Tinciones Diferenciales Aspectos Tecnicos

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1. Slide 1: Tinciones Diferenciales Prácticas de Laboratorio II Dr. José Magariños Téc. Luciano Rey Téc. Belén Manrique
2. Slide 2: Tinciones diferenciales Como su nombre lo indica, nos permiten diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales Las tinciones diferenciales más comúnmente utilizadas son la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen
3. Slide 3: Tinción de Gram • La tinción de Gram. Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. • La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas.
4. Slide 4: Fundamento de la Técnica La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y características de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante- mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la célula. Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante- mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fácilmente teñida por el colorante secundario o de contraste.
5. Slide 5: Resultados de la coloración Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se refiere difieren en el color con el que finalmente se tiñen las bacterias. Gram positivas se observarán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial con los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la Safranina. La diferencia esta determinada por la composición de su envoltura celular, las bacterias Gram. positivas poseen una malla de péptido glicano en su parte mas externa ,mientras que las Gram. negativas recubriendo una fina capa de peptidoglicano y presentan una membrana externa .
6. Slide 6: Reactivos y Colorantes La tinción de Gram. requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Un colorante básico (+) que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El mas utilizado es el cristal violeta. 2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes usados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico; por ejemplo alcohol acetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina.
7. Slide 7: Procedimiento Técnico 1) Realizar el extendido de la muestra 2) Fijación del extendido Métodos físicos: acción del calor Métodos químicos: metanol 5) Primer colorante: cristal violeta 6) Mordiente: Lugol (sc I2/KI) 7) Decoloración: mezcla alcohol-acetona 1:1 8) Segundo colorante: safranina
8. Slide 8: Procedimiento Técnico
9. Slide 9: Diferencias entre Gram (+) y (-)
10. Slide 10: Morfología Bacteriana
11. Slide 11: Tinción de Ziehl-Neelsen • La tinción de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clínicas de pacientes es otra muy importante tinción diferencial. • La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: BAAR positivas y BAAR negativas. BAAR: bacilos ácido alcohol resistentes
12. Slide 12: Fundamento de la Técnica Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul.
13. Slide 13: Procedimiento Técnico 1) Hacer un frotis 2) Secar al aire y fijar por calor 3) Cubrir todo el porta-objetos con fucsina fenicada 4) Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores. 5) El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario. 6) Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. 7) Lavar con un chorro suave de agua. 8) Decolorar con alcohol ácido 9) Lavar con agua 10) Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto. 11) Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al microscopio con el objetivo de inmersión Las bacterias ZN+ o BAAR se observarán teñidas intensamente de color rojo.
14. Slide 14: Mycobacterium tuberculosis
15. Slide 15: Tinciones Selectivas • Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras de las células gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados • Se pueden observar estructuras como la pared celular, cápsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depósitos de materiales de reserva de poli-ß-hidroxibutirato, glucógeno y gránulos metacromáticos
16. Slide 16: Coloración de esporas Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas \"germinan\" y vuelven a generarse formas vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tinción, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo, las endosporas se pueden teñir aplicando calor a la preparación previamente cubierta con una solución de colorante que en la técnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las células vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste permitirá distinguir claramente a las esporas de color verde.
17. Slide 17: Endosporas en las bacterias
18. Slide 18: Coloración de la cápsula Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su realización es sencillísima, consiste en colocar la muestra húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin color.
19. Slide 19: Procedimiento Técnico Método de la tinta china para cápsula 1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender. 2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y se presiona suavemente evitando que queden burbujas. 3.-Observar inmediatamente al microscopio. 4.-Desechar la preparación en un recipiente con antiséptico. La cápsula se observa como una gran estructura alrededor de la célula delimitada por los pequeños fragmentos de carbón de la tinta china.
20. Slide 20: Cápsulas bacterianas