konnte nach einerReaktionszeit von 45 Stunden kein Umsatz in dem Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse von rac-18 beobachtet werden (Tabelle 2.26). Die gesamteReaktionszeit über war das immobilisierte Enzym im wäßrigen Medium unlöslich.Eine mögliche Erklärung für die hohe Aktivität dieser Enzympräparation imorganischen Medium und die im Gegensatz dazu niedrige Aktivität im wäßrigenMedium, liegt darin, daß diese auf einem makroporösen Acrylharz immobilisiertePräparation speziell für die Synthese von Estern konzipiert ist.126 Zusätzlich könnenStofftransportprobleme am heterogenen Katalysator nicht ausgeschlossen werden.Tabelle 2.26: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)Reaktionszeit Umsatz ee Ester 18 ee Alkohol 12 E 45 h 0% - - -Daraufhin wurde eine lyophilisierte Form der CAL-B, mit dem HandelsnamenChirazyme L2, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-18 eingesetzt. Aberauch diese Enzympräparation zeigte eine relativ niedrige Aktivität in derenzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18. So konnte in der Chirazyme L2-katalysierten Reaktion lediglich ein Umsatz von 7 % zum Alkohol (−)-12 nach 46 %Stunden beobachtet werden (Tabelle 2.27). Aufgrund der niedrigen Aktivität dieserLipasen im wäßrigen Medium wurden keine weiteren Versuche zu einer CAL-B-katalysierten Hydrolyse von rac-18 unternommen.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 93Tabelle 2.27: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E 46 h 7% 8% n. b. -Die Enantiomeren des Alkohols 12 sind bisher nicht in der Literatur beschrieben, sodaß zur Bestimmung der Absolutkonfiguration kein Drehwert zum Vergleich zurVerfügung steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Absolutkonfiguration derEnantiomere des Alkohols 12 daher auf der Basis zugeordnet, daß alle bisherhergestellten (αR,βR)-Tramadol-Analoga mit tertiärer Hydroxylgruppe eine positivenDrehsinn des Drehwerts zeigen.184Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 18, 46 und 47 erfolgte inAnalogie zu der des Alkohols 12.2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)Nachdem in der enzymatischen Hydrolyse von rac-18 sehr gute Ergebnisse erzieltworden sind, wurde die Umkehrreaktion, die Enzym-katalysierte Transacylierung vonrac-12 im organischen Medium, ebenfalls untersucht.Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium neben demhydrolytischen Verfahren würde weiterhin den Vorteil bieten, hydrolyselabile oderhydrophobe und daher im wäßrigen Milieu unlösliche Verbindungen einsetzten zukönnen. Dieser Gesichtspunkt ist vor allem für zukünftige Tramadol-Analoga vonBedeutung. Daher ist neben der enzymatischen Hydrolyse ebenfalls ein Verfahrenzur Enzym-katalysierten Acylierung von rac-12 untersucht worden (Abb. 2.41).Begonnen wurden diese Untersuchungen mit der Burkholderia cepacia Lipase (BCL),welche auch nach den in Kap. 2.3.2 gemachten Vorbemerkungen eine geeigneteLipase zur Umsetzung sekundärer Alkohole sein sollte. So ist beispielsweise von

94 THEORETISCHER TEILKANERVA et al. das cis-2-Dimethylaminomethyl-cyclohexanol mit sehr gutenResultaten in die Lipase PS-katalysierte Transacylierung eingesetzt worden.195 Me2N OH OMe O O OH Lipase R (−)-Ester OMe HO Vinylester + Me2N organisches Lösungsmittel OH rac-12 RT OMe HO Me2N (+)-12Abb. 2.41: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.Als erste Reaktionsbedingungen zur BCL-katalysierten Acylierung von rac-12 wurdeIsopropenylacetat als Acylierungsmittel und Toluol und Acylierungsreagenz alsLösungsmittel ausgewählt (Tabelle 2.28). In beiden Versuchen konnte allerdingsnach nahezu 3 Wochen keine Ester detektiert werden. Da diese Lipase eigentlich inder Acylierung von rac-12 aktiv sein sollte, deuten diese Ergebnisse vielmehr aufungeeignete Reaktionsbedingungen hin.Tabelle 2.28: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat (40 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)Isopropenylacetat (6) 20 d 3%ToluolIsopropenylacetat als Solvens 20 d 3%Daher wurde Vinylpropionat als Acyldonor gewählt, das eine etwas längere Alkylketteträgt und somit für eine Lipase ein geeigneteres Acylierungsmittel darstellen sollte.Des weiteren wurde die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung verdreifacht.Die Lösungsmittel Toluol und Acylierungsreagenz wurden beibehalten. Unter diesen

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 95leicht veränderten Bedingungen konnte anschließend in beiden Lösungsmitteln eineBCL-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12 beobachtet werden (Tabelle2.29). Allerdings ist die beobachtete Aktivität der BCL hinsichtlich des Substratsrac-12 gering. So konnte nach 8 Tagen lediglich ein Umsatz von 11 % bzw. 5 %erzielt werden. Die Reaktion im Lösungsmittel Vinylpropionat wurde daraufhinabgebrochen, da keine wesentliche Steigerung des Umsatzes zu erwarten war. Miteiner Selektivität von E = 22 ist zudem für einen sekundären Alkohol eine relativniedrige Selektivität beobachtet worden. Nach den in der CRL-katalysiertenHydrolyse erzielten Ergebnissen, wurde eine wesentliche höhere Selektivität in derAcylierung von rac-12 erwartet. Im Lösungsmittel Toluol war eine etwas größereReaktionsgeschwindigkeit zu beobachten und daher wurde sie erst nach insgesamt13 Tagen bei einem Umsatz von 12 % abgebrochen. Die in dieser Reaktion erzielteSelektivität von E = 38 ist größer als in Vinylpropionat als Solvens und imangestrebten Bereich von E ≥ 30. Insgesamt ist die Aktivität des Enzym BCL unterden verwendeten Reaktionsbedingungen aber sehr niedrig.Tabelle 2.29: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (120 U/ml) Reaktions- Mittel bedingungen 8d E-Wert 13 d E-Wert E-Wert (Äquiv.) Umsatz 11 % 12 %Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38Toluol ee Alkohol (+)-12 8% 12 % Umsatz 5% n. b.Vinylpropionat ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22als Solvens ee Alkohol (+)-12 4% n. b.Nach den guten Ergebnissen in der Hydrolyse des korrespondierenden Esters wurdedaraufhin die Candida rugosa Lipasen-katalysierte Acylierung von rac-12 untersucht.In drei verschiedenen parallelen Ansätzen wurde der Alkohol rac-12 in die CRL-katalysierte Acylierung mit Vinylpropionat in den Lösungsmitteln Diisopropylether,

96 THEORETISCHER TEILToluol und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.30). Diisopropylether und Toluolsind Standardlösungsmittel für die Enzym-katalysierte Transacylierung. DieVerwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz sondern auch als Solvenserbrachte in der enzymatischen Acylierung der Tramadol-Analoga mit aromatischerHydroxylgruppe sehr gute Ergebnisse. Daher wurden diese drei Lösungsmittel zumVergleich ausgewählt.Tabelle 2.30: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (37 U/ml) Reaktionsbedingung 3d 6d 8d 11 d 16 d (Äquiv.) (%) (%) (%) (%) (%) Umsatz 0 2 2 3 -Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 - Umsatz 37 57 58 58 -Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 - Umsatz 23 41 48 53 58Vinylpropionat 88 84 86 82 79 ee Ester (−)-46als Solvens ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90In dem Solvens Diisopropylether ist die geringste Aktivität des Enzyms CRLhinsichtlich des Substrats rac-12 zu erkennen. Entsprechend der Aktivität desEnzyms im Lösungsmittel Diethylether ist auch die Selektivität mit E = 19 sehr gering(Tabelle 2.31). Ether, wie auch der Diethylether im Falle der phenolischen Substraterac-8 und rac-11, sind damit nach den bisherigen Ergebnissen keine geeignetenLösungsmittel für eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von Tramadol-Analoga.Dies Ergebnis steht in Einklang mit den von JUNGEN gemachten Untersuchungen zurMPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer Alkohole in verschiedenenLösungsmitteln. Im Lösungsmittel MTBE wurden durchweg niedrige Aktivitäten undSelektivitäten erhalten.85

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 97Im Falle der Lösungsmittel Toluol und Vinylpropionat ist die Aktivität der CRL vielgrößer. So werden nach 6 Tagen Umsätze von 57 % bzw. 41 % erreicht. Das dieReaktion im Lösungsmittel Toluol nach diesen 6 Tagen kaum noch voranschreitet,kann durch die hohe Selektivität der Reaktion erklärt werden, da ab einem Umsatzvon 50 % die größte Menge des schneller reagierenden Enantiomers verbraucht istund sich die Reaktionsgeschwindigkeit dann nur noch nach dem langsamerreagierenden Enantiomer richtet. Die hohe Selektivität der Reaktion wird durch einenmittleren E-Wert von 109 belegt (Tabelle 2.31). Die Schwankungen des E-Werts, dereigentlich über den gesamten Reaktionsverlauf konstant bleiben sollte, läßt sichdurch die Meßgenauigkeit der Bestimmung der ee-Werte erklären. Bei hohenE-Werten führen schon sehr kleine Änderungen des ee-Werts zu Schwankungen imE-Wert. Dies läßt sich auch am Verlauf der E-Werte in dem LösungsmittelVinylpropionat erkennen. Da hier der E-Wert der Reaktion geringer ist, fallen dieSchwankungen innerhalb der Reaktionsdauer auch viel geringer aus. Insgesamt istdie Selektivität der CRL-katalysierten Acylierung im Solvens Vinylpropionat mit einemE-Wert von 23, trotz der akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit zu niedrig, um siepräparativ interessant erscheinen zu lassen (Tabelle 2.31).Tabelle 2.31: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel (Äquiv.)Vinylpropionat (5), - - - 19 - 19DiisopropyletherVinylpropionat (5), 56 89 >200 89 - 109ToluolVinylpropionat 19 19 26 27 25 23als SolvensEin Nebenprodukt der enzymatischen Transacylierung ist der bereits erwähnteAcetaldehyd, der aus dem primär entstehenden Vinylalkohol gebildet wird (vgl.Kap 2.3.2.2 beginnend ab Seite 39). Gerade von der Lipase aus Candida rugosa istbekannt, daß sie durch Acetaldehyd deaktiviert werden kann.139,140,141 Von mehreren

98 THEORETISCHER TEILAutoren wird in diesem Fall eine Steigerung der Aktivität und Selektivität der CRLberichtet, wenn statt Vinylacetat Isopropenylacetat verwendet wird.139,141b),142,209Dieser Argumentation folgend wurde Isopropenylacetat als Acylierungsreagenz in dieCRL-katalysierte Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurdenToluol, das zu der höchsten Selektivität mit Vinylpropionat geführt hat, undIsopropenylacetat verwendet (Tabelle 2.32).Tabelle 2.32: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat (37 U/ml) Reaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d (Äquiv.) Umsatz 19 % 34 % 47 % 58 %Isopropenylacetat (6), ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 % Umsatz 3% 5% 13 % 16 %Isopropenylacetat n. b. 10 % 24 % 24 % ee Ester (−)-47als Solvens ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%Im Lösungsmittel Toluol zeigt die CRL eine wesentlich höhere Aktivität als imAcylierungsmittel als Solvens. Qualitativ deckt sich diese Beobachtung mit denErgebnissen, die mit dem Acylierungsreagenz Vinylpropionat erzielt wurden.Allerdings ist die Reaktion in Isopropenylacetat sehr langsam, da nach fast3 Wochen lediglich ein Umsatz von 16 % erreicht wurde. Die Reaktion verläuft miteinem E-Wert von 2 außerdem nahezu unselektiv (Tabelle 2.33).Die Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung mit Isopropenylacetat verläuftin den ersten 5Tagen bis zu einem Umsatz von ca. 45% mit nahezu perfekterSelektivität (E >200) und fällt danach ab. Die Reaktion im Lösungsmittel Toluolverläuft mit Isopropenylacetat als Acylierungsmittel langsamer als mit Vinylpropionat.Die in beiden Reaktionen im Mittel erzielten Selektivitäten sind im gleichen Rahmensehr gut. Dies deutet daraufhin, daß unter diesen Reaktionsbedingungen (Toluol,Reaktionszeiten von 3 bis 5 Tagen) mit Vinylpropionat und Isopropenylacetat keineDeaktivierung der CRL durch Acetaldehyd vorliegt.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 99Tabelle 2.33: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel (Äquiv.)Isopropenylacetat (6), n. b. >200 67 94 120ToluolIsopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2als SolvensAufgrund der erzielten Ergebnisse in der CRL-katalysierten Transacylierung wurdeebenfalls versucht eine PLE-katalysierte Transacylierung von rac-12 zu erreichen(Abb. 2.42). Beim Alkohol rac-12 handelt es sich um einen sekundären Alkohol, derim Vergleich zum Phenol rac-8 ein geeigneteres Substrat für Schweineleber-Esterase darstellen sollte. O OH OMe R O Me2N OH PLE OMe (+)-Ester HO Vinylester + Me2N organisches Lösungsmittel Me2N OH rac-12 OMe RT HO (−)-12Abb. 2.42: PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.Native PLE zeigt im Gegensatz zu Lipasen allerdings praktisch keine Aktivität in derTransacylierung von Alkoholen mit Vinylestern im organischen Medium. Es wurdedaher MPEG/PLE (vgl. Kap. 2.1) als Katalysatorpräparation in die Transacylierungvon rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Toluol verwendet, da in diesemLösungsmittel die CRL eine hohe Aktivität zeigte, als Acylierungsmittel wurdensowohl Vinylacetat als auch Isopropenylacetat eingesetzt (Tabelle 2.34).

100 THEORETISCHER TEILTabelle 2.34: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 (6.4 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)Vinylpropionat (5), 20 d 3%ToluolIsopropenylacetat (5), 20 d 0%ToluolUnter diesen Reaktionsbedingungen fand, wie schon zuvor beim Phenol rac-8, keinePLE-katalysierte Reaktion in einem nennenswerten Umfang statt.Um weitere Reaktionsmedien im Hinblick auf mögliche günstige Eigenschaften füreine PLE/MPEG-katalysierte Reaktion von rac-12 zu testen, wurden drei weitereLösungsmittel untersucht. Mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel wurdeDichlormethan, MTBE und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Solventien in diePLE/MPEG-katalysierte Acylierung von rac-12 eingesetzt (Tabelle 2.35). Außerdemwurde in diesen Reaktionen die sechsfache Menge an Katalysator im Vergleich zuden vorherigen Reaktionen eingesetzt.Tabelle 2.35: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (41.3 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)Vinylpropionat (5), 21 d 2%DichlormethanVinylpropionat (5), 4d 1%MTBEVinylpropionat (200) 21 d 3%

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 101Trotz dieser wesentlich gesteigerten Katalysatormenge konnte wiederum nur eineminimale Menge an Acylierungsprodukt detektiert werden. Interessanterweise wurdeim Acylierungsmittel als Solvens die größte Menge an gebildeten Ester 46beobachtet.Um eine Deaktivierung des Enzyms durch Nebenprodukte ausschließen zu können,wurde eine neue Katalysatorspezies aus PLE und Rinderserumalbumin (BSA) für dieAcylierung von Tramadol-Analoga eingesetzt.Von GAIS et al. konnte nämlich gezeigt werden, daß die Aktivität der PLE vonverschiedenen Carbonyl-Nebenprodukten (Acetaldehyd, Aceton, Carbonsäuren ausder Hydrolyse des Acyldonors) beträchtlich beeinflußt wird.84,85 Um einer Reaktiondieser Carbonyl-Verbindungen mit Lysin-Resten des Enzyms entgegenzuwirken,wurden Rinderserumalbumin und verschiedene aminhaltige Harze in derColyophilisierung mit PLE benutzt.83 Diese Verbindungen sollten statt des Enzymsmit den Carbonyl-Nebenprodukten reagieren und so die Aktivität der PLE erhöhen.Außerdem sollte die Nebenreaktion der PLE-katalysierte Hydrolyse des Acyldonorsdurch geringe, zugesetzte Mengen an Wasser eingeschränkt werdenFür eine Acylierung von rac-12 wurde ein Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG(PLE/BSA/MPEG) gewählt und eingesetzt, welches bei Standardsubstraten einehohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 Als Acylierungsmittel wurdeVinylpropionat für die Reaktionen gewählt und diesmal das Lösungsmittel variiert. Eswurden Dichlormethan und Toluol verwendet. Zum Lösungsmittel Toluol wurdehierbei ein Wasserzusatz von 0.25 % gegeben (Tabelle 2.36).Der Wasserzusatz wurde gemacht, da Wasser auch für die Enzymkatalyse inorganischen Lösungsmitteln von entscheidender Bedeutung ist. Es dient als"Schmiermittel"150 zur Einstellung verschiedener Proteinkonformationen.85 In völligwasserfreien Systemen können Enzyme ihre Aktivität daher nicht entfalten. Vielfachreicht allerdings schon eine sehr geringe Wassermenge (<1 %) zur Enzymkatalyse inorganischen Medien aus. Beeinflußt wird das System auch durch das Additiv MPEG,daß die effektive Wasserkonzentration in der Enzymumgebung verringert210,211 undso als "Puffer" für den Wassergehalt des Enzyms dient.212 Von JUNGEN ist in derKatalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste Reaktions-

102 THEORETISCHER TEILgeschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daherwurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatzvon 0.25 % gewählt.Tabelle 2.36: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.)PLE/BSA/MPEG (24.4 U/ml), 11 d 0%Vinylpropionat (5), DichlormethanPLE/BSA/MPEG (20.0 U/ml), H2O (0.25 %), 11 d 0%Vinylpropionat (5), ToluolIm Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators vonweiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der ZusatzBSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur ausder enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartigeNebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213beobachtet worden. O +E R1 OH + H2O A O +E O + [R1-CO-E]R1 O B + R2-OH O + H2O O R2 + E + R2-OH R1 O R1 OH CAbb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 103In Abb. 2.43 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige Reaktionsschemawiedergegeben. Nach der irreversiblen Bildung des Acyl/Enzym-Komplexes, kanndieser die Nebenreaktion mit Wasser eingehen (A) oder den gewünschtenReaktionsweg, die Reaktion mit dem racemischen Alkohol, beschreiten (B). Je nachWassermenge kann die unerwünschte Nebenreaktion sogar dominieren. Desweiteren kann der gebildete Ester enzymatisch hydrolysiert werden (C) was dieenzymatische Transacylierung quasi-reversibel macht.In beiden Reaktionsansätzen konnte aber kein Umsatz in der Acylierung von rac-12detektiert werden. Insgesamt deuten somit die erzielten Ergebnisse in denVersuchen zur PLE-katalysierten Transacylierung darauf hin, daß Tramadol-Analoga,sowohl mit aromatischer als auch mit sekundärer Hydroxylfunktion, keine geeignetenSubstrate für eine PLE-katalysierte Reaktion im organischen Medium darstellen.

104 THEORETISCHER TEIL2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexylester (rac-19)Der racemische Alkohol rac-13 ist eine pharmakologisch wirksame Verbindung, dieeine dem Tramadol ähnliche analgetische Aktivität besitzt. Das Hydrochlorid des(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13⋅HCl)befindet sich in einem fortgeschrittenem Stadium der klinischen Entwicklung von derGRÜNENTHAL GmbH. Die Verbindung zeigt ein solch gutes pharmakologisches Profil,das eine direkte Vermarktung des Racemats ohne eine weitere Derivatisierungerhofft werden kann (Abb. 2.44).184 OH OH OMe ⋅HCl Me2NAbb. 2.44: Hydrochlorid von rac-13, dessen Vermarktung von der GRÜNENTHAL GmbH angestrebt wird.Die Substanz zeigte eine mittlere analgetische Aktivität in der Wirkstärke desO-Desmethyltramadols (rac-8) bei außerordentlich hoher Bioverfügbarkeit. Dies stellteinen Fortschritt gegenüber der bisherigen Therapie dar. Dazu ist die Halbwertszeitim Körper dieser Substanz sowie die des O-Desmethyl-Metaboliten gegenübervergleichbaren Substanzen, wie dem Tramadol, verlängert.184Der Wirkstoff rac-13⋅HCl zeigt, ähnlich wie das Tramadol, eine dreifaches Wirkprofil.So existiert neben der µ-opioiden Wirkung auch Inhibierung der Wiederaufnahme derNeurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT), was zu einer Inhibierungder spinalen Schmerzleitung führt.184Interessanterweise zeigen die Enantiomeren eine synergistische Wirkung, ähnlichwie auch beim Tramadol, dies kann die weitere Entwicklung und später geplanteVermarktung des Racemats ermöglichen. Trotzdem werden natürlich die einzelnenEnantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 105Obwohl es sich bei dieser Verbindung um ein 1,3-diaxial substituiertes Molekülhandelt, sollte versucht werden, die sehr guten Resultate in der Enzymkatalyse des(1SR,3RS,4RS)-konfigurierten Epimers auf diese neue Verbindung zu übertragen(Abb. 2.45). O Pr O OH O OMe Pr O OH Me2N Hydrolase OMe 19 Phosphatpuffer- + Me2N Lösung Me2N RT OH rac-19 HO OMe 13Abb. 2.45: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-19.Um ein Enzym zu identifizieren, daß die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19mit hoher Aktivität und Selektivität zu finden, wurden acht Hydrolasen unter denbisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem (pH 7.0, pH 8.0 imFalle der PLE) mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolysedes Esters rac-19 eingesetzt. Es konnte nach ein bis drei Tagen Reaktionszeit inkeinem Fall eine Hydrolyse des Substrates in einem nennenswerten Umfangfestgestellt werden (Tabelle 2.37). In allen Fällen konnte das eingesetzte Eduktnahezu vollständig zurückerhalten werden (91 – 100 % Ausbeute).

106 THEORETISCHER TEILTabelle 2.37: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Enzym Reaktionszeit Umsatz Cholesterolesterase 24 h 1% (CE; 11.0 U/ml) Candida rugosa Lipase 29 h 0% (CRL; 4.6 U/ml) Chirazyme L-2 45 h 0% (CAL-B; 38.8 U/ml) Burkholderia cepacia Lipase 45 h 0% (BCL; 0.05 U/ml) Burkholderia cepacia Lipase 46 h 0% (BCL, 30 U/ml) Porcine pancreatic Lipase 23 h 1% (PPL; 16.8 U/ml) Chromobacterium viscosum Lipase 69 h 0% (CVL, 0.18 U/mg) Schweineleber-Esterase 41 h 0% (PLE, 6.5 U/ml), pH 8.0Da sich in der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga neben demwäßrigen Einphasensystem das wäßrig-organische Zweiphasensystem als eingeeignetes Reaktionsmedium herausgestellt hat, wurde rac-19 ebenfalls unter denReaktionsbedingungen eines Zweiphasensystems eingesetzt (Tabelle 2.38). Eskonnte allerdings auch in diesem Fall keine nennenswerte enzymatische Aktivitätbeobachtet werden.Tabelle 2.38: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (9.2 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1) Reaktionszeit Umsatz ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 69 h 1% n. b. n. b. -

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 107Insgesamt stellen die hier eingesetzten Enzyme eine repräsentative Auswahl derstandardmäßig in der organischen Synthese eingesetzten Hydrolasen dar. Die inKap. 2.3.2 hervorgehobenen Enzyme sind ebenfalls in dieser Auswahl vertreten.Daher ist es nicht wahrscheinlich, daß bei dem Versuch weitere Enzyme in dieHydrolyse von rac-19 einzusetzen ein Enzym gefunden wird, daß diese Reaktionkatalysiert und zudem noch die in Kap. 2.3.2 gemachten Voraussetzungen erfüllt.Da unter den zur Hydrolyse von rac-19 verwendeten Enzymen und Reaktions-bedingungen die zuvor eingesetzten Tramadol-Analoga als Substrate akzeptiertwurden, ist die Konsequenz, daß rac-19 kein geeignetes Substrat für eineenzymatische Hydrolyse darstellt. Ein naheliegender Grund warum dieser 1,3-diaxialsubstituierte Ester nicht von den getesteten Enzymen als Substrat akzeptiert wird,kann der sterischen Anspruch der tertiären Hydroxylgruppe, die sich in direkter Nähezu der vom Enzym anzugreifenden Estergruppe befindet, sein.Um dennoch eine Enzym-katalysierte Racematspaltung erzielen zu können, wurdedaher zunächst versucht eine enzymatische Transacylierung deskorrespondierenden Alkohols rac-13 zu erreichen.

108 THEORETISCHER TEIL2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13)Nachdem sich der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 als kein geeignetes Substratfür eine enzymatische Hydrolyse herausgestellt hatte, wurde die enzymatischeTransacylierung des Alkohols rac-13 auch in der Hoffnung untersucht, daßzumindest der Alkohol aufgrund seines geringeren Raumbedarfs als Substratakzeptiert werden würde und einer enzymatischen Reaktion zugänglich ist (Abb.2.46). OH OH OMe OH OH Me2N Lipase OMe 13 Vinylester + Me2N organisches O NMe2 Lösungsmittel rac-13 RT R O OH OMe 19Abb. 2.46: Enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13.Obwohl es sich bei dem Grundkörper des Alkohols rac-13, ein substituiertesCyclohexan-1,3-diol, um eine für chirale Auxiliare interessante Zwischenstufehandelt, sind bis heute nur wenige Publikationen zu einer enzymatischenRacematspaltung erschienen.Daß eine Acylierung von Cylohexan-1,3-diol selbst möglich ist, wurde bereits 1992von BHATTACHARYA et al.214 sowie später 1996 MATTSON et al.215 gezeigt. Von beidenist jeweils die cis /trans-Mischung der Epimeren in die Hydrolasen katalysierteAcylierung im organischen Medium eingesetzt worden. Von BHATTACHARYA et al.wurde eine Mischung verschiedener Proteasen aus Streptomyces griseus (Pronase)mit äquimolaren Mengen p-Nitrophenylacetat in Pyridin zur Acylierung verwendet. Eswurde eine 1 : 1 Mischung der cis- und trans-kofigurierten Monoacetate in 42 %Ausbeute erhalten. MATTSON et al. verwendeten immobilisierte Candida antarcticaLipase Typ B (Novozym 435) mit S-Ethylthiooctanoat216 als Acylierungsmittel. Unterdiesen Reaktionsbedingungen konnte sogar eine Diacylierung beobachtet werden.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 109Die Absolutkonfiguration des am langsamten reagierenden Isomers wurde zu(1S,3S) bestimmt.214Beim Cyclohexan-1,3-diol sind die Hydroxylgruppen allerdings nicht wie beimAlkohols rac-13 in axialer Position fixiert, so daß bei diesem Substrat die Acylierungeiner 1,3-diaxialen Spezies als unwahrscheinlich anzunehmen ist.Von GOTOR et al. ist ein Beispiel einer enzymatischen Acylierung eines höhersubstituierten Cyclohexan-1,3-diol-Derivats veröffentlicht worden.217 Die von einerLipase aus Chromobacterium viscosum katalysierte Acylierung des (3S,5S)-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols in Vinylacetat als Solvens verläuft miteiner hohen Aktivität und führt mit 100 %Umsatz zu dem an 5 Position acyliertenMonoacetat (Abb. 2.47). Somit wird die am wenigsten sterisch gehinderteHydroxylgruppe acyliert. CVL O Vinylacetat HO OH O OH 100 % UmsatzAbb. 2.47: Enzymatische Transacylierung von cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4- ene-1,3-diol mit Vinylacetat.Um eine enzymatische Acylierung des Alkohols rac-13 zu erreichen, wurde diesesSubstrat zunächst unter für Transacylierungen im allgemeinen geeignetenBedingungen mit Vinylpropionat in Toluol eingesetzt. Als Katalysatoren wurden vierverschiedene Lipasen verwendet (Tabelle 2.39). In keinem Fall konnte eine Enzym-katalysierte Reaktion beobachtet werden. Im Fall des epimeren Alkohols rac-12konnte unter diesen Reaktionsbedingungen ein E-Wert von 109 in der CRL-katalysierten Transacylierung erreicht werden.

110 THEORETISCHER TEILTabelle 2.39: Enzymscreening zur enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-13 in Toluol Reaktionsbedingungen Reaktions- UmsatzEnzym (Äquiv.) zeitCandida rugosa Lipase Vinylpropionat (5) 72 h 0%(CRL; 37 U/ml)Porcine pancreatic Lipase Vinylpropionat (5) 72 h 0%(PPL; 67 U/ml)Cholesterolesterase Vinylpropionat (5) 72 h 0%(CE; 35 U/ml)Novozym 435 Vinylpropionat (5) 72 h 1%(CAL-B)Im Fall des Novozym 435 konnten Spuren des gewünschten Propionsäureesters von13 detektiert werden. Daher wurde dies Enzym unter verschiedenen Reaktions-bedingungen in die Transacylierung des Alkohols rac-13 eingesetzt. Es wurdenDichlormethan und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Lösungsmittel verwendet(Tabelle 2.40). Eine Enzym-katalysierte Reaktion war aber auch unter diesenBedingungen nicht zu beobachten.Tabelle 2.40: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 (CAL-B) Umsatz nach Umsatz nach Reaktionsbedingungen 2.75 d 6dVinylpropionat (5), 1% 1%ToluolVinylpropionat (5), 0% 0%DichlormethanVinylpropionat 1% 1%als SolvensIsopropenylacetat (5), 1% 1%Toluol

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 111In Anlehnung an die von GOTOR et al. publizierten Bedingungen zur enzymatischenAcylierung des cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols,217 wurde daraufhindie Chromobacterium viscosum Lipase in Vinylpropionat als Solvens in dieAcylierung von rac-13 eingesetzt. Zusätzlich wurde noch Triethylamin als Additivzugesetzt (Tabelle 2.41).In verschiedenen Fällen wurde bei der Verwendung von Triethylamin von einempositiver Effekt dieses Additivs auf das Ergebnis der enzymatischen Acylierungberichtet.213,218 Durch die Zugabe einer organische Base werden Säurespuren in derReaktionsmischung neutralisiert, wodurch eine Aktivierung des Enzyms erreicht wird.Tabelle 2.41: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin Reaktionsbedingungen Umsatz UmsatzEnzym (Äquiv) nach 5 d nach 12 dNovozym 435 Vinylpropionat als Solvens 2% 4%(CAL-B) Triethylamin (1.4)Chromobacterium viscosum Vinylpropionat als SolvensLipase (CVL, 0.7 U/ml) 0% 1% Triethylamin (1.4)Burkholderia cepacia Lipase Vinylpropionat als Solvens 0% 0%(BCL, 80 U/ml) Triethylamin (1.4)Aus Tabelle 2.41 geht hervor, das eine Acylierung des Alkohols rac-13 nicht erreichtwerden kann. Weder das von GOTOR et al. beschriebene Enzym CVL katalysiertdiese Reaktion, noch führt der Zusatz Triethylamin zu einer Aktivierung der Enzymein einem zu wünschenden Umfang.Entsprechend den Ergebnissen in den Versuchen zur enzymatischen Hydrolysewurde das 1,3-diaxiale Diol rac-13 auch unter den Reaktionsbedingungen einerTransacylierung im organischen Medium nicht von den getesteten Hydrolasen alsSubstrat akzeptiert. Das Ziel eine Enzym-katalysierte Racematspaltung mit diesemSubstrat durchzuführen scheint daher nicht erreichbar zu sein.Eine mögliche Erklärung sind die sterischen Wechselwirkungen der beiden1,3-diaxial angeordneten Hydroxylgruppen.

112 THEORETISCHER TEILAllerdings kann auch im allgemeinen eine enzymatische Reaktion an einer axialkonfigurierten Hydroxylgruppe erschwert sein. So konnten nämlich TANIKAGA et al. imFalle verschiedener 3-substituierter Cyclohexanole keine enzymatische Acylierungbeobachten, wenn sich die Hydroxylgruppe in axialer Position im Cyclohexylringbefand, wohingegen bei den gleichen Substraten mit equatorialer Hydroxylgruppeeine enzymatische Racematspaltung möglich war (Abb. 2.48).219 OH OH Lipase PS R + Vinylacetat R (1S,3S) (1R,3R) Lipase PS R OH + OH R OAc Vinylacetat R Benzol, 30 °C (−)-(1R,3S) (1R,3S) (1S,3R) R = Ph, SPh, Bn, SO2PhAbb. 2.48: Unterschiedliche Reaktivitäten der Lipase PS hinsichtlich equatorialen und axialen Hydroxylgruppen.Im Falle der von MATTSON et al. beschrieben Racematspaltung einer Mischung voncis- und trans-Cyclohexan-1,3-diol, war das zurückbleibende, am langsamstenreagierende Isomer ebenfalls (+)-(1S,3S)-konfiguriert.215Im Falle der enzymatischen Racematspaltung von N-substituierten cis-2-Aminocylhexanolen, konnte von GOTOR et al. ebenfalls keine CAL-B-katalysierteAcylierung beobachtet werden, wenn die Hydroxylgruppe axial fixiert war.197 Eineentsprechende Acylierung des trans-konfigurierten Epimers verlief hochselektiv.196Der Unterschied in der Reaktivität beider Substrate wurde von den Autoren ebenfallsdurch die geometrische Anordnung der axialen Hydroxylgruppe erklärt.Da demzufolge der Alkohol rac-13 aufgrund seiner geometrischen Anordnung keinerenzymatischen Reaktion zugänglich ist, bietet sich die Möglichkeit an, dieVerbindung so zu Modifizieren, daß sie als Substrat akzeptiert werden kann.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 1132.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3- (6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)Nachdem sich gezeigt hatte, daß weder der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19noch der korespondierende Alkohol rac-13 aufgrund der geometrischen Anordnungder Hydroxylgruppe als Substrat in eine Enzym-katalysierte Racematspaltungeingesetzt werden können, wurde nach einer geeigneten Modifizierung des Alkoholsrac-13 gesucht, um ihn einer enzymatischen Reaktion zugänglich zu machen. O Pr O OH Hydrolase OH OH OMe OMe Phosphatpuffer- Me2N Lösung Me2N rac-19 13Abb. 2.49: Versuch zur enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19.Eine erste Alternative zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-19 ist dieMöglichkeit den Alkohol rac-13 in ein cyclisches Carbonat (rac-48) unter Einbindungder tertiären Hydroxylgruppe zu überführen und anschließend eine enzymatischeRacematspaltung dieser Verbindung durchzuführen (Abb. 2.50). Das solchecyclischen Carbonate als Substrate in eine Hydrolasen-katalysierte Reaktioneingesetzt werden können, ist bereits von MATSUMOTO et al. sowie GUIBE-JAMPEL etal. demonstriert worden.220 O OH OH O O OMe OMe Hydrolase Phosphatpuffer- Me2N Me2N Lösung rac-13 rac-48Abb. 2.50: Enzym-katalysierte Racematspaltung des Carbonats rac-48 als alternative Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13.Von BURK et al. wird eine effiziente Methode zur Überführung von 1,3-Diolen incyclische Carbonate beschrieben. Nachdem es ihnen nicht gelang ein 1,3-Diol mit

114 THEORETISCHER TEILverschiedenen bekannten Methoden unter Verwendung von Kohlenstoffmonoxid,Phosgen, Trichloracetylchlorid und 1-1´-Carbonyldiimidazol die gewünschteVerbindung zu erhalten, ist ihnen diese Reaktion schließlich erfolgreich unterVerwendung von Bis-(trichlormethyl)-carbonat (Triphosgen221) gelungen.222 Es wurdedaher versucht rac-13 unter den von BURK et al. beschriebenen Reaktions-bedingungen in das Carbonat rac-48 zu überführen (Abb. 2.51). 0.5 Äquiv. O Triphosgen OH OH O O 10 Äquiv. Pyridin OMe (⋅HCl) OMe Me2N Dichlormethan Me2N − 76 °C rac-13 (⋅HCl) rac-48Abb. 2.51: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit Triphosgen.Rac-13 wurde sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base in diese Reaktioneingesetzt. Aufgrund der Giftigkeit des während der Reaktion freigesetzten Phosgenswurde keine Reaktionskontrolle durchgeführt. Nach Chromatographie der erhaltenenReaktionsmischungen konnten neben dem zurückgewonnenen Edukt nur jeweilsnicht näher charakterisierte Zersetzungsprodukte erhalten werden. Dies ist wahr-scheinlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Reaktivität desTriphosgens bzw. Phosgens eine Acylierung am Stickstoff als Nebenreaktion auftritt.Die am Stickstoff acylierte Spezies kann anschließend eine N-Dealkylierungeingehen. Diese Nebenreaktion wurde versucht zu unterdrücken, indem rac-13 alsHydrochlorid eingesetzt wurde.Eine Prozedur zur Überführung von rac-13 in das cyclische Carbonat unter milderenReaktionsbedingungen wurde von KUTNEY et al. beschrieben. Sie beschreiben dieÜberführung eines cyclischen 1,2-diols in das entsprechende Carbonat unterVerwendung von 1-1´-Carbonyldiimidazol in Toluol.223 Daraufhin wurde versuchtrac-13 mittels dieses Reagenzes unter den von KUTNEY et al. publiziertenBedingungen in rac-48 zu überführen (Abb. 2.52).

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 115 O 4 Äquiv. OH OH O O OMe 1,1´-Carbonyldiimidazol OMe Me2N Toluol, Rückfluß Me2N 5h rac-13 rac-48Abb. 2.52: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol.Rac-13 wurde wieder sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base eingesetzt. DieReaktion wurde abgebrochen nachdem jeweils kein Edukt mehr detektiert werdenkonnte. Die rohen Produktmischungen wurden mittels Massenspektroskopieuntersucht und es konnte ein Fragment mit einer Masse von 305 detektiert werden,dem M+ von rac-48 zugeordnet wurde. Nach Chromatographie (EE : MeOH = 2 : 1über Kieselgel) konnte allerdings keine gewünschtes Produkt erhalten werden. Dadas Vorhandensein von 48 in der rohen Produktmischung nachgewiesen wurde, istzu vermuten, daß das Carbonat 48 unter den Bedingungen der Chromatographienicht stabil ist. Es wird daher angenommen, daß selbst wenn rac-48 ohneChromatographie dargestellt werden könnte, es aufgrund seiner mangelndenStabilität kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt.Diese Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13 mittels einescyclischen Carbonats (rac-48) als Substrat für eine enzymatische Racematspaltung,wurde daraufhin nicht weiter verfolgt.Um trotzdem eine Möglichkeit zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von rac-13aufzuzeigen, wurde auf die bereits vorgestellte Methode der Enzym-katalysiertenRacematspaltung von Phenylestern zurückgegriffen (siehe Abb. 2.55, S. 116). Dazuist es notwendig rac-13 durch O-Demethylierung in das entsprechende Phenol zuüberführen und dies dann selektiv an der aromatischen Hydroxylgruppe zu verestern.Die Etablierung der phenolischen Hydroxylgruppe erfolgte analog zur Darstellungdes Phenols rac-8 durch Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluolunter Rückfluß in guter Ausbeute (88 %).91 Eine Dealkylierung am Stickstoff war nichtzu beobachten (Abb. 2.53).

116 THEORETISCHER TEIL OH OH OH OH OMe DiBAl-H OH Toluol Me2N Rückfluß Me2N rac-13 rac-20, 88 %Abb. 2.53: Darstellung des Phenols rac-20 durch O-Demethylierung mit DiBAl-H.Zur selektiven Darstellung des Phenylesters rac-21 erfolgte nach einer Methode vonRICE et al (s. Kap. 2.2, S. 16).95 Dazu wurde das Phenol rac-20 mit 10 ÄquivalentenButtersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt (Abb. 2.54). OH OH OH OH OH NaHCO3-Lösung O Pr 10 Äquiv. Buttersäure- Me2N Me2N O anhydrid rac-20 RT, 30 Min. rac-21, 93 %Abb. 2.54: Selektive Darstellung des Esters rac-21.Mit rac-21 steht nun ein Substrat zur Verfügung, das nach den Untersuchungen zurenzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischerHydroxylgruppe als Substrat akzeptiert werden sollte. Der Ester rac-21 wurdedaraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.55). OH OH O Pr OH OH Enzym Me2N O O Pr Phosphatpuffer- (+)-21 Me2N O Lösung + RT Me2N rac-21 OH HO OH (−)-20Abb. 2.55: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21.Im Rahmen der Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse des Phenylestersrac-15 hatte sich gezeigt, das in der Schweineleber-Esterase-katalysierten Reaktion

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 117und in der Candida rugosa Lipase-katalysierten Reaktion gute Ergebnisse erzieltworden sind. Daher wurde rac-21 in die von diesen Enzymen katalysierte Hydrolysezunächst unter Standardbedingungen, wäßrige Phosphatpufferlösung mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, eingesetzt (Tabelle 2.42). Es wurde ebenfalls das EnzymCholesterolesterase, welches aus Candida rugosa erhalten wird, in die Hydrolysevon rac-21 unter den genannten Bedingungen eingesetzt.Tabelle 2.42: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-21 (−)-20Cholesterolesterase 16.8 h 64 % 71 % 11 % 2(CE; 3.3 U/ml) pH 7.0Schweineleber-Esterase 3.3 h 82 % 20 % 6% 1.3(PLE; 4.9 U/ml), pH 8.0Candida rugosa Lipase 18.5 h 40 % 31 % 17 % 2(CRL; 4.6 U/ml), pH 7.0Aus Tabelle 2.42 geht hervor, daß der Phenylester rac-21 im Gegensatz zu demEster der sekundären Hydroxylgruppe (rac-19) ein Substrat für eine enzymatischeRacematspaltung ist. Alle drei eingesetzten Enzyme zeigen eine hohe Aktivität in derHydrolyse dieses Esters. Die Aktivität der getesteten Enzyme ist im Bereich derAktivität hinsichtlich des Esters rac-15. Die unter diesen Standardbedingungen einesEnzymscreenings erzielte Selektivitäten sind allerdings für alle Enzym sehr schlecht.Im Rahmen der Untersuchungen zum Phenylesters rac-15 wurden unter gleichenBedingungen höhere Selektivitäten in der CRL- und PLE-katalysierten Hydrolyseerzielt. Die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 wurde inder CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystembeobachtet. Daher wurde der Phenylester rac-21 ebenfalls in die CRL-katalysierteHydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.43).

118 THEORETISCHER TEILTabelle 2.43: CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig- organischen Zweiphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 46 h 57 % 89 % 28 % 5Die unter diesen Bedingungen erzielte Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von5, ist zwar höher als die, die im wäßrigen Einphasensystem beobachtet wurde, sie istallerdings für eine kinetische Racematspaltung dieses Esters zu gering.Somit ist wie im Falle des Esters rac-15 auch mit dem Esters rac-21 in der CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem die höchsteSelektivität beobachtet worden. Insgesamt konnte die prinzipielle Möglichkeit zueiner Enzym-katalysierten Racematspaltung des 1,3-diaxial substituierten Alkoholsrac-13 aufgezeigt werden und so wiederum die Anwendbarkeit der Methode einerEnzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Estern demonstriertwerden.Die bisher in der enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-21 erzielteSelektivität ist mit einem E-Wert von 5 sehr gering. Allerdings wurden in den erstenVersuchen zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-15 auch ähnlich niedrigeSelektivitäten beobachtet, die dann optimiert werden konnten. Daher kann eineOptimierung der Reaktionsbedingungen (Enzym, Cosolvens, Kettenlänge des Estersu.a.) hier möglicherweise auch zu einer Steigerung der Selektivität führen.Außerdem stehen zur Steigerung des Enantiomerenüberschusses der Produkteeiner enzymatischen Racematspaltung noch anwendungstechnische Möglichkeitenoffen. So kann das gewünschte enantiomerenangereicherte Produkt wieder in eineenzymatische Reaktion eingesetzt werden.5,6 Diese Strategie ist bereits von vielenAutoren untersucht worden224, so daß hier bereits Wege zur Vereinfachung und zurOptimierung aufgezeigt worden sind.225 Beispielsweise sind hierzu von CHEN et al.Untersuchungen zur Vorhersage des günstigsten Umsatzes gemacht worden.106In der konkurrierenden klassischen oder thermodynamischen Racematspaltung vonrac-13 mit Weinsäurederivaten können sehr gute Ergebnisse erzielt werden.184 Diese

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 119Methode ist zur Trennung der Enantiomeren in einem präparativen Maßstabgeeignet.Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 20 erfolgtedurch Vergleich der Drehwerte mit denen, die bereits für die Enantiomeren derHydrochloride des O-methylierten Alkohols 13 publiziert sind.98Die Bestimmung der Absolutkonfiguration des Esters 21 erfolgte in Analogie zu derdes Phenols 20.

120 THEORETISCHER TEIL2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)Der racemische Alkohol 2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) ist die interessanteste Verbindung, der Rahmen dieser Arbeitdiskutierten Substrate, da das (+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer eine wichtige Vorstufe desWirkstoffs (+)-50, dem para-Fluorbenzylether von (+)-14, ist. Dieser Wirkstoff ist einvielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH97, der in derpräklinischen Entwicklung weit vorangeschritten ist. Aufgrund des starkunterschiedlichen pharmakologischen Profils der einzelnen Enantiomeren ist eineVermarktung der enantiomerenreinen Verbindung (+)-50 geplant (Abb. 2.56).184 F OH OMe ⋅HCl O Me2N (+)-50⋅HClAbb. 2.56: (+)-(1S,2R,4R)-2-Dimethylaminomethyl-4-(4-fluoro-benzyloxy)-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol hydrochlorid ein vielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH.Diese Substanz zeigt eine sehr starke analgetische Aktivität, die über die vonMorphin hinausgeht. Somit könnte ein Einsatz in der Therapie gegen sehr starkeSchmerzen erfolgen. Aufgrund einer sehr hohen Wirkstärke von (+)-50 ist hierzu nurdie Verabreichung geringster Mengen nötig. Dabei ist auch eine orale Einnahmemöglich, was einen Fortschritt zu der bisherigen Therapie darstellt. Eine weitereVerbesserung ist, daß die häufig als Nebenwirkung auftretende Atemdepressiongegenüber vergleichbaren Wirkstoffen, wie dem Morphin, vermindert ist.184Interessanterweise zeigt dieser Wirkstoff, wie das Tramadol, eine µ-opioide und einenicht-opioide Wirkung. Doch während beim Tramadol die Inhibierung derWiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT)hauptsächlich über das (−)-Enantiomer erfolgt, zeigt in diesem Falle das (+)-50neben der µ-opioiden Wirkung auch die Wirkung der Wiederaufnahmehemmung.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 121Das Wirkprofil des Racemats Tramadol konnte somit in einem Enantiomer einesneuen Wirkstoffs vereint werden.184Das entsprechende (−)-Enantiomer zeigt ebenfalls eine analgetische Aktivität, dieaber nicht an die Wirkstärke von (+)-50 heranreicht. Zudem verursacht es starkeNebenwirkungen (Herz-Kreislauf-Beschwerden), die im Falle des (+)-50 wenigerstark ausgeprägt sind. Durch die Fluor-Substitution am Aromaten wird eineverlangsamte Metabolisierung im Körper erreicht.184 Erst kürzlich ist über das nichtfluorsubstituierte (+)-4-Benzyloxytramadol ist mit ausgewählten pharmakologischenDaten berichtet worden.46i) Diese zeigen ebenfalls eine im Vergleich zum Tramadolgesteigerte Affinität zum µ–Opioidrezeptor.Obwohl in diesem Fall die Verwendung eines einzelnen Enantiomers geplant ist,werden natürlich beide einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologischeBegutachtung benötigt.Wie der isomere Alkohol rac-12 ist auch rac-14 aufgrund der equatorialangeordneten sekundären Hydroxylgruppe ein Substrat, daß sich für eineHydrolasen-katalysierte Racematspaltung anbietet. Ausgehend von den bisherigenErgebnissen zur enzymatischen Hydrolyse von Tramadol-Analoga wurde wiederumdas Butyrat als Acylrest gewählt und unter den bisherigen Standardbedingungen,wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatischeHydrolyse eingesetzt (Abb. 2.57). OH OMe Pr O Me2N O OH (+)-22 Enzym OMePr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung + O 10 % Cosolvens rac-22 Me2N OH RT OMe HO (−)-14Abb. 2.57: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

122 THEORETISCHER TEILAls erstes Enzym wurde die Lipase aus Burkholderia cepacia als Katalysator in dieenzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.44). Nach22 Stunden Reaktionszeit konnte kein Produkt mittels DC-Reaktionskontrolledetektiert werden, daraufhin wurde die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für dierestliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit konnteimmer noch kein Umsatz beobachtet werden, daraufhin wurde die Reaktionabgebrochen. In der BCL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-12 mitVinylpropionat wurde ebenfalls eine nur geringe Aktivität dieses Enzyms festgestellt(Tabelle 2.29). Eine Erklärung könnte sich aus dem aktiven Zentrum dieser Lipaseergeben: von KAZLAUSKAS et al. wurden die aktiven Zentren verschiedener Lipasenuntersucht, hierbei zeigte sich, daß die BCL226 verglichen mit der CRL227 über eineviel schmalere Tasche zur Bindung des Alkohols verfügt.228 Dies mag der Grunddafür sein, daß dies Enzym die relativ großen Moleküle der Tramadol-Analoga nurmit geringer Aktivität akzeptiert.Tabelle 2.44: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 (20 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Enzym Umsatz E-Wert zeit 22 14Burkholderia cepacia 48 h 0% n. b. n. b. -LipaseIn der Transacylierung des korrespondierenden Alkohols rac-14 zeigte dieEnzympräparation Novozym 435 (CAL-B) sehr gute Aktivität und auch Selektivität(s. Kap. 2.4.2.9 beginnend ab S. 144). Daraufhin wurde das Novozym 435 auch indie Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.45). Wie schon bei derNovozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 zuvor ist die Aktivität dieserimmobilisierten Candida antarctica Lipase auch in der Hydrolyse des Esters rac-22gering. Erst nach einer Reaktionszeit von 10 Tagen ist ein Umsatz von 35 % beieiner moderaten Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von 24, erzielt worden.Die CAL-B hydrolysiert bevorzugt den (−)-Ester zum Alkohol (−)-14. Damit zeigt siedie gleiche Enantiopräferenz wie zuvor beim Substrat rac-18, bei dessen Lipasen-katalysierter Hydrolyse bevorzugt der Alkohol (−)-12 gebildet wird.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 123Tabelle 2.45: CAL-B-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 mit verschiedenen Enzympräparationen (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Enzym Umsatz E-Wert zeit (+)-22 (−)-14Novozym 435 10 d 35 % 67 % 85 % 24(CAL-B)Chirazyme L2 45 h 7% 9% ≥98 % >200(CAL-B, 58 U/ml)Eine höhere Aktivität in der Candida antarctica Lipase des Esters rac-22 wurde voneiner lyophilisierten Form unter dem Namen Chirazyme L2 erwartet (Tabelle 2.45).Allerdings konnte nach 45 Stunden lediglich ein Umsatz von 7 % erzielt werden. EinUmsatz, der in der gleichen Zeit auch in der Novozym 435-katalysierten Hydrolysedes Esters rac-18 erreicht worden war. Eine Verlängerung der Reaktionszeit würdesicherlich zu höheren Umsätzen führen, aber eine Reaktionszeit von bis zu 10 Tagenerscheint für einen möglichen zukünftigen Produktionsprozeß nicht zweckmäßig.Interessanterweise ist die Selektivität dieser Reaktion bis zum erreichten Umsatzaußerordentlich hoch. Es wurde praktisch nur der (−)-Ester hydrolysiert. Diese hoheSelektivität wird als E > 200 ausgedrückt. Bei einem höheren Umsatz wäre dieserE-Wert aussagekräftiger, da bei niedrigen Umsätzen kleine Schwankungen in derBestimmung des ee-Werts des Alkohols zu hohen Schwankungen im E-Wert führenkönnen, außerdem kann es bei Abweichungen von den Voraussetzungen zum E-Wert zu einem Abfall der Selektivität mit Fortschreiten der Reaktion kommen.Die Candida rugosa Lipase hat in der Hydrolyse von rac-18 und Transacylierung vonrac-12 sehr gute Aktivitäten und Selektivitäten gezeigt. Zunächst wurde die CRL indie Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens eingesetzt (Tabelle 2.46). Nach 24 Stunden konnte bei einemUmsatz von 27 % ein ee-Wert von 92 % im Alkohol (−)-14 bei einem ee-Wert imEster von 38 % erzielt werden. Dies entspricht einem E-Wert von 34. Wie schon beider Hydrolyse des Esters rac-18 wird von dem Enzym CRL, wie zuvor auch von derCAL-B, das (−)-Enantiomer des Substrats bevorzugt umgesetzt. Die erzielteSelektivität ist niedriger als die, die in der Hydrolyse der isomeren Verbindung rac-18

124 THEORETISCHER TEILerzielt wurde. Für eine Hydrolyse in einem größeren präparativen Maßstab wäre dieSelektivität aber hoch genug. In Abb. 2.22 auf S. 58 ist die Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-22 und Produkt (−)-14 bei einer Selektivität von E = 34dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 60 %der nicht umgesetzte Ester enantiomerenrein vorliegt.Tabelle 2.46: CRL-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 in verschiedenen Reaktionssystemen (Candida rugosa Lipase; 4.5 U/ml) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-22 (−)-14Einphasensystem(Phosphatpuffer, pH 7.0; 24 h 27 % 38 % 92 % 3410 % tert-Butanol)Zweiphasensystem(Phosphatpuffer, pH 7.5; 5d 34 % 37 % 69 % 8MTBE; 1 : 1)Nach der Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem, wurde die CRL-katalysierteHydrolyse im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem als Reaktionsmediumdurchgeführt (Tabelle 2.46). Bisher zeigte die CRL im Zweiphasensystem bei meistähnlicher Aktivität eine höhere Selektivität. Im Fall des Substrates rac-22 ist dieReaktionsgeschwindigkeit im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem erheblichniedriger als im Einphasensystem. Zum Erreichen eines Umsatzes von 34 % werden5 Tage benötigt. Diese Verlängerung der Reaktionszeit kann durch eine für dasSubstrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms, welche die Diffusiondes Esters in das aktive Zentrum und die anschließende Bildung des Acyl-Enzymserschwert, hervorgerufen werden. Die Selektivität der Hydrolyse im Zweiphasen-system ist ebenfalls erheblich niedriger als die im Einphasensystem. Dies würde sichdurch eine für das Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzymsebenfalls erklären lassen.Zur Vorhersagbarkeit der Selektivität in Lipasen-katalysierten Reaktionenentwickelten KAZLAUSKAS et al. einfache empirische Modelle (Abb. 2.58). Mit diesenModellen läßt sich die Selektivität hinsichtlich des bevorzugt reagierendenEnantiomers für sekundäre229 und primäre230 Alkohole vorhersagen, wobei die

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 125Substituenten am Stereozentrum nur aufgrund ihrer Größe unterschieden werden.231Durch gezielte Veränderung von Substraten konnte gezeigt werden, daß dieSelektivität durch Erhöhung des Größenunterschieds der Substituenten gesteigertwird. Die Anwendung dieses Models auf große, höher substituierte Verbindungenmuß aber nicht immer gelingen, da es nicht für solche Verbindungen im Detail belegtworden ist. HO HO H H M L M L sekundäre Alkohole primäre AlkoholeAbb. 2.58: Empirische Selektivitätsmodelle nach KAZLAUSKAS et al. Das jeweils gezeigte Enantiomer wird schneller in einer Lipasen-katalysierten Reaktionen umgesetzt (L = großer Substituent, M = kleiner Substituent).Im Fall des Esters 22 wird von der CRL bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierteEnantiomer umgesetzt. Dies läßt sich mit dem KAZLAUSKAS Modell in Einklangbringen (Abb. 2.59). Zum Vergleich sind in Abb. 2.59 neben dem Alkohol (−)-14 dievon der CRL bevorzugten Enantiomere (−)-41193 und (+)-42194 abgebildet. Auf alledrei Enantiomere läßt sich das Selektivitätsmodell nach KAZLAUSKAS et al. anwenden. OH OH OH OMe NMe2 N OMe OH MeO (−)-14 (−)-41 (+)-42 Me2N OH OMe HO (−)-14Abb. 2.59: Von der CRL entsprechend dem von KAZLAUSKAS et al. entwickelten Modell bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

126 THEORETISCHER TEILIn weiteren Untersuchungen zur Candida rugosa Lipase wurde das aktive Zentrumdieses Enzyms von KAZLAUSKAS et al. mit dem anderer verglichen.228 Das aktiveZentrum der CRL wird durch eine weite Öffnung beschrieben, die es ermöglicht auchgroße sekundäre Alkohole als Substrate zu akzeptieren.227 Des weiteren ist einetunnelartige Tasche in direkter Nähe zum aktiven Zentrum, die den Acylrestaufnehmen kann. Im Vergleich zu dem aktiven Zentrum der CRL verfügt die CE übereine ähnliche weite Öffnung, die es diesem Enzym ermöglicht ebenfalls großesekundäre Alkohole umzusetzen.232Diese Betrachtungen führten zu der Überlegung die Cholesterolesterase in dieenzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 einzusetzen (Abb. 2.60). OH OMe Pr O Me2N O OH CE OMe (+)-22Pr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung (pH 7.0) + O 10 % Cosolvens Me2N OH rac-22 RT OMe HO (−)-14Abb. 2.60: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.Die CE-katalysierte Hydrolyse wurde unter den Reaktionsbedingungen des wäßrigenEinphasensystems bei pH 7 mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens durchgeführt. DasEnzym zeigte eine gute Aktivität in der Hydrolyse, daher wurde die Reaktion bereitsnach 2.5 Stunden abgebrochen und aufgearbeitet (Tabelle 2.47). Nach dieserReaktionszeit lag der gebildete Alkohol (−)-14 bei einem Umsatz von 21 %enantiomerenrein vor, der noch nicht umgesetzte Ester hatte 30 % ee. DieCholesterolesterase hydrolysiert bevorzugt das (−)-Enantiomer und zeigt somit diegleiche Enantiopräferenz wie die CRL. Die in der CE-katalysierten Hydrolyse desEsters rac-22 erreichte Selektivität von E größer 200 ist wesentlich höher als diezuvor beobachteten Selektivitäten. Für ein repräsentatives Beispiel ist der erreichteUmsatz allerdings zu niedrig. Die Reaktion wurde daher wiederholt und nach19.5 Stunden bei einem Umsatz von 38 % abgebrochen. Bei diesem Umsatz lag dergebildete Alkohol (−)-14 nur noch mit einem ee-Wert von 93 % vor (Tabelle 2.47).

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 127Tabelle 2.47: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 (9 U/ml; Phosphat- puffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200 19.5 h 38 % 67 % 93 % 55Für eine Selektivität von E > 200 hätte er enantiomerenrein vorliegen müssen. DieSelektivität der Reaktion bei einem Umsatz von 38 % läßt sich daher auch nur miteinem E-Wert von 55 beschreiben. Ein geringer Abfall der Selektivität der Reaktionbei höheren Umsätzen wurde auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse vonrac-15 beobachtet (Tabelle 2.9, S 52). Eine Änderung des E-Werts im Verlauf derReaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachtenVoraussetzungen zum E-Wert dar. Bei sehr hohen Selektivitäten ist außerdem zubeachten, daß geringe Schwankungen im gemessenen ee-Wert zu einen großenDifferenz im E-Wert führt.Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 wurde daraufhin wiederholt und mitdem bereits vorgestellten Verfahren zur Gewinnung der Produkte durch Extraktionbei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Zum Aufarbeitung der Reaktion nach22.5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit Diethylether bei pH 7 extrahiert. Eskonnte (+)-22 in 53 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden.Nachdem die verbliebene wäßrige Phase durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10eingestellt wurde, konnte (−)-14 in 45 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % durchExtraktion mit Dichlormethan erhalten werden (Tabelle 2.48).

128 THEORETISCHER TEILTabelle 2.48: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver Aufarbeitung (6.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14 22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67Es konnte eine Selektivität von 67 bei einem Umsatz von ca. 46 % beobachtetwerden. Sowohl der nicht umgesetzte Ester (+)-22 als auch der Alkohol (−)-14 liegenmit einem ee-Wert von 91 % vor. Dies Ergebnis stellt eine gute Ausgangsbasis zurGewinnung der einzelnen Enantiomeren von 14 dar. Würde die Reaktion früherabgebrochen, kann der Alkohol (−)-14 mit hohen ee-Werten erhalten werden (vgl.Tabelle 2.47). Würde man die Reaktion später bei einem Umsatz größer 50 %abbrechen, könnte der enantiomerenreine Ester (+)-22 erhalten werden.Mit dieser präparativen Reaktion konnte demonstriert werden, daß die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 ein geeignetes Verfahren zur Darstellungder Enantiomeren von 14 darstellt. In der Katalyse mit dem Enzym wurde diehöchste Selektivität in der Hydrolyse des Esters rac-22 beobachtet. Somit stelltdieses Enzym einen interessanten Katalysator nicht nur in der Racematspaltung vonTramadol-Analoga dar.Für eine enzymatische Hydrolyse von Tramadol-Analoga in einem präparativenMaßstab kann die geringe Löslichkeiten der entsprechenden Ester unvorteilhaft sein,da dadurch nur geringe Konzentrationen verwendet werden können, die ein erhöhtesLösungsmittelaufkommen mit den sich daraus ergebenen Konsequenzen notwendigmacht. Günstiger für einen Prozeß sind hohe Substratkonzentrationen.Es wurde daher erwogen, das Hydrochlorid des Esters rac-22 in die CE-katalysierteHydrolyse einzusetzen, da die Hydrochloride von Tramadol-Analoga im allgemeinensehr gut wasserlöslich sind.Die Verwendung von basischen Verbindungen in Form ihrer Hydrochloride in derEnzym Katalyse ist bisher selten. Eines der wenigen Beispiele hierzu stammt vonHUTCHINSON et al., die einen phenolischen Ester mit einem tertiären Amin auch alsHydrochlorid in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt haben (Abb. 2.17 rechts,S. 45)170.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 129Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 in Form seines Hydrochlorids wurdemit der gleichen Substratkonzentration (0.014 mol/l) durchgeführt, die auch bei derVerwendung der freien Base als Substrat gewählt wurde (Tabelle 2.49). DasHydrochlorid des Esters zeigte keinerlei Schwierigkeiten bei der Löslichkeit imwäßrigen Milieu. Ein Cosolvens wäre zur Löslichkeitsvermittlung nicht notwendig,wurde aber zur besseren Vergleichbarkeit mit den zuvor durchgeführten Katalysenmit dem Enzym beibehalten. Eine um ein vielfaches höhere Substratkonzentrationwäre wahrscheinlich durch die Verwendung des Hydrochlorids des Substratsmöglich. Dies wurde aber zunächst nicht untersucht.Tabelle 2.49: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl (9 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 19.5 h 43 % 86 % 94 % 89In Tabelle 2.49 ist das Ergebnis der CE-katalysierten Reaktion zusammengefaßt.Verglichen mit dem zuvor erzielten Ergebnis in der Hydrolyse der freien Base(Tabelle 2.48) ist kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Mit einer Selektivitätvon E = 89 verläuft die Reaktion weiterhin mit hoher Aktivität und Selektivität desKatalysators. Dies ist ein sehr wichtiges Resultat, denn der Einsatz der Substrate inForm ihrer Hydrochloride bringt einige Vorteile: Hydrochloride sind einfach zuhandhaben, sie sind lagerstabil, sie sind im wäßrigen Medium sehr gut löslich, unddie Hydrochloridfällung stellt eine weitere Möglichkeit zur Aufreinigung des Substratsdar.Eine Darstellung von (+)-14 zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 durcheine CE-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids des Esters rac-22 stellt zwar einetechnisch durchführbare Reaktion dar, ist allerdings umständlich, da der nichtumgesetzte Ester (+)-22 erst noch in einem zusätzlichen Reaktionsschritt hydrolysiertwerden müßte. Einfacher wäre eine enzymatische Hydrolyse die direkt zu (+)-14 alsProdukt führen würde.Da im Falle des Substrats rac-18 die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzteEnantiopräferenz zeigten, wurde diese Eigenschaft der Katalysatoren ebenfalls für

130 THEORETISCHER TEILdas Substrat rac-22 erhofft, denn dies würde zu dem Ziel eines Hydrolyseproduktes(+)-14 in der PLE-katalysierten Hydrolyse führen.Daher wurde der Ester rac-22 anschließend als Substrat in die PLE-katalysierteHydrolyse im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvenseingesetzt (Abb. 2.61). Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Tabelle 2.50 zusammen-gefaßt. Me2N OH OMe Pr O O (−)-22 OH PLE OMePr O Phosphatpuffer- + Me2N Lösung (pH 8.0) O 10 % Cosolvens OH rac-22 OMe RT HO Me2N (+)-14Abb. 2.61: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.Die Aktivität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse des Substrats rac-22 ist niedriger alsin der Hydrolyse des isomeren Esters rac-18. Die gleiche Verschiebung in derAktivität hinsichtlich dieser beiden Substrate konnte zuvor schon in der Katalyse derCRL beobachtet werden. Interessanterweise erfolgt die PLE-katalysierte Hydrolysedes Esters rac-22 mit einem E-Wert von 34. Die gleiche Selektivität wurde zuvorauch in der CRL-katalysierten Hydrolyse beobachtet. Somit ist die Selektivität dieserReaktion zwar gut, bleibt aber hinter der Selektivität der Katalyse der CE zurück.Tabelle 2.50: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 (3 U/ml; Phosphat- puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E 16.5 h 18 % 22 % 93 % 34

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 131In der CRL-katalysierten Hydrolyse wurde bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierteEnantiomer umgesetzt. In der PLE-katalysierten Hydrolyse wird hingegen das(+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer bevorzugt hydrolysiert. Damit zeigt die Schweineleber-Esterase eine zu den anderen getesteten Enzymen entgegengesetzteEnantiopräferenz. Dieses konnte zuvor auch an dem isomeren Substrat rac-18beobachtet werden. Somit kann, wie erhofft, der enantiomerenangereicherte Alkohol(+)-14 als direktes Reaktionsprodukt in einer enzymatischen Racematspaltungerhalten werden. Im Hinblick auf eine Synthese des gewünschten Produkts (+)-50stellt dies eine Vereinfachung dar.Zur Visualisierung der Enantiopräferenz der PLE wurden in Abb. 2.62 die bevorzugtumgesetzten Enantiomere (+)-12 und (+)-14 dem Kastenmodell nach JONES et al.angepaßt dargestellt. PB Ser HL: große, hydrophobe Tasche HS: kleine, hydrophobe Tasche HL HS PF: vordere, polare Tasche PB: hintere, polare Tasche PF Ser: Serin-Rest OH OH MeO MeO OH NMe2 OH NMe2 (+)-12 (+)-14 OH OH OMe OMe HO HO Me2N Me2NAbb. 2.62: Von der PLE entsprechend dem Kastenmodell nach JONES et al. bevorzugt umgesetzte Enantiomere.Wie aus Abb. 2.62 hervorgeht, zeigt die Hydroxylgruppe des Moleküls (+)-12 genauin Richtung der Hydroxylgruppe am Serin-Rest, dagegen zeigt die Hydroxylgruppevon (+)-14 ein wenig von dem Serin-Rest weg in eine andere Richtung. Dies kann die

132 THEORETISCHER TEILUrsache für die Unterschiedliche Aktivität des Enzym hinsichtlich der beidenSubstrate sein und erklären, warum rac-18 schneller als rac-22 umgesetzt wird. Inbeiden Molekülen zeigen die Dimethylaminomethylgruppen in Richtung der vorderen,polaren Tasche.Kommerziell verfügbare PLE ist in der Regel eine Mischung verschiedenerIsoenzyme. Analytisch können diese Isoenzyme durch isoelektrische Fokussierungaufgetrennt werden.128a),129 Obwohl 1988 von JONES et al. noch keine wesentlichenUnterschiede in Selektivität und Substratspezifität in der Katalyse der Isoenzymeerkannt werden konnten233, wurde hingegen in neueren Arbeiten von MATTSON et al.signifikante Unterschiede in den katalytischen Eigenschaften der einzelnenIsoenzyme aufgezeigt.130 Da Isoenzym-angereicherte Fraktionen der PLEkommerziell verfügbar sind (z.B. bei ROCHE DIAGNOSTICS als Chirazyme E1 undChirazyme E2), wurde ebenfalls ein möglicher Einfluß der Isoenzymzusammen-setzung der PLE untersucht. Hierzu wurde das Isoenzym-angereicherteChirazyme E1 in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt. Mitdiesem Enzym wurden zuvor in der GRÜNENTHAL GmbH enzymatische Hydrolysendurchgeführt. Hierbei konnte in systematischen Untersuchungen ein günstigerEinfluß von 16 % Aceton als Cosolvens auf die Hydrolyse von Tramadol-Analogagefunden werden.184 Auf diese Ergebnisse zurückgreifend wurde ebenfalls einZusatz von 16 % Aceton als Cosolvens für die Chirazyme E1-katalysierte Hydrolysedes Esters rac-22 gewählt (Tabelle 2.51).Tabelle 2.51: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (1.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.014 M Substrat)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85Die Reaktion wurde nach einer Reaktionszeit von 42 Stunden bei einem Umsatz vonca. 24 % abgebrochen und nach der Methode der Extraktion bei verschiedenenpH-Werten aufgearbeitet. Wie zuvor sind die isolierten Ausbeuten sehr gut, da die

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 133Gesamtausbeute 97 % beträgt. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichenHydrophobizität der Verbindungen. Ausgedrückt werden kann dies anhand vonausreichend großen Unterschiede im log P-Wert (Tabelle 2.52). Dabei handelt essich in diesem Fall um den Logarithmus des Verteilungskoeffizienten zwischenWasser und Cyclohexan.Tabelle 2.52: Log P-Werte (Wasser / Cyclohexan) für rac-14 und rac-22 bei verschiedenen pH-Werten pH rac-14 rac-22 7.0 -2.691 0.557 7.4 -2.297 0.946 8.0 -1.724 1.498 10.0 -0.680 2.333 12.0 0.633 2.360Die Selektivität der Chirazyme E1 Präparation in der Hydrolyse des Esters rac-22 istsehr hoch. Der Alkohol (+)-14 konnte mit einem ee-Wert von 97 % und der Ester(−)-22 mit einem ee-Wert von 27 erhalten werden. Insgesamt ist also die Selektivitätmit einem E-Wert von 85 größer als die der PLE-katalysierten Reaktion.Damit stellt das Isoenzym-angreicherte Chirazyme E1 einen geeigneterenKatalysator als die gesamte Isoenzym-Mischung PLE dar. Zudem scheint diesesErgebnis die von MATTSON et al. gemachte Aussage, daß die einzelnen Isoenzymesignifikante Unterschiede hinsichtlich der Selektivität zeigen, zu belegen. Daallerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Untersuchungen zur Zusammensetzungder einzelnen Enzym-Katalysatoren und ihrer Selektivität gemacht wurden, konntedieser Gesichtspunkt nicht weiter vertieft werden.Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieses Verfahrens wurde der Estersrac-22 auch in Form des Hydrochlorids dieser Verbindung in die Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse unter Verwendung von 16 % Aceton als Cosolvens eingesetzt.Der Verlauf des Umsatzes sowie der ee-Werte von Substrat und Produkt ist durchEntnahme einzelner Proben über einen Zeitraum von 23 Stunden verfolgt worden(Abb. 2.63). Es ist zu erkennen, daß bis zu einem Umsatz von 12 % der Alkohol

134 THEORETISCHER TEIL(+)-14 nahezu enantiomerenrein vorliegt (E > 200) und daß danach der ee-Wert fällt.Entsprechend dem Gegebenheiten einer kinetischen Racematspaltung steigt deree-Wert des Esters (−)-22 mit dem Umsatz. Nach 22.5 Stunden liegt der Alkohol miteinem ee-Wert von 95 % und der Ester mit einem ee-Wert von 28 % vor, diesentspricht einem E-Wert von 50 (Tabelle 3.50, obere Zeile). Danach wurde dieReaktionsmischung mit der Methode der Extraktion bei unterschiedlichen pH-Wertenaufgearbeitet (Tabelle 3.50, untere Zeile). 100 90 E = 50 80 70 ee-Wert (%) 60 ee-Wert Ester ee-Wert Alkohol 50 40 30 E = 50 20 10 0 0 5 10 15 20 Umsatz (%)Abb. 2.63: Verlauf der ee-Werte von Alkohol (+)-14 und Ester (−)-22 in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.Wie aus Tabelle 2.53 hervorgeht, konnte der Alkhohl nur mit einem ee-Wert von91 % erhalten werden und somit ergibt sich ein E-Wert von 27. Da der ee-Wert desAlkohols nach 22.5 Stunden in der Reaktionslösung noch bei 95 % lag und bei derExtraktion des Alkohols (+)-14 noch Reste des zuvor nur unvollständig extrahiertenEsters (−)-22 erhalten wurden, ist anzunehmen, daß der Abfall in dem ee-Wert desAlkohols während der Aufarbeitung erniedrigt worden ist. Während der Extraktion beipH 10 sind vermutlich Teile des (−)-Ester zum (−)-Alkohol hydrolysiert, was einen

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 135Abfall des ee-Wertes von (+)-14 zur Folge hat. Somit beschreibt der aus derReaktionslösung bestimmte E-Wert von 50 die Selektivität der kinetischenRacematspaltung zutreffender. Die im Vergleich zur Hydrolyse der freien Base desEsters rac-22 geringere Selektivität läßt sich durch die geänderten Reaktions-bedingungen erklären. In der Hydrolyse des Hydrochlorids wurde eineSubstratkonzentration von 0.200 mol/l gewählt, die um ein vielfaches höher ist, alsdie in der Hydrolyse der freien Base mit 0.014 mol/l. Um eine vergleichbareReaktionsgeschwindigkeit in der Hydrolyse des Hydrochlorids zu erreichen, ist dieEnzymmenge um etwa den gleichen Faktor von 1.6 U/ml auf 22.8 U/ml erhöhtworden. Aus Tabelle 2.51 und Tabelle 2.53 läßt sich abschätzen, daß dieReaktionsgeschwindigkeit tatsächlich in etwa gleich groß ist. Insgesamt hat dieErhöhung der Substrat- und Enzymkonzentration zu einer kleinen Verringerung derSelektivität in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse geführt.Tabelle 2.53: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (22.8 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M Substrat)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 (22.5 h) (26 %) (95 %) (50) 24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27Da das Hydrochlorid des Esters rac-22 auch in der Konzentration von 0.231 mol/lohne den Zusatz von Aceton als Cosolvens gut löslich ist, entsteht die Frage, obüberhaupt ein Cosolvens in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse vonrac-22⋅HCl notwendig ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden zweiparallele Reaktionen durchgeführt. In einer Reaktion wurde unter sonst identischenBedingungen (22.8 U/ml Chirazyme E1; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 Mrac-22⋅HCl) 16 % Aceton als Cosolvens verwendet, in der anderen kein Cosolvens.Aus beiden Reaktionen wurden Proben entnommen, die dann extrahiert undanalysiert wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Reaktionen lassen sich inAbb. 2.64 erkennen, in welcher der Verlauf des Umsatzes über die Zeit dargestellt

136 THEORETISCHER TEIList. Beide Zeit-Umsatz Kurven zeigen nach ca. 50 Stunden Reaktionszeit einenRückgang im Umsatz. Dies wurde durch einen systematischen Fehler,wahrscheinlich bei der Extraktion der Probe oder durch eine weitere Temperatur-schwankung, verursacht. Es ist deutlich zu erkennen, daß die Reaktion ohne Zusatzvon Aceton als Cosolvens mit höherer Reaktionsgeschwindigkeit verläuft.Beispielsweise wird in der Katalyse ohne Cosolvens bereits nach 7.5 Stunden einUmsatz von 21 % erreicht. Zum Vergleich wird dieser Umsatz in der Katalyse mitAceton als Cosolvens erst nach 175 Stunden (1 Woche) beobachtet. DieserUnterschied in der Aktivität des Enzyms wird wahrscheinlich durch eine Inhibition desEnzyms durch das Cosolvens Aceton verursacht. 45 40 E = 31 E = 27 E = 27 Umsatz = 41 % E =157 35 E = 30 30 mit 16 % Aceton als Cosolvens Umsatz (%) ohne Cosolvens 25 E > 200 20 E > 200 15 E > 200 Umsatz = 21 % 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Reaktionszeit (h)Abb. 2.64: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens.Im Vergleich zu den zuvor vorgestellten Reaktionen verlaufen beide Reaktionen miteine niedrigeren Reaktionsgeschwindigkeit. Dies ist auf einen technischen Defektzurückzuführen, der die Reaktionstemperatur im Vergleich zu den vorherigenVersuchen herabsetzte. Neben dem Einfluß des Acetons auf die Aktivität derEnzymkatalyse ist auch ein Einfluß des Cosolvens auf die Selektivität der

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 137Chirazyme E1-katalysierten Reaktionen zu beobachten. Ein direkter Vergleich derSelektivitäten beider Reaktionen in Abb. 2.64 ist aber aufgrund des niedrigenUmsatzes in der Reaktion mit Cosolvens kaum möglich, da ein Vergleich derE-Werte nur bei gleichem Umsatz aussagekräftig ist. Bei Erfüllung aller inKap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen ist der E-Wert über den Verlauf derReaktion konstant. Im Verlauf der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführtenenzymatischen Hydrolysen von Tramadol-Analoga konnte allerdings häufiger einlangsames Abfallen des E-Wertes mit dem Fortschreiten einer Reaktion beobachtetwerden. Aus Abb. 2.64 geht hervor, daß in der Reaktion mit dem Cosolvens Acetonnach 175 Stunden ein E-Wert größer 200 bei einem Umsatz von 21 % beobachtetwird. In der Reaktion ohne Cosolvens ist bei dem gleichen Umsatz von 21 % derE-Wert allerdings auch größer 200, dieser Umsatz wird nur schon viel früher nach7.5 Stunden erreicht. Somit verlaufen beide Reaktionen in ihrem Anfanghochselektiv. In der Reaktion ohne Cosolvens ist danach allerdings ein starker Abfallin der Selektivität mit dem Umsatz der Reaktion zu beobachten. Bei 40 % Umsatzläßt sich die Selektivität nur noch durch einen E-Wert von 27 beschreiben. Hier istein direkter Vergleich mit der Reaktion mit einem Zusatz von Aceton als Cosolvensnicht mehr möglich.Eine von der GRÜNENTHAL GmbH beobachtete Abhängigkeit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz ist in Tabelle 2.55auf S. 142 dargestellt.Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Alkohols 14 erfolgtedurch Vergleich des Drehwerts, der bereits für die Verbindung (+)-50⋅HCl, dasHydrochlorid des para-Fluorbenzylethers zum Alkohol (+)-14, publiziert ist.97 Hierbeierfolgte die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-50⋅HCl durch Röntgen-strukuranalyse.184Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 22, 23, 24 und 45 erfolgte inAnalogie zu der des Alkohols 14.

138 THEORETISCHER TEIL2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23)Da bisher keine Racematspaltung über diastereomere Salzbildung mit dem Alkoholrac-14 gelungen ist, stellt die Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung bisherdas einzige Verfahren zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 in einempräparativen Maßstab dar.Somit ist die GRÜNENTHAL GmbH bei diesem Substrat auf eine enzymatischeMethode zur Gewinnung der einzelnen Enantiomeren angewiesen. Zugleich ist dieVerbindung (+)-50 auch eine in der präklinischen Forschung weit vorangeschritteneVerbindung. Dies macht die Entwicklung einer enzymatischen Methode zur Synthesevon (+)-14 notwendig, welche die Bereitstellung von Kilogrammmengen in einemTechnikumsmaßstab zu leisten vermag. Ein endgültiger Produktionsprozeß für dieVerbindung (+)-50 sollte zur dritten klinischen Testphase bekannt sein.Im Hinblick auf einen technisch durchführbaren enzymatischen Prozeß stellt sich dieFrage, ob eine Veresterung von rac-14 mit der Buttersäurechlorid zur Darstellungvon rac-22 unter dem Aspekt einer möglichen Geruchsbelästigung realisierbar ist.Die technische Durchführbarkeit dieser Reaktion und der anschließendenenzymatischen Hydrolyse ist in jedem Fall gegeben.184Aufgrund dieser Vorbehalte wurde die Möglichkeit einer Variation des Acylrestes desSubstrats in Erwägung gezogen. In Vorversuchen zeigte sich, daß Valerian-säurechlorid ebenfalls sehr penetrant unangenehm riecht und somit auch nicht inFrage kommt. Aus wirtschaftlicher Sicht läßt sich eine Verlängerung des Acylrestesbis zur Hexansäure (C6) vertreten. Eine Verkürzung des Acylrestes ist ebenfalls eineweitere Möglichkeit. Aufgrund der schlechten Erfahrungen in der Synthese desAcetats rac-24 wurde dieser Ansatz zunächst aber nicht verfolgt, sondern vielmehrdas Capronat von rac-14 dargestellt und dessen Eigenschaften als Substrat in derPLE-katalysierten Hydrolyse untersucht (Abb. 2.65).

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 139 Me2N OH OMe C5H11 O O (−)-23 OH Chirazyme E1 OMeC5H11 O Phosphatpuffer- + Me2N Lösung (pH 7.0) O 16 % Cosolvens OH rac-23 RT OMe HO Me2N (+)-14Abb. 2.65: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23.Die Reaktionsbedingungen der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Estersrac-23 wurden entsprechend den zuvor durchgeführten Hydrolysen gewählt. Eswurde die freie Base als Substrat eingesetzt. Durch den längeren Acylrest ist dasSubstrat rac-23 hydrophober als beispielsweise das Butyrat rac-22. Als eineKonsequenz war eine herabgesetzte Löslichkeit des Substrats zu beobachten. ZuBeginn der Reaktion war die Reaktionslösung stark getrübt und klärte sich dannlangsam mit Voranschreiten des Umsatzes. Die Aktivität des Katalysators und damitauch die Reaktionsgeschwindigkeit war moderat. Nach 24 Stunden, bei einemUmsatz von ca. 46 %, wurde mit der Methode der Extraktion bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Bei einem pH-Wert von 7.0 konnte durch Spuren von Hexan-säure (Capronsäured) verunreinigter und daher penetrant ziegenähnlich riechenderEster (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % in 54 % Ausbeute isoliert werden.Anschließend wurde bei pH 10 der Alkohol (+)-14 einem ee-Wert von 77 % in 46 %Ausbeute erhalten (Tabelle 2.54). Die Selektivität der Reaktion läßt sich durch E = 24beschreiben und verläuft somit mit geringerer Selektivität als die Hydrolyse desButyrats rac-22.d capra (lat.) = Ziege.

140 THEORETISCHER TEILTabelle 2.54: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens (3.1 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0)Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24Unter anwendungstechnischen Aspekten ist der ziegenähnliche Geruch derHexansäure ein ausschlaggebender Nachteil, da keine Verbesserung gegenüberdem Geruch der Buttersäure erzielt worden ist. Hier könnte die Verwendung desPropionats als Acylrest den Mittelweg zwischen mangelnder Stabilität des Substrats(Acetat) und Geruchsbelästigung (Butyrat und höhere Ester) darstellen.Der zu beobachtende Einfluß des Acylrests auf die Selektivität der Enzym-katalysierte Hydrolyse ist ebenfalls eine Nachteil der Verwendung des Substratsrac-23. Da das Enzym Schweineleber-Esterase bevorzugt kurzkettige wasserlöslicheEster wie Acetate hydrolysiert, stellt das Substrat rac-23 durch seinen großenAcylrest ein eher ungeeignetes Substrat dar.2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen MaßstabZur Bereitstellung erster größerer Mengen an (+)-14 im Halbkilogramm-Maßstab fürdie präklinische Entwicklung des Wirkstoffs (+)-50 in der GRÜNENTHAL GmbH wurdedort eine optimierte Laborsynthese entwickelt und eingesetzt. Ein solches Verfahrenstellt eine besondere Herausforderung an die Effizienz der Enzym-katalysiertenRacematspaltung und die Aufarbeitungsmethode dar.Aufgrund der Robustheit der enzymatischen Hydrolyse als Methode zur Darstellungenantiomerenangereicherter Verbindungen wurde daher von der GRÜNENTHAL GmbHeine PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 durchgeführt (Abb. 2.66). Eswurden 200 g Hydrochlorid des Esters rac-22 mit 1.5 g Chirazyme E1 im wäßrigenEinphasensystem aus Phosphatpuffer (pH 7.0) und 16 % Aceton als Cosolvensumgesetzt.184 Bei einem Umsatz von ca. 52 % wurde zur Aufarbeitung die auch in

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 141einem Kilogramm-Maßstab einfach und effizient durchzuführenden Methode derExtraktion von Ester und Alkohol bei jeweils unterschiedlichen pH-Werten verwendet.Diese Methode hat den Vorteil auf chromatographische Trennverfahren verzichten zukönnen, da solche Verfahren in einem späteren Produktionsprozess nur schwerumzusetzen ist. Weiterhin wurde während der Durchführung darauf verzichtet denpH-Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant zu halten. Dies führte während derReaktion zu einer Schwankung des pH-Werts im Phosphatpuffers um 0.5. Me2N OH OMe Pr O O OH (−)-22 Chirazyme E1 OMe Pr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung (pH 7.0) + O ⋅HCl 16 % Aceton OH RT OMe rac-22⋅HCl HO Me2N (+)-14Abb. 2.66: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.Des weiteren wurde als Substrat in der enzymatischen Hydrolyse nicht mehr die freieBase des Esters rac-22 eingesetzt, da diese in höheren Konzentrationen nicht mehrim wässrigen Medium löslich ist. Stattdessen wurde das Hydrochlorid der Verbindungeingesetzt, welches eine sehr viel größere Löslichkeit hat. Die Isoenzym-angereicherte PLE-Präparation Chirazyme E1 wurde als Katalysator wegen derEnantiopräferenz für das (+)-Enantiomer eingesetzt, so daß der benötigte (+)-Alkoholdirekt als Reaktionsprodukt erhalten wird. Weiterhin verfügt das Chirazyme E1gegenüber der PLE über eine höhere Selektivität hinsichtlich des Substrates rac-22.Auch stellt allgemein eine lyophilisierte Form des Enzyms, wie beim Chirazyme E1,einen einfach zu handhabenden Katalysator dar.Ebenfalls wurde Aceton als Cosolvens verwendet. In der GRÜNENTHAL GmbH konnteeine deutliche Abhängigkeit des ee-Wertes des gebildeten Alkohols (+)-14 von derzugesetzten Menge an Aceton beobachtet werden (Tabelle 2.55).184

142 THEORETISCHER TEILTabelle 2.55: Abhängigkeit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden (Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.5 g Substrat) Aceton- ee Ester Gehalt ee Alkohol Gehalt E zusatz (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 16 % 94 % 56 % 96 % 44 % 174 9% 98 % 51 % 90 % 49 % 86 0% 98 % 50 % 73 % 50 % 28Insgesamt konnte in diesem Versuch der nicht umgesetzte Ester (−)-22 in 99 %Ausbeute mit einem ee-Wert von 72 % und der gebildete Alkohol (+)-14 in 96 %Ausbeute mit einem ee-Wert von 93 % isoliert werden (Tabelle 2.56). Durchanschließende Kristallisation des Alkohols konnte dessen ee-Wert auf >99 %gesteigert werden.184,234Tabelle 2.56: Von der GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (Phosphatpuffer, pH 7.0; 200 mM Substrat) Enzym Reaktions- Umsatz Ester (−)-22 Alkohol (+)-14 E zeit Ausbeute ee Ausbeute ee Chirazyme E1 15 h 52 % 99 % 72 % 96 % 93 % 59 (22.4 U/ml)Eine geringe Steigerung der Selektivität der Reaktion läßt sich beobachten, wennman nach der Hälfte der Reaktionszeit nochmals Enzym zugibt.Hiermit konnte gezeigt werden, daß eine enzymatische Laborsynthese, wie sie imRahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, in eine Multigramm-Maßstab zur Darstellungerster Kilogramm-Mengen übertragen werden kann. Als besonders wirkungsvoll istdabei die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu betrachten.

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 143Sie stellt einen Schlüsselschritt für die Aufarbeitung der enzymatische Hydrolyse dar.Diese Methode hat sich im Halbkilogramm-Maßstab in der GRÜNENTHAL GmbHetabliert und würde sich auch in einen späteren Produktionsprozeß einsetztenlassen.Eine alternative Möglichkeit zu einer effizienten Trennung von Ester und Alkohohl beieiner enzymatischen Racematspaltung stellt die von THEIL et al. vorgestellteExtraktion nach Lipasen-katalysierter Fluoracylierung dar.235 Dies Verfahren basiertauf der Verteilung zwischen organischer und fluoriger Phase und erlaubt eineIsolierung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch, die auch in einem industriellenGroßmaßstab angewendet werden kann. O CAL-B OH CF3(CF2)7(CH2)2CO2CH2CF3 O (CF2)7CF3 OH + Ph MeCN, Rt Ph Ph Extraktion mit n-C6F14 O O (CF2)7CF3 OH Ph Ph 47 %, 98 % ee 48 %, > 98 % ee fluorige Phase (n-C6F14) org. Phase (MeOH)Abb. 2.67: Lipasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Phenylethanol und anschließender extraktiver Trennung mit Hilfe eines fluorig-organischen Zweiphasensystems.In einer CAL-B-katalysierten Transacylierung wird hierzu das schneller reagierende(R)-Enantiomer des Phenylethanols mit einem hochfluorierten Acylrest acyliert (Abb.2.67). Der mit diesem „Teflon-Schwanz“236 ausgestatte Ester kann anschließendselektiv n-Perfluorhexan extrahiert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daßsich in der fluorigen Phase auch noch der Überschuß an fluorierten Acylierungsmittelbefindet, dessen Abtrennung noch nötig sein kann.

144 THEORETISCHER TEIL2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)Nachdem mit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 bereitsein Verfahren zur Darstellung des Alkohols (+)-14 und damit zur Synthese desgewünschten Produkts (+)-50 zur Verfügung steht, wurde die Enzym-katalysierteTransacylierung von rac-14 unter dem Aspekt untersucht, eine Möglichkeit zurRacematspaltung neuer hydrophober und daher im wäßrigen Milieu unlöslicherTramadol-Analoga zu schaffen. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung imorganischen Medium bietet neben dem bereits etablierten hydrolytischen Verfahrenden Vorteil alternativer Reaktionsbedingungen. Da in der Lipasen-katalysiertenHydrolyse bevorzugt (−)-14 gebildet wurde, wird in der Umkehrrektion, der Enzym-katalysierte Transacylierung von rac-14 im organischen Medium, ebenfalls (−)-14bevorzugt acyliert und es kann wie in der PLE-katalysierten Hydrolyse dasgewünschte (+)-Enantiomer des Alkohols als Produkt isoliert werden (Abb. 2.68). Me2N OH OMe R O O (−)-Ester OH Lipase OMe HO Vinylester organisches + Me2N Lösungsmittel OH rac-14 RT OMe HO Me2N (+)-14Abb. 2.68: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14.Zunächst wurde die Candida rugosa Lipase als Katalysator in die Transacylierungdes Alkohols rac-14 eingesetzt. Als Acyldonoren wurden Vinylacetat undIsopropenylacetat in Toluol und Acyldonor als Lösungsmittel verwendet. DieErgebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 2.57 zusammengefaßt. Wie schonzuvor in der CRL-katalysierten Hydrolyse der korrespondierenden Ester rac-22 undrac-18 zu beobachten war, ist die Aktivität der CRL hinsichtlich des Alkohols rac-12

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 145höher als hinsichtlich des Alkohols rac-14. Die in den CRL-katalysiertenTransacylierungen des Alkohols rac-14 beobachteten Reaktionsgeschwindigkeitensind gering, ebenso die beobachteten Selektivitäten. Die CRL empfiehlt sich dahereher als Katalysator für die Substrate 12 und 18. Interessanterweise wird in CRL-katalysierten Acylierung mit Isopropenylacetat in Toluol der höchste Umsatz beihöchster Selektivität erzielt. Dies Ergebnis unterstützt die These, daß während derReaktion gebildetes Acetaldehyd das Enzym deaktiviert. In einem solchen Fall bietetsich die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel an.Tabelle 2.57: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat und Isopropenylacetat (37 U/ml) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 16 d Umsatz 18 %Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 44 % 5Toluol ee Alkohol (+)-14 72 % Umsatz 11 %Vinylacetat ee Ester (−)-24 47 % 4als Solvens ee Alkohol (+)-14 48 % Umsatz 25 %Isopropenylacetat (6), ee Ester (−)-24 68 % 14Toluol ee Alkohol (+)-14 87 % Umsatz 12 %Isopropenylacetat ee Ester (−)-24 77 % 10als Solvens ee Alkohol (+)-14 35 %Eine in der jüngeren Literatur häufig mit großem Erfolg zur Acylierung sekundärerAlkohole verwendete Enzympräparation ist das Novozym 435, welches eine aufeinem makroporösen Acrylharz immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B ist.126Daraufhin wurde das Novozym 435 in die Transacylierungen des Alkohols rac-14 mitVinylacetat in den Lösungsmitteln Toluol und Dichlormethan eingesetzt (Tabelle

146 THEORETISCHER TEIL2.58). Die Aktivität dieses Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 ist verglichen mitden zuvor durchgeführten enzymatischen Transacylierung außerordentlich hoch.Bereits nach 48 Stunden werden Umsätze von 70 % bzw. 79 % erreicht. DieSelektivität in beiden Reaktionen ist auch sehr hoch. In dem polaren LösungsmittelDichlormethan wird ein E-Wert von 99 erzielt.Tabelle 2.58: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 48 h Umsatz 70 %Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 90 % 38Toluol ee Alkohol (+)-14 67 % Umsatz 79 %Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 90 % 99Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 %Auf Basis dieser guten Ergebnisse, wurde daraufhin Vinylpropionat alsAcylierungsmittel in die Novozym 435-katalysierte Transacylierung eingesetzt. Umden Einfluß des Lösungsmittels auf das Ergebnis der Transacylierung zuuntersuchen, wurden als Lösungsmittel Toluol, Toluol mit einem Zusatz von 0.2 %Wasser, Dichlormethan und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.59). Von JUNGENist zuvor in der Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchsteReaktionsgeschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtetworden.85 Diesem Ergebnis zufolge wurde die Verwendung des Zusatzes an Wasserzum Lösungsmittel in der CAL-B Katalyse untersucht. Alle Reaktionslösungen warenzu Beginn der Reaktion klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktioneneine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war zusätzlich noch einweißer Niederschlag zu erkennen. Nach 24 Stunden wurden alle Reaktionen beieinem Umsatz von 50 % abgebrochen. In Toluol als Lösungsmittel wurde eine hoheSelektivität von E = 90 beobachtet. Verglichen mit dem Acylierungsmittel Vinylacetatist hier eine Steigerung in der Selektivität der Novozym 435-katalysierten Acylierungerreicht worden. Ein Zusatz von 0.2 % Wasser zum Lösungsmittel Toluol führt

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 147sowohl zu einer Erniedrigung der Aktivität des Enzyms hinsichtlich des Substratsrac-14 als auch zu einer Erniedrigung der Selektivität der Reaktion. Von RUPPERT84und JUNGEN85 wurde zuvor eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und derSelektivität der PLE-katalysierten Transacylierung geschildert. Dieses konnte nichtauf die CAL-B katalysierte Transacylierung übertragen werden. Ein anzunehmenderGrund hierfür ist eine aufgrund der hohen Aktivität des Enzym verstärkte Hydrolysedes Acyldonors als Nebenreaktion. Diese „Nebenaktivität“ des Enzyms führt zu demscheinbar geringeren Umsatz hinsichtlich des umgesetzten Substrats rac-14.Tabelle 2.59: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 24 h Umsatz 51 %Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 92 % 89Toluol ee Alkohol (+)-14 95 % Umsatz 35 %Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 89 % 30Toluolmit Zusatz von H2O (0.2 %) ee Alkohol (+)-14 56 % Umsatz 50 %Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 98 % >200Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 % Umsatz 52 %Vinylpropionat ee Ester (−)-45 97 % 192als Solvens ee Alkohol (+)-14 88 %In den Lösungsmitteln Dichlormethan und Acylierungsmittel werden außerordentlichhohe Selektivitäten in der enzymatischen Acylierung von rac-14 erzielt. In demLösungsmittel Dichlormethan werden mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel höhereSelektivitäten als mit Vinylacetat erzielt, dies wurde zuvor auch in Toluol beobachtet.

148 THEORETISCHER TEILIn der Reaktion des achiralen Acylierungsreagenzes mit dem Enzym wird derAcyl/Enzym-Komplex gebildet. Da sich im diesem Komplex die Acylgruppe direkt imaktiven Zentrum befindet, beeinflußt die Struktur des Carbonsäureteils desEnolesters die Steuerung der Enantiomeren-Diskriminierung beim Angriff deschiralen Nucleophils (Abb. 2.69).237 Untersuchungen zum Einfluß der Kettenlängevon Enolestern auf das Ergebnis von Transacylierungen lassen den Schluß zu, daßdie optimale Kettenlänge sowohl vom verwendeten Enzym als auch von der Strukturdes Substratalkohols abhängt. Dies macht eine individuelle Optimierung derenzymatischen Transacylierung für jedes Substrat notwendig.Abb. 2.69: Einfluß des Acyldonors auf die Steuerung der Enantiomeren- Diskriminierung eines Enzyms.237a)Insgesamt stellt die Novozym 435 katalysierte Transacylierung von rac-14 eineinteressante Alternative zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 dar. Aktivität undSelektivität des Enzyms sind hervorragend. Um das vorhandene Potential diesesKatalysators zu erschließen, wurde die Katalysatormenge halbiert und der Einflußauf die Transacylierung in den Lösungsmitteln Toluol und Vinylpropionat untersucht(Tabelle 2.60). Zusätzlich wurde in einer weiteren Reaktion ein Zusatz vonTriethylamin zum Lösungsmittel Toluol gemacht. Interessanterweise zeigten alleReaktion, mit Ausnahme der Reaktion unter Zusatz von Triethylamin, nach ca.48 Stunden eine milchige Trübung. Wie aus Tabelle 2.60 hervorgeht, erreichen alledrei Reaktionen nach 7.6 Stunden einen Umsatz von ca. 50 % und bleiben nahezubei diesem Umsatz bis zum Reaktionsende nach 47.75 Stunden stehen. Da dieReaktionsgeschwindigkeit des langsamer reagierenden Enantiomers im Vergleich zudem des schneller reagierenden vernachlässigbar gering ist, spricht dies für einehohe Enantiomeren-Diskriminierung des Enzyms. Entsprechend sind die E-Wertealler drei Reaktionen auch hoch (Tabelle 2.61).

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 149Tabelle 2.60: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 47.75 h (Äquiv.) Umsatz 51 % 53 % 53 %Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 %Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % ≥98 % Umsatz 50 % 53 % 52 %Vinylpropionat ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 %als Solvens ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 %Vinylpropionat (5), Umsatz 54 % 55 % 56 %Triethylamin (0.25), ee Ester (−)-45 92 % 93 % 91 %Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 %Der erzielte E-Wert im Lösungsmittel mit nur 5 mg Katalysator entspricht dem der mit10 mg erhalten wurde. Somit ist hier eine Reduzierung der Katalysatormengeproblemlos möglich. In Vinylpropionat als Solvens ist der erzielte E-Wert zwar einwenig geringer als mit der doppelten Katalysatormenge, aber noch in der zuvorerzielten Größenordnung, so daß hier eine Reduzierung der Enzymmenge nochvertretbar ist.

150 THEORETISCHER TEILTabelle 2.61: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 47.75 h Mittel (Äquiv.)Vinylpropionat (5), 49 97 111 84ToluolVinylpropionat 81 144 125 119als SolvensVinylpropionat (5), 125 144 111 131Triethylamin (0.25), ToluolInteressanterweise wird im Lösungsmittel Toluol unter Zusatz von Triethylamin einehöhere Selektivität als in reinem Toluol erzielt. Durch einen Zusatz von Triethylaminkann eine Steigerung der Selektivität erreicht werden. Diese Beobachtung ist auchbereits von verschiedenen Autoren publiziert worden.218a),213 Das Triethylamin dientim organischen Medium zur Pufferung der als Nebenprodukt entstandenenCarbonsäure. In Abb. 2.43 auf Seite 102 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörigeReaktionsschema wiedergegeben. Die Carbonsäure entsteht durch die Neben-reaktion des Acyl/Enzym-Komplexes mit in Spuren im Reaktionsmedium vor-handenem Wasser und führt so zu einer Hydrolyse des Acylierungsreagenzes. InAbwesenheit des Triethylamins als Base kann die gebildete Carbonsäure an derEnzym-Oberfläche gebunden werden und kann durch ionische Wechselwirkungendie elektrostatische Umgebung beeinflussen, wodurch wiederum kleineKonformationsänderungen im Protein möglich sind, welche die Aktivität undSelektivität des Enzyms verändern.218a)In der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 wurde ein günstigerEinfluß des Acyldonors Isopropenylacetat auf die Enzymkatalyse beobachtet, dawährend der Reaktion kein Acetaldehyd freigesetzt wird. In der Novozym 435-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat wirdebenfalls nach 24 Stunden ein Umsatz von ca. 50 % beobachtet (Tabelle 2.62).Erreicht wurde dieser Umsatz, wie nach Tabelle 2.60 anzunehmen ist, schon nach8 Stunden. Die mit diesem Acylierungsreagenz in dem Lösungsmittel Toluol erzielte

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 151Selektivität ist höher als die, die mit Vinylacetat und Vinylpropionat in Toluolbeobachtet wurde. Es empfiehlt sich auch in der Novozym 435-katalysiertenTransacylierung die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel.Tabelle 2.62: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 24 h Umsatz 51 %Isopropenylacetat (5), ee Ester (−)-24 94 % 170Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 %Es wurde der Versuch durchgeführt eine PLE-katalysierte Transacylierung desAlkohols rac-14 zu erreichen. Nach den Ergebnissen in der PLE/MPEG- undPLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 ist allerdingskein Erfolg zu erwarten, zumal die PLE wie die CRL rac-18 in der Hydrolyse alsSubstrat gegenüber rac-22 bevorzugt. So konnte in der PLE/MPEG-katalysiertenTransacylierung des Alkohols rac-14 auch kein nennenswerter Umsatz unterverschiedenen Reaktionsbedingungen beobachtet werden (Tabelle 2.63).Tabelle 2.63: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (6.4 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 20 d 2% Toluol Isopropenylacetat (5), 20 d 0% ToluolFür eine Acylierung von rac-14 wurde auch das Colyophilisat aus PLE, BSA undMPEG (PLE/BSA/MPEG) eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hoheAktivität im organischen Medium zeigt.83 In der PLE/BSA/MPEG-katalysierten

152 THEORETISCHER TEILTransacylierung des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in Toluol wurde eine starkerhöhte Katalysatorkonzentration verwendet (Tabelle 2.64). Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun. Dies belegt die enzymatische Hydrolyse des Acylierungsmittels zu Carbonyl-Nebenprodukten wie Essigsäure. Eine enzymatische Acylierung des Substratesrac-14 war allerdings auch mit dieser stark erhöhten Katalysatormenge nichtmöglich.Tabelle 2.64: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (2000 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylacetat (5), 11 d 0% ToluolIn der PLE-katalysierten Hydrolyse des korrespondierenden Esters rac-23 wurdeeine isoenzymangereicherte Fraktion der Schweineleber-Esterase (Chirazyme E1)mit großem Erfolg eingesetzt. Dies Enzympräparation führte zu einer Erhöhung derAktivität und Selektivität im Vergleich zu der kompletten Isoenzymmischung (PLE).Daraufhin wurde rac-14 auch in die Chirazyme E1-katalysierte Transacylierung mitVinylpropionat in Toluol eingesetzt (Tabelle 2.65). Nach 48 Stunden konnte einminimaler Umsatz beobachtet werden, der allerdings hochselektiv verlief.Tabelle 2.65: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (33 U/ml; 5 Äquiv. Vinylpropionat in Toluol)Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 47.75 h 2% ≥98 % 3% -Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß die Enzym-katalysierteTransacylierung des Alkohols rac-14 eine effiziente Methode zur Darstellung dereinzelnen Enantiomere darstellt. In Novozym 435 katalysierten Reaktionen wird in

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 153der Regel eine hohe Aktivität des Enzyms CAL-B beobachtet, so daß dieReaktionszeiten denen der Hydrolyse im wäßrigen Milieu entsprechen. Die mit dieserEnzympräparation erzielten Selektivitäten sind sehr hoch. Somit ist die enzymatischeTransacylierung durchaus geeignet, die Bereitstellung enantiomerenreinerVerbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.So konnte beispielsweise die GRÜNENTHAL GmbH eine kinetische Racematspaltungeines neuen Tramadol-Analogons (rac-52 in Abb. 2.70) aufbauend auf den imRahmen dieser Arbeit erreichten Ergebnissen erzielen. Das in Abb. 2.70 dargestellteNaphtyl-Derivat zu rac-14 ist im wäßrigen Milieu in Form eines Buttersäureestersunlöslich und es konnte keine PLE-katalysierte Hydrolyse beobachtet werden. Imorganischen Medium konnte allerdings unter den vorgestelltenReaktionsbedingungen eine effiziente CAL-B-katalysierte Racematspaltung zurDarstellung des gewünschten (+)-Enantiomers erreicht werden.184 Me2N OH OMe R O OH O CAL-B (−)-Ester OMeHO Vinylester organisches + Me2N OH Lösungsmittel OMe rac-52 RT HO Me2N (+)-52Abb. 2.70: Durch die GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte CAL-B-katalysierte Trans- acylierung von rac-52, eines Naphtyl-Derivats zu rac-14.

154 THEORETISCHER TEIL2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer HydroxylfunktionenTertiäre Alkohole und deren Ester sind wahrscheinlich aufgrund von sterischenHinderungen im allgemeinen keine Substrate für Hydrolasen-katalysierteRacematspaltungen. Bis heute sind nur einige wenige Beispiele für Hydrolasen-katalysierte Umsetzungen dieser Substrate bekannt.134,238,239,240O´HAGEN et al. konnten 1992 zeigen, daß aktivierte Ester tertiärer Alkohole, die eineAcetylengruppe am stereogenen Zentrum enthalten, von der Candida rugosa Lipaseakzeptiert und mit mittleren Selektivitäten hydrolysiert werden. Erklärt wurde diesdadurch, daß die Acetylengruppe in der Lage ist die Bindungsstelle desWasserstoffs, im Falle von sekundären Alkoholen, zu belegen.238 Daß dieSchweineleber-Esterase ebenfalls Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppeam stereogenen Zentrum tragen, mit hoher Selektivität hydrolysiert, zeigten COOPE etal. am Beispiel eines tertiären Buttersäureesters des Quinuclidinols unter Zusatz vonMethanol als Cosolvens.134 KONIGSBERGER et al. erweiterten diese Substratgruppeum aktivierte Ester von Trifluormetlyl-substituierten Cyanhydrinen, die mit sehr gutenSelektivitäten von der CRL umgesetzt wurden.239Um die vom Enzym anzugreifende Estergruppe möglichst nah an denChiralitätszentren zu lokalisieren und so eine möglichst große Enantiomer-Differenzierung des Enzyms zu erhalten, wurde in eigenen Vorarbeiten Ester rac-43unter Einbezug der tertiären Hydroxylgruppe synthetisiert. Der Ester rac-43 wurdeanschließend zwei PLE-katalysierten Hydrolysen mit tert-Butanol und Methanol alsCosolvens unterworfen, die aber nur jeweils 3 % Hydrolyseprodukt nach 100 h bzw.26 h ergaben (Abb. 2.71).80

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 155 O Pr O O OMe Pr O PLE Me2N OMe 43 Phosphatpuffer- Lösung (pH 8.0) + Me2N OH 10 % Cosolvens OMe rac-43 RT Me2N 7Abb. 2.71: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-43.Diese Ergebnisse legen nahe, daß Ester der tertiären Hydroxylgruppe vom Tramadolkeine Substrate für das Enzym PLE sind, da sie sterisch sehr anspruchsvoll undelektronisch nicht aktiviert sind.2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexylester (rac-25)In Vorversuchen zur Darstellung des (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) zeigte sich, daß dieReaktivität der tertiären Hydroxylgruppe ausgesprochen hoch ist. Eine Veresterungder tertiären Hydroxylgruppe gelang durch Reaktion von Buttersäureanhydrid mitPyridin in Dichlormethan bei Raumtemperatur in quantitativer Ausbeute. Da unterdiesen Reaktionsbedingungen auch die sekundäre Hydroxylgruppe acyliert wird,kann nach Aufarbeitung der Diester rac-25 erhalten werden. Aufgrund des einfachenZugangs zu dieser Verbindung, wurde untersucht, ob sie gegebenenfalls ein Substratfür eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Da sich anhand des Esters rac-19 gezeigthatte, daß keine enzymatische Hydrolyse der sekundären Estergruppe möglich ist,bietet der Diester rac-25 die Möglichkeit einer enzymatischen Hydrolyse der tertiärenEstergruppe (Abb. 2.72).

156 THEORETISCHER TEIL O O Pr O O Pr O O OMe Pr O O Pr Enzym Me2N OMe 25 Phosphatpuffer- Me2N Lösung + 10 % Cosolvens rac-25 O RT Pr O OH OMe Me2N 19Abb. 2.72: Versuch zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-25.Der Diester rac-25 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse im wäßrigenEinphasensystem eingesetzt. Als Enzym wurden die CE und die CRL unterVerwendung von 10 % tert-Butanol als Cosolvens und die PLE unter Verwendungvon 16 % Aceton eingesetzt (Tabelle 2.66). Die Enzyme CE und CRL wurdenaufgrund ihrer großen hydrophoben Taschen im aktiven Zentrum ausgewählt, diePLE wegen der von COOPE et al. erzielten Ergebnisse in der Hydrolyse einestertiären Buttersäureesters.Tabelle 2.66: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Enzym Reaktionsbedingungen Reaktionszeit UmsatzCholesterolesterase Phosphatpufferlösung, 25 h 0%(CE; 13.1 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-ButanolCandida rugosa Lipase Phosphatpufferlösung, 44 h 0%(CRL; 9.3 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-ButanolSchweineleber-Esterase Phosphatpufferlösung, 42 h 1%(PLE; 4.9 U/ml) pH 7.0; 16 % Aceton

ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 157Wie aber in Tabelle 2.66 zu ersehen ist, konnte mit allen drei Enzymen, unter denjeweiligen Bedingungen, keine Hydrolyse des Diesters rac-25 beobachtet werden. Inallen Reaktionen wurde die eingesetzte Menge Esters rac-25 nach Extraktionnahezu vollständig zurückerhalten werden. Ein Ergebnis, das nach den Resultaten inder Hydrolyse des Esters rac-43 und dem Kenntnisstand der Literatur erwartetwerden konnte.Der Diester rac-25 ist somit aufgrund von sterischen Hinderungen keine Substrat füreine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung. Im Umkehrschluß bedeutet dies aberauch, daß keine Enzym-katalysierte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe zuerwarten ist. Daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Transacylierung nicht interferiert,ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die hydroxysubstituierten Tramadol-Analoga direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können.Von FANG et al. ist, um der sterischen Hinderung von tertiären Alkoholen zubegegnen und sie so einer Enzym-katalysierten Reaktion leichter zugänglich zumachen, eine einfache Modifikation durchgeführt worden. Die tertiären Alkoholewurden zunächst in die entsprechenden ß-Alkoxy Alkohole überführt undanschließend deren primäre Alkoholfunktionalität von Lipasen mit zufriedenstellenderAktivität und mäßiger Selektivität acyliert (Abb. 2.73).241 Diese Modifikation könntezur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga eingesetzt werden, beidenen nur eine tertiäre Hydroxylgruppe für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion zurVerfügung steht. OH BSL oder O OH O O CRL oder O PPL Isopropenyl- acetat MTBE 33-78 % ee E = 2.5 - 9.4Abb. 2.73: Enzymatische Racematspaltung von modifizierten tertiären Alkoholen.

158 THEORETISCHER TEIL2.5 ZusammenfassungZiel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zur Enzym-katalysiertenkinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Unter Nutzung dieserMethoden sollten beide Enantiomere von neuen Molekülen auf Tramadol-Basisdargestellt werden.In Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von Tramadol (rac-7),konnte, den Erwartungen entsprechend, gezeigt werden, daß Verbindungen mitlediglich einer tertiären Hydroxylgruppe im allgemeinen keine Substrate für Enzym-katalysierte Reaktionen sind. Dies ist Voraussetzung dafür, daß Tramadol-Analogamit weiteren reaktiven Hydroxylgruppen im Molekül direkt in Enzym-katalysierteRacematspaltung eingesetzt werden können, ohne daß Nebenreaktionen an dertertiären Hydroxylgruppe zu erwarten sind.Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Enzym-katalysiertenRacematspaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe durch-geführt. In dieser Gruppe von Substraten konnte am Beispiel des O-Desmethyl-tramadols (rac-8) gezeigt werden, daß sich gute Ergebnisse in der Lipasen-katalysierten Hydrolyse erzielen lassen, die dazu geeignet sind die Enantiomeredieser Verbindung in einem präparativen Maßstab darzustellen. So konnte in derCRL-katalysierte Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-15) imwäßrig-organischen Zweiphasensystem das gebildete Phenol (−)-8 mit einemee-Wert von 90 % in 27 % Ausbeute isoliert werden (E = 34). Dies ist innerhalb derdurchgeführten Untersuchungen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racemat-spaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe die höchsteerzielte Selektivität. Offenkettige, phenolische Tramadol-Analoga, wie dasuntersuchte 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11),werden zwar als Substrate in der Enzym-katalysierten Hydrolyse akzeptiert, jedochsind die zu beobachtenden Selektivitäten so gering, daß keine geeignete Methodezur Trennung der Enantiomeren gefunden werden konnte. Die zu geringeEnantiomeren-Differenzierung tritt wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilitätdieser Moleküle gegenüber den cyclischen Verbindungen auf.

ZUSAMMENFASSUNG 159Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen zu Substraten aufTramadol-Basis mit phenolischer Hydroxylgruppe, daß die Enzym-katalysierteRacematspaltung hier prinzipiell einen Zugang zu den einzelnen Enantiomeren darzu stellen vermag. Dies ist insbesondere beachtlich, da viele analgetisch aktiveMoleküle über eine aromatische Hydroxylgruppe verfügen, sonst aber über keinefunktionelle Gruppe, die für eine Racematspaltung genutzt werden könnte.Als zweite Gruppe von Verbindungen wurden Tramadol-Analoga untersucht, die einezusätzliche sekundäre Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst tragen. Zu diesenVerbindungen gehören aktuelle, analgetisch aktive Entwicklungskandidaten derGRÜNENTHAL GmbH, wie z.B. das Hydrochlorid des enantiomerenreinen para-Fluorbenzylethers (+)-50.In Untersuchungen zu dem Cyclohexanol-Tramadol-Analogon (1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) konntegezeigt werden, daß dieses Substrat sowohl in der Hydrolyse als auch in derTransacylierung mit sehr hohen Selektivitäten in Enzym-katalysierten kinetischenRacematspaltungen umgesetzt werden kann. So konnte anhand der Enzym-katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-18) eine äußersteffiziente kinetische Racematspaltung demonstriert werden. Die CRL-katalysiertekinetische Racematspaltung dieses Esters verläuft mit einer nahezu perfektenSelektivität (E > 200) und mittels extraktiver Aufarbeitung können der Alkohol (−)-12und der nicht umgesetzte Ester (+)-18 in sehr hohen Ausbeuten erhalten werden. OH Me2N OH OMe OMe HO Me2N O OH HO (+)-12 PLE OMe CRL (−)-12 + Pr O O + Me2N OH Me2N OH OMe OMe rac-18 Pr O O O Me2NPr (−)-18 (+)-18Abb. 2.74: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-18 zur Darstellung beider Enantiomere.

160 THEORETISCHER TEILEinen einfachen Zugang zu dem enantiomeren Alkohol (+)-12 ermöglicht die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (E = 89). Da das Enzym PLE eine zur CRLentgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt, wird der Alkohol (+)-12 erhalten werden(Abb. 2.74). Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beiderenantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.Auch in der alternativen enzymatischen Reaktionsführung im organischen Medium,der Lipasen-katalysierten Acylierung, verläuft die CRL-katalysierten Transacylierungdes Alkohols rac-12 mit überaus hoher Selektivität (E = 120). Die erzieltenErgebnisse zeigen, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischenMedium des Alkohols rac-12 eine interessante Alternative, auch in einem präparativeMaßstab, zur Hydrolyse im wäßrigen Medium darzustellen in der Lage ist. OH OH Me2N OMe OMePr O Pr O Me2N O (−)-22 O (+)-22 OH PLE OMe CRL + + Pr O CE Me2N OH OH Me2N O OMe OMe rac-22 HO HO Me2N (+)-14 (−)-14Abb. 2.75: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-22 zur Darstellung beider Enantiomere.Auch im Fall der zum rac-12 epimeren Verbindung (1RS,2RS,4SR)-2-Dimethyl-aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) konnte gezeigtwerden, daß dieses Cyclohexanol-Tramadol-Analoga hochselektiven enzymatischenRacematspaltungen zugänglich ist. Es konnte demonstriert werden, daß wie im Falleder Verbindung rac-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse (Chirazyme E1, E = 85) miteiner zur CRL (E = 34) und CE (E = 89) entgegengesetzten Enantiopräferenz verläuft(Abb. 2.75). Die gezielte Darstellung beider Enantiomere durch eine geeignete Wahldes Enzym ist ebenfalls bei diesem Substrat möglich.In der enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-14 konnte gezeigt werden,daß mit einer immobilisierten CAL-B als Katalysator außerordentlich guteErgebnisse erzielt werden (E > 200). Die CAL-B zeigt in der Regel bei

ZUSAMMENFASSUNG 161ausgezeichneter Selektivität eine so hohe Aktivität, daß Reaktionszeiten im Bereichvon enzymatischen Hydrolysen erreicht werden. Somit ist die Enzym-katalysierteTransacylierung von rac-14 dazu geeignet ist, die Bereitstellung enantiomerenreinerVerbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.Insgesamt konnte gezeigt werden, daß sich mit Ausnahme des 1,3-diaxialsubstituierten 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols(rac-13) Cyclohexanol-Tramadol-Analoga nahezu ideal in der Enzym-katalysiertenRacematspaltung verhalten. Bei der Verbindung 13 sind wahrscheinlich sterischeHinderungen des Moleküls für die nicht Reaktivität verantwortlich, die aber alsspezielle Ausnahme dieser Verbindung zu betrachten sind. Die Enzym-katalysierteHydrolyse von Cyclohexanol-Tramadol-Analoga stellt ein effizientes Verfahren zurSynthese enantiomerenreiner Verbindungen dar. Bei diesem Verfahren konnte eineeinfache und effiziente Aufarbeitung durch Extraktion von Ester und Alkohol beiverschiedenen pH-Werten etabliert werden. Es wurde aufgezeigt, daß beideEnantiomere der gewünschten Verbindung je nach Wahl des geeigneten Enzymsdurch Enzym-katalysierte Racematspaltung dargestellt werden können.Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen konnten verschiedeneMöglichkeiten zu der Optimierung Enzym-katalysierter Racematspaltungen vonTramadol-Analoga aufgezeigt werden:• Zur Steigerung der Substratkonzentration von Tramadol-Analoga im wässrigen Medium ist es gelungen statt der freien Basen deren Hydrochloride, die eine wesentlich höhere Löslichkeit haben, als Substrate einzusetzen.• Durch die Wahl der Butyratgruppe als Acylrest kann in enzymatischen Hydrolysen ein geeignetes Substrat geschaffen werden, welches sowohl von Lipasen als auch Esterasen mit guter Selektivität umgesetzt wird.• Anhand der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga konnte gezeigt werden, daß bei in einem Wechsel vom wässrigen Einphasensystem zum wässrig- organischen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium eine Steigerung der Selektivität von Lipasen-katalysierten Reaktionen möglich ist.

162 THEORETISCHER TEIL• Als eine einfache, effiziente und ökonomische Methode zur Aufarbeitung von enzymatischen Hydrolysen konnte die Extraktion von Ester und Alkohol bei verschiedenen pH-Werten etabliert werden, wodurch auf aufwendige chromatographische Trennverfahren verzichtet werden kann.• In der Enzym-katalysierten Transacylierung konnte durch die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel, welches kein Acetaldehyd bildet, eine Steigerung der Aktivität und Selektivität gegenüber konventionellen Vinylestern beobachtet werden.• Es konnte gezeigt werden, daß im besonderen die Enzyme PLE, CRL und CAL-B zu einer kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga geeignet sind. Sie zeigen eine hohe Aktivität und Selektivität. Zudem sind diese Enzyme gut untersucht und über einen größeren Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar.Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß sich verschiedeneTramadol-Analoga als gute Substrate für Enzym-katalysierte kinetische Racemat-spaltungen eignen. Im allgemeinen können sowohl in der Hydrolyse als auch in derTransacylierung gute Aktivitäten der Enzyme bei genügender Selektivität beobachtetwerden. Es konnte daher in dieser Arbeit gelingen, die Enzym-katalysiertenkinetischen Racematspaltungen als Methode zur Darstellung einzelner Enantiomerevon verschiedenartigen neuen Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab zuetablieren. Beachtenswert ist hierbei, daß die vom Enzym anzugreifendeHydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereozentren der Verbindungen entferntlokalisiert ist.

AUSBLICK 1632.6 AusblickAufbauend auf den zur Hydrolyse und Transacylierung von Tramadol-Analogaentwickelten Verfahren und gesammelten Erfahrungen, sollten weitere synthetischwertvolle Substrate gesucht werden, die mit anderen Methoden nur schwerenantiomerenrein zugänglich sind. Hier bieten sich biologisch aktive Moleküle an, dieneben einer aromatischen Hydroxylgruppe über keine weiteren funktionellenGruppen verfügen, die für eine Racematspaltung genutzt werden können.Im besonderen bieten sich hier weitere Tramadol-Analoga an, die statt über einesekundäre Hydroxylgruppe über eine Aminogruppe im Cyclohexylring verfügen.Hinweise auf eine analgetische Aktivität dieser Gruppe von Verbindungen sindebenfalls vorhanden (Abb. 2.76).184 OH OH OMe OMe H2N H2N Me2N Me2NAbb. 2.76: Neue interessante Tramadol-Analoga mit zusätzlicher Aminogruppe.Aus Arbeiten von GOTOR et al. geht hierzu hervor, daß es allgemein möglich ist,Amine als Substrate in CAL-B-katalysierten Transacylierungen hochselektiv zuacylieren.242 Auch N-selektive Lipasen-katalysierte Acylierungen von cyclischenAminoalkoholen sind ebenfalls von GOTOR et al. beschrieben worden.243Unter dem Gesichtspunkt der Etablierung eines präparativen Verfahrens zur Enzym-katalysierten Transacylierung im organischen Medium, nicht nur von Tramadol-Analoga, wäre die Entwicklung einer Methode zur Aufarbeitung der Reaktion, welcheauf chromatographische oder destillative Trennschritte verzichtet, von großemVorteil.

3 Experimenteller Teil

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 1653.1 Allgemeine Vorbemerkungen3.1.1 Eingesetzte ComputerprogrammeVisualisierung von E-Werten„Enantiomeric Ratio“ Copyright © 1994, 1995: K. Faber, H. Hönig, TechnicalUniversity of Graz.Konvertierung in das Portable Document Format (PDF)„Adobe Acrobat“ Copyright © 1987 - 1999: Adobe Systems Inc.Chemische Strukturen„ChemDraw“ Copyright © 1985 - 2000: CambridgeSoft, Cambridge.3.1.2 Analytische Methoden und GeräteGaschromatographie (GC)Umsatz- und Reinheitsbestimmungen wurden mit Kapillar-GC-Geräten von VARIAN(Varian 3800 mit 2 Split/Splitness-Injektionssystem), CHROMPACK (CP 9000) undCARLO ERBA (Mega 5360) durchgeführt. Die Peakdetektion erfolgte über einenFlammenionisationsdetektor (FID) bei einer Detektionstemperatur von 330 ºC. Eswurden folgende Bedingungen gewählt:CP-Sil-8Säulenspezifikation: 95 % Methylpolysiloxan, 5 % PhenylpolysiloxanSäulenlänge: 30 mInnerer Säulendurchmesser: 0.32 mmFilmdicke: 0.25 µmTrägergas und -druck: H2, 75 kPa (Varian 3800) bzw. 100 kPa (Mega 5360)

166 EXPERIMENTELLER TEILEs wurden dabei folgende Standardprogramme bei einer Injektionstemperatur von250 ºC verwendet: 100 ºC (5 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.; 5 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.;S1 15 Min.) 50 ºC (5 Min.) → 150 ºC (30 ºC/Min.; 2 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.;S2 2 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.; 15 Min.)Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Werte wurden unter Annahme einesFehlerbereichs von 0.5 % auf ganze Zahlen gerundet. Abgeleitete Größen wurdenmit den Originaldaten berechnet.Gaschromatographische Bestimmungen der Enantiomerenüberschüsse erfolgtedurch vorherige Trennung an folgenden chiralen stationären Phasen: CP-Chirasil-Dex-CB (CHROMPACK) Säulenspezifikation: Permethyl-β-Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.25 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPa Lipodex-γ-6-Me (MACHEREY-NAGEL) Säulenspezifikation: 2,3-O-Dipentyl-6-O-methyl-γ-Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.15 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 167 Lipodex-E (MACHEREY-NAGEL) Säulenspezifikation: Octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl)-γ- Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.15 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPaMassenspektroskopie (MS)Gerät: Varian MAT 212 S, Erfassung mit Varian MAT SS 200. Falls nicht andersvermerkt, wurde als Standardbedingung Elektronenionisation (EI, 70 eV) oderchemische Ionisation (CI, Methan, 100 eV) verwendet. Die Angabe von Massen derFragmentionen (m/z) erfolgte als dimensionslose Zahl. Es wurden nur Signale mithoher Intensität oder besonders charakteristische Signale aufgeführt.GC-MS-AnalysenGeräte: Gaschromatograph: Varian Modell 3700, Massenspektrometer: Varian MAT112 S. Ionisation: 70 eV (EI) oder MeOH, 40 eV (CI).Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)Geräte zur analytischen HPLC: Millipore Waters 600E Systemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; RI-Detektion mit einem Waters 410 Differential Refraktometer; Waters 510 Pumpen;RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm).Geräte zur präparativen HPLC: Merck Novaprep 200; UV-Detektion (λ = 273 nm);RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,Filmdicke 10 µm) und eine VARIAN Anlage mit UV-Detektion (λ = 273 nm); RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,Filmdicke 10 µm) oder RP-Select B-LiChrosor b® der Firma MERCK (Säulenlänge250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 7 µm).Geräte zur analytischen HPLC an chiraler stationärer Phase: Millipore Waters 600 ESystemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996Photodiode Array Detektor; Waters 510 Pumpen; Chiralcel OD-Vorsäule; Chiralcel

168 EXPERIMENTELLER TEILOD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel) und Millipore Waters 600 ESystemcontroller; UV-Detektion (λ = 273 und 254 nm) mit einem Waters Lamda-Max481; Chiralcel OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm,Innendurchmesser 46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel).NMR-SpektroskopieGeräte: Varian VXR 300 (300 MHz, 75 MHz), Varian Gemini 300 (300 MHz,75. MHz), Varian Inova 400 (400 MHz, 100 MHz), Varian Unity (500 MHz, 125. MHz).Alle Spektren wurden bei 20 ºC aufgenommen. Als interner Standard dienteTetramethylsilan (TMS). Chemische Verschiebungen δ wurden in ppm bezogen aufTMS (δ = 0.00 ppm) und Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Aufspaltungs-muster wurden generell nach erster Ordnung interpretiert, wobei folgendeAbkürzungen zur Beschreibung benutzt wurden: s = Singulett; d = Dublett; t =Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; dm = Multiplett eines Dubletts; tm = Multipletteines Tripletts; br = breit. 13Die C-NMR-Spektren sind 1H-breitband-entkoppelt. Die Substitutionsmuster der13 C-NMR-Signale wurden den J-modulierten Spinecho-Spektren (APT) und mit u = C,CH2 und d = CH, CH3 angegeben. Zur genauen Zuordnung wurden HETCOR-Spektren gemessen.FT-Infrarotspektroskopie (IR)Gerät: Perkin-Elmer FTIR 1760 S.Die Proben wurden als KBr-Presslinge (KBr) oder als kapillare Filme (kapillar)präpariert. Die Spektren wurden im Bereich von 4000 – 700 cm-1 aufgenommen. DieLage der Absorptionsbanden (∼ wurde in cm-1 angegeben; bei der Charakterisierung ν)wurden nur Banden mit Intensität >40 % aufgelistet, wobei die Abkürzungen s (stark,Absorption >80 %), m (mittelstark, Absorption 60 – 80 %) und w (schwach,Absorption 40 – 60 %) verwendet wurden.ElementaranalyseGerät: Heraeus CHNO-Rapid. Eine Substanzprobe wurde für ∆C,H,N <0.4 % alsauthentisch betrachtet.

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169PolarimetrieGerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und589.6 nm). Die Angabe der spezifischen Drehung [α ] 20 erfolgte in (grd⋅dm3)/(dm⋅g), Ddie Angabe der Konzentration c in (g/dm3).AutotitratorGerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modusmit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben.UltrafiltrationGerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30(Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE.GefriertrocknungGerät: Christ Alpha 2-4.SchmelzpunkteGerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20.Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben.SiedepunkteDie Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben.DünnschichtchromatographieEs wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdickevon 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung beiλ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz.H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an-schließendem Erhitzen.Präparative SäulenchromatographieEs wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.

170 EXPERIMENTELLER TEIL3.1.3 Lösungsmittel und ReagenzienDie verwendeten Lösungsmittel wurden mit den laborüblichen Methoden getrocknetund absolutiert. Die Reagenzien wurden, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, inhandelsüblicher Qualität ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Diisobutyl-aluminiumhydrid wurde von der SCHERING AG zur Verfügung gestellt, der ich andieser Stelle ebenfalls für die Unterstützung dieser Arbeit danken möchte.MethanolDie Trocknung erfolgte, indem Methanol mit Magnesium-Spänen zur Reaktiongebracht und anschließend destilliert wurde.DiisopropyletherDie Entfernung von Peroxiden aus Diisopropylether sowie dessen Vortrocknungwurde durch Säulenfiltration über basischem Aluminiumoxid erreicht. Dies erfolgtevor jedem Gebrauch, zusätzlich wurde vor jedem Gebrauch und insbesondere vorjedem Einengen mit essigsaurer Kaliumiodidlösung auf Peroxide getestet.eTransacylierungsreagenzienEssigsäure-vinylester (Vinylacetat), Essigsäure-isopropenylester (Isopropenylacetat)und Propionsäure-vinylester (Vinylpropionat) wurden über NaCO3 destilliert, umSpuren von Säure zu entfernen, bevor sie in die Enzym-katalysierte Transacylierungeingesetzt wurden.3.1.4 Verwendete ProteinePferdeleber-Esterase (HLE, EC 3.1.1.1) SIGMA; Aktivität: 0.74 U/mg Lyophilisat (Buttersäureethylester, pH 8.0, 25 ºC).Schweineleber-Esterase (PLE, EC 3.1.1.1) a) BOEHRINGER MANNHEIM; 30 mg Enzym in 3 ml 3 M (NH4)2SO4, pH 6. Aktivität >120 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).e Autorenkollektiv, Organikum, 17. Aufl., VEB-Verlag Berlin 1988.

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 171 b) ROCHE DIAGNOSTICS; 306 mg Enzym in 30.6 ml3 M (NH4)2SO4, pH 6. Aktivität 130 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC). c) ROCHE DIAGNOSTICS; Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE, Fraktion 1). Aktivität: 33.0 U/m g Lyophilisat (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).Burkholderia cepacia Lipase (BCL, EC 3.1.1.3)wurde bezogen als Pseudomonas cepacia Lipase (PCL): a) FLUKA; Aktivität: 40 U/mg (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). b) SIGMA; Aktivität: 0.09 U/mg (Glycerin-triester, pH 7.0; 37 ºC).Candida antarctica Lipase (CAL-B, EC 3.1.1.3) a) BOERINGER MANNHEIM; Chirazyme L-2 (lyophilisierte CAL, Typ B, CAL-B). Aktivität: 1.0 MU/6.452 g Lyophilisat (100 mM Glycerin-tributyrat, pH 7.0, 25 ºC). b) NOVO NORDISK; Novozym 435 (immobilisierte CAL, Typ B, CAL-B). Aktivität: ca. 7 U/mg (Veresterung 1-Propanol mit n-Dodecansäure, 60 ºC) Diese Lipase wurde mittels rekombinater DNA-Technik in dem Wirt-Organismus Aspergillus oryzae produziert und anschließend auf einem makroporösen Acrylharz immobilisiert.126 Novozym 435 wurde freundlicherweise von NOVO NORDISK zur Verfügung gestellt. c) FLUKA; Aktivität: 3.2 U/mg (CAL) Lyophilisat; bezogen als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits.Candida rugosa Lipase (CRL, EC 3.1.1.3)wurde bezogen als Candida cylindracea Lipase (CCL): FLUKA; Aktivität: 37 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). FLUKA; Aktivität: 25.9 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). FLUKA; Aktivität: 2.4 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC); bezogen als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits.Cholesterolesterase (CE, EC 3.1.1.13) BOERINGER MANNHEIM; aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea). Aktivität: 52 KU/2.96 g Lyophilisat (Cholesterol oleate, 25 ºC).Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, EC 3.1.1.3) SIGMA; Aktivität: 3.58 U/mg Lyophilisat (Olivenöl, pH 7.7; 37 ºC).Porcine pancreatic Lipase (PPL, EC 3.1.1.3)wurde bezogen als Lipase aus hog pancreas: FLUKA; Aktivität: 16.8 U/mg (Olivenöl, pH 8.0; 37 ºC).

172 EXPERIMENTELLER TEILAcetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) SIGMA; Typ V-S aus Electrophorus electricus (electric eel); Aktivität: 970 U/mg (Acetylchlolin, pH 8, 37 ºC).Aus einem Lipasen-Screening Grundkit (FLUKA) wurden eingesetzt: - Rhizomucor miehei bezogen als Mucor miehei Lipase (EC 3.1.1.3; 1.3 U/mg) - Rhizopus arrhizus Lipase (EC 3.1.1.3; 2 U/g) - Rhizopus niveus Lipase (EC 3.1.1.3; 2.6 U/g) - Aspergillus niger Lipase (EC 3.1.1.3; 1 U/mg)Das Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (1.5 % Proteingehalt) wurdefreundlicherweise von Herrn Dr. V. Jadhav zur Verfügung gestellt. Dieser Katalysatorwurde wie in Kap. 3.2.1 auf S. 174 beschrieben aus 6 ml (60 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 180 U/mg), 2 g MPEG5000 und 2 g BSA durch Gefriertrocknunghergestellt.83 Die spezifische Aktivität dieses Colyophilisats betrug2.22 U/mg Colyophilisat oder 148 U/mg PLE (Aktivitätsbestimmung nach Kap. 3.2.2,S. 174).Bei der Einordnung der Lipasen ergeben sich einige taxonomische Besonderheiten.Mehrere Lipasen wurden nach Klonierung und Sequenzierung neu identifiziert undklassifiziert. So wurde 1992 die Candida cylindracea Lipase neu zur Candida rugosaLipase, 1995 die Pseudomonas cepacia Lipase neu zur Burkholderia cepacia Lipaseund die Mucor miehei Lipase neu zur Rhizomucor miehei Lipase klassifiziert.6,101Zudem ergab die Klonierung und Sequenzierung der Lipasen aus Rhizopus arrhizusund Rhizopus niveus eine nahezu 100% Identität dieser Enzyme.101 Einunterschiedliches Substratspektrum dieser Enzyme ist somit nicht zu erwarten.Um eine einheitliche Nomenklatur zu Verwenden, werden die Enzymedementsprechend in dieser Arbeit durchgehend nach ihrer aktuellen Klassifizierungbenannt und nicht ungedingt so, wie sie bezogen wurden.Des weiteren werden in dieser Arbeit auch einige von Herstellern eingeführteEigennamen von Proteinen verwendet, um bestimmte Eigenschaften dieserEnzympräparationen zu verdeutlichen. So wird im folgenden der BegriffChirazyme E1 statt PLE verwendet, um zu zeigen, daß es sich um lyophilisierte PLEder Fraktion 1 handelt. Ebenso soll der verwendete Begriff Novozym 435

ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 173verdeutlichen, daß es sich um eine immobilisierte Candida antarctica Lipase desTyps B handelt.Aktivitätsangaben verschiedener Proteine in dieser Arbeit beziehen sich auf die vomHersteller angegebenen Methode der Aktivitätsbestimmung. Aktivitätsbestimmungenmit Tramadolderivaten als Substrat wurden nicht durchgeführt.Alle Proteine wurden für nicht länger als 6 Monate bei 2 ºC gelagert.3.1.5 Besondere ArbeitstechnikenAlle Reaktionen mit feuchtigkeits- oder luftempfindlichen Reagenzien wurden inausgeheizten Schlenkkolben unter Argon-Schutzgasatmosphäre mittels Spritzen-technik durchgeführt.Ester von Tramadol-Analoga sind im allgemeinen nicht im wäßrigenEinphasensystemen löslich und neigen dazu an Glasflächen Kolloide zu bilden. AlleSubstrate der Enzym-katalysierten Hydrolysen wurden daher vorher in demjeweiligen Cosolvens gelöst und dann langsam zur Phosphatpuffer-Lösung gegeben.Nach anfänglicher Trübung während der Zugabe entstanden klare, homogeneLösungen. Aufgrund der Dimethylaminomethyl-Seitenkette reagieren alleeingesetzten Substrate schwach basisch, so daß sich während der Zugabe desSubstrats zur Phosphatpuffer-Lösung der pH-Wert änderte. Es wurde daher vorZugabe des Enzyms der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure wieder aufden gewünschten Wert eingestellt.Enzym-katalysierte Transacylierungen wurden in unbehandelten Schnapp-deckelgläschen durchgeführt, da diese durch ihre günstigenOberflächeneigenschaften nicht zu einem Festkleben des Enzyms an derGlasoberfläche führten. Mit Wasser gesättigte Lösungsmittel wurden bei 20 ºC mitdest. Wasser gesättigt. Proben zur Reaktionskontrolle wurden zur Trocknung und zurAbtrennung von Proteinen über eine mit NaSO4 und Celite gefüllte Pasteurpipettefiltriert.

174 EXPERIMENTELLER TEIL3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE84,853 ml PLE/(NH4)2SO4-Suspension (entspricht 30 mg natives Protein) wurden durchUltrafiltration unter Eiskühlung durch eine PM 30-Membran (Ausschlußgrenze:>30 kDa) mit 1 L dest. Wasser unter 1.0 bar N2-Überdruck entsalzt. Der Rückstandwurde mit ca. 250 ml dest. Wasser aufgenommen. Die leicht getrübte Suspensionwurde unter Rühren mit 1000 mg MPEG5000 versetzt, für 3 h gerührt, in flüssigemStickstoff gefroren und für 60 h bei Raumtemperatur im Hochvakuum (0.01 mbar,RT) lyophilisiert. Das so gefriergetrocknete Colyophilisat aus MPEG/PLE (3 %Proteingehalt) wurde als weißer, flockiger Feststoff mit einer Ausbeute von 100 %erhalten.3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE86 O O PLE + O Rt, pH 8 OH OHAbb. 3.1: Enzymatische Verseifung von Buttersäureethylester.90 ml Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 8.00) wurden mit 3 ml Buttersäureethylester(22.7 mmol) versetzt und heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion entstand. DieMischung wurde auf pH 8.00 eingestellt. Nach Zugabe von ca. 1 mg Enzym(entspricht 100 µl PLE/(NH4)2SO4-Suspension oder 34 mg MPEG/PLE; ca. 100 -200 U) wurde der pH-Wert durch einen Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstantgehalten und der Verbrauch an NaOH-Lösung über 2 Stunden verfolgt. Anhand desVerbrauchs an 1 N NaOH-Lösung ließ sich die Enzymaktivität bestimmen (ZurProgrammierung des Autotitrators siehe Kap. 3.7.1, S. 271). Hierzu wurde derVerbrauch an NaOH-Lösung gegen die Zeit aufgetragen und der Verbrauch proMinute anhand von zwei Meßpunkten im linearen Bereich des Diagramms bestimmt.

DARSTELLUNG UND ANALYTIK DER MPEG/PLE PRÄPARATIONEN 175Die Enzymaktivität ist definiert als:Formel 3.1: 1 U = 1 µmol hydrolysierter Buttersäureethylester/(Min⋅mg Protein)Die Proteinmenge wurde im Falle der MPEG/PLE direkt eingewogen, im Falle derPLE/(NH4)2SO4-Suspension mit einer Eppendorf-Pipette (Genauigkeit: 100 µl±0.8 %) abgemessen.Tabelle 3.1: Standardaktivität verschiedener Enzympräparationen Enzympräparation Standardaktivität PLE/(NH4)2SO4-Suspension 120 – 180 U Colyophilisat MPEG/PLE 110 – 150 U/mg PLE Colyophilisat PLE/BSA/MPEG 148 U/mg PLE Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE) 26 – 30 U

176 EXPERIMENTELLER TEIL3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1)91Zur Freisetzung der Base aus ihrem Hydrochlorid wurde dieses in einer Emulsionaus Wasser (0.5 ml/mmol) und Dichlormethan (0.4 ml/mmol) suspendiert. UnterRühren wurde langsam 40 %ige Natronlauge (0.13 bis 0.20 ml/mmol) zugetropft undfür ca. 30 Min. nachgerührt bis der gesamte Feststoff reagiert hatte. NachPhasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml/mmol)nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfatgetrocknet. Nach Einengen im Rotationsverdampfer wurde die freie Base in derRegel als farbloses, Sirup ähnliches Öl erhalten, das vorsichtig im Hochvakuum vonLösungsmittelresten befreit wurde. Alle freien Basen haben die Eigenschaft bei derEntfernung von Lösungsmittelresten unter vermindertem Druck stark zu schäumen,daher ist diese Operation mit besonderer Sorgfalt und gegebenenfalls unter gelindemErwärmen zur Erhöhung der Viskosität der Lösung durchzuführen.3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen244 (AAV 2)Zu einer Mischung von 1.2 Äq. Säureanhydrid und 0.1 Äq. Pyridin in Dichlormethanwurde unter Rühren das Phenol gegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 - 3 Tagebei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC-Kontrolle kein Edukt mehrdetektiert werden konnte, wurde die Reaktionsmischung über Nacht mitges. NaHCO3-Lösung gerührt, um überschüssiges Säureanhydrid zu hydrolysieren.Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Diethylether (2 ml/mmol) nachextrahiert.Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet, imRotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum von Lösungsmittelrestenbefreit.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1773.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3)Das Hydrochlorid oder die freie Base des sekundären Alkohols wurde in abs.Tetrahydrofuran oder Diethylether (3.15 ml/mmol) suspendiert. Anschließend wurdenbei der angegebenen Temperatur vorsichtig 2.5 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle desHydrochlorids oder 1.0 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle der freien Base zugegeben(exotherme Reaktion, gegebenenfalls Kühlen). Es entstand in allen Fällen eine klare,schwach gelbe bis dunkelgelbe Lösung. Danach wurde noch eine halbe Stundenachgerührt und anschließend unter Eiskühlung bei 5 ºC über einen Zeitraum von10 Min. 1.0 - 1.5 Äq. Säurechlorid in Tetrahydrofuran oder Diethylether(0.47 ml/mmol) zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wurde die Lösungnoch eine Stunde bei der angegeben Reaktionstemperatur gerührt und danach überNacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die hellgelbe Reaktionslösung miteinem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt, umüberschüssiges Säurechlorid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimalmit Dichlormethan (1.25 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischenPhasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampferwurde der Ester als farbloses bis gelbliches, sirupöses Öl erhalten, das imHochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde.3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den racemischen Basen (AAV 4)Die Base wird in einer Mischung aus trockenem Aceton (1.40 ml/mmol) und Ethanol(0.28 ml/mmol) gelöst. Anschließend wird zur Vermeidung von Nebenreaktionen, wieEliminierungen, schonend durch Zugabe von 1 Äq. Wasser und 1 Äq.Trimethylchlorsilan das Hydrochlorid ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuumgetrocknet.

178 EXPERIMENTELLER TEIL3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexanol (rac-7)Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethansuspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitungwurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-7: MW = 263.4 g⋅mol-1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.2 ppm (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H),17.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s,3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 -1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d](C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u](C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9[u] (C-4), 22.3 [u] (C-5). 13Die Zuordnung der C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdateneindeutig möglich.245

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1793.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenol (rac-8)91Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluolzugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklungkam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung aufRaumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eineInnentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min.nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml einesEthanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperaturvon 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mitca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperaturnachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf VolumenteilenEssigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden dievereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und amRotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g(18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einemSchmelzpunkt von 139 ºC bildete. OH 10 5 6 1 9 11 OH 3 7 4 2 14 N 12 13 8 rac-8: MW = 249.4 g⋅mol-1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.5 ppm (s, 1 H, 10-H), 7.2 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz,11 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 -1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d](C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u](C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2[u] (C-5).

180 EXPERIMENTELLER TEILMS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6).MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+,10).IR (KBr): ∼ = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s), ν1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w),988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1.C15H23NO2 (249.2 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 72.25 71.98 H 9.30 9.10 N 5.62 5.563.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2- dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden5.0 g (19.3 mmol) rac-11⋅HCl in 19 ml dest. Wasser und 2 ml Dichlormethansuspendiert und mit 10 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitungwurden 4.188 g (18.8 mmol, 97 %) rac-11 als farbloser Sirup erhalten, welcherfarblose, weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 98 ºC bildete. OH 8 1 7 9 4 OH 3 5 2 12 N 10 11 6 rac-11: MW = 223.3 g⋅mol-1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.3 – 8.1 (br s, 1 H, 9-OH), 7.21 (s, 1 H, 8-H), 7.06 (t,13J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J =2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1812.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65(d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H). C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d]13(C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u](C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93(10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62).IR (KBr): ∼ = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s), ν2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240(s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793(s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1.C13H21NO2 (223.3 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.92 69.73 H 9.48 9.56 N 6.27 6.233.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden3.293 g (10.4 mmol) rac-12⋅HCl in 5 ml dest. Wasser und 20 ml Dichlormethansuspendiert und mit ca. 3.0 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitungwurden 2.883 g (10.3 mmol, 99 %) rac-12 als farbloser, zäher Sirup erhalten, derunter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dortanschließend erstarrte. 2.273 g (8.1 mmol, 79 %) wurden so als farblose Kristalle miteinem Schmelzpunkt von 49 ºC gewonnen und 0.552 g (2.0 mmol, 19 %) alsfarbloser Sirup zurückbehalten.

182 EXPERIMENTELLER TEIL OH 5 10 6 1 9 11 HO O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-12: MW = 279.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 10-H), 7.01 (d,13J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m,1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz,3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13),117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7[u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4),26.3 [u] (C-3).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100).IR (in CHCl3): ∼ = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s), ν1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206(m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844(m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1.C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.44 H 9.02 9.38 N 5.01 4.93

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1833.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13)Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethansuspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitungwurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einemSchmelzpunkt von 106 ºC erhalten. OH OH 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-13: MW = 279.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.99 ppm (s, 1 H, 1-OH), 7.26 (t, 3J = 8 Hz, 1 H,113-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H,5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H,7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz,2J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz,6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d](C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d](C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6[u] (C-4), 21.8 [u] (C-3).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4).IR (KBr): ∼ = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s), ν1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246(s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m),971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.

184 EXPERIMENTELLER TEILC16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.65 H 9.02 9.25 N 5.01 4.933.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden1.802 g (5.7 mmol) rac-14⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethansuspendiert und mit ca. 0.9 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitungwurden 1.578 g (5.5 mmol, 99 %) rac-14 als farbloser, zäher Sirup erhalten, derunter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dortanschließend erstarrte. 1.300 g (4.7 mmol, 82 %) wurden so als farblose Kristalle miteinem Schmelzpunkt von 44 ºC gewonnen und 0.278 g (1 mmol, 17 %) als farblosessirupöses Öl zurückbehalten. OH 10 5 6 1 9 11 O HO 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-14: MW = 279.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.25 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.13 (s, 1 H,110-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81(s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz,3J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d](C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d](C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2[u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 185IR (KBr): ∼ = 3391 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2829 (s), 2781 (s), 1604 (s), 1584 (s), ν1483 (s), 1464 (s), 1431 8s), 1369 (w), 1287 (s), 1253 (s), 1167 (m), 1135 8w), 1074(m), 1041 (s), 990 (s), 960 (m), 853 (w), 828 (w), 782 (m), 703 (m) cm-1.MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 11), 234 (2), 135 (2), 58 (100), 45 (2).C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.82 H 9.02 8.81 N 5.01 4.993.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.00 g (8.0 mmol) rac-8 mit einerMischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridinin 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie(EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-15)= 0.31; Rf (rac-8) = 0.10) wurden2.401 g (7.5 mmol, 94 %) eines weiß-grauen kristallinen Feststoffs mit einemSchmelzpunkt von 54 ºC erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 16 18 O 15 7 17 4 3 2 14 N 12 O 13 8 rac-15: MW = 319.4 g⋅mol-1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 1 H, 13-H), 7.2 (s, 1 H, 10-H), 6.9 (m,12 H, 12-H, 14-H), 2.5 (t, 3J = 5 Hz, 2 H, 16-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H,

186 EXPERIMENTELLER TEIL7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H),1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H). C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u]13(C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u](C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9[u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 319 (M+, 9), 58 (100).IR (KBr): ∼ = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608 ν(m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s),1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1.C19H29NO3 (319.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 71.44 71.03 H 9.15 9.19 N 4.38 4.353.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 miteiner Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol)Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26;Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinenFeststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187 OH 10 5 6 1 9 11 O 15 16 7 4 3 2 14 N 12 O 13 8 rac-16: MW = 291.4 g⋅mol-1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 3 H, 13-H, 10-H, 12-H/14-H), 6.93 (m,11 H, 12-H/14-H), 5.8 – 6.4 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H,7´-H), 2.29 (s, 3 H, 16-H), 2.25 – 1.25 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u](C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u](C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8[u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8).IR (KBr): ∼ = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m), ν2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m),1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991(m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1.C17H25NO3 (291.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 70.07 69.91 H 8.65 8.13 N 4.81 4.713.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1- hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 miteiner Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol)Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und

188 EXPERIMENTELLER TEILSäulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1, 1 % Triethylamin über Kieselgel,Rf (rac-17)= 0.58) wurden 1.995 g (6.8 mmol, 85 %) eines farblosen Öls erhalten. OH 8 1 7 9 14 16 4 O 13 5 3 2 12 15 N 10 O 11 6 rac-17: MW = 293.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 (s, 1 H, Ar), 7.22 (s, 1 H, Ar), 7.15 (s, 1 H, Ar),16.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz,2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H,2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J= 7 Hz, 3 H, 3-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C-7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1),63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u](C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7).IR (kapillar): ∼ = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586 ν(m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m),838 (w), 704 (m) cm-1.C17H27NO3 (293.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.59 69.52 H 9.28 8.93 N 4.77 4.67

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1893.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g(10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium-tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol)Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 über Kieselgel,Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klarensirupösen Öls erhalten. O OH 18 10 5 6 1 9 11 19 16 O O 17 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-18: MW = 349.5 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.26 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.14 (s, 1 H,110-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H,5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m,18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u](C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u](C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1[d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d](C-19).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45(3).IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583 ν(m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),

190 EXPERIMENTELLER TEIL1186 (s), 1093 (m), 1048 (s), 1018 (m), 978 (m), 963 (m), 864 (w), 847 (w), 784 (m),756 (m) 704 (w) cm-1.C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.44 H 8.94 8.77 N 4.01 4.303.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei –10 ºC, dazu wurden 3.50 g (12.5 mmol)rac-13, gelöst in 102 ml abs. Diethylether und auf –10 ºC gekühlt, mit 1.408 g(12.5 mmol) Kalium-tert-butylat und 1.203 g (11.3 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in8 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.235 g eines gelben,öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropyl-ether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.29) wurden 1.904 g (5.4 mmol, 44 %)rac-19 als sirupöses Öl und 1.787 g einer Mischfraktion aus rac-13 (Rf = 0.16) undrac-19 erhalten. Nach erneuter Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =1 : 1 über Kieselgel) wurden weitere 0.593 g (1.7 mmol, 14 %) rac-19 und 0.582 gMischfraktion erhalten. O 18 19 16 O OH 17 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-19: MW = 349.5 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t,1 3 J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.12 (s,1 H,.10-H), 7.02 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 3 Hz, 1 H, 12-H),5.17 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.29 – 3.36 (m, 2 H, 17-H), 2.11 (s, 6 H, 8-H),2.08 – 1.63 (m, 11 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 18-H), 0.96 (t, 3J = 7.5 Hz, 3 H, 19-H).

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 191 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u]13(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u](C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0[d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d](C-19).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601 ν(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.35 H 8.94 9.08 N 4.01 4.303.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3- dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20)91Zu 1.790 g (6.4 mmol) rac-13, gelöst in 8 ml abs. Toluol, wurden beiRaumtemperatur 42 ml Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M, 42.0 mmol) in abs.Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer starkenGasentwicklung kam. Anschließend wurde die Reaktionslösung für 1 Stunde beiRaumtemperatur und danach für weitere 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. NachAbkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 5.0 ml Ethanol sozugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danachwurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden anschließend 10.0 mleines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eineInnentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Nach Filtration wurde die

192 EXPERIMENTELLER TEILorganische Phase über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer untervermindertem Druck eingeengt. Es wurden 1.653 g (5.6 mmol, 88 %) eines farblosenFeststoffs mit einem Schmelzpunkt von 74 ºC erhalten, welcher noch Spuren rac-13enthielt. Eine chromatographische Abtrennung dieser Verunreinigung war nichtmöglich, daher wurde im folgenden die in Spuren verunreinigte Substanz eingesetzt. OH OH 10 5 6 1 9 11 OH 3 7 4 2 14 N 12 13 8 rac-20: MW = 265.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (mt, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.1 – 6.8 (br s,11 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz,4J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45(m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d](C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d](C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3[u] (C-3).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601 ν(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1933.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)951.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 gNaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sicheine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml(6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegebenwurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zurVervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 mlDichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes,sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %)rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhaltenwerden. OH OH 10 5 6 1 9 11 16 18 O 15 3 7 17 4 2 14 N 12 O 13 8 rac-21: MW = 335.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.27 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.20 ( br s, 1 H, -1H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz,1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t,3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u](C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u](C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5[u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).

194 EXPERIMENTELLER TEILIR (KBr): ∼ = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m), ν1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221(m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874(m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1.3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g(8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium-tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol)Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39;Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Ölserhalten. OH 10 5 6 1 9 11 17 O 19 16 O 3 7 15 4 2 14 18 N 12 13 O 8 rac-22: MW = 349.5 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,110-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78(m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 –1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H,19-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u](C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u](C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4[u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d](C-19).

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 195MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 8), 135 (2), 58 (100), 45 (3).IR (kapillar): ∼ = 3077 (w), 2960 (s), 2873 (m), 2831 (m), 2783 (m) 1728 (s), 1601 ν(m), 1583 (m), 1483 (s), 1462 (s), 1432 8s), 1384 (m), 1356 (w), 1287 (s), 1254 (s),1184 (s), 1093 (m), 1047 (s), 1013 (s), 997 (s), 964 (w), 784 (m), 703 (m) cm-1.C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.68 H 8.94 9.01 N 4.01 4.433.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml abs. Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g(13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 1.090 g (8.1 mmol) Hexansäurechlorid,gelöst in 2.6 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.370 g einesgelben, zähflüssigen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie(Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.57; Rf (rac-14) = 0.19) undanschließender präparativer HPLC (EE : MeOH = 1 : 1 über RP-Säule 18) konnten1.562 g (4.1 mmol, 77 %) rac-23 als trübes, sirupöses Öl erhalten werden, welchesnach NMR- und GC-Analytik noch Spuren des Diesters der Hexansäure und rac-14enthielt. OH 10 5 6 1 9 11 21 19 17 O 16 O 3 7 15 4 2 14 20 18 N 12 13 O 8 rac-23: MW = 377.5 g⋅mol-1

196 EXPERIMENTELLER TEILH-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,110-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s,1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H,6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u](C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u](C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4[u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18),22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100).MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4).IR (kapillar): ∼ = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583 ν(m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s),1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m)cm-1.C22H35NO4 (377.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.99 70.15 H 9.34 9.49 N 3.71 3.61

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 1973.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol)Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 mlDiethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligenRohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblichöligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 undEssigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H)im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparativeHPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zurZersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nichtmöglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhalteneMischung eingesetzt. OH 10 5 6 1 9 11 O 17 16 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 O 8 rac-24: MW = 263.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H,110-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75(s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H,6-H, 7-H, 8-H, 17-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u](C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u](C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4[u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).

198 EXPERIMENTELLER TEIL3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4- dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25)Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydridgegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösunghierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden beiRaumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werdenkonnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einemÜberschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. NachPhasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Dievereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und überNaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches,Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde.Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten. O O 18 22 21 16 O O 20 23 19 17 1 10 5 6 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-25: MW = 419.6 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 6.76 (m, 3 H,110-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz,4J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz,2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H,22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u](C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d](C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 19944.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u](C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23).MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100),375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10),85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31).IR (kapillar): ∼ = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605 ν(m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s),1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w),778 (w), 700 (w) cm-1.Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur inTHF mit einer Ausbeute von 96 %.3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der enzymatischen Transacylierung3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol)Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30;Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Ölserhalten.

200 EXPERIMENTELLER TEIL O OH 5 10 6 1 9 11 16 O O 17 7 15 3 14 4 2 N 12 13 8 rac-47: MW = 321.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.06 (s, 1 H,110-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12(m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 –1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u](C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u](C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1[d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4).IR (kapillar): ∼ = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462 ν(m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1.3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36;Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwachgelblichen sirupösen Öls erhalten.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201 O OH 18 5 10 6 1 9 11 16 O O 17 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-46: MW = 335.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.07 (s, 1 H,110-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H,5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m,16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u](C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u](C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5[d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100).IR (kapillar): ∼ = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584 ν(m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m),1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1.3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)Die Synthese erfolgte, indem 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 mlDichlormethan, mit 2.3 ml (25 mmol) Vinylacetat und 500 mg Novozym 435 versetztund bei Raumtemperatur gerührt wurden. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei nichtzu hoch gewählt, um den immobilisierten Katalysator nicht zu beeinträchtigen. Nach96 h konnte kein Edukt 14 mehr detektiert werden. Die Reaktionslösung wurde vomKatalysator abfiltriert, mit 2 ml Dichlormethan versetzt und für weitere 15 h mit 5 mlges. NaHCO3-Lösung gerührt, um während der Reaktion entstandene Essigsäure zuneutralisieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan

202 EXPERIMENTELLER TEILnachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet.Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.080 g (0.25 mmol, 99 %)gelbliches Öl erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 O 17 16 O 3 7 15 4 2 14 N 12 O 8 13 rac-24: MW = 321.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.16 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.03 (s, 1 H,110-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m,17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u](C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u](C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0[u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58(100), 49 (16), 47 (16).IR (kapillar): ∼ = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584 ν(s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m),1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 2033.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45)Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g(0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung undSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33;Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwachgelblichen sirupösen Öls erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 17 O 16 O 3 7 15 4 2 14 18 N 12 O 8 13 rac-45: MW = 335.4 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,110-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17-H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u](C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u](C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4[u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18).MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7).IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584 ν(s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w),1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w),785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.

204 EXPERIMENTELLER TEIL3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]- nonan-3-on (rac-48)3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis- (trichlormethyl)-carbonat222,2461.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs.Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde übereinen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis-(trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen-technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabeiverfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff.Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperaturerwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und fürweitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 mlDichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Eskonnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt.Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10)konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisiertenZersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden.Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis.f S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.

DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 2053.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol223,247500 mg (1.8 mmol) rac-13 wurden in 15 ml abs. Toluol gelöst und mit 1.162 g(7.2 mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol versetzt. Die Reaktionslösung wurdeanschließend für 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und danach für weitere15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösungmit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 10 Stunden kräftig gerührt.Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Dievereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet und dasLösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. NachSäulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnten drei nicht nähercharakterisierte Fraktionen (66 mg (Rf = 0.75); 15 mg (Rf = 0.75 und Rf = 0.47);0.47 mg (Rf = 0.47)) erhalten werden und 138 mg einer Hauptfraktion (Rf = 0.30). Diespektroskopischen Daten dieser Fraktion lassen folgende Struktur vermuten: O 17 N N 16 O 1 10 5 6 9 11 19 18 O 4 3 15 2 12 14 13 49: MW = 298.3 g⋅mol-1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.05 ppm (s, 1 H, 17-H), 7.33 (t, J = 2 Hz, 1 H,1Ar/Im), 7.15 (t, J = 8 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.97 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.87 (dd, J = 8 Hz,J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.82 (t, J = 2 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.71 (dd, J = 8 Hz J = 3 Hz, 1 H,Ar/Im), 6.08 (m, 1 H, 2-H), 5.32 (m, 1 H, 5-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.82 (dm,J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.58 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.33 (m, 2 H, Cy), 1.96 (m, 2 H,Cy).(Ar: Proton am Arylring, Im: Proton am Imidazolring, Cy: Proton am Cyclohexylring)

206 EXPERIMENTELLER TEIL C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u]13(C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1[d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10),75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3).Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298(M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100).Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hierkonnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.

ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 2073.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen Substrat Ester (AAV 5)Der racemische Ester (ca. 0.1 bis 0.2 mmol) wurde in 1 ml (10 Vol%) desorganischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 9 ml wäßrigerPhosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Mischung wurde anschließend auf dengewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung fürmindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne Enzym gerührt. Im Anschlußwurde die Reaktionslösung mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet, amRotationsverdampfer eingeengt und dünnschicht- und gaschromatographischuntersucht.3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15Die Stabilität des Esters rac-15 gegen Autohydrolyse wurde bereits in eigenenVorarbeiten untersucht80.3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25Die Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25wurde in unabhängigen Versuchen nach AAV 5 überprüft. Dazu wurde die in Tabelle3.1 angegebene Menge Substrat in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und über die in Tabelle 3.1 angegebene Zeitbei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte nur der jeweilige Ester nachGC-Analytik nachgewiesen werden.

208 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.2: Überprüfung der Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 Substrat Substratmenge Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) rac-17 50 mg 24 h nein rac-18 50 mg 46 h nein rac-19 50 mg 65 h nein rac-22 50 mg 46 h nein rac-21 50 mg 24 h nein rac-25 50 mg 95 h nein3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23Die Hydrolysestabilität des Esters rac-23 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden50 mg (0.16 mmol) rac-23 in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt.Nach Aufarbeitung konnte keine Hydrolyse durch GC-Analytik nachgewiesenwerden.3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16Die Hydrolysestabilität des Esters rac-16 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurdenin zwei verschiedenen parallelen Ansätzen jeweils 50 mg (0.17 mmol) rac-16 in 1 mltert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung bei dem in Tabelle 3.3angegeben pH-Wert gelöst und über die in Tabelle 3.3 angegebene Zeit beiRaumtemperatur gerührt.

ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 209Tabelle 3.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität des Esters rac-16 bei verschiedenen pH-Werten pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-83.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden50 mg (0.16 mmol) rac-24 (enthält Diessigsäurester von rac-24) in 1.48 ml Aceton(16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vierTage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnten 40 mg einerMischung aus drei Komponenten erhalten werden: rac-14, rac-24 undDiessigsäurester von rac-24. Nach GC-Analytik wies die Mischung 2 % rac-14 auf.

210 EXPERIMENTELLER TEIL3.5 Bestimmung von Umsätzen und EnantiomerenverhältnissenDie Umsätze der enzymkatalysierten Reaktionen wurden gaschromatographisch(GC) oder flüssigchromatographisch an chiraler stationärer Phase (HPLC) ermittelt.Die ermittelten Umsätze werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. DieRetentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 3.4 und Tabelle 3.6 aufgeführt.Tabelle 3.4: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Analyse der Reaktionsmischung zur Umsatzbestimmung an achiraler Phase Temperatur- RetentionszeitenReaktionsmischung programm (Min.) rac-8, rac-15 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (15) = 11.8 rac-8, rac-16 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (16) = 10.9 rac-11, rac-17 S1 (CP9000) tR (11) = 9.4 tR (17) = 10.6 rac-12, rac-18 S1 (CP9000) tR (12) = 11.4 tR (18) = 12.8 rac-12, rac-18 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (18) = 14.6 rac-12, rac-47 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (47) = 13.1 rac-12, rac-46 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (46) = 13.8 rac-13, rac-19 S1 (Varian 3800) tR (13) = 12.3 tR (19) = 13.6 rac-20, rac-21 S1 (Varian 3800) tR (20) = 12.0 tR (21) = 13.0 rac-14, rac-22 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (22) = 14.5 rac-14, rac-23 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (23) = 16.2 rac-14, rac-24 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.4 tR (24) = 13.0 rac-14, rac-45 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.5 tR (45) = 13.8Die Enantiomerenverhältnisse wurden entweder gaschromatographisch oderflüssigchromatographisch an chiralen stationären Phasen ermittelt. Die ermitteltenee-Werte werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die Retentionszeiten der

BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 211einzelnen Enantiomere unter den jeweiligen Trennbedingungen sind in Tabelle 3.5und Tabelle 3.6 angegeben.Tabelle 3.5: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Bestimmung von EnantiomerenverhältnissenVer- Chirale Retentionszeit Temperatur-Programma)bindung Phase (Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-8) = 72.9 rac-8 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) Dex-CB tR ((−)-8) = 73.5 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 110 ºC (5 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-15) = 59.1rac-15 5 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) → Dex-CB tR ((−)-15) = 59.6 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-16) = 67.7rac-16 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) Dex-CB tR ((−)-16) = 68.1 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-12) = 21.6rac-12 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) → Dex-CB tR ((−)-12) = 22.1 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-18) = 192.0rac-18 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-18) = 194.0 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-47) = 116.4rac-47 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-47) = 117.6 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-46) = 171.6rac-46 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-46) = 175.4 → 200 ºC (10 ºC/Min.)

212 EXPERIMENTELLER TEILFortsetzung Tabelle 3.5: 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-14) = 22.8rac-14 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) → Dex-CB tR ((−)-14) = 23.5 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((−)-22) = 71.8rac-22 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((+)-22) = 76.3 → 200 ºC (10 ºC/Min.) Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-24) = 70.3rac-24 6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-24) = 74.5 Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-45) = 71.8rac-45 6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-45) = 76.3a) Trägergas H2 mit 100 kPa Vordruck; Split 1:40.Tabelle 3.6: Trennbedingungen zur Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen durch HPLC Analyse an Chiralcel OD-H Phase Flow Retentionszeitena) Verbindung Laufmittel-Verhältnis (mL / Min.) (Min.) n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-8) = 19.1 rac-8 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-8) = 20.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-15) = 9.9 rac-15 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-15) = 11.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-16) = 10.1 rac-16 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-16) = 12.1 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-11) = 36.2 rac-11 0.75 990 : 10 : 1 tR ((−)-11) = 46.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-17) = 13.7 rac-17 0.75 990 : 10 : 1 tR ((−)-17) = 16.5

BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 213Fortsetzung Tabelle 3.6: n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-12) = 21.0 rac-12 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-12) = 29.5 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-18) = 11.8 rac-18 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-18) = 17.7 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-13) = 20.7 rac-13 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-13) = 24.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-19) = 16.1 rac-19 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-19) = 22.9 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-20) = 26.5 rac-20 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-20) = 29.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-21) = 13.9 rac-21 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-21) = 15.2 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-14) = 26.8 rac-14 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-14) = 39.9 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-22) = 13.5 rac-22 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-22) = 19.4 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-23) = 13.2 rac-23 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-23) = 18.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-24) = 21.1 rac-24 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-24) = 26.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-45) = 16.3 rac-45 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-45) = 20.0a) Die Detektion erfolgte bei λ = 273 und 254 nm.

214 EXPERIMENTELLER TEIL3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen Medium3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen System (AAV 6)Der racemische Ester (0.5 bis 2 mmol) wurde in 4 ml (10 Vol%) des organischenCosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 36 ml wäßrigerPhosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Dabei entstand häufig zuerst eine Trübungdurch Emulsionsbildung, die aber rasch verschwand und eine klare Lösunghinterließ. Aufgrund der Basizität der Substrate wurde die Mischung anschließendauf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolleüberprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur überden gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösungwurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten.Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt.Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurdenmit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und zweimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethanextrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mitNa2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zurAufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan fürein bis zwei Tage kontinuierlich extrahiert. Die vereinigten organischen Phasenwurden anschließend mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt undunter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit.3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig- organischen Zweiphasen System (AAV 7)Der racemische Ester (0.5 bis 1 mmol) wurde in 5 ml MTBE gelöst und unterkräftigem Rühren langsam zu einer Emulsion aus 20 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) und 15 ml MTBE gegeben. Es entstand in allen Fällen eine klare

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 215Emulsion, die anschließend aufgrund der Basizität der Substrate auf dengewünschten pH-Wert eingestellt wurde. Danach wurde die Reaktionslösung für24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolleüberprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur überden gesamten Reaktionszeitraum heftig gerührt, so daß eine feine Emulsionentstand. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitratormit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurdeüber die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünntund dreimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurdeabgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipettegegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde dieReaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für 48 Stunden kontinuierlichextrahiert. Anschließend wurde die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet, imRotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck vonLösungsmittelresten befreit.3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen Lösungsmitteln (AAV 8)Das racemische Substrat (0.25 mmol) und das Acylierungsmittel wurden in 5 ml desorganischen Lösungsmittels gelöst. Die Reaktionslösung wurde für 24 Stunden ohneEnzym bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktionstattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben und die Mischung für einigeMinuten kräftig gerührt, um das Enzym möglichst fein zu verteilen. Danach wurde derAnsatz über den restlichen Reaktionszeitraum langsam gerührt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 500 µl-Proben entnommen und zur Abtrennung vonProteinen und eventuell vorhandenem MPEG mit 1.5 ml Dichlormethan über eine mitNa2SO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.

216 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.2 Berechnung des E-WertsFolgende Formeln wurden zur Berechnung der E-Werte benutzt6,106,108: ln [1 − c(1+ eeP )]Formel 3.2: E= , für c < 50 % ln [1− c(1− ee P )] ln [(1− c)(1− ee S )]Formel 3.3: E= , für c > 50 % ln [(1− c)(1+ ee S )] ee SFormel 3.4: Umsatz ber = ee S + ee P  1− ee S   ee P (1− ee S )  ln   ln  (ee + ee )  1 + (eeS /ee P )   S  E=  = PFormel 3.5:  1 + ee S   ee P (1+ ee S )  ln   ln   1 + (eeS /ee P )   ee P + ee S ) (mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und demee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnungdes E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurdeabgesehen.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2173.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2- dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als CosolvensDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml Aceton und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. DieReaktion wurde nach 5 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.248 g einer Mischung aus Ester (+)-15und Phenol (−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von Aceton als CosolvensReaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 5 Min 52 % 27 % 46 % 43.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden1.135 g (3.6 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. DieReaktion wurde nach 2 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 52 % durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.532 g (1.67 mmol, 47 %) (+)-15 und 0.428 g (1.72 mmol,49 %) (−)-8 isoliert werden.

218 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.8: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemReaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 2h 62 % 47 % 47 % 49 % 133.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. DieReaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22;Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol,10 %) (+)-15 isoliert werden.(+)-15: [α ] 20 = + 10.74º (c = 0.7, MeOH) D(−)-8: [α ] 20 = − 3.43º (c = 1.5, MeOH) DTabelle 3.9: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemReaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 3h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2193.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 0.6 mg Acetylcholinesterase (AChE;970 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 7.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.297 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol(−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.10: Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 7.5 h 3% n. .b. n. .b. -3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida antarctica Lipase(CAL; 3.2 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktionwurde nach 3.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.310 g einer Mischung aus Ester (+)-15und Phenol (−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.11: CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 3.75 h 8% 3% 3% 1.1

220 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Lipase aus Mucor miehei(1.3 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.245 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol(−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.12: Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 19.5 h 25 % 11 % 30 % 2.13.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Horse liver esterase (HLE;0.74 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 4 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen undaufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8erhalten werden.Tabelle 3.13: HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 4h 31 % 17 % 51 % 4

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2213.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Cholesterolesterase (CE;17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.231 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol(−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.14: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 24 h 90 % 72 % 39 % 53.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL;16.8 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.259 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol(−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.15: PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 2.5 h 66 % 19 % 78 % 10

222 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Burkholderia cepacia Lipase(BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktionwurde nach 22 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.318 g einer Mischung aus Ester (+)-15und Phenol (−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.16: BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 22 h 35 % 75 % 67 % 113.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRLDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Candida rugosa Lipase (CRL;2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 3 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen undaufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8erhalten werden.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223Tabelle 3.17: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen EinphasensystemReaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 3h 64 % 98 % 45 % 103.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit roher CRLDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL;2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol,30 %) (−)-8 isoliert werden.(+)-15: [α ] 20 = + 17.90º (c = 1.3, MeOH) D(−)-8: [α ] 20 = − 11.45º (c = 2.0, MeOH) DTabelle 3.18: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit roher CRLReaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8 3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27

224 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRLDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden0.319 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 5.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 33 % durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.186 g (0.58 mmol, 58 %) (+)-15 und 0.068 g (0.27 mmol,27 %) (−)-8 isoliert werden.Tabelle 3.19: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRLReaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8 5.25 h 58 % 58 % 90 % 27 % 343.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure- 3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir roher CRLDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 7.25 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 225und aufgearbeitet. Es konnten 0.286 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol(−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.20: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 7.25 h 45 % 4% 26 % 23.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 7.0Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 1.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mitDichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischungaus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.21: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 7.0Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 1.75 h 36 % 35 % 52 % 43.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 8.0Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 80 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 45 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan

226 EXPERIMENTELLER TEILabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.229 g einer Mischung aus Ester (+)-16und Phenol (−)-8 erhalten werden.Tabelle 3.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 8.0Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 0.75 h 31 % 50 % 74 % 103.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethyl- aminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung verschiedener LipasenDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in siebenverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 mit 50 mg (0.50 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.23aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 227Tabelle 3.23: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Enzymmenge Umsatz nach Enzym 14 d (GC) Porcine pancreatic Lipase 100 mg 0% (PPL; 16.8 U/mg) Burkholderia cepacia Lipase 15 mg 0% (BCL, 40 U/mg) Candida rugosa Lipase 60 mg 2% (CRL; 2.4 U/mg) Rhizopus niveus Lipase 50 mg 0% (2.6 U/g) Candida antarctica Lipase 5 mg 0% (CAL; 3.2 U/mg) Rhizopus arrhizus Lipase 50 mg 0% (2 U/g) Aspergillus niger Lipase 5 mg 0% (1 U/mg)3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit VinylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 unter den in Tabelle 3.24 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 100 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) umgesetzt. In allenReaktionen entstand vor Enzymzugabe eine klare Lösung. Die PPL bildete eineSuspension, da das Enzym nicht löslich war. Nach 24 Stunden Reaktionszeit hattensich alle Reaktionen aufgrund einer Braunfärbung des Enzyms dunkel verfärbt.

228 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.24: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat 28 d 2%5 ml Dichlormethan (H2O ges.)112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat 28 d 1%5 ml Trichlormethan (H2O ges.)5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat 12 d 6%3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit VinylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 unter den in Tabelle 3.25 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) umgesetzt. In allenReaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klarenReaktionslösung gegeben wurde.Tabelle 3.25: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert Umsatz (GC) 3%112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. -5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 18 %5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 10 % 1.2 ee Phenol (+)-8 2%

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2293.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit VinylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vierverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 unter den in Tabelle 3.26 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 30 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) umgesetzt. In allenReaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klarenReaktionslösung gegeben wurde.Tabelle 3.26: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert Umsatz (GC) 2%112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. -5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 8%112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. -5 ml MTBE ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 36 %5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 38 % 3 ee Phenol (+)-8 21 % Umsatz (GC) 66 %112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 33 % 2.55 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 26 %

230 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit VinylbutyratDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 unter den in Tabelle 3.27 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In beidenReaktionen entstand eine weiße Suspension, da sowohl das Enzym unlöslich war,als auch Anteile des Substrat sich nicht vollständig lösten.Tabelle 3.27: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat Reaktionsbedingungen 17 d E-Wert143 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 4%Vinylbutyrat ee Ester (−)-15 n. b. -5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 15 %5 ml (39 mmol) ee Ester (−)-15 28 % 2Vinylbutyrat ee Phenol (+)-8 15 %3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.063 g (0.25 mmol) desPhenols rac-8 unter den in Tabelle 3.28 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 45 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 231Tabelle 3.28: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 0%5 ml Dichlormethan125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 0%5 ml Trichlormethan5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 4d 5%3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 40 µl (0.4 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 25 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.104 g einer Mischung aus Ester 17und Phenol 11 erhalten werden.Tabelle 3.29: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E 25 Min. 69 % 7% 1% 1.1

232 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRLDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.128 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11erhalten werden.Tabelle 3.30: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E 2.5 h 17 % 1% 3% 1.13.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3- (3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung verschiedener LipasenDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in fünfverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) desPhenols rac-11 mit 125 mg (0.50 mmol) Vinyllaurat und der in Tabelle 3.31aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 233Tabelle 3.31: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-11 Enzymmenge Umsatz nach Enzym 14 d (GC) Burkholderia cepacia Lipase 100 mg 0% (BCL, 40 U/mg) Candida rugosa Lipase 60 mg 0% (CRL; 2.4 U/mg) Candida antarctica Lipase 10 mg 0% (CAL; 3.2 U/mg) Rhizopus arrhizus Lipase 50 mg 0% (2 U/g) Aspergillus niger Lipase 5 mg 0% (1 U/mg)3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4- dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.174 g (0.50 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 50 µl (0.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. DieReaktion wurde nach 5.75 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 40 % durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (EE : MeOH : TEA = 50 : 50 : 1 an Kieselgel,

234 EXPERIMENTELLER TEILRf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden.(−)-18: [α ] 20 = − 6.01º (c = 1.50, MeOH) D(+)-12: [α ] 20 = + 21.70º (c = 0.80, MeOH) DTabelle 3.32: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12 5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 893.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende derReaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz(GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 anKieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %)(+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden.(+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH) D(−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH) D

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235Tabelle 3.33: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen EinphasensystemReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 1333.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. NachSäulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 an Kieselgel,Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden.(+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH) D(−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH) DTabelle 3.34: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 72 h ≥98 % 40% ≥98 % 39 % >200

236 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit extraktiver AufarbeitungDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL;25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zumAbbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Dievereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und imRotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser,öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebenewäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck vonLösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und dievereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen amRotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einemee-Wert von 97 % erhalten.(+)-18: [α ] 20 = + 7.9º (c = 0.69, MeOH) D(−)-12: [α ] 20 = − 28.60º (c = 0.93, MeOH) DTabelle 3.35: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit extraktiver AufarbeitungReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2373.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 60 mg Novozym 435 (immobilisierteCAL-B) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos, das immobilisierteEnzym unlöslich. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 gEster rac-18 erhalten werden.Tabelle 3.36: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester 18 ee Alkohol 12 E 45 h 0% - - -3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.245 g (0.70 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B;154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.240 g einer Mischung aus Ester (+)-18 und Alkohol(−)-12 erhalten werden.Tabelle 3.37: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E 46 h 7% 8% n. b. -

238 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit IsopropenylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 mit jeweils 5 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unterden in Tabelle 3.38 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständiglöslich war. Nach 24 Stunden waren die Reaktionen, die in Toluol durchgeführtwurden, klar.Tabelle 3.38: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)145 mg (1.45 mmol) Isopropenylacetat, 20 d 3%5 ml Toluol5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat 20 d 3%3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit VinylpropionatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 mit jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unterden in Tabelle 3.39 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt.Tabelle 3.39: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 239 Reaktions- Mittel 8d E-Wert 13 d E-Wert bedingung E-Wert125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 11 % 12 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 385 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 8% 12 % Umsatz (GC) 5% n. b.5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 4% n. b.3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit VinylpropionatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.40 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da Substrat und Enzym nichtvollständig löslich waren. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluoldurchgeführt wurde, klar.

240 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.40: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 3d 6d 8d 11 d 16 dReaktionsbedingung (%) (%) (%) (%) (%)125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 0 2 2 3 -Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -5 ml Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 37 57 58 58 -Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 - Umsatz (GC) 23 41 48 53 585 ml (49.95 mmol) 88 84 86 82 79 ee Ester (−)-46Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90Tabelle 3.41: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, - - - 19 - 195 ml Diisopropylether125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 56 89 >200 89 - 1095 ml Toluol5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 19 19 26 27 25 23

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2413.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit IsopropenylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.42 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständiglöslich war. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol durchgeführt wurde,klar.Tabelle 3.42: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit IsopropenylacetatReaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d145 mg (1.45 mmol) Umsatz (GC) 19 % 34 % 47 % 58 %Isopropenylacetat, ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 % Umsatz (GC) 3% 5% 13 % 16 %5 ml (70 mmol) n. b. 10 % 24 % 24 % ee Ester (−)-47Isopropenylacetat ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%Tabelle 3.43: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel145 mg (1.45 mmol) n. b. >200 67 94 120Isopropenylacetat, 5 ml Toluol5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2

242 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12a) mit 7 mg MPEG/PLEDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.44 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 7 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) in 5 ml Toluolumgesetzt.Tabelle 3.44: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 3%125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0%b) mit 45 mg PLE/MPEGDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.45 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 45 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 243Tabelle 3.45: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 2%5 ml Dichlormethan125 mg (1.25 mmol Vinylpropionat 4d 1%5 ml MTBE5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 21 d 3%3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkoholsrac-12 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat unter den in Tabelle 3.46aufgeführten Reaktionsbedingungen und mit der dort angegebenen Menge anColyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE, 1.5 % Proteingehalt) umgesetzt.In beiden Reaktionen entstanden klare Lösungen. Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun.Tabelle 3.46: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)55 mg PLE/BSA/MPEG in 5 ml Dichlormethan 11 d 0%45 mg PLE/BSA/MPEG, 12 µl H2O in 6 ml Toluol 11 d 0%

244 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexylester (rac-19)3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in sieben verschiedenenAnsätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mitder in Tabelle 3.47 angegebenen Menge der jeweiligen Lipase versetzt. DieReaktionen wurden nach der in Tabelle 3.47 angegebenen Reaktionszeit durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Dieerhaltenen Ausbeuten sind in Tabelle 3.47 angegeben.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 245Tabelle 3.47: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen Enzym- Reaktions- Ausbeute UmsatzEnzym menge zeit Ester 19 (GC)Cholesterolesterase 25 mg 24 h 181 mg 1%(CE; 17.5 U/mg)Candida rugosa Lipase 5 mg 29 h 190 mg 0%(CRL; 37 U/mg)Chirazyme L-2 10 mg 45 h 195 mg 0%(CAL-B; 155 U/mg)Burkholderia cepacia Lipase 20 mg 45 h 200 mg 0%(BCL; 0.09 U/mg)Burkholderia cepacia Lipase 30 mg 46 h 194 mg 0%(BCL, 40 U/mg)Porcine pancreatic Lipase 40 mg 23 h 195 mg 1%(PPL; 16.8 U/mg)Chromobacterium viscosum 2 mg 69 h 200 mg 0%Lipase (CVL, 3.58 U/mg)3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 69 Stunden durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.184 gEster 19 erhalten werden.

246 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.48: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemReaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 69 h 1% n. b. n. b. -3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 200 µl (2.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 41 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.191 g Ester 19 erhalten werden.Tabelle 3.49: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 41 h 0% - - -3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13)3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener LipasenDie Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vierverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 247Alkohols rac-13 mit 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.50aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Toluol versetzt.Tabelle 3.50: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen Enzymmenge Umsatz nach Umsatz nachEnzym 3 h (GC) 72 h (GC)Candida rugosa Lipase 5 mg 0% 0%(CRL; 37 U/mg)Porcine pancreatic Lipase 20 mg 0% 0%(PPL; 16.8 U/mg)Cholesterolesterase 10 mg 0% 0%(CE; 17.5 U/mg)Novozym 435 10 mg 0% 1%(immobilisierte CAL-B)3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vierverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-13 unter den in Tabelle 3.51 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 20 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.

248 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.51: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 Umsatz nach Umsatz nach Reaktionsbedingungen 66 h (GC) 6 d (GC)125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 1% 1%5 ml Toluol125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 0% 0%5 ml Dichlormethan125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 1% 1%5 ml Toluol5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 1% 1%3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von TriethylaminDie Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-13 mit 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat und 50 mg (0.36 mmol)Triethylamin sowie der in Tabelle 3.52 aufgeführten Menge Lipase versetzt.Tabelle 3.52: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin Enzym- Umsatz nach Umsatz nachEnzym menge 5 d (GC) 12 d (GC)Novozym 435 30 mg 2% 4%(immobilisierte CAL-B)Chromobacterium viscosum Lipase 1 mg 0% 1%(CVL, 3.58 U/mg)Burkholderia cepacia Lipase 10 mg 0% 0%(BCL, 40 U/mg)

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2493.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6- dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 7.5 mg Cholesterolesterase (CE;17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.107 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol(−)-20 erhalten werden.Tabelle 3.53: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 16.75 h 64 % 71 % 11 % 23.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.184 g (0.55 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mitDichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.116 g einer Mischungaus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.

250 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.54: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 3.25 h 82 % 20 % 6% 1.33.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.141 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol(−)-20 erhalten werden.Tabelle 3.55: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im EinphasensystemReaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 18.5 h 40 % 31 % 17 % 23.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazuwurden 0.162 g (0.48 mmol) des Esters rac-21 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierlicheExtraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.138 geiner Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 251Tabelle 3.56: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im ZweiphasensystemReaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 46 h 57 % 89 % 28 % 53.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.5, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 20 mg Burkholderia cepaciaLipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Da nach22 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiertwerden konnte, wurden die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restlicheReaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit wurde durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Eskonnten 0.187 g Ester rac-22 erhalten werden.Tabelle 3.57: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 48 h 0% - - -

252 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Novozym 435(immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos; dasimmobilisierte Enzym unlöslich. Da nach 19 Stunden Reaktionszeit noch keinProdukt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden weitere 40 mgNovozym 435 zur Reaktionslösung gegeben. Nach insgesamt 10 TagenReaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-22 erhalten werden.Tabelle 3.58: Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 10 d 35 % 67 % 85 % 243.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurdenach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochenund aufgearbeitet. Es konnten 0.181 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol(−)-14 erhalten werden.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 253Tabelle 3.59: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 45 h 7% 9% ≥98 % >2003.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase(CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktionwurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.180 g einer Mischung aus Ester (+)-22und Alkohol (−)-14 erhalten werden.Tabelle 3.60: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemReaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 24 h 27 % 38 % 92 % 343.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.5, dazuwurden 0.350 g (1.0 mmol) des Esters rac-22 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL;25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktionwurde nach 5 Tagen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen

254 EXPERIMENTELLER TEILund aufgearbeitet. Es konnten 0.226 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol(−)-14 erhalten werden.Tabelle 3.61: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen ZweiphasensystemReaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 5d 34 % 37 % 69 % 83.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß in zwei Reaktionen nach AAV 6bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit jeweils20 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klarund farblos. Die Reaktionen wurden nach 2.5 Stunden und 18.5 Stunden durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Eskonnten 0.189 g und 0.185 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14erhalten werden.Tabelle 3.62: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200 19.5 h 38 % 67 % 93 % 55

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2553.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit extraktiver AufarbeitungDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazuwurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruchder Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösungdreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasenwurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Dieverbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertemDruck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert unddie vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen amRotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wertvon 91 % erhalten.(+)-22: [α ] 20 = + 14.14º (c = 1.02, MeOH) D(−)-14: [α ] 20 = − 34.75º (c = 1.05, MeOH) DTabelle 3.63: CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver AufarbeitungReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14 22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67

256 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazuwurden 0.221 g (0.57 mmol) des Esters rac-22⋅HCl in 4 ml tert-Butanol und 36 mlwäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 20 mg Cholesterolesterase(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktionwurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethanabgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.166 g einer Mischung aus Ester (+)-22und Alkohol (−)-14 erhalten werden.Tabelle 3.64: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HClReaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 19.5 h 43 % 86 % 94 % 893.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 75 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. DieReaktion wurde nach 16.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mitDichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischungaus Ester (−)-22 und Alkohol (+)-14 erhalten werden.Tabelle 3.65: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E 16.5 h 18 % 22 % 93 % 34

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2573.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als CosolvensDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 1.9 mg Chirazyme E1 (PLE,Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch derReaktion nach 42 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 22 %, und zur Aufarbeitungwurde die Reaktionslösung zunächst zweimal mit je 30-40 ml MTBE undanschließend mit dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigtenorganischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfereingeengt. Es konnten 0.147 g (0.42 mmol, 74 %) (−)-22 mit einem ee-Wert von27 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampferunter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe vonNa2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 mlDichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.037 g (0.13 mmol,23 %) (+)-14 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten.Tabelle 3.66: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz von Aceton als CosolvensReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85

258 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen EinphasensystemChirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22(rac-22⋅HCl) unter Zusatz von Aceton als Cosolvens1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Acetonund 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösungwurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolleüberprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurdeder Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftiggerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitratormit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurdeüber die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurdenanalog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zumAbbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermalmit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mitNa2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g(1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliertwerden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer untervermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethanextrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. NachEinengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 %(0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol,4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten.(−)-22: [α ] 20 = − 4.62º (c = 0.96, MeOH) D(+)-14: [α ] 20 = + 26.40º (c = 0.32, MeOH) D

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 259Tabelle 3.67: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von Aceton als CosolvensReaktions- Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E zeit (%) (%) (%) 1h 2 2 ≥98 - 1.5 h 3 3 ≥98 - 3h 4 5 ≥98 - 4.25 h 7 7 ≥98 - 5.25 h 8 9 ≥98 - 7.25 h 10 11 ≥98 - 22.5 h 20 26 95 50Tabelle 3.68: Ergebnis nach Aufarbeitung der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HClReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22⋅HClmit und ohne Zusatz von Aceton als CosolvensIn zwei parallelen Versuchen wurde 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl einmal zu einerMischung aus 2 ml Aceton (16 Vol%) und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung(0.1 M, pH 7.25) und ein zweitesmal zu 12.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung(0.1 M) gegeben. Die Lösungen wurden anschließend auf pH 7.25 eingestellt.Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde zu beiden Versuchen jeweils9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurden dieAnsätze über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Aufgrund einestechnischen Defekts fiel die Temperatur nach 8 Stunden für die restliche

260 EXPERIMENTELLER TEILReaktionszeit drastisch ab. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden analog zur AAV 6100 µl Proben entnommen.Tabelle 3.69: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton Umsatz ee Ester ee Alkohol Umsatz ee Ester ee Alkohol Zeit (HPLC) (−)-22 (+)-14 (HPLC) (−)-22 (+)-14 (h) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 2.5 6 n. b. ≥98 8 n. b. ≥98 5 7 9 ≥98 18 21 ≥98 7.5 8 13 ≥98 21 31 98 22 16 20 ≥98 36 47 98 27 13 22 ≥98 38 59 90 30 17 23 ≥98 38 61 89 48 15 27 ≥98 36 65 88103 17 30 ≥98 43 74 85175 21 29 ≥98 42 75 85

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 261Tabelle 3.70: E-Werte der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktionszeit mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton (h) E-Wert E-Wert 2.5 >200 >200 5 >200 >200 7.5 >200 134 22 >200 157 27 >200 34 30 >200 31 48 >200 30 103 >200 27 175 >200 273.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23)3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasensystem mit Aufarbeitung durch kontinuierliche ExtraktionDie Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.432 g (1.14 mmol) des Esters rac-23 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 mlwäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3.8 mg Chirazyme E1 (PLE,Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war während der ersten Stunden derReaktion stark getrübt, in Laufe der Reaktion verschwand diese Trübung. Nach24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung dieReaktionslösung zunächst dreimal mit je 30-40 ml MTBE und dann dreimal mit je25 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mitNa2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.234 g

262 EXPERIMENTELLER TEIL(0.62 mmol, 54 %) durch Spuren von Hexansäure penetrant ziegenähnlichriechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % isoliert werden. Die verbliebenewäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck vonLösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und dievereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen amRotationsverdampfer wurden 0.146 g (0.52 mmol, 46 %) (+)-14 als Öl mit einem ee-Wert von 77 % erhalten.(−)-23: [α ] 20 = − 6.70º (c = 1.93, MeOH) D(+)-14: [α ] 20 = + 25.83º (c = 0.9, MeOH) DTabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz von Aceton als CosolvensReaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 243.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vierverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.72 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionenentstand eine klare Lösung in der das unlösliche Enzym suspendiert war.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 263Tabelle 3.72: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 Reaktionsbedingungen 16 d E-Wert108 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 18 %Vinylacetat ee Ester (−)-24 44 % 55 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 72 % Umsatz (GC) 11 %5 ml (54 mmol) ee Ester (−)-24 47 % 4Vinylacetat ee Alkohol (+)-14 48 %125 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 25 %Isopropenylacetat ee Ester (−)-24 68 % 145 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 87 % Umsatz (GC) 12 %5 ml (70 mmol) ee Ester (−)-24 77 % 10Isopropenylacetat ee Alkohol (+)-14 35 %3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit VinylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.73 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigtenalle Reaktionen eine milchige Trübung.

264 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.73: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 48 h E-Wert129 mg (1.5 mmol) Umsatz (HPLC) 70 %Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 385 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 67 %125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 79 %Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 995 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 %3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionata) mit 10 mg Novozym 435Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in dreiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.74 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigtenalle Reaktionen eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz warzusätzlich noch ein weißer Niederschlag zu erkennen.

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 265Tabelle 3.74: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert durch 10 mg Novozym 435 Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 895 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 95 %125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 35 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 89 % 3010 µl H2O, 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 56 %125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 50 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 98 % >2005 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 % Umsatz (HPLC) 52 %5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-45 97 % 192Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 88 %b) mit 5 mg Novozym 435Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vierverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.75 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 5 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn derReaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Bis auf die Reaktion unterZusatz von Triethylamin zeigten die anderen Reaktion nach ca. 48 Stunden einemilchige Trübung.

266 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.75: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert durch 5 mg Novozym 435Reaktionsbedingung 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 % 53 % 52 % 53 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % 91 %5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % 95 % ≥98 % Umsatz (HPLC) 50 % 53 % 52 % 52 %5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % 92 %Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 54 % 55 % 56 % 56 %Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 93 % 93 % 91 %6 mg Triethylamin, ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %5 ml ToluolTabelle 3.76: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h Mittel125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 49 97 78 111 845 ml Toluol5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 81 144 125 125 119125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 125 144 144 111 1316 mg Triethylamin, 5 ml Toluol

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2673.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit IsopropenylacetatDie Enzym-katalysierten Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8. Dazu wurde0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.77 aufgeführtenReaktionsbedingungen mit 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.Die Reaktionslösungen war über die gesamten Reaktionszeit klar und farblos.Tabelle 3.77: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 %Isopropenylacetat, ee Ester (−)-24 94 % 1705 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 %3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zweiverschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) desAlkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.78 aufgeführten Reaktionsbedingungen mitjeweils 7 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE) in 5 ml Toluol umgesetzt.Tabelle 3.78: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 in Toluol Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 2%125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0%

268 EXPERIMENTELLER TEIL3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 108 mg (1.25 mmol) Vinylacetat mit 60 mgPLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE) in 6 ml Toluol umgesetzt. Es entstand eine klareLösung. Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe derReaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun.Tabelle 3.79: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 11 d 0% - - -3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat mit 5 mgChirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) in 5 ml Toluol umgesetzt.Tabelle 3.80: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 47.75 h 2% ≥98 % 3% -

ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 2693.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexylester (rac-25)3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen EinphasensystemDie Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in zwei verschiedenenAnsätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mitder in Tabelle 3.81 angegebenen Mengen des jeweiligen Enzyms umgesetzt. Nachder in Tabelle 3.81 angegebenen Reaktionszeit wurden die Reaktionen durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet.Tabelle 3.81: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Enzym- Reaktions- Ausbeute UmsatzEnzym menge zeit Ester 25 (GC)Cholesterolesterase 30 mg 25 h 165 mg 0%(CE; 17.5 U/mg)Candida rugosa Lipase 10 mg 44 h 195 mg 0%(CRL; 37 U/mg)3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 6 ml Aceton und 34 ml wäßrigerPhosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Nach 42 Stunden wurde die Reaktion durchkontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Eskonnten 0.199 g Ester 25 erhalten werden.

270 EXPERIMENTELLER TEILTabelle 3.82: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 42 h 1% - - -

ANHANG ZUM EXPERIMENTELLEN TEIL 2713.7 Anhang zum experimentellen Teil3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von ButtersäureethylesterMode STAT Regelparameter Endpunkt pH 8.00 Regelbereich 0.5 Max. Rate 10.0 ml/Min. Min. Rate 25.0 µl/Min. Titrationsparameter Start V aus Start 0s Start pH aus Startrate aus Zeitintervall 60 s Titrationsrichtung + Meßeingang 1 Parameter Abbruchbedingungen Stoppzeit abs. 7000 s Stoppvolumen abs. 99.99 ml Stopprate aus Füllgeschwindigkeit max Statistik Status aus Auswertung U. Grenze 1 aus Fix-V1 bis Fix-V9 alle 600 s (→ C51 bis C59) Fix-Zeit 1 aus Überwachung Alle Unterpunkte aus Vorwahl Ident. abfragen aus Einmass abfragen alle (→ C00) Rate anzeigen aus Aktivierpuls ausc-fml C01=0.01Formel RS1 = (C52 − C51) / (C00 ∗ C01) = 10 – 20 Min. [U]Report Kurve, voll, Liste

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2875 LebenslaufName: Carsten GriebelGeburtstag: 12.11.1971Geburtsort: NiebüllStaatsangehörigkeit: deutschFamilienstand: ledigSchulausbildung:08/1978 – 06/1982 Grundschule Emmelsbüll-Horsbüll08/1982 – 07/1989 Friedrich-Paulsen-Schule Niebüll, Gymnasium des Kreises Nordfriesland08/1989 – 06/1991 Städtisches Mathematisch-Naturwissenschaftliches Gymnasium Mönchengladbach06/1991 Allgemeine Hochschulreife (Abitur)Studium:10/1991 – 03/1998 Diplomstudiengang Chemie an der Rheinisch- Westfälischen Technischen Hochschule Aachen06/1994 Vordiplom10/1997 – 03/1998 Diplomarbeit am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais mit dem Titel: „Enzymatische Racematspaltungen von phenolischen Analgetika“03/1998 Abschluß: Diplom-ChemikerPromotion:04/1998 – 02/2002 Dissertation bei Prof. Dr. H.-J. Gais am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen mit Thema: „Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol–Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit“13.12.2002 Tag der mündlichen Prüfung

Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

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