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  • 1. 3B-2 GUÍA DE PRÁCTICAS UnIDAD ACADémICA: ESCUELA ACADEmICO PROFESIOnAL DE OBSTETRICIA nOmBRE DE LA ASIGnATURA BIOQUÍmICA Y nUTRICIÓn nOmBRES Y APELLIDOS : JOSELInE RICCI CUELLAR AUTOR : Q.F. JAVIER F. mARTInEZ CARRERASINTRODUCCIÓN La Bioquímica, que crece a un ritmo extraordinariamente vigoroso, ejerce una influencia cadavez mayor en las Ciencias de la vida. Actualmente se considera que la Bioquímica es el arma máspoderosa con que se cuenta para interpretar el fenómeno biológico, con una profunda incidencia ennumerosas áreas incluyendo la medicina y la nutrición humana. La presente guía de práctica comprende la aplicación experimental de los conceptosfundamentales, tanto básicos como de desarrollo de la capacidad crítica del estudiante más que en elalmacenamiento memorístico de datos que tampoco puede, sin embargo, descuidarse. Cada Práctica de laboratorio incluye: Marco Teórico, Competencias, Materiales y Equipos,Procedimiento, Cuestionario y Fuentes de información que se deben desarrollar cuidadosamentedurante la práctica. La guía de laboratorio debe ser revisada antes de iniciar la práctica.INSTRUCCIONES GENERALESEl estudiante deberá estar en las prácticas en el horario programado, a la hora exacta y con mandil blanco.Todos los alumnos participarán activamente en el desarrollo de las prácticas.Es necesario que el alumno antes de cualquier experimento posea los conocimientos básicos: - Los objetivos de cada práctica. - El material y equipo de laboratorio necesario para la realización de dicha practica. - Los reactivos verificando su nombre, concentración, evitando contaminar los mismos. - El método seleccionado que permitirá obtener resultados objetables - Desarrollar su capacidad de observación y actitud críticaEl modelo para el informe de cada práctica debe seguir el siguiente esquema:1.− Título de la práctica2.− Nombre del(los) integrante(s), fecha de entrega3.− Materiales y Procedimientos4.- Cálculos y Resultados5.− Conclusiones (de acuerdo a los objetivos y resultados de la práctica)6.− Desarrollo del cuestionarioF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 1
  • 2. 7.− Bibliografía Práctica N° 1 “Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio bioquímica” 1.1 Marco teórico Para realizar con éxito las practicas programadas para el curso, se requiere de diferentes materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. Así mismo el uso de equipos e instrumentos como potenciómetro, balanza, espectrofotómetro y otros. Estos materiales y equipo tienen condiciones básicas para su uso como el estar calibrados, limpios y que sea el material correcto según nuestras necesidades. 1.2 Competencias • Demuestra y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio. • Aprende el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio. 1.3 Materiales y equipos Materiales y equipos a usar en la práctica: Tubos Beacker 100mL Refrigerante Alcohol 70° Centrífuga 13x100mm Tubos Beacker 500mL Bagueta Anaranjado de Baño maría 10x75mm metilo Tubos Matraz 50mL Pipeta pasteur Azul de metileno Potenciómetr 17x150mm o Tubo de Matraz 500mL Pipeta 1mL 1/10 Agua destilada Balanza centrífuga Probeta Micropipeta Pipeta 1mL 1/100 Mecheros de ron Incubadora 100mL 10-100uL Probeta Micropipeta Pipeta 2mL 1/10 Pinza para buretas Espectrofotó 1000mL 100-1000uL metro Bureta 25mL Tips amarillos Pipeta 5mL 1/10 Mortero Mechero de gas Gradillas Tips azules Pipeta 10mL 1/10 Propipeta Pinzas para tubos Luna de Reloj Matraz Kitazato Pipeta 25mL 1/10 Adaptador Tripode 500mL venoject Goteros Fiola 100mL Pipeta 5mL no Ligadura Embudo terminal Rejilla de Fiola 1000mL Pipeta 5mL volum Aguja venoject Soporte asbesto 21Gx1” universal 1.4 Procedimiento PIPETAS: Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volúmenes de líquidos. Primero deberá identificar si es una pipeta terminal (graduación llega a la punta) o no terminal (graduación finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puede medir con la pipeta (capacidad de la pipeta). Modo de uso: Introduzca la pipeta en el líquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere, tapar la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente su dedo y deje salir el líquido hasta que logre enrazar el líquido (nivel deseado). El profesor le enseñará el correcto uso de las pipetas. MICROPIPETAS:F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 2
  • 3. Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volúmenes muy pequeños en el rango de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volúmenes (regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que es específico según la capacidad de la micropipeta. Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajústelo, regule el volumen a medir girando el mando del émbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta, presione suavemente e introduzca el tip al líquido a medir, suelte suavemente el émbolo y observe que el líquido llene el tip, para depositar el contenido presione el émbolo completamente y el líquido será expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione el mando expulsor. RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRA BIOLOGICA EL TIP DEBE SER ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMO LA LEJIA O SIMILAR. El profesor le enseñará el correcto uso de las micropipetas y demás materiales y equipos de laboratorio. 1.5 Cuestionario 1. Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa las características de este material. 2. Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones. 3. El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la forma correcta para el lavado de materiales de vidrio. 4. Describa cada uno de los materiales mostrados durante la práctica y explique su uso. 1.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 3
  • 4. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Práctica N° 2 “Determinación del pH, Amortiguadores” 2.1 Marco teórico El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo definió como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno es decir: pH = - log (H) ó = [H + ] = 10 – pH ó = - log ( 1 ) H Donde la concentración del hidrogenión es dada en unidades moles. La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más utilizados en bioquímica puesto que esta medida determina características notables de la estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas, por consiguiente, la conducta de las células y de los organismos. CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION: Procedimiento .- Consiste en calcular la concentración de iones hidrógeno [H+] Calcular el logaritmo de base 10 de [H+] El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1) Ejemplo: El agua pura (25ºC), de concentración 1 x 10 –7 M tiene como pH: PH = - log ( 1 x 10 – 7 ) PH = - ( - 7 ) PH = 7 El agua es un conductor eléctrico cuando se encuentra pura, debido a su propiedad disociativa, pero en pequeño grado. H2O + H2O H3O+ + HO– (1) A 25ºC existe 1 molécula de H3O + y una molécula de HO– por cada 5.55x108 moléculas de agua El número de agua por litro sería: 1000 g/L = 55.5 moles/L (2) 8 g/mol 55.5 x 108 moles de agua hacen 107g /L, existiendo solo un gramo de H3O+; es decir, 10–7 g/L, y un gramo de OH– ó 10 – 7 g/L. De la fórmula (1) se deduce que la constante de ionización del agua (Kw) es: Kw = [H3O+] [HO-] = [H3O+] [ OH - ] 2 2 [H2O] (55.5) De lo que: [H3O+] [OH-] = K(55.5)2 = Kw Por lo que: Kw = 10 – 7 x 10– 7 = 10 – 14 Por lo tanto: Log Kw = log [H3O+] + log [OH-] -Log KW = -log [ H3O+] + - log [OH-] - p Kw = p[H3O+] + p[HO-] -p Kw = pH + pOH Soluciones Buffer, tampón o amortiguadores : Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES DEBILES y sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que el cambio de este no sea el más mínimo.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 4
  • 5. APLICACIONES : En organismos vivientes, por ejemplo: Para conocer las alteraciones producidas en la composición química de la sangre. Para conocer las alteraciones del pH de otros líquidos biológicos: saliva, lagrimas, sudor, líquido cefalorraquídeo, etc. En ciertos fenómenos fisiológicos: respiración, aplicación de enzimas (catalizadores), etc. En química: Para determinar el pH de una solución. Para determinar el punto final de una titulación Demostración : reacciones químicas con liberación o consumo de iones H +. Otros 2.2 Competencias • Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la acción de los sistemas buffer. • Utiliza las técnicas para medir el pH. 2.3 Materiales y equipos Materiales y equipos a usar en la práctica: Potenciómetro Anaranjado de Bureta 25mL Estandar de pH Pipeta 1mL metilo 10 Beacker 100mL Papel de tornasol Soporte Ac. Acético Pipeta 2mL azul universal 0,1N Matraz 100mL Papel de tornasol Pinza para Acetato sodio Pipeta 5mL rosado bureta 0,1N Estandar de pH Indicador de pH 1-14 Tubos Agua destilada Pipeta 10mL 4 13x100mL Estandar de pH Gradillas Vaso Fenolftaleina HCl 0,1N 7 descartable METODOS DE DETERMINACION DEL pH: Existen varios procedimientos: Mediante indicadores Mediante cintas o papel de pH universal Mediante el potenciómetro o pHmetro DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES: Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos para dosar, con el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándose por la aparición, desaparición o modificación del color. Estas sustancias químicas pertenecen al grupo de los ácidos y bases débiles. Según Glaser, se clasifican en tres grupos: 1ero: Para valorar bases débiles con ácidos fuertes. Ejem: anaranjado de metilo, rojo de congo, etc. 2do: Para valorar bases y ácidos fuertes. Ejem : Tornasol, paranitrofenol, etc. 3ero: Para valorar ácidos débiles con bases fuertes. Ejem: fenolftaleina, etc. Aplicación : 1) En determinar el pH de una solución deseada. 2) En determinar el punto final de una titulación (volumétrica) 3) En determinar reacciones químicas con liberación o consumo de H Comprende: Elección de un indicador para una titulación, para lo que se debe tener en cuenta conceptos básicos sobre disociación de sales, la que está sujeta a una constante (pK) y a una variación de colores dependiente a su mayor o menor disociación de pK; el pK se emplea y se define como el log (1/Ka) ó el –log Ka para definir la fuerza de un ácido o de una base. Un ácido cuya constante de ionización sea 10 –4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es – log Kb, para cualquier constante de equilibrio Kb. (Ka constante de ionización de un ácido; Kb, constante de ionización de una base). Continuando : a) Disociación de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil:F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 5
  • 6. NH4Cl NH4+ + Cl- H2O OH - + H+ NH 4Cl + H2O NH 4 OH + HCl La mayor tendencia de ionización del HCl frente a la del NH4OH lo hace una solución ACIDA. b) Disociación de una sal formada a partir de un ácido débil y una base fuerte. Ejemplo : Citaremos la titulación del CH3 – COOH con NaOH CH 3 – COONa CH 3–COO - + Na + H2O OH - + H + CH3–COOH + NaOH CH3COOH presenta menor tendencia a ionizarse que el NaOH siendo ésta una solución ALCALINA. c) Disociación de una sal formada a partir de un ácido y una base fuertes. Citaremos la titulación del HCl con NaOH. NaCl Na+ + Cl – H2O OH - + H+ NaOH+ HCl La solución es NEUTRA ya que NaOH como el HCl tienen igual tendencia a ionizarse Determinación del pH mediante el uso del papel indicador : El papel Indicador: Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que al ponerse en contacto con la solución a evaluar da un color que corresponde al pH aproximado de la solución problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles indicadores, por ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH – YDRIEN papel (pH del 10 a 14) Podemos observar la siguiente tabla de indicadores: TABLA DE INDICADORES : INDICADOR Pk LIMITES COLOR Azul de timol 1.50 0.5 – 2.8 rojo – amarillo Azul de bromofenol 3.98 3.0 – 5.0 amarillo – azul Verde de bromofenol 4.68 3.7 – 5.7 amarillo - azul Anaranjado de metilo 4.00 3.5 – 4.5 anaranjado–amarillo Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 amarillo - rojo Púrpura de bromocresol 6.30 5.3 – 7.3 amarillo - púrpura Azul de bromotimol 7.00 6.0 – 8.0 amarillo - azul Rojo de fenol 7.90 6.9 – 8.9 amarillo - rojo Fenolftaleína 9.20 8.2 – 10.2 incoloro - rojo Rojo de metilo 5.10 4.4 - 6.0 rojo - amarilloF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 6
  • 7. DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO: Fundamento.- Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece cuando se emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentración en las cuales se hace pasar una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a la diferencia de concentración(es) entre las soluciones. Partes que lo constituyen.- 1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeño bulbo de vidrio soldado a un vástago de vidrio de borosilicato (pirex) dentro de él existe una solución de KCl 0.1N en la que está sumergido un electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell, quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermético constituido por un dieléctrico de cera o plástico y un casco de metal o plástico. 2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell 3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo. PARTE OPERATIVA: La calibración consiste en darle información al equipo mediante el uso de estándares de pH, o sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado. Pasos previos: Verificar la instalación correcta del equipo, su conexión con la corriente general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con agua destilada y secando los electrodos con papel filtro. Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio. La aplicación se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secándolos con papel absorbente y sumergiéndolos en la solución problema, obteniéndose su pH que se leerá en el lector en una escala de 0 a 14. Actualmente se usan pHmetros portátiles, que funcionan con baterías o con una corriente alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros. 2.4 Procedimiento 1. Determinación del pH: El alumno deberá medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor (leche, gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los métodos descritos en la práctica. 2. Titulación Acido-Base: 2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un ácido: Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidróxido de sodio) 0.1N y tres gotas de fenolftaleína Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (ácido sulfúrico) 0.1N Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gastó en la titulación (gasto) 2.2.-Titular un ácido (H2SO4 0,1 N) con una base: Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 7
  • 8. 3. Cambios de pH en un sistema Buffer: 3.1. El agua como buffer Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gastó en la titulación. 3.2. Un ácido débil y su respectiva sal en diferentes proporciones: Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de ácido acético 0.1N, 0,5mL de acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación. 3.3. Un ácido débil y su respectiva sal en iguales proporciones: Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de ácido acético 0.1N, 1,0mL de acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación. 2.5 Cuestionario 1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, saliva y su correlación con alguna patología. 2.-Principales sistemas buffer orgánicos. 2.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. BarcelonaF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 8
  • 9. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. EspañanOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COnmUESTRAS DE LEChE, YOGURT, GASEOSA, FRUTAS, JUGO DEFRUTAS. Practica N° 3 “Identificación de los carbohidratos“ “Determinación de glicemia y glucosuria“ 3.1 Marco teórico Los carbohidratos son los principales constituyentes de nuestra dieta, llegando a presentarseen un 50-60% de la misma. Así mismo, son la principal fuente de energía del humano, siendo losalmidones los más abundantes. Entre los monosacáridos de mayor importancia se tiene a la glucosa, la manosa, la galactosa (aldohexosas), la ribosa (aldopentosa) y la fructuosa (cetohexosa), entre los disacáridos tenemos a la maltosa (Glu-Glu), la sacarosa (Fru-Glu) y la lactosa (Gal-Glu), y entre los polisacáridos el almidón vegetal, al almidón animal (glucógeno) y la celulosa.. Los azúcares, hidratos de carbono o carbohidratos son los compuestos más abundantes en la naturaleza y en nuestra dieta, en su mayoría del tipo aldohexosas y cetohexosas. Los carbohidratos se ingieren en la dieta como almidones (polisacárido), sacarosa y lactosa (disacáridos) y en menor proporción en como glucosa, galactosa y fructosa (monosacáridos). El producto principal de la digestión de los polisacáridos es la glucosa (monosacárido) la cual es absorbida ya sangre donde se mantiene en ayunas entre 70 a 110 mg/dL, lo que se conoce como los niveles de Glicemia. Para su dosaje existen diferentes métodos como el de la glucosa oxidasa, el método de la orto-tolouidina (en desuso por ser cancerígeno) y el de Somogy – Nelson. Las necesidades de glucosa son cubiertas inicialmente por el glucógeno o almidón animal que es la reserva de glucosa de la que se echa mano a través de la glucogenólisis. Esta vía es regulada por dos hormonas: el glucagon para el glucógeno hepático y la adrenalina para el hepático y muscular. Cuando el requerimiento de glucosa es grande y los depósitos están vacíos, se puede formar glucosa a partir de intermediarios anfibólicos (como el lactato, los aminoácidos, el glicerol, los ácidos grasos y los cuerpos cetónicos), mediante la gluconeogenesis, que se lleva a cabo en las células hepáticas, adiposas y musculares. De esta manera se mantienen los niveles sanguíneos de glucosa que son necesarios para las células, especialmente para las células cerebrales, que no tienen posibilidad de reserva y están a merced de la glucosa circulante. En el aspecto hormonal, la glucosa sanguínea está regulada principalmente por dos hormonas secretadas por el páncreas endocrino:F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 9
  • 10. La Insulina: Es una hormona formada por 51 aminoácidos dispuestos en dos cadenas. La insulina se forma a partir de la proinsulina, que está constituida por una sola cadena polipetídica que se sintetiza en las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans. La insulina es el factor más importante de los que intervienen en la regulación de los niveles de glucosa sanguínea, que deben mantenerse dentro de unos límites rigurosos. Cuando la glucosa está elevada en la sangre el nivel de insulina se incrementa del mismo modo. El Glucagon: Es una hormona formada por una cadena polipeptídica compuesta por 29 aminoácidos; es sintetizada por las células α de los islotes pancreáticos de Langerhans y se incrementa en la sangre al disminuir la glucosa, estimulando la glucogenólisis hepática. Alteraciones del Metabolismo de los Carbohidratos: Para los efectos del establecimiento del diagnóstico en el trastorno o alteraciones del metabolismo de carbohidratos se han considerado dos situaciones clínicas bien definidas: Hiperglucemia: Es el estado biológico donde los niveles de glucosa sanguínea están por encima de los valores considerados normales: La hiperglucemia fisiológica en situaciones de excitación síquica, esfuerzos musculares, por exposición a baños calientes y a veces en el periodo menstrual, y la hiperglucemia patológica más común es la Diabetes mellitus que es un síndrome caracterizado por un aumento de los niveles de la glucosa en estado postprandial y ayuno, que conlleva a características de laboratorio como: Aumento de la glucosa en ayunas por encima de 7.8 mmol/L (140 mg/dl). Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del día, por encima de 200mg/dl Aparición de glucosa en orina (glucosuria) cuando esta pasa de 180 mg/dL en sangre (umbral renal de filtración para la glucosa). El aumento de glucosa en orina produce un aumento en la osmolaridad y en la secreción de agua en orina, con aumento de la excreción de orina (poliurea). El aumento de glucosa sérica produce igualmente un aumento de la osmolaridad sanguínea, y un aumento de agua intravascular por dos mecanismos: por una parte, se produce una sed intensa que obliga a beber una cantidad (polidipsia) y, por otra parte, existe un trasvase del agua interior de la célula al exterior, que lleva a una hemodilución de los elementos formes. Aunque existe una gran cantidad de glucosa en la sangre esta no es capaz de ingresar a la célula y producir energía debido a la falta de insulina, produciéndose sensación de hambre y el enfermo come mucho (polifagia), pero a pesar de ello disminuye su peso corporal, ya que se utilizan las reservas, activándose la gluconeogénesis, con una gran formación de cuerpos cetónicos, que dan lugar a un estado de acidosis metabólica y de halitosis (aliento a manzanas). La Diabetes se acompaña de pérdida de proteína muscular y cetosis al aumentar el catabolismo de proteínas, el músculo libera mayor cantidad de alanina proporcionando substrato para la gluconeogénesis, promoviendo la hiperglucemia debido a la mayor disponibilidad de substrato, la gluconeogénesis puede contribuir con más del 30% de la producción de la glucosa hepática; la mayor utilización de aminoácidos produce la pérdida de proteína. Con el tiempo y con hiperglicemias constantes, se producen trastornos vasculares que afectan a vasos pequeños, como los de la retina, el riñón y los capilares de la circulación general, con lo que el enfermo puede acabar con problemas de ceguera, insuficiencia renal y gangrena en zonas periféricas. El diagnóstico precoz y un buen control de la enfermedad, encaminado a mantener los niveles de glucosa dentro de unos niveles adecuados, son condiciones necesarias para que el enfermo con diabetes mellitus pueda tener una buena calidad de vida y no sea esta enfermedad la que le produzca la muerte. Hipoglucemia: Hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitúan en 2.2 y 2.5 mmol/l (40-45 mg/dL). La hipoglucemia se puede presentar por un ayuno prolongado, ejercicio intenso o a un exceso de insulina, como ocurre en la hiperplasia de las células de los islotes pancreáticos (insulinomas), o pueden ser del tipo reactivas producidas por la administración exagerada de insulina exógena o por tratamiento con hipoglucemiantes orales en el caso de enfermos diabéticos. 3.2 CompetenciasF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 10
  • 11. • Determina cualitativamente la presencia de carbohidratos en muestras de alimentos. • Diferencia entre almidones, monosacáridos y azúcares reductores presentes en los alimentos. • Determina la glucosa en sangre por el método enzimático de glucosa oxidasa. • Determina cualitativamente la glucosa en orina por el método de Benedict. 3.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Bagueta Pipeta 1mL Rvo. Benedict Luna de reloj Alcohol Pipeta 5mL Rvo. Glicemia enzimático Mechero de ron Mortero Goteros Estd Glucosa 100mg/dL Pinza para tubos Agua destilada Rvo. Lugol Micropipeta 10-100uL Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Algodón Rvo. orcinol Gradilla Pipeta 2mL Ligadura Rvo. Selivanoff Espectrofotómetro Pipeta 5mL Tips amarillos Alcohol amilico Baño maría Centrífuga Micropipeta 10-100uL Portacubetas Aguja venoject 21Gx 1” Glucosa Método enzimático de la Glucosa Oxidasa. Fundamento: Se basa en la oxidación de la glucosa por la enzima glucosa oxidasa, reacción en la que se consume oxígeno (O2) y se genera agua oxigenada (H2O2). Con esta reacción como principio, la glucosa se puede cuantificar por varios métodos: Reacción de la Glucosa Oxidasa: Glucosa + O2 GOD Acido Glucónico + H2O2 (suero) H2O2 + Cromógeno POD Compuesto coloreado+ H2O (505nm) GOD: Glucosa Oxidasa POD: Peroxidasa Para la determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT Fundamento.- Este método se basa en que la glucosa tiene la capacidad de reducir los iones cúpricos (Cu +2) a iones cuproso (Cu+).Por calentamiento los iones cuprosos forman oxido cuproso (Cu2O), este método detecta los azúcares reductores totales en orina. 3.4 Procedimiento 1.- Identificación de los carbohidratos Reacción de BenedictReacción de Molisch para Reacción de Lugol para para determinar ladeterminar la presencia de determinar la presencia de presencia de CarbohidratosMonosacáridos C Almidones reductores Muestra Muestra MuestraAgregar 2 Agregar por las Agregar 2 Calentar al mechero Agregar 2–gotas de mL de Rvo. 3 gotas deRvo. paredes por 1-2 min. Tenga lentamente 3mL de Benedict Rvo. LugolMolisch cuidado de H2SO4 (+) Formación de anillo (+) Cambio de color al azul (+) Cambio de color al verdoso, castaño, amarillo, azul intenso o negro color VIOLETA marrón o rojo ladrilloF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 11
  • 12. Reacción de Bial. Para las Pentosas. a. En un tubo de prueba se coloca 5 ml. De Reactivo de orcinol, se calienta hasta ebullición y en este momento se adiciona gota a gota 1mL de solución problema. b. La aparición de un color verde oliva , soluble en alcohol amilico, indica presencia de pentosa. Reacción de Selivanoff. a. En un tubo de prueba se coloca 3 ml de solución clorhídrica de resorcinol y 6 ml de Muestra problema. b. Luego se coloca en Baño de María hirviente por unos minutos. c. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado rojiza indica presencia de pentosas. 2.- Determinación de glicemia Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el suero. Determinación de glucosa sanguínea: Colocar en tres tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema: REACTIVO / TUBO BLANCO ESTANDARD MUESTRA Estándar Glucosa(100mg/dL) -- 20 ul -- Muestra (suero) -- -- 20 ul Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml Mezclar e incubar en baño María a 37º C por 10 minutos. Leer a 505nm, llevando a cero el aparato con el blanco de reactivo. CALCULO DE LOS RESULTADOS: Glucosa (g/L) = D (Abs M) x f f = 1,00 g/L Abs. Std VALORES DE REFERENCIA: Suero o plasma: 0.70 – 1.10 g/L Sangre total: 0.60 – 1.00 g/L LCR: 0.40 – 0.74 g/L 3.- Determinación de glucosuria Determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT: Colocar en un tubo de ensayo 8 gotas de orina patológica y en otro tubo 8 gotas de orina de su compañero (no patológica), agregar a ambos tubos 2mL. del reactivo de Benedict, llevar a hervir durante 3 minutos, enfriar e interpretar los resultados. INTERPRETACION: Color Interpretación Azul negativo Azul verdoso vestigios Verde positivo + Verde parduzco positivo ++ Amarillo positivo +++F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 12
  • 13. Rojo ladrillo positivo ++++ Normalmente en la orina no hay azucares, su presencia nos indica que hay glucosuria, que generalmente está en relación con el incremento de la glucosa en sangre sin embargo, hay algunas situaciones fisiológicas en la que esta presencia puede ser positiva pero por la presencia de otros glúcidos como la lactosa en la mujer gestante o en la que está dando de lactar sin que sea patológica. 3.5 Cuestionario 1.- Fundamento de la reacción de Molisch, Benedict y Lugol. 2.- Cuales son los azúcares característicos de cada una de las muestra empledas. 3.- Por qué la diferencia de reacción entre el azúcar blanca y rubia. 4.- Que es un “azúcar invertido” y su utilidad. 5.- Según la última clasificación de la OMS, cuantos tipos de diabetes existen. 6.- Como se produce la insulina recombinante. 3.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria yF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 13
  • 14. nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con muestras de leche, yogurt, queso, gaseosa, cerveza, azúcar rubia, azúcar blanca, huevo, galleta, pan, frutas. Practica N° 4 Seminario N° 1: “Aspectos bioquímicos de la Diabetes Mellitus y la Diabetes Gestacional”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Conceptos. Etiopatogenia 2.- Tipos de Diabetes. Factores predisponentes 3.- Insulina. Síntesis. Función. Deficiencia 4.- Complicaciones en el embarazo Seminario Nº2: “ Mecanismo Hormonales de Regulación Metabólica” Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Conceptos. Características generales de las hormonas. 2.- Clasificación de las hormonas 3.- Sistema de la adenilato ciclasa y la proteína quinasa A. 4.- Sistema de la fosfolipasa, inositol y Ca++. 5.- Receptores intracelulares Seminario N° 3: “Rol bioquímico y fisiológico del surfactante pulmonar en la maduración fetal y el de las prostaglandinas en el proceso de parto”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Significado fisiológico. Composición química. 2.- Índices de madurez pulmonar 3.- Estructura y desarrollo del alveolo pulmonar 4.- Biosíntesis. Etapa embrionaria. Etapa pseudoglandular. Fase canalicular. Fase de saco terminal 5.- Aceleración de la madurez pulmonar fetal Importancia de la utilización de corticoides en la vida fetal Rol de los corticoides en el desarrollo prenatal 6.- Efectos adversos de la corticoterapia antenatal. Riesgos fetales y maternos 7.- Enfermedades por insuficiencia del surfactante pulmonar: Atelectasias. Membrana hialina. Embolia pulmonar. Síndrome distress respiratorio 8.- PROSTAGLANDINAS. Síntesis. Metabolismo . Actividad farmacológica de las prostaglandinas. Accion de la prostaglandina en el proceso de parto Seminario N° 4: Hormonas en Embarazo y lactancia.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 14
  • 15. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Funciones 2.- Clasificación 3.- Metabolismo 4.- Regulación hormonal Practica N° 5 “Identificación y características de los lípidos“ 5.1 Marco teórico Los lípidos son macromoléculas orgánicas que se encuentran en el organismo formando parte estructural de la membrana celular, el tejido adiposo y otras formas moleculares funcionales; así mismo, constituyen una rica fuente de reserva energética de nuestro organismo. Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en agua, pero solubles en solvente orgánicos no polares como eter, acetona, cloroformo, benceno, etc. Quimicamente están constituidos por unidades denominadas ácidos grasos, unidos covalentemente a moléculas de alcohol. Los podemos clasificar en Lípidos simples (ésteres de ac.graso y alcohol generalmente glicerol), lípidos complejos (alcohol, ac. graso y otras moléculas como fosfato, aminas, carbohidratos y similares) y lípidos derivados como los esteroides, el colesterol, la Vit D y los ácidos biliares. 5.2 Competencias • Determina la solubilidad de los lípidos y un esquema de extracción. • Demuestra el poder emulsificador de las sales biliares. • Determina la presencia de colesterol 5.3 Materiales y equipos Baño maría Pipeta Bagueta KOH saturado Alcohol 1mL Cocinilla Pipeta Gradilla HCl concentrado Acetona 2mL Beacker 1L Pipeta Bencina HNO3 concentrado Cloroformo 5mL Tubo 17x150mm Gotero Bilis en SSF Agua destilada Pinza para tubos Tubo 13x100mm Mechero de ron 5.4 Procedimiento 1.- Solubilidad de los lípidos: Reactivo/Tubos 1 2 3 4 5 Aceite de oliva (gotas) 5 5 5 5 5 Agua (mL) 2 --- --- --- --- Cloroformo (mL) --- 2 --- --- Eter Etílico (mL) --- --- 2 --- Benceno (mL) --- --- --- 2 Alcohol (mL) --- --- --- --- 2 Al tubo N°5 (con alcohol) agregar 3mL de agua y calentar lentamente en el mechero. Anotar los resultados de solubilidad e interpretar. 2.-Extracción de los lípidos: -1ra. extracción: Coloque en un beacker aprox. 1 g de yema de huevo (10 gotas) y agregue 5mL de eter etílico, mezcle con la bagueta hasta obtener una mezcla homogénea que vertirá en un tubo y agite fuertemente,F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 15
  • 16. luego centrifugue a 4000 rpm. por 5min. Observe el resultado y anote. -2da. extracción: Separe cuidadosamente, en un tubo, el sobrenadante de la 1ra. extracción, y agregue al residuo 10mL de acetona, agite para mezclar. Observe y anote el resultado. Filtre la mezcla, lave residuo del filtro con acetona. Observe el precipitado y el filtrado final, anote los resultados en el siguiente cuadro: SUSTANCIA OBTENIDA CARACTERISTICAS 1ra. extracción Sobrenadante (con Eter) Precipitado 2da. extracción Sobrenadante (con acetona) Precipitado 3.-Identificación del Colesterol: Reacción de Lieberman-Burchard -En un tubo de ensayo colocar 1mL de sobrenadante de la 2da extracción y evaporar elsolvente con sumo cuidado, en baño maría de 36-40°C. -Agregar 2mL de anhidrido acético, luego, por las paredes del tubo, 0,2mL de H2SO4 concentrado. -Observe la reacción y la aparición de un color característico. Anote los resultados. Color resultante: ..................................... Corresponde a: ......................................... 5.5 Cuestionario 1.- Fundamento de las características de solubilidad de los lípidos. 2.- Composición y función de las sales biliares. 3.- Fundamento de la Reacción de Lieberman-Burchard para la identificación de colesterol. 4.- Importancia de los lípidos en la estructuración de la membrana celular. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 16
  • 17. 5.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn:hUEVOS. Practica N° 6 “Hidrólisis enzimática de los lípidos“ 6.1 Marco teórico Los lípidos son compuestos orgánicos insolubles en el agua, pero solubles en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno, disulfuro de carbono entre otros; participan en la absorción de vitaminas liposolubles, síntesis de hormonas etc. Desde el punto de vista energético constituye reserva calórica como tejido adiposo, proporcionando 9 kilocalorías por gramo. En general la hidrólisis de los lípidos libera ácidos grasos de alto peso molecular y un alcohol que depende del tipo de lípido, siendo el glicerol el mas frecuente. La digestión de los lípidos se inicia en el estómago, mediante una lipasa ácido- estable que se cree que en su mayoría se origina en la parte posterior de la lengua. Sin embargo, la velocidad de hidrólisis es lenta porque los triacilgliceroles forman una fase lipídica separada con una interfase agua-lípido limitada. La verdadera hidrólisis se realiza en la primera porción del yeyuno la primera acción de la lipasa pancréatica, esta enzima es específica para esteres en la posición 1 y 3 del glicerol y prefiere ácidos grasos de cadena larga de mas de 10 átomos de carbono. La hidrólisis de triacilgliceroles por la enzima pancreática también tiene lugar en la interfase agua-lípido de las partículas de la emulsión .La lipasa llega al intestino con el jugo pancreático requiere un pH optimo 8,sin embargo, el quimo ácido que viene del estómago no se neutraliza completamente por la alcalinidad del jugo pancréatico y la bilis. El pH intestinal es 6.5 y aún así la lipasa puede ejercer su acción. Por ejemplo a falta de la enzima cuando hay obstrucción del conducto pancreático por cualquier proceso patológico las grasas de la alimentación quedan sin digerir en las heces (esteatorrea). La lipasa libera los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3 del glicerol, pasando sucesivamente por triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos, este último con el ácido graso (en posición 2),F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 17
  • 18. sobre el no actúa la lipasa interviniendo entonces una enzima, la ISOMERASA que transforma el monoglicérido de posición 2 a 1 ó 3, haciéndolo de esta manera suceptible a la acción lenta, los productos finales de la digestión de los triglicéridos son monoglicéridos, pequeña cantidad de diglicéridos, triglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres. Las sales biliares, en especial el glicocolato y taurocolato de sodio, contenidos en la bilis llegan al hígado por el coledoco, participan en la digestión y absorción de los lípidos. Su papel en la digestión consiste en disminuir la tensión superficial de las gotas de lípidos (de 500 000 A de diámetro) originando una emulsión, en gotas de lípidos muy pequeñas, permitiendo una mayor superficie de acción a la lipasa y aumentando paulatinamente La actividad enzimática. Terminando el proceso digestivo por acción de las sales biliares, los productos finales forman complejos de 50 A de diámetro, llamadas MICELAS, que son absorbidas. Las sales biliares se absorben en el ileon y regresan al hígado por la vena porta. Los pasos de la digestión se pueden distinguir en el esquema siguiente: HIDRÓLISIS: O O H2C – O – C – R1 R1 – CO2H LIPASA + CH2 -- OH R2 – C – O – CH O + 2 H2O R2 -- CO2 --CH + H2C – O – C – R3 CH2 -- OH R3 – CO2H Triacilglicerol 2 ácidos grasos y 1 monoacilglicerol R = cadena hidrocarbonada En la hidrólisis pueden distinguirse al menos cinco fases diferentes: -Hidrólisis de triacilgliceroles a ácidos grasos libres y monogliceroles -Solubilización de los ácidos grasos libres y monogliceroles por detergentes (ácidos biliares ) y transporte desde la luz intestinal hacia a la superficie celular. -Captación de ácidos grasos libres y mono gliceroles al interior de la célula y resíntesis a triacilgliceroles. -Empaquetamiento de los triacilgliceroles recién sintetizados en glóbulos lipídicos especiales denominados quilomicrones. -Exocitósis de los quilomicrones desde las células y liberación a la linfa. 6.2 Competencias • Mide la actividad de la lipasa pancreática por titulación con una base. • Determina el efecto de las sales biliares sobre la digestión de los lípidos. 6.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Bagueta Buffer fosfato pH 8 Gradilla Baño maría Bilis en Buffer pH 8 Pipeta 1mL Aceite de oliva KOH 0.1N Pipeta 5mL Fenolftaleina Sol. Pancreatina 2% Pipeta 10mL Agua destilada Hidrólisis del aceite por acción de la lipasa Fundamento: Se ha demostrado que los aceites no hidrolizables difícilmente se absorben en cantidades apreciables. Sin embargo, cuando el aceite está en forma de emulsión muy fina, puede ser absorbido a nivel intestinal en pequeña proporción.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 18
  • 19. Para que esto ocurra es necesario la presencia de las sales biliares (bilis) que van a producir la emulsión de las grasas y de esa manera facilitar su absorción y la acción enzimática de la lipasa pancreática sobre las grasas hasta el desdoblamiento en ácidos grasos y glicerol. En todo este proceso interviene el pH óptimo de 8.00. En el laboratorio su demostración se puede llevar a cabo empleando una enzima pancreática (sintética, solución de pancreatina) en lugar de la lipasa pancreática, la cual para poder ser aislada necesita un proceso laborioso, también debido a su inestabilidad. 6.4 Procedimiento Disponer una serie de 3 tubos de ensayo y proceder de la siguiente manera Reactivo / Tubos Nº 1 2 3 Aceite de oliva neutralizado mL 1 1 -- Buffer pH 8. 0 mL - 2 2 Sales biliares en buffer pH8 mL 2 -- 2 Agua destilada mL 2 2 1 Antes de agregar la solución de pancreatinina, debemos estar seguros de que no haya acidez libre en el medio que estamos preparando, para lo cual debemos emulsionar bien cada tubo y si el color rosado del indicador (fenolftaleína) no se mantiene, nos indica acidez en el medio de proceso; se añade unas gotas de KOH 0.1N, cuidando del exceso. Solución de pancreatina mL 5 5 5 Agitar y deje incubando durante 20 minutos a 37º C. Durante este tiempo la enzima libera los ácidos grasos del aceite que acidifican el medio, esto hace virar al indicador hacia la zona ácida. En el tubo que no contiene sales liberadas, la reacción habrá sido más lenta que la del primer tubo, y en el que no contiene aceite de pepita no habrá ninguna acidez. 6.5 Cuestionario 1.- Cual es el origen de la pancreatina empleada en la práctica. 2.- Cuantos tipos de Lipasa existen. 3.- Importancia clínica, tipos y composición de la bilis.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 19
  • 20. 6.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Practica N° 7 “Identificación de proteínas, determinación de proteínas totales y fraccionadas“ 7.1 Marco teórico Las proteínas son macromoléculas compuestas de cadenas de aminoácidos. Todos los aminoácidos tienen la misma estructura básica, conformada por un carbono central α unido a un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH), un hidrógeno y un radical variable (-R) que da la diferencia entre uno y otro aminoácido, confiriéndoles propiedades distintivas. Se define como Aminoácido a aquella molécula con grupo amino y grupo carboxilo que proviene de la hidrólisis de las proteínas, según ello se han identificado 20 aminoácidos los cuales difieren en sus propiedades fisicoquímicas, a tal punto que la secuencia exacta de ellos determina, la función, la solubilidad o no en agua, su función catalítica como enzima, su función reguladora como hormona o estructural. En algunos casos variaciones en un solo aminoácido ocasiona que una proteína pierda su función. Las proteínas presentan diferentes funciones muy importantes en los procesos biológicos, actúan como elementos estructurales, biocatalizadores, coagulación sanguínea, anticuerpos, hormonas, receptores hormonales y también como nutrientes de primer orden en la dieta y alimentación del humano. PROTEINAS SERICAS: El plasma sanguíneo es una solución coloidal con gran contenido de proteínas, aprox 7-7,5 g/dL. Al conjunto de proteínas del plasma se les denomina proteínas totales plasmáticas. Albúmina.- Las albúminas constituyen mas de la mitad del total de proteínas del organismo, debido a ello se les pueden considerar como una importante reserva proteica del organismo. Se caracterizan por su gran estabilidad, solubilidad en agua y soluciones salinas, bajo peso molecular siendo el mayor contribuyente en el mantenimiento de la presión osmótica coloidal intravascular. Es sintetizada por el hígado, se encarga de fijar y transportar numerosas sustancias que son insolubles en medios acuosos tales como los ácidos grasos, hormonas esteroidales, bilirrubina, catecolaminas ,etc.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 20
  • 21. Globulinas.- Son proteínas plasmáticas complejas, muy heterogéneas, de alto peso molecular, son insolubles en agua pero solubles en soluciones salinas, constituyen las proteínas conjugadas (glicoproteínas y lipoproteínas). Fibrinógeno.- Se sintetiza en el hígado y constituye la fase preliminar de la fibrina que interviene en el proceso de coagulación sanguínea, su concentración media es de 0.3g/dL. Variaciones en los Niveles de las Proteínas Séricas -Hiperproteinemia.- Se presenta en la deficiencia relativa de agua. Se trata de cambios en la concentración y no indica que haya alteración de la cantidad absoluta de proteínas, se aprecia en casos de deshidratación, en ciertas enfermedades crónicas: procesos inflamatorios crónicos, cirrosis hepática, etc. -Hipoproteinemia.- Se presenta en un exceso relativo de agua. Se trata de cambios en la concentración y no indica alteración de la cantidad absoluta de proteínas. Pérdida excesiva de proteínas, principalmente albúmina, a través del riñón en el síndrome nefrótico, por la piel en quemaduras graves, y por el intestino en enteropatías. Disminución de la síntesis proteica por deficiencia proteica grave en la dieta, hepatopatía grave o malabsorción. A niveles <4 g/dl, es frecuente la aparición de edemas. -Hiperalbuminemia.- Es el aumento anormal de albúmina y se presenta generalmente, en casos de deshidratación. -Hipoalbuminemia.- Es la disminución anormal de albúmina lo cual genera trastornos en la distribución de los líquidos orgánicos con formación de edema, acompañados de hipocalcemia (debido a su unión con el calcio plasmático), presentándose en cuadros de infección crónica, insuficiencia hepática, hemorragias y síndrome nefrótico. -Hiperglobulinemias.- Aumento anormal de globulinas, se presenta en daño hístico activo, como en procesos inflamatorios, procesos malignos, después de traumatismos, etc. -Hipoglobulinemias.- Es la disminución de globulinas presentándose en diversos cuadros dependiendo del tipo de globulina involucrada. Las α-globulinas, están disminuidas particularmente en casos de enfisema pulmonar y aumentadas en las reacciones inflamatorias. Las γ-globulinas, están disminuidas en casos de pérdida renal como en el síndrome nefrótico, disminución de su síntesis, deficiencias inmunitarias, edad avanzada, etc, encontrándose aumentadas generalmente en procesos inflamatorios crónicos y en algunas enfermedades autoinmunitarias. TERMINOLOGIA CLINICA : Proteinograma: Gráfico que representa cada una de las concentraciones proteicas en los distintos líquidos del organismo. Proteinemia: Concentración de las proteínas en la sangre. Proteinosis: Acumulación de proteínas en los tejidos. Proteinuria : Presencia de proteína en orina. Proteinuria falsa: Proteína extraña a la de la orina por contaminación, ejemplos: leucorrea vaginal, menstruación, semen, secreciones perianales o rectales, etc. Para evitar se recomienda recoger orina por cateterismo. 7.2 Competencias • Determina la presencia cualitativa de las proteínas en diferentes muestras. • Determina la concentración de proteínas totales y fraccionadas (albúmina y globulina) en suero. 7.3 Materiales y equipos Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Centrífuga Rvo. Biuret Espectrofotómetro Pipeta 2mL Baño maría Rvo. Proti 2 Winer Prot.Tot Alcohol Pipeta 5mL Espatula Rvo. Proti 2 Winer albúmina Tips amarillos Gotero Bagueta Estándar Prot Totales y AlbuminaF-CV3-3B-2 venoject 21Gx 1” Aguja Gradilla Mortero Piceta Micropipeta 10-100uL Ligadura Algodón Rev. Junio 2007 21
  • 22. Método para la determinación de proteínas totales: Fundamento: Las proteínas en medio alcalino y en presencia de sulfato de cobre forman un complejo de color violeta, debido a que el ión cobre forma un complejo tetra coordinado con el nitrógeno del enlace peptídico C C H--N N--H R—H--C C—H--R Cu ++ C C H--N N--H Método para la determinación de Albúmina Fundamento: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la Bromo Cresosulfon Ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a un pH 3.8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivos, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. 7.4 Procedimiento DETERMINACIONDE PROTEÍNAS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS Colocar cada muestra en tubos de ensayo (si son alimentos líquidos) o en lunas de reloj (si son alimentos sólidos) y agregar 2 mL de Rvo de Biuret. El color violeta indicará la presencia de proteína y el mantenimiento del color celeste la ausencia. De requerirlo, un alimentos sólido (cereales, granos, otros) puede ser triturado en el mortero previo a la reacción. DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el suero. Colocar en tres tubos de acuerdo al esquema siguiente: Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA Agua destilada 50 uL - - Estándar Prot. Tot. - 50 uL - Muestra (suero) - - 50 uL Rctv.EDTA/ Cu 3.5 mL 3.5mL 3.5 mL Mezclar e Incubar durante 15 minutos a 370C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando a cero con el tubo blanco. Estabilidad de la mezcla de reacción Final: El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. DETERMINACION DE ALBUMINAS Colocar en tres tubos lo siguiente: Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA Estándar Albúminas - 10 uL - Muestra (suero) - - 10 uL Reactivo BCF 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mLF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 22
  • 23. Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28º C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm llevando a cero con el blanco de reactivo. Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de la reacción es estable 20 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS: Proteínas Totales (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std.P.T.g/dL] Abs Std Albúmina (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std. Alb. g/dL] Abs. Std. Globulinas (g/dL) = [Proteínas Totales] - [Albúmina] Relación A/G = [Albúmina g/dL] [Prot. Tot. g/dL] - [Alb. g/dL] VALORES DE REFERENCIA: Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dL Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dL Globulinas: 2,0 a 3.6 g/dL Relación A / G: 1–2 7.5 Cuestionario 1.-Mencione usted las características moleculares de: Caseína, ovoalbúmina, suero de leche, gelatina, insulina, glutatión. 2.- Tratamientos contra las quemaduras empleando colágeno. 3.- Explique usted los cuadros de hipoproteinemia por pérdida renal. 7.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. BarcelonaF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 23
  • 24. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. EspañaNOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con lo siguiente: Huevos, leche, yogurt, carne cruda,carne cosida, soya, quínua. Practica N° 9 “Determinación de Colesterol” 9.1 Marco teórico El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de los ácidos biliares, esteroides, y vitamina D. Su determinación contribuye al diagnóstico y clasificación de las dislipidemias. 9.2 Competencias • Determina la concentración de Colesterol en suero • Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico 9.3 Fundamentos del metodo El colesterol se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm. Colesterol ester CEH Colesterol + ácidos grasos Colesterol + O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H2O2 2H2O2 + 4-AAP +p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O 9.4 Reactivos y Equipos Conservado entre 2° y 8° C. y protegido de la luz, estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El reactivo con el tiempo puede tomar un leve color rosado que no afecta los resultados. Descartar el reactivo si la absorbancia contra blanco de agua es superior a 0.4 D.O. a 505 nm. Preparación: El reactivo se provee listo para su uso. Composición del reactivo enzimático: Buffer fosfato pH 7.2 100 mMF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 24
  • 25. Colesterol ester hidrolasa >150 U/l Colesterol oxidasa (recombinante) >100 U/l Peroxidasa >1000 U/l 4-Aminoantipirina 0.4 mM Acido p-hidroxibenzoico 10 mM Azida sódica 0.1 g/dl Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s. Solución standard: Colesterol en solución acuosa estabilizada 200 mg/dl Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de medir absorbancia a 505 nm. (rango 500 - 550 nm.) Baño Maria Pipetas MUESTRAS Utilizar de preferencia suero o plasma (Heparina o EDTA) libre de hemólisis. La muestra debe tomarse con el paciente en ayunas. Los tubos y material de vidrio deben estar limpios y libres de residuos de detergentes. El colesterol es estable 7 días a temperatura ambiente, y 6 meses en congelador. 9.5 Procedimiento Llevar el reactivo a la temperatura que se realizará el ensayo. Las pipetas a utilizar deben estar limpias y libres de residuos para no contaminar el reactivo. Blanco Standard Muestra Muestra (ml) -- -- 0.01 Standard (ml) -- 0.01 -- Reactivo (ml) 1.00 1.00 1.00 Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C. ó 10 minutos a temperatura ambiente (>20°C.). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos. 9.6 Calculos FACTOR = 200 Absorbancia Standard Colesterol (mg/dl)= Factor x Abs. Muestra RANGO DE REFERENCIA 140 a 200 mg/dl “Determinación de Acido Úrico en suero “ 9.7 Marco teórico Los nucleótidos de una célula se estan renovando continuamente. Los nucleotidos se degradan por hidrólisis a nucleósidos, por medio de lasF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 25
  • 26. nucleotidasas. Las nucleósidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforolítica de los nucleósidos para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de una base nitrogenada de tipo purínica A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón dando lugar a urato. En los seres humanos, el urato es el producto final de la degradación de las purinas y se excreta en la orina. Niveles elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en la que las sales de urato forman cristales que deterioran las articulaciones y los riñones. En algunos casos se utiliza el alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar la gota. También existen otros desórdenes que transcurren acompañados de hiperuricemia, tales como leucemia, policitemia, mieloma múltiple, intoxicación plúmbica, incluyendo alteraciones medicamentosas en los tratamientos con citostáticos o con tiazidas. Mientras que otros medicamentos (drogas uricosúricas tales como salicilatos y la fenilbutazona) aumentan la excreción del ácido úrico, disminuyendo los niveles séricos del mismo 9.8 Competencias • Determina la concentración de ácido úrico en suero • Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico 9.9 Materiales y equipos Micropipeta 10 a 200 ul Tips amarillo Pipetas 5 mL Suero Gradilla Estándar de ácido urico 10 mL x grupo Tubos 3 x mesa Rvo Enzimático de acido úrico 10 mL x grupo Espectrofotométro Baño María 9.10 Fundamento del método El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa, generándose alantoína y H2O2, el cual en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3 dimetiaminobenzoico y 4 – AAP produciéndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 555 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de ácido úrico presente en la muestra. Acido Úrico uricasa Alantoína + H2O2 H2O2 + DMAB + 4- AAP POD H2O + Complejo coloreado 9.11 Procedimiento BLANCO STANDARD MUESTRA Muestra (ml) --- --- 0, 025 Standard (ml) --- 0, 025 --- Reactivo (ml) 1,00 1, 00 1, 00 Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C, o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). Leer a una longitud de onda óptima 555 nm. Llevar a cero con agua destilada el espectrofotómetro Anote la absorbancia de la muestra:……………. La fórmula matemática a usar es el factor de calibración FACTOR = 10 mg/mL Absorbancia Estándar ACIDO ÚRICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDOF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 26
  • 27. VALORES DE REFERENCIA: En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl. Mujeres...................... 2, 4 a 5, 7 mg/dl. 9.12 Cuestionario 1.- ¿Cuáles son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades cardíacas y vasculares, Además del exceso de colesterol? 2.- ¿Qué tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno? 3.- ¿Cómo afecta a los niños el colesterol, y cuál es el nivel de colesterol recomendable en la infancia? 4.- Desarrolle el esquema metabólico de la formación del ácido úrico? 5.- Señale que otras muestras biológicas podemos usar para determinar ácido úrico? 9.13 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 27
  • 28. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Practica N° 10 “Actividad enzimática y factores que la afectan“ 10.1 Marco teórico Las Enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químico-biológicas acelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio. Los substratos son las moléculas sobre las que actúan las enzimas. En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentración de la enzima. La Actividad Enzimática se puede expresar como: a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO. E + S E + b.- La APARICION del PRODUCTO P c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES Factores que Modifican la Actividad Enzimática Donde: C C´ Son diversos: E = Enzima 1.- pH del medio S = Substrato 2.- Temperatura P = Producto 3.- Concentración de Enzima 4.- Concentración de Substrato C = Cofactor antes de la reacción 5.- Acción de Inhibidores y Activadores 10.2 Competencias • Comprueba la acción de los factores que regulan la actividad enzimática • Demuestra como la actividad enzimática puede ser expresada. 10.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Pipeta 1mL Indicador de pH Solución Salina 1-14 Fisiológica Potenciómetro Pipeta 5mL Estandar de pH 4 Albúmina de huevo en SSF Baño maría Pipeta 10mL Estandar de pH 7 Pepsina en SSF Hielo Bagueta Estandar de pH 10 Agua destilada Beacker 500mL Gradillas Portacubetas NaCO3 10% Espectrofotómetr HCl 1N o Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA. La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de proteínas convirtiéndolas en cadenas pequeñas. La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrará por desaparición del substrato, o sea la disminución de la turbidez de una solución de Albúmina de huevo sobre la cual actuará la enzima. La turbidez se leerá en el ESPECTROFOTOMETRO.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 28
  • 29. 10.4 Procedimiento Experiencia Nº1 EFECTO DEL PH Principios Teóricos.- Si actúa una enzima sobre un Efectos del pH sobre la Actividad substrato n cantidades equimoleculares (iguales) Enzimática. variando el pH del medio de reacción, se observará que existe una región o punto de actividad óptima, A E pH óptimo correspondiendo al pH, al cual se denomina pH c n 1 OPTIMO, que varía con la pureza de la enzima, el t z tipo de sustancia sobre el cual actúa, las sales del medio, etc. Ello debido a la interacción E–S (Enzima i i –Substrato) que se realiza, en gran parte, a través de v m los grupos ionizados existentes en sus moléculas. La i á concentración de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-) d t presentes en el medio, alteran los grupos ionizados a i e impiden la asociación de las moléculas. d c Procedimiento Experimental: a Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente: 0 Tubo Nº 1 2 3 4 5 BAJO pH 6 H2O dest. (mL) --- 1,5 2 1,5 --- --- HCl 1N (mL) 2,0 0,5 --- --- --- Na2CO3 10%(mL) --- --- --- 0,5 2,0 --- Albúmina (mL) 5 5 5 5 5 --- Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 20 pH del tubo 1.0 2 6.0 10 11.0 --- Incubar por 5 min los 6 tubos en Baño maría a 37ºC. Añadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien. Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en baño maría a 37ºC. Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotómetro a una longitud de onda de 440nm, usando un blanco de agua destilada. La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubación, de no ser así, mantener los tubos en agua helada hasta el momento de la lectura. CALCULOS: Para obtener la actividad enzimática se debe restar la mayor absorbancia obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papel milimetrado, colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimática en las ordenadas. RESULTADOS: Encontrar el pH óptimo de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA Experiencia Nº2 EFECTO DE LA TEMPERATURA Efectos de la Temperatura sobre la Principios Teóricos.- La temperatura acelera la velocidad Actividad Enzimática. de las reacciones al aumentar las colisiones efectivas entre A E Temperatura los elementos reaccionantes. En una reacción enzimática también deben colisionar E-S óptima (Enzima-Sustrato) para que la reacción progrese, por c n 1 tanto, las reacciones enzimáticas serán más rápidas a t z mayores temperaturas, sin embargo y dada la naturaleza i i proteica de las enzimas, la temperatura no puede v m aumentarse indefinidamente, pues comenzarán a romperse los puentes de hidrógeno, alterándose las i á estructuras secundarias, situación que se conoce como d t DESNATURALIZACION (Ver esquema). a i d c Procedimiento Experimental: 1º Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente: Reactivo / Tubo N° CONTROL 1 2 3 4 5 H2O dest. (mL) 3,0 3,5 3,5 3,5 3,5 ---F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 29
  • 30. HCl 1N (mL) --- 0,5 0,5 0,5 0,5 --- Albúmina (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 --- Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 11 Incubar por 5 min a 37°C en baño maría Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 e inmediatamente incubar por 5min según el esquema siguiente: Tubo 1 2 3 4 Temperatura °C 0 (hielo) 25(Ambiente) 37 100 (ebullición) Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la reacción, hasta el momento de su lectura. Leer al espectrofotómetro los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con agua destilada. CALCULOS: La actividad enzimática se encontrará restando la lectura de cada tubo (1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un papel milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimática en las ordenadas. RESULTADOS: Encontrar la T° óptima de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA 10.5 Cuestionario 1.- Explique el mecanismo de acción de la las enzimas 2.- Escriba la reacción que cataliza la pepsina. 3.- Con los datos de la práctica elabore las gráficas de pH vs Actividad y T° vs Actividad, y explique en función a la bibliografía recomendada. 4.- A que llamamos especificidad por el sustrato? 5.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnóstico clínico, de ejemplos.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 30
  • 31. 10.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Prática N° 11 REPRESENTACION GRAFICA DEL MECANISMO DE ACCION DE LAS HORMONAS A NIVEL DE MEMBRANA Y A NIVEL DE NUCLEO 11.1 Marco teórico.Las hormonas son sustancias químicas que se caracterizan por ejercer su actividad en un lugardiferenta a donde se producen, se encuentran por lo general asociadas a una glándula endocrina, estalibera a la hormona al torrente sanguíneo hasta que recibe la señal fisiológica adecuada. La hormonaviaja por el torrente circulatorio e interactúa con la las célula diana mediante la unión inicial a unreceptor macromolecular, situado en la membrana plasmática o en el interior de la célula. Para ejercer su acción, todas las hormonas deben unirse a su receptor específico, estas unionesinician mecanismos intracelulares que conllevan las respuestas celulares. De acuerdo a sumecanismo de acción las hormonas se dividen en dos grupos,Los receptores de membrana en general presentan dominios específicos que: a.). Se unen al ligando;b). Interactúan con sistemas efectores ya sea en forma indirecta a través de la proteína G o directa porlos canales del calcio; c). Tienen actividad enzimática inherente; d). Determinan la localización en lamembrana e internalización.Con respecto a las hormonas esteroídeas, estas se producen en células específicas de los testículos,la corteza adrenal, ovarios y placenta. Los testículos son los encargados de secretar, principalmente,testosterona (andrógenos), la corteza adrenal produce la aldosterona, cortisol y la DHEA(dehidroepiandrosterona), los ovarios producen los estrógenos que engloban el estradiol, 4-androsteno-3, 17-diona y la progesterona, y por último esta la placenta que también secreta estradiol yprogesterona, pero además produce otra sustancia, el estriol. Gracias a su naturaleza lipídica las hormonas esteroídeas atraviesan fácilmente las membranas de lascélulas diana o células blanco, y se unen a las moléculas receptoras de tipo proteico, que seencuentran en el citoplasma. De esta manera llegan al núcleo, donde actúan sobre genes del ADN, seproduce la transcripción. Las moléculas de ARNm originadas se encargan de dirigir en el citoplasmala síntesis de unidades proteicas, que son las que producirán los efectos fisiológicos hormonales. 11.2. Competencia. Representa con gráficos el mecanismo de acción de las hormonas a nivel deMembrana y a nivel de núcleo.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 31
  • 32. 11.3. Materiales. a. Bibliografía del silabo de Bioquímica y Nutrición b. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.) c. Retroproyector. d. Videos VHS, etc e. Libros y revistas f. C D .Power point. 11.4.Procedimiento. Se realizará de acuerdo a la técnica para elaborar representaciones gráficas del mecanismo de acción de las hormonas a nivel de membrana biológica y a nivel de núcleo. 11.5. Cuestionario. a. Elabore un mapa conceptual del mecanismo de acción del glucagón. b. A que nivel actúa el glucagón y, a que nivel lo hace la adrenalina. c. Grafique el mecanismo de acción de la hormona de crecimiento.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 32
  • 33. d. Esquematice el mecanismo de acción de la testosterona. e. Elabore un mapa conceptual de las hormonas d la corteza adrenal.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 33
  • 34. Practica N° 12 “Evaluación nutricional de un niño“ 12.1 Marco teórico La evaluación nutricional de un individuo es el conjunto de procedimientos destinados a determinar las condiciones físicas y orgánicas en que se encuentra en determinado momento de su vida. Estas condiciones se ven afectadas por factores ambientales, sociales, económicos, etc., los cuales deben ser incluidos para la evaluación. Para realizar la evaluación nutricional de un ser humano o de un grupo humano más o menos homogéneo, se precisa de ciertas normas, que aplicadas debidamente pueden proporcionar datos útiles sobre el estado nutricional de dicha persona o grupo de personas. Para esta clase de evaluaciones existen muchas técnicas, algunas complejas y otras simples. Sin embargo, toda evaluación nutricional debe considerar los siguientes aspectos: 1. Aspectos geográficos y socioeconómicos. 2. Estado sanitario y epidemiológico. 3. Antropometría. 4. Estudio Clínico. 5. Estudios de laboratorio. 6. Encuestas alimenticias. 12.2 Competencias • Determina el estado nutricional del niño evaluado y los factores que contribuyen a ello. 10.3 Materiales y equipos Cinta CIMDER o brazalete de salud Balanza de pié Cinta métrica Tensiómetro Balanza con tallímetro Estetoscopio 12.4 Procedimiento 1. Determine el peso y talla del niño, paro tomar estas medidas deben encontrarse con prendas de vestir ligeras y sin zapatos, anote lo datos. 2. Pregunte usted sobre sus datos de procedencia, socioeconómicos y sanitarios del paciente evaluado. 3. A través de la observación, realice una evaluación clínica del paciente tomando como referencia las pautas establecidas en el cuadro adjunto. 4. Con los datos obtenidos elabore un informe sobre el estado nutricional del niño. 12.5 Cuestionario 1. Busquen en la bibliografía relacionada las tablas de peso-talla y superficie corporal para interpretar los resultados. 2. ¿De acuerdo a la evaluación clínica realizada su paciente tiene alguna deficiencia nutricional? ¿Cuál? ¿Por qué? 3. ¿En los datos existe algún factor que contribuye con mayor incidencia en el estado nutricional del paciente?F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 34
  • 35. 4. Escriba como calcula la cantidad de calorías consumida por su paciente ¿Es un valor normal? 5. ¿Cuál es la unidad de consumo de la familia completa de su paciente? 6. Haga una breve revisión bibliográfica sobre la forma que influye, sobre el estado nutricional, cada aspecto evaluado. 12.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. EspañaF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 35
  • 36. DATOS CRITERIOS RESULTADOS DATOSESTUDIO Cabellos: anotar si falta CRITERIOS brillo, pigmentación, grosor, RESULTADOSCLINICO Nombres y Apellidos fragilidad de arrancarlos. Edad Pigmentación de la piel, presencia de dermatitis Cara:PERSONALES Sexo seborréica en la región naso-labial, inflamación Raza Labios: palidez, queilosis y estomatitis angular.GEOGRAFICO Procedencia familiar papilar, edema, glositis Lengua: Color, atrofiaSY Ubicación domiciliaria Ojos: Palidez conjuntival, manchas de Bitot, xerosis de laSOCIOECONO Tipo de construcción conjuntiva y de la cornea, queratomalaciaMICOS Gastos diarios enmoteado, caries, número de dientes. Dientes: Esmalte alimentos Agua y desague Encias: Esponjosas, sangrantes, inflamación Disposición de excretas Glándulas del cuello: Aumento de tamaño de la tiroides yESTADO Disposición de basura glándulas salivales parótidasSANITARIO Luz eléctrica Piel y uñas: Xerosis, petequias, hiperqueratosis, dermatitis Problemaaspecto de pintura cuarteada, inflamación, pelágica, epidemiológico Peso ausencia de grasa, edema subcutánea, erupciones Talla subcutáneo: Edema, cúmulos, grasos TejidoANTROPOMET Superficie corporal Tejido muscular esquelético: Atrofia muscular, incrementoRIA Perímetro braquial. de las protuberanciasfrontales, occipitales y de las epífisis Pliegue cutáneo óseas. Nódulos costales. Deformaciones toráxicas y de las piernas Abdomen: Hepatomegalia, Esplenomegalia Cardiovascular: Frecuencia cardiaca, presión arterial, edema, especialmente en miembros inferiores Sistema nervioso: Reflejos rotuliano y aquíleo. Parálisis. Parestesia, Confusión mental. N° de veces que come al día Alimentos que más consume en :a)DesayunoENCUESTA b)AlmuerzoALIMENTICIA c)Lonche d)Cena N° de calorías al díaRESULTADO ESTADO NUTRICIONAL RECOMENDACIONESDE LAEVALUACION Practica N° 13 MAPA CONCEPTUAL DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES E HIDROSOLUBLES 13.1. Marco teórico. Las vitaminas son compuestos orgánicos de composición variada, esenciales para los seres vivos e Imprescindibles en los procesos metabólicos que tienen lugar en ellos. Actuán no solo como biocatalizadores sino como componentes de varios coenzimas que son indispensables para que se realicen todas las transformaciones en el organismo. Si bien no aportan energía, puesto que no se utilizan como combustible, sin ellas el organismo no es capaz de aprovechar los elementos constructivos y energéticos suministrados por la alimentación.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 36
  • 37. La dieta debe suministrar las vitaminas debido a que el cuerpo humano no las sintetiza, a excepción de la vitamina D que se puede obtener por exposición de la piel a los rayos solares y las vitaminas K, B1, B12 y ácido fólico, que se forman en pequeñas cantidades en la flora intestinal. Es importante mencionar que el consumo de tabaco, alcohol o drogas ocasiona un mayor gasto de algunas vitaminas, por lo que en estos casos se considera necesario ingerirlas en mayor cantidad o hacer un aporte suplementario teniendo en cuenta que las que vienen naturalmente en los alimentos son más efectivas que las que se producen en laboratorio 13.2. Competencia. Conceptualiza la clasificación de las vitaminas y lo esenciales que son para la vida del ser humano. 13.3. Materiales. a. Bibliografía del silabo de Bioquímica. b. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc. c. Videos VHS, etc d. Libros y revistas e. C D .Power point 13.4. Procedimiento. Se realizará de acuerdo a las normas de aprendizaje establecidas por la Universidad, donde los alumnos elaborarán de acuerdo a técnicas establecidas un mapa conceptual de la clasificación de las vitaminas. 13.5. Cuestionario. a. Elabore un mapa conceptual de las vitaminas que son precursoras de las coenzimas.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 37
  • 38. b. Mencione 3 vitaminas que tienen origen animal. c. Prepare una tabla con los frutos o verduras que tengan el porcentaje mas alto en vitamina C, d. Porqué se requiere ingerir vitamina D para poder asimilar el calcio. 13.6. Fuentes de Información. 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Practica N° 14 “Valoración bioquímica y nutricional de un alimento“ 14.1 Marco teórico Los alimentos que consumimos a diario nos aportan una serie de nutrientes que contribuyen a cubrir nuestras necesidades. Algunos como las menestras y tubérculos son ricas en carbohidratos, otras como las carnes y los huevos aportan gran cantidad de proteínas, mientras que los aceites, maní, palta y otros aportan las grasas necesarias. Sin embargo la mayoría de los alimentos presentan, en proporciones diversas, todos los nutrientes, los cuales nos permite tener en un solo producto los componentes necesarios para cubrir nuestras necesidades. En la práctica aplicaremos los conocimientos y destrezas adquiridos durante el desarrollo de las experiencias anteriores para valorar e identificar la presencia de los nutrientes más importantes como los carbohidratos, lípidos y proteínas en un alimento.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 38
  • 39. 14.2 Competencias • Valora e identifica cualitativamente el contenido de los nutrientes mas importantes, en un alimento. • Aplica los conocimientos y destrezas adquiridas en la realización de las experiencias en las prácticas anteriores, en la valoración bioquímica de un alimento. 14.3 Materiales y equipos Tubos 17x150 Centrífuga Papel filtro HCl 0,5N Anhidrido acético Pipeta 5mL Mortero Algodón HNO3 concentrado H2SO4 conc. Mechero de ron Gotero Gradillas Acetato de plomo Rvo. Benedict Beacker 50mL Baguetas Picetas Ninhidrina Rvo. Lugol Luna de reloj Acetona Balanza Hidróxido de amonio Agua destilada Rvo. Biuret Eter etílico Hidróxido de sodio 0,1N 14.4 Procedimiento 1.- Preparación de la muestra: Pele el alimento si éste tuviera cáscara. Luego tome un trozo del mismo y péselo en la balanza y anote el resultado. En un mortero, triture o muela el producto hasta obtener una muestra homogénea. Separe la muestra en tres porciones equivalentes en una luna de reloj. Denomínelas Muestra A, B y C. 2.- Identificación de componentes orgánicos: 2.1. Identificación de lípidos y colesterol: Extracción de los lípidos: -En un Beacker coloque la muestra A y agregue 5mL de eter etílico, mezcle con la bagueta hasta obtener una mezcla homogénea. -Vierta la mezcla en un tubo y agite fuertemente y centrifugue a 4000 rpm. por 5min. Observe el resultado y anote. -Separe el sobrenadante con cuidado en otro tubo y agregue 10mL de acetona, agite suavemente para mezclar y luego observe y anote el resultado. -Filtre la mezcla lavando el filtro con acetona. -Observe el precipitado y el filtrado final, anote los resultados en el siguiente cuadro: SUSTANCIA OBTENIDA CARACTERISTICAS Con Eter 1er. Precipitado Filtrado Final Precipitado Final Identificación del Colesterol: -En un tubo de ensayo colocar 1mL de filtrado final de la experiencia anterior, evaporar con sumo cuidado el solvente en baño maría de 36-40°C. -Agregar 2mL de anhidrido acético y por las paredes del tubo 0,2mL de H 2SO4 concentrado. -Observe la reacción y la aparición de un color característico. Anote los resultados. Color resultante: ..................................... Corresponde a: ................................ 2.2. Identificación de Carbohidratos: Coloque la muestra B en un tubo de prueba, agregue 5mL de H2O destilada y agite fuertemente hasta lograr una disolución o suspensión homogénea. Mida el pH y anote.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 39
  • 40. -Separe la muestra colocando 2mL de la misma en dos tubos de prueba. -Realice las siguientes reacciones: Tubo 1: Reacción de Benedict cualitativa, 2mL de muestra + 2mL del Rvo. de Bénedict, agitar y, con una pinza de madera, calentar a ebullición en el mechero por 1-2min y anotar el cambio de color. TENER MUCHO CUIDADO. Tubo 2: Reacción del Lugol, 2mL de la muestra agregar 1-2 gotas de Rvo. Lugol y anotar el cambio de color a Negro si existe almidón 2.3. Identificación de proteínas y aminoácidos: -Coloque la muestra C en un beacker, agregue 20mL de H2O destilada y agite fuertemente hasta lograr un solución o suspensión homogénea. -Separe la muestra colocando 2 mL de la misma en 8 tubos de prueba. -Realice las siguientes reacciones: Tubo 1: Reacción de precipitación por calor, 2mL de muestra calentar directamente al mechero sin quemar la muestra, anotar los resultados. Tubo 2: Reacción de precipitación por ácido, 2mL de muestra agregar 1mL de HCl 0,1N, anotar los resultados. Tubo 3: Reacción de precipitación por álcalis, 2mL de muestra agregar 1mL de NaOH 0,1N, anotar los resultados. Tubo 4: Reacción de precipitación por metales pesados, 2mL de muestra agregar 1mL de acetato de plomo 10%, anotar los resultados Tubo 5: Reacción de Biuret, 2mL de muestra agregar 2mL de Rvo. de Biuret, observar el color violeta característico de la presencia de proteínas, anotar. Tubo 6: Reacción Xantoprotéica, 2mL de muestra agregar HNO 3 concentrado, agite y caliente suavemente, observe la aparición de color naranja que indica la presencia de proteínas, anotar los resultados. Tubo 7: Reacción de la Ninhidrina, 2mL de muestra agregar 0,5mL de ninhidrina, calentar suavemente hasta hervir por 2min, anotar los resultados. Tubo 8: Reacción de identificación de Aminoácidos azufrados, 2mL de muestra agregar 2mL de NaOH 0,1N, hervir por 3min, enfriar y agregar 10 gotas de acetato de plomo, dejar caer con mucho cuidado 1mL de HCl conc., anotar los resultados. CUADRO DE RESULTADOS Rx PROCESO RESULTADO DATOS DE LA Peso de la muestra MUESTRA PH de la muestra 1 Extracción IDENTIFICACIÓN DE 2 Fosfolípidos LIPIDOS 3 Colesterol 4 Glucosa IDENTIFICACION DE 5 Fructuosa CARBOHIDRATOS 6 Almidón 7 Floculación al calor 8 Floculación por ácido IDENTIFICACION DE 9 Reacción de Biuret PROTEINAS Y 10 Reacción Xantoprotéica AMINOACIDOS 11 Reacción de Ninhidrina 12 Reacción de AAcs. azufrados14.5 Cuestionario 1.- ¿Qué compuestos orgánicos logró identificar en el alimento estudiado? 2.- ¿Cómo reconoció cada compuesto identificado en la práctica?F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 40
  • 41. 3.- Los procedimientos utilizados dan resultados cuantitativos o cualitativos? ¿Por qué? 4.- Busque información sobre la composición química porcentual del alimento que utilizó en la práctica. 5.- Con los datos de la pregunta 4 y el peso de la muestra que utilizó, calcule el aporte energético del alimento utilizado. 6.- ¿Cuales serán los requerimientos de carbohidratos, lípidos y proteínas en una gestante? 7.- Defina: Dieta balanceada, dieta hipocalórica, dieta hipoprotéica. 8.- Proponga usted una dieta para: a)Niño de 0-1año; b)Miño pre-escolar; c)Adolescente mujer de 12-17 años; d)Gestante normal en 1er, 2do y 3er trimestre; e)Gestante diabética; f)Gestante hipertensa; g)Anciano. 9.- ¿Cuanto de energía aportará una porción de un alimento que pesa 145g y está constituído por el 40% de almidones, 27% de grasa. 22% de proteínas, 6% de agua y 5% de fibra? 14.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España)F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 41
  • 42. 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. EspañaNOTA: El alumno deberá traer a la práctica un alimento a base de harinas, huevos yleche.. Practica Nº 15 Seminario N° 5: “Rol del Calcio, Hierro y Hemoglobina durante el embarazo y la lactancia”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Calcio. Fuentes. Requerimientos. Importancia en el embarazo y lactancia. 2.- Hierro. Fuentes. Requerimientos. Importancia en el embarazo y lactancia. 3.- Hemoglobina. Características. Función en el organismo y durante el embarazo y la lactancia. Seminario N°6: Cáncer. Aspectos Moleculares. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades 2.- Características de la célula cancerosa 3.- Aspectos genéticos del cáncer 4.- Metastasis 5.- Angiogenesis Seminario N° 7: Bioquímica de la Nutrición, digestión y transporte de Biomoleculas. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Consideraciones energéticas y materiales 2.- Absorción (absorción de alimentos) 3.- Digestión Seminario N°8: “Alteraciones Nutricionales por exceso y deficiencias”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Vitaminas 2.- Minerales 3.- Macronutrientes (carbohidratos, lípidos, proteínas)F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 42

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