Microbiología de Alimentos II: PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

43,245 views
42,862 views

Published on

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

Published in: Education
0 Comments
10 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
43,245
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
68
Actions
Shares
0
Downloads
559
Comments
0
Likes
10
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Microbiología de Alimentos II: PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

  1. 1. lESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL Licenciatura en Nutrición MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II Laboratorio Nº 9 Tema: PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION Autor: JORGE ANDRÉ ROMÁN PERERO Docente: MSc. ABEL ROSADO Ayudante: FAUSTO CARRASCO Fecha de Entrega: 31 de Junio del 2012 Curso: 2012-2013
  2. 2. INTRODUCCIONPRUEBAS APILos sistemas miniaturizados API son métodos rápidos que permiten laidentificación de microorganismos a través de la realización de diferentespruebas bioquímicas. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico convarios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados odiferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requieremontar. Entre algunas de las pruebas bioquímicas que pueden realizarse conestos sistemas están las pruebas de fermentación de carbohidratos, ladeterminación de la producción de H2S, la determinación de la hidrólisis de lagelatina, entre otras.El Índice Analítico de Perfil (API) son un conjunto de pruebas bioquímicas que seconcentran en muy poco espacio mediante el uso de pocillos con el reactivocorrespondiente ya preparado para ser usado. Se llenan los pocillos siguiendolas instrucciones del fabricante con la muestra problema. Se sellan los pocillosque sean obligatorios. Se incuba la estufa a unos 37º C normalmente.Posteriormente se comprueba los resultados pasado el tiempo indicado en latira. Los resultados se apuntan por cada prueba bioquímica en el casillerocorrespondiente, de manera que al final dará un número de varias cifras. Coneste número se puede buscar en el libro de referencia de las tiras API, el tipo debacteria que se tiene en la muestra. Son muy útiles, capaces de identificar enpoco tiempo la bacteria problema (actualmente unas 600 especies).Sistemas de identificación multipruebas (API): La batería de pruebas API20E esun sistema de identificación rápida para bacterias de lafamilia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram-. Básicamente consta de 21tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Estesistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizarnumerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos opocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una pruebabioquímica distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de formaindependiente a la tira. Las pruebas de que consta la galería son las siguientes:
  3. 3. Batería de pruebas API: Pruebas incluidas y tablas de lectura con coloracionespositivas y negativas Pueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja azul oscuro o CIT utilización del citrato verde turquesa sin precipitado H2S producción de H2S precipitado negro negro URE ureasa amarillo rojo o naranja TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo color rosa o anillo IND producción de indol amarillo rosa-rojo producción de acetoína (Voges- VP sin color rosa-rojo Proskauer) difusión de GEL gelatinasa sin difusión pigmento GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo OX citocromo oxidasa
  4. 4. Pruebas API que actualmente se encuentran siendo utilizadas en la granmayoría de laboratorios de Microbiología son:API 20E: Permite la identificación de microorganismos pertenecientes al grupode las enterobacterias y de otros bacilos gram negativos.API 20 NE: Permite la identificación de bacilos gram negativos no pertenecientesal grupo de las enterobacterias como por ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter,Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros.API 20 A: Con este sistema miniaturizado se pueden montar las pruebasbioquímicas que permiten la identificación de bacterias anaerobias.API STAPH: Este sistema permite la identificación de microorganismospertenecientes al género Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria.API 50 – CHL: Utilizado para la identificación de Lactobacilos.Existen otros sistemas miniaturizados API; entre ellos podemos señalar el API20STREP, el API CAMPY, el APICORYNE, el APICANDIDA. OBJETIVO - Identificar mediante pruebas bioquímicas la cepa de Salmonella spp (Aislada del huevo, practica pasada, especialmente de la parte interna).
  5. 5. DESARROLLOPruebas Bioquímicas desarrolladas en la práctica: - Urea Agar. - MR-VP Medio - Agar Citrato de Simmnons - Agar Hierro Tres Azúcares - Agar Levine – EMB - Agar SIM médium - Oxidasa - Catalasa - MicroscopiaUrea Agar: Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a laactividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, talescomo Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.FundamentoEn el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para eldesarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balanceosmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan laurea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono.Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo alrojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa,acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizanlentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella. Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesTripteína 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950 mlGlucosa 1.0 de agua destilada. Dejar reposar 2Cloruro de sodio 5.0 minutos. Esterilizar en autoclave aFosfato monopotásico 2.0 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de unaRojo de fenol 0.012 solución de urea al 40% previamente esterilizada porAgar 15.0 filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo. pH final: 6.8 ± 0.2
  6. 6. Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del picode flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo deincubación.Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.Resultados Microorganismo Actividad ureásica Color del medio Proteus mirabilis ATCC 43071 Positiva Rojo-Rosado K. pneumoniae ATCC 700603 Positiva débil Rojo-Rosado Escherichia coli ATCC 25922 Negativa Amarillo S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo S. typhimurium ATCC 14028 Negativa AmarilloMR-VP Medio: Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo yVoges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación deenterobacterias.Fundamento: En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientesnecesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbonofermentable.La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través dedistintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finalesácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros(acetil metil carbinol).Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por laadición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia deproductos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio paraevidenciar la presencia de productos finales neutros.Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después deadicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos enmedio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetilcarbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un colorrojo.
  7. 7. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de Glucosa 5.0 agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y Fosfato dipotásico 5.0 esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. pH final: 6.9 ± 0.2Siembra: Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.Incubación: En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.Revelado de pruebas bioquímicas. a. Prueba del rojo de metilo:Añadir unas gotas de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. b. Prueba del Voges Proskauer:Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxidode potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar el tubo, y dejar a Tº ambientedurante 10-15 mins. Observar el color de la superficie del medio.Resultados 1. Prueba del rojo de metilo: - Positivo: color rojo. - Negativo: color amarillo. 2. Prueba de Voges Proskauer: - Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. - Negativo: ausencia de color rojo. Microorganismo Crecimiento RM VPE. coli ATCC 25922 Bueno + -K. pneumoniae ATCC Bueno - +700603P. mirabilis ATCC 43071 Bueno + -S. typhimurium ATCC Bueno + -14028Citrobacter freundii Bueno + -Enterobacter aerogenes Bueno - +
  8. 8. Agar Citrato de Simmnons: Medio utilizado para la diferenciación deenterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente decarbono y energía.Fundamento: En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuentede nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Amboscomponentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatoforman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro desodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador depH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial enbase a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente decarbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con laconsiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, enaquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácidotricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato ypiruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidosorgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos ybicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de laproducción de citrato permeasa.Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesCitrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litroCloruro de sodio 5.0 de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos yFosfato dipotásico 1.0 mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2Fosfato monoamónico 1.0 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar enSulfato de magnesio 0.2 posición inclinada.Azul de bromotimol 0.08Agar 15.0pH final: 6.9 ± 0.2Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie uninóculo ligero, usando un asa sin arrastrar el agar.Incubación: A 35-37 ºC, durante 24-48 hrs, en aerobiosis. Algunos MO puedenrequerir hasta 4 días de incubación.Resultados
  9. 9. - Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. - Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Citrato permeasa Color del medio Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Positivo Azul S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul E. coli ATCC 25922 Negativo Verde S. flexneri ATCC 12022 Negativo VerdeAgar Hierro Tres Azúcares: Medio universalmente empleado para ladiferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa,sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan losnutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa yglucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es elsustrato necesario para producir de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro yamonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácidosulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es elindicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por mediodel indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. Eltiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego conuna sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesExtracto de carne 3.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de aguaPluripeptona 20.0 destilada. Mezclar bien y calentar conCloruro de sodio 5.0 agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutosLactosa 10.0 hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar aSacarosa 10.0 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico deGlucosa 1.0 flauta profundo.Sulfato de hierro y amonio 0.2Tiosulfato de sodio 0.2Rojo de fenol 0.025Agar 13.0 pH final: 7.3 ± 0.2
  10. 10. SiembraA partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendosobre la superficie del medio.IncubaciónA 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.Resultados 1. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el MO solamente fermenta la glucosa. 2. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el MO fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el MO es no fermentador de azúcares. 4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el MO produce gas. 5. Ennegrecimiento del medio indica que el MO produce ácido sulfhídrico. Microorganismo Pico/Fondo Produce gas Produce H2S E. coli ATCC 25922 A/A + - K. pneumoniae ATCC 700603 A/A + - P. mirabilis ATCC 43071 K/A + + S. typhimurium ATCC 14028 K/A - + S. enteritidis ATCC 13076 K/A + + S. flexneri ATCC 12022 K/A - - P. aeruginosa ATCC 27853 K/K - -A: ácido K: alcalinoAgar Levine – EMB: Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación debacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otrosmateriales.FundamentoLa fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine,eliminando la sacarosa e incrementando la concentración de lactosa, lo quepermite una mejor diferenciación de E. coli.
  11. 11. Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento deenterobacterias. La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe eldesarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativasfastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y nofermentadoras de lactosa.Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de colorazulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismosno fermentadores de lactosa son incoloras.Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) ylevaduras, pueden crecer, originandocolonias incoloras y puntiformes.Este medio de cultivo,es útil para la orientación y no confirmación de especiesbacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias conbrillo metálico), por lo cual será necesario realizar pruebas bioquímicas, para laidentificación de género y especie. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Lactosa 10.0 Suspender 37,4 g de polvo por litro de agua destilada, dejar reposar 5 minutos. Fosfato dipotásico 2.0 Calentar a ebullición hasta disolución Agar 15.0 total. Distribuir y esterilizar 15 minutos a Eosina 0.4 121°C. Azul de metileno 0.065 pH final:7.1 ± 0.2Siembra: Directa, estriando la superficie.Incubación: De 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.Resultados Microorganismos Crecimiento Características de las colonias Bueno a excelente Verdosas con brillo metálico y centro negro Escherichia coli ATCC 25922 azuladoKlebsiella pneumoniae ATCC 700603 Bueno a excelente Mucosas, rosa púrpura, confluentes P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno a excelente Incoloras Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno a excelente Incoloras S. aureus ATCC 25923 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes Shigella flexneri ATCC 12022 Bueno a excelente IncolorasSalmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno a excelente Incoloras
  12. 12. Agar SIM médium: Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad,producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.Fundamento: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas,y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacteriaspara formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadastriptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo deKovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móvilespueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de lapunción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico sedistinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partirdel tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de Peptona 6.1 agua destilada. Mezclar hasta disolver; Sulfato de hierro y amonio 0.2 calentar agitando y hervir durante un Tiosulfato de sodio 0.2 minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a Agar 3.5 121°C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical. pH final: 7.3 ± 0.2Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar porpunción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Sedebe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios deprofundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que lasiembra se realice en línea recta.Incubación: Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.Resultados - Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. - Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
  13. 13. - Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. - Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. - Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. - Cepas indol negativas: sin cambio de color. Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido sulfhídricoE. coli ATCC 25922 + + -K. pneumoniae ATCC 700603 - - -P. mirabilis ATCC 43071 + - +S. typhimurium ATCC 14028 + - +S. enteritidis ATCC 13076 + - +S. flexneri ATCC 12022 - - -Oxidasa: Tirillas de Oxidasa: tiras reactivas que sirven para la detección rápiday sencilla del enzima citocromo-oxidasa en el diagnóstico microbiológico. Adiferencia con el ensayo tradicional de laboratorio, donde el reactivo tetrametil p-fenilendiamina, posee una gran inestabilidad, en las tiras de la oxidasa Panreac,gracias a que el reactivo se encuentra fijado en la almohadilla, su estabilidad esmuy superior.Principales ventajas: - Estabilidad Superior, el reactivo se encuentra fijado en la almohadilla. - Rapidez y comodidad, no son necesarios ni calibraciones, ni preparaciones ni largos tiempos de espera.Catalasa: Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que seencuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas quecontienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente,esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C. pyogenes y C. haemolyticum, ambos - ) de Erysipelothrix (-)
  14. 14. Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacersesiguiendo dos técnicas: 1. Método del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. 2. Método del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agarsangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa alretirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y supresencia dará un falso resultado positivo.TECNICA SIEMBRA POR ESTRIAS SUPERFICIEEl método de siembra por estría en placa Es el método más fácil y el más usado paraobtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de lapoblación mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólidopreparado en una placa Petrí. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa,cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. Acontinuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimasestrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sinsembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar célulasindividuales.
  15. 15. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que lascélulas aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formarcolonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clonderivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos célulasquedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Portanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, convienerepetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa.Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad,cultivos axenicos.Siembra por picadura: El inoculo es introducido con el asa recta o pipetapasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado enhacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca deltubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa decultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen eltapón.Siembra en superficie y picadura: El inoculo es introducido con el asa recta opipeta Pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendocuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia lasuperficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debeflamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir eltubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que losgases expulsen el tapón.Tinción de GRAMLa tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleadoen microbiología para la visualización de bacterias. Debe su nombre albacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utilizatanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poderrealizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de colormoradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
  16. 16. Metodología. Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloración) Enjuagar con agua. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua. Observar al microscopio a 100x con aceite de inmersión.Bacterias resistentes a la Tinción de GramLas siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas: Mycobacterias (están encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (pérdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).
  17. 17. Diagrama del proceso de la Tinción de GramMICROSCOPIAConjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos deestudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojonormal.Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso delmismo requiere para producir las imágenes adecuadas, de todo un conjuntode métodos y técnicas afines pero extrínsecas al aparato. Algunas de ellasson, técnicas de preparación y manejo de los objetos de estudio, técnicas desalida, procesamiento, interpretación y registro de imágenes, etc.PREPARACIONES MICROSCOPICAS.Para realizar observaciones de los microorganismos presentes en unamuestra es necesario manipular previamente dicha muestra.Esta manipulación permite obtener una preparación microscópica, que es elmaterial que finalmente se colocará en la pletina del microscopio.Esta preparación constará obligatoriamente de un portaobjetos (ya seaconvencional o de uso específico), una porción de la muestra (que en muchoscasos habrá sido modificada) y podrá o no incluir un cubreobjetos y otrosmateriales. Las preparaciones microscópicas se obtienen de modos diversos
  18. 18. que dependen de la naturaleza de la muestra y de los parámetros que queremos observar. Hay distintos criterios que pueden utilizarse para clasificar las diferentes preparaciones microscópicas existentes. El criterio que vamos a seguir aquí consiste en establecer tres grupos: - Preparaciones para examen en fresco sin modificar. - Preparaciones para examen en fresco ligeramente modifica das. - Preparaciones fijadas y teñidas. La muestra a partir de la cual se obtiene debe ser una muestra directa fresca o un cultivo reciente, pues la utilización de muestras y cultivos envejecidos y no conservados adecuadamente puede hacer que las características observadas no correspondan a la realidad.LIMITACIONES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO.¿Por qué se trabaja a un máximo de 1.000 aumentos en los microscopiosópticos?La limitación básica no es una cuestión de aumentos,sino de poder de resolución, que es la capacidad de distinción entre dos puntosadyacentes como distintos y separados.Por cuestiones relacionadas con la longitud de onda de la luz visible en las queno vamos a entrar, la luz visible no permite distinguir nítidamente objetosmenores de 02 μ m de diámetro. Con algunas modificaciones puedenconstruirse microscopios ópticos de 2.000 o 3.000 aumentos. Sin embargo, losmicroscopios ópticos de más de 2.000 o 3.000 aumentos proporcionaránimágenes más grandes pero más borrosas y esto no tiene ninguna utilidad.Desarrollo de la práctica Materiales. - Algodón - Mechero Sustancias. - Lápiz graso - Agua Destilada Estéril - Asa de platino en forma de asa - Medio de cultivo con muestra - Asa de platino en forma de punta (Salmonella) - Caja Petri (con muestra) - Alcohol Antiséptico
  19. 19. - Tirillas de Oxidas - Cristal Violeta - Incubadora (1) - Lugol - Encendedor - Alcohol - Papel Aluminio - Safranina - Cinta Masking tape - Aceite de Inmersión - Guante de seguridad - Peróxido de Hidrógeno (agua - Gradilla oxigenada) - Porta objetos (3) - Rojo de Metilo - Cubre Objetos - Urea Agar. - Microscopio óptico - MR-VP Medio - Pipeta volumétrica - Agar Citrato de Simmnons - Vaso de precipitación - Agar Hierro Tres Azúcares - Tubo de ensayo con tapa (6) - Agar Levine – EMB - Cámara de flujo laminar - Agar SIM médiumSiembras por Estría de Superficie (S.E.S.), resuspensión (R) y picadura (P).En diferentes agares para desarrollo de pruebas bioquímica ydeterminación del tipo de MO específico. 1. Ingresamos al laboratorio de microbiología manteniendo las normas de bioseguridad. 2. Escuchamos una breve introducción de lo que será la práctica a realizar (pruebas bioquímicas de identificación). 3. Escuchar con atención las pautas, recomendaciones y normas para realizar la práctica (indicaciones) por parte del profesor y ayudante. 4. Observar con detenimiento y anotar todos los pasos realizados por el docente al realizar una demostración rápida de lo que será la práctica a realizar (pruebas bioquímicas de identificación y desarrollar los métodos S.E.S., P, R). 5. Preparar el rótulo respectivo para tubo asignado (6 tubos por subgrupo) (Fecha, agar, técnica, muestra, Tº, nombre, grupo, subgrupo, etc) 6. Plaqueamos los tubos asiganados, ya con los medios (agares) dentro de ellos, para realizar la siempra.
  20. 20. 7. Ubicarse (Cabina de flujo laminar) y preparar (cono de seguridad) todo en el lugar de trabajo asignado, tomando en cuenta las indicaciones y recomendaciones del profesor.8. Siembra en Urea Agar (P). 8.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. 8.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el urea agar. 8.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por picadura. 8.4. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.9. Siembra en MR-VP Medio (R). 9.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de asa, previamente flameada. 9.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el MR-VP medio. 9.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por resuspensión. 9.4. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.10. Siembra en Agar Citrato de Simmons (P/S.E.S.). 10.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. 10.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Citrato de Simmons. 10.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por picadura. 10.4. Una vez realizada la siembra por picadura, antes de sacar el asa, de manera inmediata, con mucho cuidado realizar la siembra por estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el agar. 10.5. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.11. Siembra en Agar Hierro Tres Azucares (T.S.I.) (P/S.E.S.). 11.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada.
  21. 21. 11.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Hierro Tres Azucares. 11.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por picadura. 11.4. Una vez realizada la siembra por picadura, antes de sacar el asa, de manera inmediata, con mucho cuidado realizar la siembra por estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el agar. 11.5. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.12. Siembra en Agar Levine - EMB (S.E.S.). 12.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. 12.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Levine - EMB. 12.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa en forma de asa y realizar la siembra por estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el agar. 12.4. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.13. Siembra en Agar SIM – médium (P). 13.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. 13.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el agar SIM. 13.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por picadura. 13.4. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.14. Luego de sembrar, llevamos la gradilla a la incubadora 1 y dejamos a una Tº= 37ºC por 24 hrs.15. Tinción de GRAM y microscopia 15.1. Colocamos una gota de agua destilada utilizando el gotero sobre el portaobjetos. 15.2. Encender el mechero, esterilizamos el asa de platino en forma de asa.
  22. 22. 15.3. Luego, tomar la placa (caja petri), abrirla y enfriar el asa en la parte superior de esta.15.4. Luego, tomamos con el asa de platino una muestra muy muy pequeña (un ligero roce sobre la muestra).15.5. Tomamos el portaobjetos (con la gota de agua destilada) y realizamos el frotis sobre este (sobre la gota) esparcimos solo en la zona a trabajar, expandir bien.15.6. Luego tomamos el portaobjeto con las pinzas para hacer la fijación (flameo) sobre la llama (de adentro hacia afuera).15.7. Luego de la fijación, dejamos enfriar un poco, y con el lápiz graso delimitamos la muestra con dos líneas dibujadas que la dividan desde el centro formando una cuadrado.15.8. Llevamos el portaobjetos al lavabo, lo colocamos sobre el soporte del lavabo, para realizar la tinción.15.9. Procedemos a colocar el violeta cristal sobre el portaobjetos (en la zona delimitada por el lápiz graso) y dejamos reposar 1min.15.10. Luego, verter el liquido en la rejilla del lavabo y enjuagamos a chorro ligero, dejando caer el agua sobre nuestro dedo índice y con este hacerla llegar al portaobjetos para dejarla parcialmente limpia.15.11. Luego, procedemos a colocar el lugol sobre el portaobjetos (en la zona delimitada por el lápiz graso) y dejamos reposar 1min.15.12. Luego, verter el liquido en la rejilla del lavabo y enjuagamos a chorro ligero, dejando caer el agua sobre nuestro dedo índice y con este hacerla llegar al portaobjetos para dejarla parcialmente limpia.15.13. Después verter alcohol sobre el portaobjetos, así mismo como en el violeta cristal y lugol, por la zona delimitada, por 20seg.15.14. Luego, enjuagamos a chorro ligero, dejando caer el agua sobre nuestro dedo índice y con este hacerla llegar al portaobjetos para dejarla parcialmente limpia.15.15. Finalmente colocamos la safranina sobre el portaobjetos (en la zona delimitada por el lápiz graso) y dejamos reposar 1min.15.16. Luego, verter el liquido en la rejilla del lavabo y enjuagamos a chorro ligero, dejando caer el agua sobre nuestro dedo índice y con este hacerla llegar al portaobjetos para dejarla parcialmente limpia.
  23. 23. 15.17. Secamos la parte inferior del portaobjetos con una toalla, y luego dejamos reposar hasta que se seque. 15.18. Una vez seco nuestro portaobjetos, colocamos unas gotas de aceite de inmersión en el área delimitada por el lápiz graso. 15.19. Colocamos encima del acite de inmersión de nuestro porta objetos, el cubre objetos. 15.20. Luego, llevamos al microscopio óptico (a una visualización de 100X) para realizar las observaciones respectivas y distinguir, Gram- (Salmonellas) 15.21. Anotar y dibujar los resultados de esta observación. (Resultados) 16. Finalmente lavamos todo lo utilizado. 17. Observar después de las 24hrs y anotar resultados. RESULTADOSSegún lo realizado en esta práctica, de la muestra que tomamos (placa petri conMedio de Cultivo de muestra - Salmonellas) fue adquirida de los cultivosobtenidos del huevo que muestreamos la semana pasada, La muestrapresentaba las siguientes características: - Agar (SS) Color: Verde. - Colonias de color: Rosa, grises, incoloras. - Colonias con caracteristicas cremosas (ciertas), con centros de color gris o negro.En las pruebas realizadas en el laboratorio se obtuvo los siguientes resultados(mismo día de la práctica): Oxidasa: Tirillas de oxidasa al reaccionar con la muestra: Tono azul  Positivo Catalasa: Peróxido de Hidrógeno al reaccionar con la muestra: Produce efervescencia (burbujas  liberación de O2 + H2O)  Positivo. Tinción de Gram: Resultado favorable: Coloración de gram – (lo que buscábamos) logrando ver en la microscopia  Salmonellas
  24. 24. Después de 24hrs los tubos en la incubadora 1 se obtuvieron los siguientesresultados: Urea Agar: Coloración sin cambio alguno (Amarillo)  Negativo MR-VP Medio: Al agregar las gotas de rojo de metilo (MR) coloración roja (parte media-superior)  Positivo Agar Citrato de Simmnons: Coloración azul (medio del tubo)  Positivo Agar Hierro Tres Azúcares: Coloración del agar no presenta cambio alguno (Rojo)  Negativo Agar Levine – EMB: Coloración del agar no presenta cambio alguno  Negativo. Agar SIM médium: El medio presenta turbidez que se extiende más allá de la línea de siembra  La cepa presenta movilidad (Muy móvil, ya que extendía por todo el agar en el tubo).En la microscopia pudimos observar los MO gram negativas  Salmonellas
  25. 25. DISCUSIÓNSe obtuvo de la muestra (del huevo; tomada la práctica anterior/ Interno yexterno, Pero específicamente de la muestra externa). Como se infectan los huevos: Varias cepas de Salmonella habitan el intestino de animales y aves y son transmitidas a los humanos por alimentos de origen animal. La contaminación del huevo con deposiciones de la gallina y/o la rotura facilita la infección. Este mecanismo en otros países se ha controlado casi totalmente por medio de la inspección cuidadosa de los huevos y técnicas de aseo. Sin embargo pese al consumo exclusivo de huevos con cáscara intacta y desinfectados el problema persiste ya que la Salmonella enteritidis infecta silenciosamente los ovarios de gallinas aparentemente sanas y contamina los huevos antes de la formación de la cáscara. En ciertas zonas de EU se estima que 1 de cada 10.000 huevos puede estar contaminado internamente. Sólo un pequeño número de gallinas están infectadas en un momento preciso e incluso una gallina infectada puede poner muchos huevos sanos y sólo ocasionalmente algunos infectados. Quienes pueden enfermar: Los ancianos, niños pequeños y personas con deficiencia de la inmunidad están en mayor riesgo de enfermedad grave. En ellos una pequeña cantidad de salmonellas puede producir la enfermedad. La mayoría de los casos fatales por esta infección se producen en ancianos internados en asilos. Los adultos sanos y niños también pueden sufrir la infección pero habitualmente en forma más benigna.Al observar (todos los tubos) pudimos observar los diversos resultados y coloresde colonias (cultivos obtenidos) y reacciones de los MO que allí habían, de loque pude observar he elaborado una tabla de resultados, tomando comoreferencia al tipo de prueba bioquímica (agar o medio, reacción) y el resultadoobservado, en dependencia de si es positivo o negativo, coloración de MO entinción de gram, microscopia.
  26. 26. PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADOUrea Agar. NegativoMR-VP Medio PositivoAgar Citrato de Simmons PositivoAgar Hierro Tres Azúcares NegativoAgar Levine – EMB NegativoAgar SIM médium PositivoOxidasa PositivoCatalasa PositivoTinción de Gram Gram NegativasMicroscopia Bacilos flagelados gran negativos  S. marcescens: Vistas en 3D a una visualización de 80x (Gram negativas). S. marcescens: Vista macroscópicamente (colonias-color rojo) S. marcescens: Vista microscópicamente: Microscopio Óptico (bacilo con flagelo)
  27. 27.  S. marcescens: Observación microscopio electrónico (óptico) (bacilos con flagelos)Tomando en cuenta estos resultados y guiándonos en las tablas para determinarel tipo de MO especifico (señalando y descartando posibles MO que cumplenestas características en cuanto a los resultados) que se ha obtenido es Serratiamarcescens.Serratia marcescens  Reino: Bacteria; Filo: Proteobacteria; Clase: GammaProteobacteria; Orden: Enterobacteriales; Familia: Enterobacteriaceae;Genero: Serratia; Especie: S. marcescens.Serratia marcescens es motil, en forma de bacilo, Gram-negativos, anaerobiosfacultativos bacteria, clasificado como un patógeno oportunista.De manera óptima, Serratia marcescens crece a 37 ° C, pero puede crecer atemperaturas que van desde 5-40 ° C. Crecen en los niveles de pH que vandesde 5 hasta 9. Serratia marcescens es bien conocido por la pigmentación rojaque produce llamada prodigiosina. La Prodigiosina se compone de tres anillosde pirrol y no se produce a 37 ° C, pero si a temperaturas inferiores a 30°C. Laproducción de pigmentos de color rojo no está presente en todas las cepas, peroen los que está presente, se asemejan a la sangre. Esto y el hecho deque Serratia marcescens normalmente crece en el pan y hostias almacenadosen lugares húmedos, se ha llevado a los científicos a sugerir la contaminaciónSerratia como una posible explicación para los milagros transubstanciación (laconversión del pan en el Cuerpo y la Sangre de Cristo). Por ejemplo, la historiadel Milagro de Bolsena de los estados que, en 1263, un sacerdote con dudas dela presencia de Cristo en la hostia consagrada presidió una misa en la basílicade Bolsena. Después de hablar las palabras de la consagración, la sangre
  28. 28. empezó a gotear de la hostia consagrada en sus manos y el altar. Este eventofue representado por Rafael en las paredes del VaticanoEl genoma de la cepa Serratia marcescens DB11 se secuenció por el InstitutoSanger de la colaboración del Dr.Jonathan Ewbank del Centre dImmunologie deMarsella Luminy. El genoma completo se compone de un único cromosomacircular de 5,113,802 pares de bases que contienen un contenido de G + C, de59,51%.Estructura de la célula y MetabolismoSerratia marcescens es un bacilo motil. Es un anaerobio facultativo, lo quesignifica que puede crecer en ya sea la presencia de oxígeno (aeróbico) o enausencia de oxígeno (anaerobio).Principalmente se utiliza la fermentación comoel medio de reunir la energía y tiene enzimas (superóxido dismutasa, catalasa operóxidos) que lo protegen de especies reactivas del oxígeno, lo que le permitevivir en ambientes oxigenados. Serratia marcescens es una bacteria gramnegativa. Las bacterias gram negativas tienen una pared celular delgada hechade una sola capa de peptidoglicano que está encerrado por una membranaexterna. La membrana externa tiene lipopolisacáridos (LPS), que son una claseespecial de fosfolípido compuesto de ácidos grasos que están conectados a undímero fosfato glucosamina. Una glucosamina se fija entonces a un polisacáridobásico que se extiende a los polisacáridos O. La membrana externa tambiénsirve como un medio para regular la absorción de nutrientes y la exclusión de lastoxinas. Los poros de proteínas y transportadores que se encuentran en lascapas envolventes variar en selectividad.Serratia marcescens es móvil y se desplaza por diferentes medios. Una solabacteria Serratia marcescens puede nadar con la utilización de su flagelo. Comogrupo, pueden estar como un enjambre juntos en agar de concentraciones másbajas (0 .5 a 0.8%) Las células de este Enjambre pueden variar en longitud de5-30 micras y son muy flageladas y no septadas Serratia marcescens tienealrededor de 100 - 1.000 flagelos por célula nadadora Serratiamarcescens también pueden formar un biofilm (estructura compleja formada porsecretada mucilaginosa matrixto. formar una capa protectora en la que estánencerrados).
  29. 29. La hidrólisis de la caseína no es un rasgo común y es por lo tanto útiles en ladiferenciación de Serratia marcescens de las 438 cepas de las familiasEnterobacteriaceae y Pseudomonadaceae. Serratia marcescens tiene lacapacidad de reproducirse a romper la caseína produce un intercambio deinformación sobre placas de agar de leche. La caseína es la proteína de la lecheprecipitada que forma la base de queso y algunos tipos de plástico. Serratiamarcescens utiliza enzimas llamadas proteasas extracelulares para romper losenlaces peptídicos (CO-NH) en la caseína. De manera similar, una enzimaextracelular llamado rompe gelatinasa abajo gelatina, una proteína incompletaque carece de triptófano. Hidrólisis gelatina transforma la proteína a losaminoácidos individuales y provoca que se licuan en condiciones frías (menosde 25 ° C) cuando lo que debería ser sólido.Hay otras pruebas bioquímicas que ayudan a identificar Serratia marcescens enel laboratorio. Es negativo para la prueba de rojo de metilo debido a suproducción de 2, 3 - butanodiol y etanol, pero positivo para la prueba de Voges-Proskauer, que muestra capacidad de un organismo para convertir el piruvato aacetoína Serratia marcescens es negativo para el ácido. Producción (positivo) delactosa, glucosa y sacarosa fermentación. Las pruebas de nitratos son positivasdesde que el nitrato se utiliza generalmente como el aceptor final de electronesen lugar de oxígeno. Citrato (prueba positiva) es utilizado por Serratiamarcescens para producir ácido pirúvico. Es positivo para la descarboxilasa, quees la eliminación de un grupo carboxilo de un aminoácido, produciendo unaamina y dióxido de carbono. La pigmentación de color rojo (prodigiosina)que Serratia marcescens es conocido por puede ser un factor de diferenciaciónpero sólo está presente en algunas cepas. No se conoce exactamente por quées, pero hay la hipótesis de que es un producto del gen estrechamenteregulado. La Prodigiosina puede activar el sistema inmunológico del cuerpo(anticuerpos y células T), por lo que es posible que las Serratia marcescens queviven en un cuerpo humano limiten su síntesis de prodigiosina y, por tantoescapar a la detección por el sistema inmune del huésped. Muchas cepasparecen haber perdido la capacidad para producirla en absoluto.
  30. 30. Ecología: Serratia marcescens: Se encuentra comúnmente en el suelo, agua,plantas y animales. Es ampliamente presentes en el agua no potable en lospaíses subdesarrollados debido a la cloración pobres. Este microorganismo esun agente común responsable de la contaminación de las placas de Petri en ellaboratorio, y también se encuentra creciendo en elpan. Aunque S. marcescens es un microorganismo patógeno, sólo es así con losindividuos inmunocomprometidos, tales como los encontrados en los hospitalesdonde muchas de las infecciones documentadas tienen lugar. El modo detransmisión de este microorganismo es por contacto directo, o por catéteres,gotas, soluciones salinas de riego, y otras soluciones que se cree que sonestériles.Patología: Serratia marcescens es un patógeno oportunista que causainfecciones nosocomiales. Es resistente a muchos antibióticos utilizadostradicionalmente para tratar infecciones bacterianas, como la penicilina y laampicilina. Esto es debido a todas las características Serratia marcescens;membrana única (LPS) como una bacteria Gram-negativas, la capacidad desobrevivir en condiciones aerobias y anaerobias, y su motilidad. La mayoría delas cepas son resistentes a varios antibióticos debido a la presencia de factoresR (genes que codifican para resistencia a los antibióticos) en plásmidos. Haymuchas enfermedades que se asocian con Serratia marcescens: sepsis,abscesos bacteriemia, meningitis y cerebrales, infecciones del tracto urinario,osteomielitis, infecciones oculares, y endocarditis. Debido a la amplia gama deenfermedades Serratia marcescens causas, no es un síntoma o la determinaciónde fuente de origen. Las biopelículas son generalmente producidaspatógenamente en el cuerpo.También, como se menciona en la estructura celular, la capa de LPS está unidaa la membrana externa de la bateria Gram negativas. El LPS actúa como unaendotoxina (un componente de la célula que es inofensivo, siempre y cuando elpatógeno se mantiene intacto). La liberación de LPS se sobre-estimular lasdefensas del huésped y hacer que someterse a shock endotóxico letal. Lapresencia de LPS por lo tanto hace que sea difícil de matar Serratiamarcescens, sin causar la muerte de las células del huésped.
  31. 31. Algunos de los antibióticos han demostrado ser eficaces contra Serratiamarcescens son los antipseudomonal antibióticos beta-lactámicos, que matanlas bacterias inhibiendo la síntesis de la pared celular. A pesar de que se handesarrollado y se utiliza para matar las pseudomonas, que también handemostrado su eficacia contra la Serratia marcescens y otras estrechamenterelacionadas con las bacterias Gram negativas. Parte de la naturalezaproblemática de este organismo es su capacidad de colonizar cualquiersuperficie. Por ejemplo, Serratia marcescens ha sido identificado como elorganismo más común que se encuentra en ambos de los sitios corneales ylentes de contacto. Se ha encontrado, sin embargo, que policuaternio-1 (unbiocida utilizado comercialmente en una solución desinfectante de lentes decontacto) es activo frente a la membrana citoplasmática de Serratia marcescensUn estudio reciente sugiere que la Serratia marcescens ost3 produce unapelícula de prodigiosina llamada MAMPDM ((2,2- [3-metoxi-1amyl-5-metil-4-(1-pirrilo) dipyrrylmethene)) que puede tener un impacto importante en eltratamiento del cáncer. Este pigmento rojo ha demostrado una actividadcitotóxica selectiva en líneas celulares de cáncer, pero en el contraste se revelóuna toxicidad reducida para las células no malignas. Llegaron a la conclusión deque la Serratia marcescens ost3 puede en un tiempo ser utilizada como unfuente de desarrollo de un compuesto contra el cáncer.Otro estudio sugiere que la Serratia marcescens cepa NCTC 10211 puede servircomo un probiótico en la inhibición del crecimiento de H. pylori, el agentecausante de las úlceras de estómago. Al examinar diferentes especies y cepasde bacterias, Serratia marcescens cepa NCTC 10211 reveló sorprendenteszonas de inhibición cuando se inocularon con diferentes componentes de HPstrains. El mecanismo implicado en la inhibición de la proliferación de HP todavíano se comprende bien. Se necesita investigación adicional para aislar ycaracterizar las sustancias inhibidoras de modo que puedan ser utilizados parala terapia de Hp. Es en gran parte no está claro si Serratia marcescens tieneactividad bactericidial o si promueve cambios en la fisiología y morfología de Hp.Serratia marcescens tiene una capacidad única para producir enzimasextracelulares. Varias de tales enzimas han demostrado tener la capacidad dedegradar quitina, una sustancia que comprende principalmente las paredes
  32. 32. celulares de los hongos. Estas enzimas quitinolíticas podrían tener posibles usosindustriales y agrícolas, tales como la introducción de estos genes para enzimasque degradan la quitina en los cultivos, así como las bacterias fermentativas. Lainvestigación adicional en la modificación de proteínas de secuencias denucleótidos que permiten la expresión mejorada de quitina genes que producen,proporcionando así un mecanismo de protección de plantas sensibles ybacterias fermentadoras contra infecciones fúngicasSe sabe que causa varias infecciones nosocomiales, sobre todo, inducido por elcatéter bacteriemia, infección del tracto urinario, e infecciones de la herida.Dada su omnipresencia en el medio ambiente, y su parcialidad hacia lascondiciones de humedad, S. marcescens prolifera en los baños, donde seobserva como una coloración rosada y película aceitosa sobre la proliferación delos residuos de jabón y champú y materiales que contengan fósforo. Una vezque las bacterias se han establecido, la aniquilación total es bastantecomplicada, pero se puede hacer mediante la aplicación de un desinfectantebasado en cloro. El microbio se encuentra también en la sub-gingival biopelículade los dientes. Estos microbios también sintetizar un pigmento de color rojizo-anaranjado llamado prodigiosina que podría resultar en la tinción extrínseca delos dientes. También tiene una afición por el crecimiento en los alimentos conalmidón, donde las colonias pigmentadas se confunden con las gotas desangre.Serratia marcescens puede provocar conjuntivitis, queratitis e infecciones enheridas, riñones y vías urinarias, así como infecciones respiratorias,meningitis y endocarditis. Esta bacteria afecta especialmente a pacienteshospitalizados y a pacientes que tienen la inmunidad disminuida porenfermedades sistémicas o tratamientos médicos inmunosupresores.Serratia marcescens, síntomas La sepsis o bacteriemia es el síntoma más común de presentación de S. marcescens, y es visto como la fiebre con escalofríos. La infección urinaria es una manifestación más común. Las características clínicas son: necesidad frecuente de orinar, ardor al orinar, sangre y sangre en la orina y fiebre.
  33. 33. La infección del tracto respiratorio se demuestra como fiebre, tos con expectoración, sibilancias y jadeo y dolor en el pecho. La meningitis o abscesos cerebrales, debido a los microbios se desarrollan en los niños, y se manifiesta como: fiebre, vómitos, convulsiones y coma. Las infecciones intra-abdominales causar daño al hígado, la vesícula biliar y los abscesos pancreáticos y exudado peritoneal. La osteomielitis y la artritis también son relativamente comunes, y son vistos como inflamación en las articulaciones, enrojecimiento y dolor en las articulaciones afectadas, la rigidez y dificultad de movimiento. La endocarditis puede ponerse de manifiesto como con fiebre, petequias y, en ocasiones, complicaciones tromboembólicas.Serratia marcescens causaEl factor de riesgo principal para la infección por S. marcescens es largointerminable hospitalización. Los que tienen un mecanismo inmunológico débilson más propensos al desarrollo de estas infecciones nosocomiales. Importantesfactores desencadenantes son: intra venosa peritoneal, intra o catéteresurinarios, la instrumentación de las vías respiratorias, como la broncoscopía y losventiladores, las inyecciones intra-articulares, trauma en el cráneo, la cirugíaneuro-, la inyección epidural o una punción lumbar.Tratamientos para infecciones o complicaciones causadas por SerratiamarcescensTodas las bacterias del género Serratia presentan resistencia a muchosantibióticos a causa de la presencia de factores R, los cuales son una tipode plásmido que codifica enzimas de resistencia a antibióticos. El másimportante de estos es el SmaI. Por ello, esta bacteria presenta una resistenciaprimaria a todas las penicilinas, a las cefalosporinas y a la polimixina.El tratamiento para infecciones leves puede realizarsecon trimetoprim, sulfamidas o fluoroquinolona. Para infecciones más graves, seutilizan fluoroquilonas (ciprofloxacino, levofloxacino), carbapenemes (ertapenem,imipenem, meropenem), o más frecuente cefalosporinas de tercera generación,generalmente asociado a un aminoglucósido (gentamicina).
  34. 34. Serratia marcescens tratamiento El plan de tratamiento principal es la administración de antibióticos. Los abscesos y exudados requieren incisión y drenaje. S. marcescens es resistente a la ampicilina, macrólidos y cefalosporinas de 1 ª generación. En consecuencia, la mayoría de los médicos se encargan el caso de los aminoglucósidos, junto con antipseudomonas beta-lactámicos. Además, las quinolonas son decididamente activa contra la mayoría de las cepas de Serratia. La terapia definitiva para el caso depende de los resultados de las pruebas de vulnerabilidad, teniendo en cuenta que, de varias cepas resistentes son bastante comunes. Inicio terapia es una alternativa para aquellos pacientes que están clínicamente estables, mientras que otros tienen que ser hospitalizadas. El pronóstico para las infecciones por S. marcescens es moderadamente - los pobres. Ciertas infecciones, como infecciones urinarias, abscesos abdominales y la artritis muestran resultados bastante buenos, mientras que la meningitis, abscesos cerebrales, sepsis y endocarditis muestran pronóstico moderado. CONCLUSIONESAl final de la práctica he concluido que ha sido muy importante para eldescubrimiento de agentes microbianos como las Salmonellas y sus diferentestipos que se hallan en huevos, son los que nosotros y nuestros hijos ingerimos,por ser al alcance de todo bolsillo y por haber un amplio recetario para prepararalimentos y tenerlos como acompañante o formando parte de otros.Considero que las pruebas bioquímicas efectuadas (en el caso de mi subgrupo)fueron plenamente exitosas, ya que se obtuvo resultados precisos quecoincidieron con un solo tipo de MO en este caso los resultados indicaron que elMO detectado es Serratia marcescens.En cuanto a este MO es un bacilo motil y flagelado, causante de daños en elorganismo humano tales como: Conjuntivitis, queratitis, infecciones en
  35. 35. heridas, riñones, vías urinarias, infecciones respiratorias,meningitis y endocarditis.El tratamiento contra este MO es arduo ya que presenta algunas resistencias aantibióticos (como se indica en la zona de tratamiento en la parte superior dondese hace referencia a la vida y características de la Serratia marcescens).Leyendo los estudios realizados a este MO he concluido que es la causanteprincipal y/o la explicación científica para eventos –sobrenaturales- o“Milagrosos” que hacen referencia al llanto de esculturas o retratos de conocidasfiguras religiosas, inclusive en ostias, hasta en pan, ya que produce y secreta unpigmento llamado Prodigiosina que curiosamente es muy similar a la sangre(fácil de confundirla con esta).Se ha determinado exitosamente con la ayuda de las tablas el tipo de MOpresente en la muestra según los resultados obtenidos. RECOMENDACIONESSe recomienda (preferible) NO consumir huevos adquiridos o comprados algranel, sin registro sanitario (no exentos de salmonellas, pero si más confiables)por las causas ya antes expuestas.Tener mucho cuidado al manipular los tubos con los agares al momento de lasiembra e inoculación. Practicar mucho y siempre según los resultados guiarseen las tablas de resultados de pruebas bioquímicas para tener una precisión almomento de determinar los o el tipo de MO que resulta..
  36. 36. BIBLIOGRAFIASlideShare (en línea): Canadá: Documents, PDF’s, videos; 2012 [Fecha deacceso 25 de junio de 2012]. URL disponible en:http://www.slideshare.net/lilicarito1/identifcacion-de-salmonellasBritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/christensemed.htmAulaVirtual.USal (en línea) España: Universidad de Salamanca: Aula Virtual;2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.htmlUCV (en línea) Venezuela: Universidad Central de Venezuela: La casa quevence la sombra; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponibleen:http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_SistemasAPI.pdfMicrobeWiki (en línea) Estados Unidos: Kenyon College – Ohio: FromMicrobeWiki, the student-edited microbiology resource; 2012 [Fecha de acceso25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Serratia_marcescensBritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htmWikipedia (en línea) España: Enciclopedia Libre; 2012 [Fecha de acceso 25 dejulio de 2012]. URL disponible en:http://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_bioqu%C3%ADmicaSerratiamarcescen (en línea) Canadá: Serratia Marcescens - Journal of MedicalMicrobiology; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.serratiamarcescens.net/
  37. 37. BritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htmSciencePhoto (en línea) Inglaterra - Gales: Science Photo Library: The LeadingProvider Of Science Images And Footage; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de2012]. URL disponible en: http://www.sciencephoto.com/media/147969/enlargeBritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htmBlogspot (en línea) España: Blogs, artículos, noticias, la red de la libre expresióny exposiciones personales; 2012 [Fecha de acceso 14 de julio del 2012]. URLdisponible en: http://randstarteam.blogspot.com/2007_12_01_archive.htmlBritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/levinembagar.htmSciencePhoto (en línea) Inglaterra - Gales: Science Photo Library: The LeadingProvider Of Science Images And Footage; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de2012]. URL disponible en: http://www.sciencephoto.com/media/121591/enlargeBritniaLab (en línea) Argentina: Productos, documentos, consultas a nuestrosprofesionales; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htmPanreac (en línea) España: Analytical Reagents & Fine Chemical; 2012 [Fechade acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.panreac.es/pdf/PI_tiras_oxidasa_ESP.pdfSIDWeb (en línea): Ecuador: Sistema Interactivo de Desarrollo para la Web de laESPOL; 2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:https://sidweb.espol.edu.ec/private/download/4018/892531/doDownload?attachment=617977&websiteId=4018&folderId=18&docId=892531&websiteType=1&action=none&url=
  38. 38. Wikipedia (en línea) España: Enciclopedia Libre; 2012 [Fecha de acceso 25 dejulio de 2012]. URL disponible en:http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_GramSlideShare (en línea): Canadá: Documents, PDF’s, videos; 2012 [Fecha deacceso 25 de junio de 2012]. URL disponible en:http://www.slideshare.net/chemaespinosa/u-t-3-m-icroscopio-optico-preparaciones-presentationJoseACortes.com (en línea) México: Recursos Didácticos para Biología; 2012[Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/catalasa.htmSlideShare (en línea): Canadá: Documents, PDF’s, videos; 2012 [Fecha deacceso 25 de junio de 2012]. URL disponible en:http://www.slideshare.net/sangra85/siembra-5897672BioCen (el línea): Cuba: Centro Nacional de bioprepados; 2012 [Fecha deacceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.biocen.cu/producto/indicemc/lmcp1.htmMCDLab (en línea) México: empresa mexicana dedicada a la fabricación ydesarrollo de Medios de Cultivo para microbiología y biología molecular; 2012[Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible enhttp://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20SALMONELLA%20SHIGELLA.pdfCienFuegos (en línea) Chile: Pediatria: Dr. Guillermo P. Cienfuegos Salinas;2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:http://www.cienfuegos.cl/salmonella.html

×