MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans       (MONT) DE BARY        S O N I A JA R A M I L L O V I L L E G A S         Fac...
Tabla de Contenido  INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1CAPÍTULO I ____________________...
3.1. Patrones de Electroforesis de Proteínas Totales ____________________________ 30  3.2. Patrones isoenzimáticos (Aloenz...
2. Saneamiento _________________________________________________________ 93  3. Escape ___________________________________...
MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans                     (MONT) DE BARY                          Sonia Jaramillo Villeg...
El hallazgo reciente del tipo de apareamiento A2 de P. infestans, en especies silvestres desolanáceas, en papa en Bolivia ...
En tal sentido es necesario impulsar la investigación sobre la interacción huésped-patógeno, queincluyan tanto los huésped...
CAPÍTULO I TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN 1. POSICIÓN TAXONÓMICA DENTRO DE LOS ORGANISMOS VIVOS En la presente sesión me permit...
cuales contienen microfibrillas de celulosa con una matriz amorfa de B’ 1-3 glucano en vez dequitina, carencia de hipoxida...
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suficientemente útiles para diferenciar especies; como tampoco lo son el crecimiento y la formade la colonia y el hinchami...
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4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIFERENCIAR ESPECIES  La adaptación de la tecnología de biología molecular, se ha constituido...
Anteridio: unicelular y/o bicelular. Anteridio: tamaño y forma. Homotálico: produce oosporas en un solo cultivo.  Heterotá...
CAPITULO II ORIGEN Y MIGRACIONES DEL PATOSISTEMA Phytophthora infestans/Solanum tuberosum 1. ORIGEN DEL PATÓGENO Phytophth...
de 1843 y para 1845 estaba esparcido por casi todo el noreste de Norte América y en el verano deese año apareció en el nor...
en China en 1700 (Laufer, 1938). Inicialmente se introdujo la subespecie Solanum tuberosumssp. andigena, la cual sólo tube...
Sin embargo, Abad et al. (1995) consideran que un alto número de formas de papas de laespecie Solanum andigena ssp andigen...
que pueden presentarse síntomas de pudriciones de tubérculos o muerte del follaje, en los cualesla gota es apenas un compo...
Luján (1996) indica que el agricultor Pedro Pardo informó en 1861, que los tubérculos de lavariedad tuquerreña, nativa de ...
Los aislamientos peruanos son muy simples en diversidad de marcadores molecularesincluyendo aloenzimas (Gpi 86/100, Pep 92...
El Centro de México, es el segundo lugar en diversidad de especies del género Solanum,muchas de las cuales son endémicas y...
las poblaciones andinas, o que la introducción original fue limitada a unos cuantos genotipos(Andrivon, 1996).  Según Andr...
Además, el desplazamiento de P. infestans también ocurrió en otros continentes: en Japón seredujo la frecuencia del linaje...
4.9. Migraciones al Este de Asia  Fry y Goodwin (1995) opinan que las migraciones al Asia tuvieron características diferen...
CAPÍTULO III CARACTERIZACIÓN POBLACIONAL  Los estudios poblacionales de Phytophthora infestans se iniciaron casi paralelam...
explica por qué en ciertas mutaciones que generan resistencia a un fungicida, (Metalxyl), laexpresión de la resistencia es...
90 y Pep 83, cuyos genotipos fueron Gpi 90/100 o 100/100 y Pep 83/100 o 100/100 o encombinación con los genotipos del prim...
Por otro lado, Miller y Johnson (2000), al inocular y llevar al campo plantas de papa, con lamisma cantidad de lesiones de...
Pérez et al., (1997-1998) evaluaron 114 aislamientos procedentes de Puno y Cusco al sur dePerú y encontraron un aislamient...
Según Schöber-Butin, et al., (1995), en Alemania se observó que para los 1950’s solo sepresentaban dos patotipos de P. inf...
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  1. 1. MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans (MONT) DE BARY S O N I A JA R A M I L L O V I L L E G A S Facultad de Ciencias Agropecuarias Medellín, 2003
  2. 2. Tabla de Contenido INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1CAPÍTULO I _____________________________________________________________ 4 TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN _________________________________________ 4 1. POSICIÓN TAXONÓMICA DENTRO DE LOS ORGANISMOS VIVOS _________ 4 2. MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE Phytophthora ______ 5 2.1. Micelio _____________________________________________________________ 6 2.2. Esporangios y Zoosporas _______________________________________________ 7 Morfología de las Zoosporas ________________________________________________ 8 2.3. Presencia de Clamidosporas _____________________________________________ 8 2.4. Órganos Sexuales _____________________________________________________ 8 3. FACTORES DEL AMBIENTE QUE INCIDEN EN LA CLASIFICACIÓN DELAS ESPECIES ___________________________________________________________ 8 4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIFERENCIAR ESPECIES _______________ 9 5. CRITERIOS ÚTILES PARA DESCRIBIR O IDENTIFICAR ESPECIES DEPHYTOPHTHORA _________________________________________________________ 9CAPITULO II ___________________________________________________________ 11 ORIGEN Y MIGRACIONES DEL PATOSISTEMA Phytophthora infestans/ Solanumtuberosum _______________________________________________________________ 11 1. ORIGEN DEL PATÓGENO Phytophthora infestans (MONT) DE BARY _________ 11 2. ORIGEN DE LA PAPA CULTIVADA (Solanum tuberosum) __________________ 12 3. MIGRACIONES Y EVOLUCIÓN DE LA PAPA CULTIVADA _______________ 12 4. ANTECEDENTES HISTÓRICOS DEL ORIGEN Y MIGRACIONES DELPATÓGENO P. infestans ___________________________________________________ 14 4.1. Teoría de Berkely (1845) y de Bary (1861). Origen en los Andes de Sur América. _ 14 4.2. Origen en el Centro de México. _________________________________________ 14 4.3. Evidencias que Soportan el Origen P. infestans en Papa en los Andes Suramericanos _______________________________________________________________________ 15 4.4. Evidencias que Soportan la Teoría del Origen de P. infestans en el Centro de México _______________________________________________________________________ 17 4.5. Teoría de las Migraciones Fry et al. (1992-93) y Goodwin et al. (1994) a EstadosUnidos y Europa. _________________________________________________________ 18 4.6. Teoría de las Migraciones de Bourke (1964), Tooley et al., (1989) y Andrivon (1996) _______________________________________________________________________ 18 4.7. Migraciones Posteriores a 1970 _________________________________________ 19 4.8. Las Migraciones de 1980’s: México, Estados Unidos y Canadá________________ 20 4.9. Migraciones al Este de Asia ____________________________________________ 21 4.10. Migraciones en Sur América___________________________________________ 21 4.11. Una Nueva Migración de Colombia al Ecuador ____________________________ 21CAPÍTULO III___________________________________________________________ 22 CARACTERIZACIÓN POBLACIONAL_____________________________________ 22 1. Tipo de apareamiento __________________________________________________ 23 2. Razas Fisiológicas_____________________________________________________ 25 3. Métodos Moleculares para la Caracterización de las Poblaciones ________________ 30
  3. 3. 3.1. Patrones de Electroforesis de Proteínas Totales ____________________________ 30 3.2. Patrones isoenzimáticos (Aloenzimas) ___________________________________ 31 3.3. Análisis del Producto de la Trascripción (Northern blot) y la Traducción (Southernblot)____________________________________________________________________ 33 3.4. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción RFLPs para análisis delos genomas nuclear y mitocondrial ___________________________________________ 34 3.5. Haplotipos Mitocondriales (RFLP-PCR)__________________________________ 35 3.6. Método AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) __________________ 41 3.7. Marcadores Microsatélites _____________________________________________ 42 3.8. ITS Regiones espaciadoras transcritas ____________________________________ 43 3.9. Nuevos cebadores (primers) para la detección de Phytophthora infestans por PCR_ 43 3.10. Marcadores de polimorfismo del DNA amplificado al azar ( Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD) _________________________________________________ 44 POBLACIONES DE P. INFESTANS REPORTADAS A NIVEL MUNDIAL ________ 44CAPÍTULO IV ___________________________________________________________ 55 BIOLOGÍA DE PHYTOPHTHORA INFESTANS_______________________________ 55 1. Reproducción asexual __________________________________________________ 57 2. Reproducción sexual ___________________________________________________ 58 3. Ciclo de Vida de Phytophthora infestans ___________________________________ 61CAPÍTULO V____________________________________________________________ 63 FUENTES GENÉTICAS DE RESISTENCIA A LA GOTA CAUSADA POR P.INFESTANS _____________________________________________________________ 63 1. Resistencia Específica a Razas de P. infestans _______________________________ 65 2. Resistencia Parcial o Cuantitativa (Resistencia de Campo) _____________________ 68 3. Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) ____________________________________ 72 4. Factores Posiblemente Involucrados en la Pérdida de la Resistencia de las Plantas a laGota____________________________________________________________________ 74CAPÍTULO VI ___________________________________________________________ 76 PATOGENICIDAD ______________________________________________________ 76 1. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Susceptibles _________________ 81 2. Interacción de P. infestans con Plantas Altamente Resistentes y con ResistenciaIntermedia _______________________________________________________________ 82 3. Interacción de P. infestans con Plantas que Presentan Resistencia de Campo (sin genesR) _____________________________________________________________________ 82 4. Desarrollo de la Interacción de P. infestans con Plantas no Huéspedes de P. infestans 83 5. Cómo Estimar la Resistencia de las Plantas a P. infestans? _____________________ 83 5.1. Pruebas moleculares para la detección de resistencia ________________________ 84 5.2. Pruebas de selección y evaluación de resistencia en plántulas bajo condicionescontroladas. ______________________________________________________________ 85 5.3. Preparación de las suspensiones de zoosporangios para la inoculación __________ 86 5.4. Pruebas de evaluación de resistencia en plantas bajo condiciones de campo ______ 87 Parámetros para estimar la resistencia de las plantas en el campo __________________ 88CAPÍTULO VII __________________________________________________________ 92 CONTROL DE LA GOTA (TIZÓN TARDÍO) CAUSADA POR Phytophthora infestans _______________________________________________________________________ 92 ELEMENTOS PARA EL MANEJO INTEGRADO DE LA GOTA DE LA PAPA ____ 93 1. Control Biológico _____________________________________________________ 93
  4. 4. 2. Saneamiento _________________________________________________________ 93 3. Escape ______________________________________________________________ 94 4. Predicción ___________________________________________________________ 94 5. Otras prácticas de control cultural ________________________________________ 95 6. Control químico ______________________________________________________ 96 6.1. Normatividad para el Registro de Productos con Acción Fungicida _____________ 97 6.2. Fungicidas utilizados para el Control Químico de la Gota (tizón tardío) _________ 98 6.2.1. Protectantes _______________________________________________________ 98 6.2.1.1. Ditiocarbamatos __________________________________________________ 98 6.2.1.2. Phthalamidas ____________________________________________________ 98 6.2.1.3. Piridineaminas ___________________________________________________ 98 6.2.1.4. Compuestos trifeniltinas ___________________________________________ 99 6.2.2. Fungicidas Sistémicos_______________________________________________ 99 6.2.2.1. Carbamatos_____________________________________________________ 100 6.2.2.2. Derivados del Ácido Cinámico _____________________________________ 100 6.2.2.3. Cianoacetamidas-oximes (CYMOXANIL) ____________________________ 100 6.2.2.4. Fosfonatos _____________________________________________________ 101 6.2.2.5. Fenilamidas (METALAXYL) ______________________________________ 101 RESISTENCIA A FUNGICIDAS SISTÉMICOS CON ÉNFASIS EN LASFENILAMIDAS _________________________________________________________ 102 MÉTODOS PARA EL MONITOREO DE LA RESISTENCIA___________________ 106 1. Evaluación en discos de tubérculo (Tomado de Sedegui, et al., 1999 y basado en latécnica de Kadish y Cohen, 1988). ___________________________________________ 106 2. Evaluación con discos de hoja flotando en la solución fungicida (Tomado de Sedegui,et al.,1999 y Basado en la técnica descrita por Kadish et al., 1990). ________________ 106 3. Evaluación con hoja flotando en la solución fungicida (Tomado de Sedegui, et al, 1999y Basado en la técnica descrita por Goth y Kean, 1997). __________________________ 107 ESTRATEGIAS PARA EVITAR RESISTENCIA A FENILAMIDAS_____________ 108 SINERGISMO ENTRE DIFERENTES FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DELTIZÓN TARDÍO ________________________________________________________ 108 UN PROGRAMA PARA EL CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA O TIZÓN TARDÍODE LA PAPA Y EL TOMATE _____________________________________________ 110 1. Efectividad de los productos fenilamidas/mancozeb (Inóculo natural) ___________ 110 2. Efectividad del control con propamocarb (Inóculo artificial)___________________ 110 3. Efectividad del control con Dimetomorf (Inóculo Natural) ____________________ 111 4. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 10 días__________________ 111 5. Efectividad del control con Fluazinam a intervalos de 7 y 10 días_______________ 111 MEZCLAS DE FUNGICIDAS DE USO COMÚN PARA EL CONTROL DE LA GOTAEN PAPA Y TOMATE EN COLOMBIA._____________________________________ 111 SISTEMAS EXITOSOS DE CONTROL QUÍMICO DE LA GOTA DE LA PAPA. __ 112 CONDICIONES PARA UNA ADECUADA APLICACIÓN DE FUNGICIDAS _____ 115CAPÍTULO VIII ________________________________________________________ 116 PRONÓSTICO DE LA GOTA CAUSADA POR P. INFESTANS_________________ 116BIBLIOGRAFIA ________________________________________________________ 120
  5. 5. MONOGRAFÍA SOBRE Phytophthora infestans (MONT) DE BARY Sonia Jaramillo Villegas I. A., M. Sc. Profesora Asociada Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Departamento de Ciencias Agronómicas. E mail: sjaramal@perseus.unalmed.edu.co INTRODUCCIÓN El Oomycete Phytophthora infestans, agente causante de la gota (tizón tardío) de la papa, hasido reconocido desde las épocas precolombinas, pero sólo a partir de 1845, se tomó concienciade su magnitud, dado que arrasó los cultivos que eran la base de la alimentación del puebloIrlandés, causando una gran hambruna que desencadenó en la muerte y la migración de unacuarta parte de la población. El control químico de la gota tiene efectos significativos en la rentabilidad del cultivo y lacontaminación del medio ambiente. Sin embargo, hasta el presente, es una de las herramientasmas utilizadas y estratégicas, pues no se han establecido otros sistemas de control eficaces, yaque la resistencia genética de las variedades de papa mas cultivadas comercialmente, no ha sidoestable y el patógeno evoluciona permanentemente, hacia poblaciones cada vez mas agresivas yresistentes a los fungicidas de tipo sistémicos. Es posible que su ubicación dentro del reino de los hongos, durante tantos años, haya retrazadoel proceso del conocimiento de la biología y el diseño de productos químicos mas apropiadospara el control de los oomycetes. Por otro lado, a partir de los años 1950’s, se estableció el Vallede Toluca (México), como centro de origen del patosistema P. infestans / S. tuberosum, dado queallí se reportó inicialmente la presencia de los dos tipos de apareamiento A1 y A2, lo cual permitela propagación sexual y conduce a una mayor diversidad genética de P. infestans. Fue así comoMéxico se constituyó en el centro de atención de los investigadores, descuidando el estudio deeste limitante patógeno en otros ecosistemas y cultivos. A partir de los años 1980’s, el programa de tizón tardío de la papa (gota) del CIP (CentroInternacional de la Papa), inició actividades de investigación en los Andes Suramericanos. Allíse encontró gran cantidad de huéspedes en el Perú, (Abad, 1983), Ecuador (Ordoñez, 2000) y unagran diversidad y agresividad del patógeno en Rionegro, Colombia, razón por la cual, seconsideró este lugar como el segundo sitio de diversidad de P. infestans, trasladando al CentroRegional de Investigación “La Selva” del ICA, el programa de evaluación de los clones obtenidospor los mejoradores de dicho centro. 1
  6. 6. El hallazgo reciente del tipo de apareamiento A2 de P. infestans, en especies silvestres desolanáceas, en papa en Bolivia y ambos tipos de apareamiento en pepino (Solanum muricatum(Alder et al. 2002) en el Ecuador, da indicios de que tanto el patógeno como las especieshuéspedes han coevolucionado en los Andes Suramericanos, razón por la cual es importantehacer estudios detallados de aislamientos y caracterización de P. infestans procedentes dediferentes zonas ecológicas y huéspedes, dado el amplio rango de adaptación de las especiesSolanum, donde la reproducción sexual pudiera ser parte importante del ciclo de vida en elecosistema andino. Existe una gran preocupación mundial por el resurgimiento de nuevas poblaciones de P.infestans, por el desconocimiento de los agricultores sobre las estrategias del control integrado yla inestabilidad de la resistencia de las variedades, que podría conducir a epidemias de mayormagnitud incluso que la de Irlanda. Esto es especialmente cierto para los países en desarrollo,por lo que Turkensteen y Flier (2002) expresaron que tanto el Centro Internacional de la Papa(CIP), como la comunidad Internacional que investiga en el tizón tardío, representada por elGILB (Global Inititive on Late Blight) deberían realizar acciones que mejoren las estrategias demanejo integrado del tizón tardío y faciliten los esfuerzos de los mejoradores, para en un futurocontar con nuevas variedades, que tengan altos niveles de resistencia estables, que puedancontrarrestar el incremento de los niveles de patogenicidad exhibidos por P. infestans. Entre los componentes epidemiológicos se destaca el abandono de campos de cultivos sincosechar, lo cual se da por bajos rendimientos ocasionados por diferentes factores, las pilas detubérculos abandonados a la intemperie en vecindades a los campos de cultivos de papa, al igualque los campos de cultivos de papa orgánica, como lo indican Zwankhuizen et al., (1998), con unmenor grado para los tubérculos-semilla y las socas o tubérculos que quedan en el campo. Sinembargo, la dinámica de la gota de la papa y el tomate en las zonas templadas, es muy diferente ala de las regiones paperas y/o tomateras en los países tropicales, razón por la cual se hacenecesario la investigación a nivel de ecoregiones. Los cultivos de papa y tomate son muy importantes para Colombia, no sólo por lo querepresentan para la seguridad alimentaria del país, ya que son básicos en la canasta familiar, sinopor la generación de mano de obra para las labores del cultivo, transporte, comercialización ytransformación industrial, que se traduce en mejor calidad de vida para las personas vinculadas demanera directa o indirecta a dichas actividades y mayor desarrollo de los municipios, ya queambos cultivos hacen parte de las cadenas agroalimentarias (papa y hortalizas respectivamente),lo que amerita todos los esfuerzos encaminados a entender la biología y el control del patógenoP. infestans, que causa la principal enfermedad de estos cultivos, gota o tizón tardío, entre otrasdenominaciones regionales. Los avances en los conocimientos de la bioquímica, fisiología y morfología de las plantashuéspedes y los estudios genéticos y moleculares del patógeno, han proporcionado unainformación sobre las relaciones huésped-patógeno en este patosistema, especialmente en lorelacionado con la identificación de genes elicitores y el establecimiento de rutas metabólicasinvolucradas en las reacciones de defensa de las plantas al ataque de P. infestans, dando laoportunidad según Kamoun (2002), de entrar a la era posgenómica, para ligar una secuenciagenética a un fenotipo, usando herramientas computacionales, para planear ensayos con altaefectividad, que permitan el uso de nuevos genes de Phytophthora que disparen una variedad derespuestas celulares y moleculares en las plantas y se empiece a establecer conexionesfuncionales, entre los genes de Phytophthora y sus procesos en las plantas. 2
  7. 7. En tal sentido es necesario impulsar la investigación sobre la interacción huésped-patógeno, queincluyan tanto los huéspedes de uso comercial, como los alternos (Alder et al., 2002) endiferentes zonas ecológicas, para entender los mecanismos involucrados en dicha relación einterpretar el comportamiento del patógeno en el campo, a su vez con el análisis de los factoresepidemiológicos, con el fin de desarrollar programas de manejo integrado de la gota de la papa, eltomate, el lulo y el pepino, en las diferentes regiones donde se cultivan para evitar el desarrollode las epidemias. El presente trabajo es producto de la investigación que se ha venido realizando en launiversidad por mas de ocho años y una amplia revisión bibliográfica de las investigaciones quese han venido realizando a nivel nacional e internacional. Se expresa los agradecimientos por losaportes financieros a la Universidad Nacional de Colombia, COLCIENCIAS, FEDEPAPA,CORPOICA, CIBA GEIGY (hoy SYNGENTA) y CEVIPAPA. Se destaca la asesoria deinvestigadores del programa de fitopatología del Centro Internacional de la Papa (CIP) y el apoyode profesores y estudiantes de la Universidad Nacional de Colombia y de la Universidad deAntioquia, en la ejecución de sus trabajos de grado y tesis, algunos de los cuales han sido objetode reconocimiento por la Asociación de Fitopatología Colombiana (ASCOLFI). 3
  8. 8. CAPÍTULO I TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN 1. POSICIÓN TAXONÓMICA DENTRO DE LOS ORGANISMOS VIVOS En la presente sesión me permito presentar una discusión basada en los textos preparados porRaven, Evert y Eichhorm (1999) y Erwin y Ribeiro (1996), con la siguiente ubicación: REINO Cromista (grupo Stramenophyle) PHYLUM Oomycota CLASE Oomycete SUBCLASE Peronosporomycetidae ORDEN Pythiales FAMILIA Pythiaceae GÉNERO Phytophthora ESPECIE infestans El Phyllum Oomycota, perteneciente al reino Cromista, comprende mas de 700 especies, lascuales no tienen pigmentos fotosintéticos, poseen dos flagelos en las zoosporas y los gametosmasculinos, con paredes formadas por celulosa o polímeros similares a celulosa y tienen hábitosacuáticos y terrestres, aunque siempre necesitan la presencia del agua. Por sus formas filamentosas parecidas a hifas, se agruparon originalmente como hongos.(Raven, Evert y Eichhorm, 1999), lo que luego fue confirmado por las filogenias moleculares,basadas en las secuencias del RNA ribosomal, datos de los aminoácidos compilados para lasproteínas de la mitocondria y cuatro proteínas que codifican para los genes cromosómicos,evidenciando que los Oomycetes adquirieron la habilidad de infectar las plantas de maneraindependiente de los hongos verdaderos (Kamoun, 2002). Los Oomycetes, están mas relacionados con las algas, dado que presentan meiosis en losgametangios, por lo tanto sus núcleos vegetativos son de naturaleza diploide. Son conocidoscomo organismos “heterocontes”, lo que significa que poseen flagelos en las zoosporas conlongitud y ornamentación diferente. Los flagelos se presentan en pares, un flagelo largo yadornado con nastigonemas (pelos) distintivos (plumosos) y un flagelo mas corto, delgado,cilíndrico y en forma de látigo o flecha. Las características que diferencian el género Phytophthora de los hongos se basan en lamorfología de las crestas mitocondriales (tubulares) y la bioquímica de las paredes celulares, las 4
  9. 9. cuales contienen microfibrillas de celulosa con una matriz amorfa de B’ 1-3 glucano en vez dequitina, carencia de hipoxidación del esqualene a esteroles y diferencias en las vías metabólicas,como resultado de un sistema genético único (Griffith et al. 1992, cit. por Erwin y Ribeiro, 1996). Los análisis de las secuencias moleculares de la subunidad 18S del rDNA (ribosomal) hanconfirmado que los Oomycetes, están estrechamente relacionados con las Crhysophytas,Diatomeas y algas cafés, pero se separaron relativamente temprano de las formas pigmentadas.(Raven, Evert y Eichhorm, 1999). Foster (1990) observó que las secuencias de la subunidad 18Sdel rDNA son similares entre las algas fotosíntéticas heterocontes y miembros del géneroPhytophthora. Al comparar las secuencias de la subunidad 28S rDNA, encontraron pocasustitución de nucleótidos entre los seis grupos de Phytophthora, mostrando gran homogeneidady por lo tanto poca utilidad de esta región para los análisis filogenéticos. (Briand, 1995, citadopor Smart et al., 2000). Al analizar el gen de la familia actina Bhattacharia y Stickel (1994) citados por Smart et al.,(2000), encontraron que todos los miembros de Oomycota contienen dos tipos de actina, loscuales probablemente surgieron por una duplicación del gen, que ocurrió después de ladivergencia de los Oomycetes y las algas cromofitas. La mayoría de las especies de Oomycetes se reproducen sexual y asexualmente: lareproducción asexual, es por medio de las zoosporas móviles cuyos flagelos son característicos ydistintivos de las especies. La reproducción sexual es oogámica. El gameto femenino (oogonio)es relativamente grande, en forma de huevo no flagelado y es fecundado por el gameto masculino(anteridio) que es notablemente mas pequeño y flagelado. En los Oomycetes, uno o muchos huevos se producen en una estructura denominada Oogonio.El anteridio contiene numerosos núcleos masculinos. La fertilización resulta en la formación deun zigoto con paredes gruesas (la Oospora, que le da el nombre al Phyllum Oomycota) quepuede entrar en estado de reposo y tolerar condiciones de estrés, permaneciendo inactiva o enreposo, cuando las condiciones no son favorables para la germinación. Las esporas asexuales (zoosporas) son producidas en el “esporangio”, de manera mas precisa elzoosporangio. Los esporangios se desarrollan sobre los esporangióforos, los cuales son similaresen diámetro a las hifas. En algunas especies emergen nuevos esporangióforos a través de lasbases de esporangióforos viejos, de las cuales se han liberado zoosporas uninucleadas. Un grupo grande de este Phyllum son acuáticos, algunos saprófitos y otros son parásitos, quecausan enfermedades en peces y sus huevos. Otros son terrestres como los géneros Phytophthoray Pythium estrechamente relacionados y pertenecen a la familia Pythiaceae, los cuales causanenfermedades en las plantas, pero requieren del agua líquida para la movilidad de las zoosporasen el suelo o en el follaje. 2. MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE Phytophthora La identificación de algunas especies de Phytophthora, parece ser relativamente simple, perolas diferencias morfológicas con otras especies del mismo género son tan pequeñas y algunascaracterísticas tan variables, que incluso los expertos consideran que el género es difícil declasificar, mas aún para los que no están relacionados con la taxonomía de este grupo. Por esta 5
  10. 10. razón es necesario acudir a las técnicas de patrones isoenzimáticos y RFLPs de DNA nuclear ymitocondrial, para diferenciar las especies. (Waterhuose et al. 1983, citado por Erwin y Ribeiro,1996). Rosenbaum (1917) citado por Erwin y Ribeiro (1996), estableció una primera clave paraseparar 11 especies de Phytophthora, utilizando características como el tipo de anteridio, laprominencia de las papilas sobre el esporangio, el tamaño y la relación longitud y ancho delesporangio, la presencia y tamaño de las clamidosporas y el tamaño y abundancia de lasoosporas: El tamaño de los esporangios no parece ser relevante, dado que éste varía con lascondiciones de crecimiento (Leonian y Geer,1929, citados por Erwin y Ribeiro,1996). Tucker, 1930, (Citado por Erwin y Ribeiro, 1996), además de la morfología, utilizó la fisiologíay la patología, en las que incluyó la habilidad para crecer en ciertos medios, el tipo de anteridio,la presencia o ausencia de órganos sexuales, la naturaleza de las papilas (especie de trompocompuesto de un material hidratado, con un índice de refracción diferente al material de la paredcelular de las hifas), la presencia de clamidosporas, la patogenicidad, el tamaño de la oospora, lapresencia de hinchamientos hifales, las temperaturas mínima, óptima, y máxima para elcrecimiento y la especificidad patogénica. Posteriormente, se publicaron muchas otras claves sobre especies de Phytophthora, pero laclave taxonómica producida por Waterhouse (1963) (citado por Erwin y Ribeiro, 1996), fue laprimera en ubicar las categorías de las especies en grupos morfológicos y parámetrosfisiológicos, lo que significó un gran avance en la taxonomía de Phytophthora, la cual es muy útily aún aceptada. Dichos parámetros incluyeron patrones de ramificación de los esporangióforos; ápice delesporangio; abundancia de esporangios sobre medio sólido; la caducidad del esporangio; laproliferación interna de esporangios; la producción de oogonios y oosporas en un solo cultivo(homotálico) o en diferentes cultivos (heterotálico); naturaleza del anteridio; abundancia oausencia de oosporas en los tejidos huéspedes o en el cultivo y para ciertas especies, forma delesporangio y sus dimensiones. Otras características incluidas en la identificación de ciertasespecies son: relación longitud-ancho, esporangióforos, hinchamientos hifales, presencia oausencia de clamidosporas, tamaño del oogonio, ornamentación de la pared del oogonio,especificidad del huésped y rangos de temperatura mínima, óptima y máxima para el crecimiento. 2.1. Micelio Las estructuras somáticas (talos) de Phytophthora son llamadas micelio y están compuestos defilamentos, “hialinos” (hifas) ramificados y cenocíticos (no septados), excepto en cultivos viejos,en los cuales algunas veces se pueden observar septas. En cultivos jóvenes, el citoplasma fluyelibremente dentro del micelio. El diámetro del micelio (5-8 micras) es variable y depende de lanaturaleza física y química del medio y de si el micelio está sobre la superficie aérea, sumergidoo dentro de las células huéspedes. En ocasiones el micelio se esponja, se vuelve nudoso otuberculado y raras veces crece simétricamente (Erwin y Ribeiro, 1996). Las hifas se ramifican en ángulos aproximados de 90 grados y algunas veces se constriñen en labase. Aunque hay especies que tienen patrones de micelio característicos, éstos no son lo 6
  11. 11. suficientemente útiles para diferenciar especies; como tampoco lo son el crecimiento y la formade la colonia y el hinchamiento de las hifas (Erwin y Ribeiro, 1996). 2.2. Esporangios y Zoosporas Los esporagios son esporas asexuales que se producen sobre pedúnculos llamadosesporangióforos, los cuales difieren ligeramente de las hifas vegetativas, su desarrollo esindeterminado y se ramifican simpodialmente, lo cual es propio de Phytophthora infestans. Losesporangios se diferencian porque en Phytophthora cada uno tiene un pedúnculo, cuya longitudvaría con la especie, en rangos d medio a corto como en P. infestans, en el cual pueden liberar ehasta 36 zoosporas (Sansome 1976, citado por Abad, 1983). Los esporangios varían en forma y tamaño. Las formas son algo diferentes para una especie enparticular, pero son a menudo variables en el rango: De esféricas, subesféricas, ovoides,ovalovoides, elipsoides, limoniformes (P. infestans), periformes, obperiformes (en forma de perainvertida), turbinadas (como un trompo), obturbinadas (trompo invertido). La diferencia detamaño puede estar afectada por la luz, los esteroles y los medios nutritivos. Los esporangiosmiden entre 29x19 a 59x31 micras (Waterhause, 1963, citado por Erwin y Ribeiro, 1996). El patógeno P. infestans, produce hinchamientos característicos arriba de la zona donde sedesprende el esporangio. En algunas especies el esporangióforo reinicia el crecimiento a travésde la base de los esporangios evacuados; el nuevo esporangio puede proliferar adentro de lasparedes de uno vacío (proliferación interna) o el esporangióforo puede crecer hacia afuera y salirpor el poro de esporangios anteriores y formar el próximo esporangio a alguna distancia delúltimo (proliferación extendida). El engrosamiento apical sobre el esporangio, el cual tiene forma de limón, se denomina papila,de cuyo extremo emergen las zoosporas. El espesor de esta estructura varía entre especies. Laespecie P. infestans es semipapilada o sea con una cavidad superficial, cuyo poro esgeneralmente estrecho. Es difícil interpretar la diferencia entre un esporangio semipapilado de uno no papilado. Losesporangios coloreados con azul de algodón (0.01%) en lactofenol, o rojo de bengala (50 mg/ml)podrían diferenciar el engrosamiento apical del protoplasma. Las coloraciones basadas enlactofenol son utilizadas debido a la conservación de los montajes que pueden ser preservados enun herbario para futuros estudios, pero a menudo se encogen los protoplasmas que están dentrode los esporangios, lo que puede evitarse por el uso de azul de algodón o azul-tripano en clorurode sodio al 0.85%; sin embargo, estas coloraciones no preservan el espécimen (Erwin y Ribeiro,1996). Los eventos de una secuencia básica que conduce a una formación de zoosporas dentro delesporangio y la disolución de la boca apical, antes de la emisión de las zoosporas a partir de losesporangios, es igual para todas las especies. La caducidad del esporangio y la longitud delpedicelo son factores importantes y únicos para ciertas especies. Las especies no papiladas noson caducas o deciduas (Erwin y Ribeiro, 1996). P. infestans y P. phaseoli son las únicas especies con esporangios que se desprenden y sonarrastrados por el aire o el agua. En el aire seco los esporangióforos de P. infestans, se retuercen 7
  12. 12. y doblan, para descargar los esporangios en el aire, como sucede con los esporangios dePeronospora, lo que les da una ventaja epidemiológica. Morfología de las Zoosporas El aparato flagelar típico de las zoosporas posee dos flagelos uno en forma de látigo y el otro enforma de pluma. La zoospora está conformada por varias partes: el kinetosoma (cuerpo basal dela zoospora), la zona de transición que une el flagelo con el kinetosoma, y el sistema delmicrotúbulo, que permite anclar el flagelo a la zoospora. Los anclajes (como raicillas) de los flagelos de P.infestans, son significativamente diferentes,pues sólo tiene cinco “raicillas”, mientras que otras especies tienen seis. Una de las “raicillas” delas zoosporas de P. infestans contiene seis microtúbulos en comparación con otras especies quesólo presentan cuatro. Esta característica podría ser útil para diferenciar P. infestans, ya queparece ser única en el género (Erwin y Ribeiro,1996). 2.3. Presencia de Clamidosporas Muchas especies no producen clamidosporas, incluyendo P. infestans. Además la morfologíade la clamidospora no es muy útil para diferenciar especies, por lo tanto, no es una característicaimportante, excepto en P. macrochlamydospora, en la cual las clamidosporas son grandes ycaracterísticas (Erwin y Ribeiro, 1996). 2.4. Órganos Sexuales Los procesos sexuales involucran la producción del oogonio y el anteridio, los cuales surgen delas puntas del micelio que se contactan. Si el oogonio crece sobre el anteridio, éste se denominaanfiginio y si el anteridio rodea al oogonio, en su parte basal cerca al pedicelo, se conoce comoparaginio. En Pythium el anteridio rodea completamente el oogonio. La posición del anteridio(paraginio o anfiginio) es una característica importante de diagnóstico. En Phytophthorainfestans el anteridio es anfiginio (Erwin y Ribeiro, 1996). 3. FACTORES DEL AMBIENTE QUE INCIDEN EN LA CLASIFICACIÓN DELAS ESPECIES Dentro de los factores fisiológicos la temperatura, la humedad relativa y la luz son importantespara diferenciar ciertas especies de Phytophthora, entre las cuales está incluida P. infestans, quecrece bien a temperaturas promedio de 18 ºC, con 1.300 microwatios por cm2 de luz en medioagar-centeno y alta humedad relativa. En general se ha reportado que la radiación solar es elfactor que mas afecta la germinación de los esporangios, posiblemente por los efectos de la luzultravioleta (Erwin y Ribeiro , 1996; Sunseri y Johnson, 2002). 8
  13. 13. 4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIFERENCIAR ESPECIES La adaptación de la tecnología de biología molecular, se ha constituido en una herramientaimportante para confirmar la validez de las especies determinadas utilizando característicasmorfológicas porque permiten detectar posibles diferencias genéticas que se desarrollan por laevolución relativamente rápida del patógeno, debido a la eficacia patogénica en muchoshuéspedes, que en ocasiones no son acompañadas de cambios morfológicos. Al comparar las secuencias de los ITSI e ITSII (regiones espaciadoras internas transcritas) delos seis grupos morfológicos descritos por Waterhouse en 1993, se demuestra que elagrupamiento propuesto, coincide con las características morfológicas establecidas (Cooke yDuncan,1997, citados por Smart et al, 2002). Sin embargo, dentro de un mismo grupo, como esel caso del grupo IV, las especies P. infestans, P. mirabilis y P. phaseoli son indiferenciables porla técnica de los ITSII, pero sí por análisis de haplotipos mitocondriales. Los otros miembros delgrupo: P. elicis, P. colocasiae y P. hibernalis se pueden diferenciar directamente utilizandomarcadores ITS (Tooley et al, 1998, citados por Smart, 2002). 5. CRITERIOS ÚTILES PARA DESCRIBIR O IDENTIFICAR ESPECIES DEPHYTOPHTHORA Los criterios que se citan a continuación han sido tomados casi textualmente de Erwin yRibeiro, 1996, por considerarlos de gran utilidad en la presente monografía. Esporangios: no papilados, semipapilados ( P. infestans) o papilados. El ancho del poro de salida sobre el esporangio. La persistencia o caducidad (P. infestans) del esporangio y la longitud del pedicelo corto(menos de 5 micras) para P. infestans. Forma y tamaño del esporangio. La relación longitud-ancho del esporangio. El esporangióforo: no ramificado, irregularmente ramificado, en un simpodio simple (conramificación compuesta simpodial nudoso; Ho 1992; Ho et al.1995 para P. infestans, citados porErwin y Ribeiro, 1996) complejo o en umbela; Se forman nuevos esporangios internamente(proliferan). Oogonio: tamaño y forma. Oogonio: ornamentación de la pared. Oosporas: diámetro y espesor de la pared celular. Oosporas: pleróticas o apleróticas. Anteridio: Anfiginio, paraginio o ambos. 9
  14. 14. Anteridio: unicelular y/o bicelular. Anteridio: tamaño y forma. Homotálico: produce oosporas en un solo cultivo. Heterotálico: produce oosporas solamente o principalmente cuando se une con un tipo deapareamiento opuesto, tipo de apareamiento A1 o A2 (P. infestans). Temperaturas adecuadas para el crecimiento: óptima, mínima y máxima (por debajo de 30grados centígrados). Hinchamiento hifal: simple, catenulado o closterado. Clamidosporas: terminal, intercalar, lateral o sésil. Patrón de crecimiento en cultivo con agar: petaloide, arrosetado, en estrella,irregular, denso oligero. Hifas: lisas, onduladas, enrolladas o coraloides. Sistema de ramificación hifal (Ho, 1978, citado por Erwin y Ribeiro, 1996). Producción de pigmentos. En un medio con caseína tirosina-hidrolizada (Sheperd, 1976, citadopor Erwin y Rtibeiro, 1996). Patogenicidad: un solo huésped o muchos huéspedes. Perfiles de proteína (Gill y Zentmyer, 1878; Erselius y Shaw, 1982; Erselius y de Vallavielle,1984; citados por Erwin y Ribeiro, 1996). No reportado para P. infestans Patrones isoenzimáticos: para P. infestans (Spielman et al., 1989, 1991, citados por Erwin yRibeiro, 1996). Patrones de Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del DNA.Para P. infestans (Goodwin, 1990, 1992, citado por Erwin y Ribeiro, 1996). 10
  15. 15. CAPITULO II ORIGEN Y MIGRACIONES DEL PATOSISTEMA Phytophthora infestans/Solanum tuberosum 1. ORIGEN DEL PATÓGENO Phytophthora infestans (MONT) DE BARY Phytophthora significa “destructor de plantas” y la especie infestans, es el agente que causa eltizón tardío (gota) de la papa, el cual tiene varios sinónimos. Erwin y Ribeiro (1996), hacen unaamplia discusión sobre la historia de este patógeno y la enfermedad que afecta la papa. Según los autores antes indicados, Matius de Prusia en 1842, lo llamó Gangraena tuberumsolani, cuando por primera vez describió el hongo que causó la enfermedad que devastó el follajey los tubérculos de papa en casi toda Europa. Informa Bourke, 1993 (citado por Peterson, 1995)que los reportes de Matius de Prusia fueron considerados como “una herejía” y que el ReverendoBerkeley de Inglaterra interesado en el estudio de la patología de las plantas, revisó el reporteinicial de Prusia, lo tradujo y lo publicó en el “Gardener’s Chronicle”, dado que sus estudioscoincidieron con el punto de vista de dicho investigador. Según Bourke (1991) citado por Erwin y Ribeiro (1996), hubo muchas teorías para explicar lanueva enfermedad que apareció en la papa en Europa Continental, las islas Británicas, pero lamayoría de los comentarios se basaban en el mal clima (tiempo lluvioso y polución industrial).Hacia 1845, Morren de Bélgica escribió varias cartas en las que sostenía que un hongo era lacausa del tizón en la papa, teoría fuertemente controvertida. Después de algunas dudas Montagne aceptó la teoría de Morren y con la información que teníadecribió el género Botrytis infestans, el cual conocemos hoy como Phytophthora infestans, quefue confirmada posteriormente por Antony de Bary 1876. (Erwin y Ribeiro, 1996). Los europeos ya conocían otros “males” que afectaban la producción de la papa(encrespamientos y pudriciones secas) desde 1760’s, que los condujo a reemplazar las semillasdegeneradas, introduciendo nuevos materiales importados por distintos puertos de manera oficialo extraoficial, ingresando nuevas variedades de Norte y Sur América, utilizadas en ensayos decampo entre 1843-1845, posibilitando el ingreso del agente causal de la gota, enfermedadobservada en dichos campos (Daly, 1996). P. infestans es la especie mas conocida por causar la enfermedad denominada como tizón tardío(gota) que produjo una tremenda destrucción de los cultivos de papa en Irlanda hacia los años1840s, con efectos inmediatos de pobreza y hambruna, que condujeron a profundos cambiossociales y económicos en ese país, a la reducción de la cuarta parte de su población por la muertede un millón de personas y la migración de otro tanto. Ninguna otra enfermedad de plantas hacausado tan amplia dispersión humana e impacto social (Erwin y Ribeiro, 1996; Daly, 1996). Desde entonces se han propuesto varias teorías en torno al origen del patógeno P. infestans,puesto que la gota fue observado por primera vez en cultivos de papa cerca a Filadelfia alrededor 11
  16. 16. de 1843 y para 1845 estaba esparcido por casi todo el noreste de Norte América y en el verano deese año apareció en el noroeste de Europa (Daly, 1996). Dado que el patógeno fue asociado inicialmente con la papa, cultivo básico en la alimentación aescala mundial, tomó gran importancia el estudio del patosistema Phytophthora infestans/Solanum tuberosum, dentro de un contexto de coevolución. 2. ORIGEN DE LA PAPA CULTIVADA (Solanum tuberosum) El antropólogo Engel (1964) citado por Estrada (2000) encontró fósiles de papa con unaantiguedad verificada de aproximadamente 10.000 años, al sureste de Perú y noroeste de Bolivia,alrededor del Lago Titicaca, coincidiendo con la conclusión de Hawkes, sobre su domesticaciónen dicha región a partir de Solanum leptophyes, que originó la primera especie cultivada Solanumstenotomum (2x=2n) diploide. Luján (1996) afirma que la papa se originó a 3.800 msnm, 17º 94’ de latitud sur y 68º 03’ delongitud oeste. Las condiciones climáticas actuales corresponden a un clima seco condeficiencias de lluvia en todas las estaciones. Temperatura promedio de 13,1 ºC. Precipitaciónpromedio (seis años) anual de 376,1 mm. Alta luminosidad a cualquier hora del día,especialmente en las tardes cuando soplan vientos fuertes y helados. Dichas condiciones son desfavorables para el desarrollo del patógeno P. infestans causante dela enfermedad, conocida como tizón tardío o gota de la papa, especialmente por la altalumimosidad, puesto que se ha encontrado que los esporangios reducen en un 95% lagerminación, con una hora de exposición a alta intensidad de la luz solar (Sunseri y Johnson,2002). Según Hawkes, citado por Estrada (2000), otras papas silvestres comenzaron a evolucionar enMéxico, y algunas migraron a Suramérica cuando se formó el puente terrestre en la épocageológica del plioceno, hace tres millones de años. Luego ocurrieron migraciones de regreso aMéxico en forma de grupos de especies tetraploides (2n=4x=48) y hexaploides (2n=6x=72). 3. MIGRACIONES Y EVOLUCIÓN DE LA PAPA CULTIVADA Dado que la migración de la papa está asociada a la posible migración del patógeno P.infestans, se ha considerado importante, presentar las rutas de migración de dicho tubérculo. Hawakes y Ortega (1992), citados por Estrada (2000), indican que el primer registro deexportación de papa a Europa fue encontrado en Sevilla (España), el cual indica que la papallegó en 1570, procedente de tubérculos de la subespecie andigena, recolectados en la partecentral de Colombia (Bogotá o páramos cercanos) y transportados por el Río Magdalena hastaCartagena y de allí a las Islas Canarias. Se compraba en el mercado de Sevilla en 1580 y fuellevada por Drake o Roberg a Inglaterra en 1590. Según Robertson (1991, citado por Abad y Abad (1995), la papa fue introducida aNorteamérica a través de las Islas Bermudas en 1663, en tubérculos procedentes de Inglaterra,pero sólo se volvió cultivo importante en 1718 con la llegada de los irlandeses presbiterianos.Hay reportes sobre su cultivo en la India en 1772-1775 (Mc Intosh, 1927) en Formosa en 1650 y 12
  17. 17. en China en 1700 (Laufer, 1938). Inicialmente se introdujo la subespecie Solanum tuberosumssp. andigena, la cual sólo tuberiza en días cortos, condición que se presenta al final del año enEuropa (Abad y Abad, 1995). Entre el descubrimiento, la introducción y el cultivo de la papa en Europa, pasaron por lomenos dos siglos a través de los cuales, se desarrolló la subespecie Solanum tuberosum ssp.tuberosum, adaptada a las condiciones de la zona templada de Europa, caracterizadas por díaslargos en el verano, con altas temperaturas e intensidades luminosas y días cortos en el otoñoscon bajas temperaturas que favorecen el proceso de tuberización. Hoy se sabe que con losmétodos genéticos modernos, es posible lograr el cambio de una subespecie a otra en pocos años(Estrada, 2000). Las diferencias entre las dos subespecies condujeron recientemente a conformar dos especies:S. tuberosum y S. andigena, separadas geográficamente por latitud y altitud, diferenciasmorfológicas de los tallos (menor número de brotes secundarios, el tamaño y número de losestolones en S. tuberosum) y follaje (reducción de la disección foliar) y diferencias fisiológicas,en cuanto a fotoperíodo y temperatura. La especie tuberosum posee, además, por lo menos sietefactores de esterilidad citoplasmática (Estrada, 2000). Daly (1996) indica que hubo movimientos de semilla entre los países europeos e importacionesde norte y sur América alrededor de 1840’s, para reemplazar los materiales que estabanpresentando reducción en las producciones. Grun et al. (1977), citados por Estrada (2000) tienenevidencia de que los clones cultivados en América del Norte y Europa, descendieron de nuevasimportaciones de Solanum tuberosum de Chile, en los cuales ocurrió el cambio de los materialesmovilizados por las civilizaciones indígenas de los Andes hacia el Sur de Chile. Dichasimportaciones se realizaron debido a la pérdida de materiales de papa como consecuencia de laepidemia de tizón tardío (gota) que se presentó en Europa entre 1843-1845. Una nueva fuente de diversidad genética se presentó en Europa por la posterior introducción dela especie Solanum demissum, por su resistencia a la gota y porque produce mayoresrendimientos, cuando se cruza con S. phureja. Cerca del 83% de las variedades alemanas tienengenes de S. demissum y 26% de otras especies silvestres. Igualmente el Reino Unido, Escocia yEstados Unidos hicieron cruces con S. demissum (Estrada,2000). La aparición de nuevas razas de P. infestans que vencieron la resistencia conferida por Solanumdemissum, condujo a la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia, con énfasis en resistencia decampo (por genes menores o cuantitativa) proporcionada por especies silvestres o nativas de lazona andina. La variedad Monserrate, obtenida por los doctores Julia Guzmán y Nelson Estradaen 1955, por un cruzamiento entre un cultivar de S tuberosum y S. andigena, es uno de los casosmas representativos y de gran importancia a nivel mundial. Estrada (2000) opina que “la contribución de las especies de papas silvestres procedentes deColombia, Venezuela, América Central y México a la evolución de las papas cultivadas fuemenor, por la escasa resistencia al tizón tardío (Phytophtora infestans) y a la marchites bacteriana(Pseudomonas solanacearum hoy ubicada en el género Ralstonia) del material suramericano”.Esto da indicios de que el origen del patógeno puede ubicarse en especies solanáceas, originadasen zonas ecológicas diferentes a la zona de domesticación de la papa. 13
  18. 18. Sin embargo, Abad et al. (1995) consideran que un alto número de formas de papas de laespecie Solanum andigena ssp andigena del Perú han sido utilizadas para obtener resistenciadurable, al igual que otras especies con resistencia parcial como S. phureja, S. stenotomun,S.acaule, S. Bukasovii. Además con resistencia vertical se han reportado las siguientes especiessilvestres del género Solanum: S. chiquidenum, S. chomatofillum, S. irosinum, S.leptophyes,S.marinasense, S. mochiquence, S. piurae, S. paucissectum, S. sparcipilum. Igualmente reportanresistencia parcial en varias especies de tomates silvestres, originarias del Perú. Se han reportado mas de 200 especies silvestres de papa, de las cuales por lo menos 140pertenecen a Sur América. Estas con sus variantes y clones de cada una, constituyen mas de2.105 clones. El Centro Internacional de la Papa (CIP) conserva mas de 5.000 variedades nativasy 1.500 colecciones de papas silvestres, y todas se pueden cruzar con las ocho especiescultivadas, debido a que no tienen diferencias básicas estructurales en los cromosomas y lasconvierten en un reservorio de genes de valor incalculable por su resistencia y adaptación afactores bióticos y abióticos (Estrada, 2000; Abad et al., 1995). 4. ANTECEDENTES HISTÓRICOS DEL ORIGEN Y MIGRACIONES DELPATÓGENO P. infestans 4.1. Teoría de Berkely (1845) y de Bary (1861). Origen en los Andes deSur América. Esta teoría supone que el patógeno se había originado en los Andes como centro de origen de lapapa y desde allí fue introducido a Europa. Esta teoría se basó en los documentos del PadreJesuita José Acosta en 1590, quien en su libro “Historia Natural y Moral de las Indias”, se refirióal término añublo (brand melthaw) de las papas en las montañas de Perú y Bolivia. Abad y Abad (1995) señalan que el coronel Acosta (1845) en carta a Boussingault, indica que“las papas son nativas de los Andes, pero jamás los indios se alarmaron con los daños causadospor el mal de la papa, el cual se presenta en la sabana de Bogotá en los años lluviosos, y es unaespecie de champiñón que se desarrolla en diferentes puntos y que corroe mas o menosprofundamente los tubérculos, reduciendo la producción en un 8% y la pérdida de un 33% en elalmacenamiento por un rápido contagio. Dicho mal, es endémico en las cordilleras”. La teoría es reforzada desde 1995-2002 por Abad y el grupo de trabajo en tizón tardío (gota) dela papa del CIP, gracias a las investigaciones bibliográficas y de campo que empezaron a realizara partir de 1977. En estos trabajos se reportaba un incremento en el número de especies (106)afectadas por dicho patógeno de manera natural o artificial (por inoculaciones), las cuales tienensu origen en los Andes del Perú y pertenecen principalmente a los géneros Solanum yLycopersicon de la familia Solanaceae (Abad, 1983; Abad et al., 1995). 4.2. Origen en el Centro de México. Según Abad y Abad (1995), Reddick (1928), cuestionó la veracidad de los registros históricosarriba señalados, basado en la carencia de términos técnicos y por ende en la posible confusióngenerada en la interpretación de la palabra “añublo”, especialmente por parte de Acosta Coronelde la Armada. A su vez Andrivon (1996), considera que hay muchos factores que interactúan y 14
  19. 19. que pueden presentarse síntomas de pudriciones de tubérculos o muerte del follaje, en los cualesla gota es apenas un componente de los diversos factores complejos. Abad y Abad, (1995), señalan que el primer reporte de gota en Sur América se hizo en Solanummuricatum (pepino) por Lagerhein (1890) en el Ecuador, situación interpretada como unaintroducción de Europa, puesto que no se conocían reportes de la enfermedad en esta zona. Estaenfermedad fue observada en dicho país, en ese mismo año en Solanum caripense y Petuniahybrida. Luego Pachano (1919-1920) la reportó en papa y pepino. Esta teoría ha sido ampliamente apoyada por varios grupos de trabajo destacados a nivelmundial en la investigación de este patógeno, que incluye las Universidades de Cornell,Washington, Wageningen, Sunchon, la USDA_ARS y el Instituto de Investigaciones de la papaen Polonia, quienes de manera conjunta prepararon el documento “Historical and RecentMigrations of Phytophthora infestans Chronology, Pathhways, and Implications” (Fry et al.1993). La primera evidencia cronológica reportada en el Noreste de Estados Unidos en 1843 y losdatos genéticos de las poblaciones son consistentes con la hipótesis de que P. infestans sufrió elfenómeno genético denominado “cuello de botella” al pasar de México a Estados Unidos y de allíhacia Europa, generándose poblaciones muy simples dominadas prácticamente por un solo linajeclonal, aunque en Estados Unidos se han reportado varios linajes clonales después de los años1990’s. Los estudios del grupo de Niederhauser en los años 1950’s, registraron la reproducción sexualen las zonas altas del Centro de México, al descubrir una nueva forma del patógeno que ladenominaron A2, la cual se podía aparear con la forma A1 originalmente conocida. Hacia losaños 1980’s se reportó la forma A2 en Suiza y posteriormente en varios países de Europa y otroscontinentes, posiblemente introducida desde México en un cargamento de 25.000 toneladas depapa en 1976 (Fry y Goodwin,1995). 4.3. Evidencias que Soportan el Origen P. infestans en Papa en los AndesSuramericanos Según Abad (1983); Abad y Abad (1995), dicha enfermedad fue observada durante ladominación española en 1762-1767 de acuerdo con el reporte “Trasactions of the Viceroy ofSantafé de Bogotá”, reportado a la Asociación Americana de Agricultura, en The Gardner’sChronicle,1847. Posteriormente informado por el Consul Pazos de Bolivia en Londres encomunicación a la Academy of Royal Society of Bruxelles, indica que las fuertes lluviasprovocan en las plantas una sustancia parásita, que según él, es un hongo o animal o zoofito, peroque mantiene los síntomas idénticos a los observados en Europa en ese año y que causan eldecrecimiento de las plantas. D’ Orbigny explorador en Suramérica en comunicación a The Society Centrale d’Agriculturede France (Roze, 1898) dice que los Aymaras que viven en la vecindad de La Paz, conocen desdetiempos remotos la enfermedad que atacó las papas en el año de 1845. En 1878, García Merinoreportó que una gran “epidemia de hielo”, había afectado los cultivos de papa, tomate y pepino deagua en los valles costeros de Lima y Lurín, en 1868, la cual había sido observada en añosanteriores sin causar daños severos. (Abad y Abad, 1995) 15
  20. 20. Luján (1996) indica que el agricultor Pedro Pardo informó en 1861, que los tubérculos de lavariedad tuquerreña, nativa de Colombia, fueron afectados con gota, en Chipaque Cundinamarca.En 1864 se observó por primera vez un campo de papa criolla (Solanum phureja) devastado porla gota antes de floración; y en 1865 la enfermedad se difundió a toda Cundinamarca de maneraagresiva, excepto en Usme (con alturas superiores a 3.000 msnm). Tales observaciones coinciden con Acosta (1845) citado por Abad y Abad (1995) quien indicaque los cultivos de papa se realizan en las partes altas de los Andes, donde se practica elprincipio de “escape” a la enfermedad. Es posible que esta condición hubiese demorado lasapariciones de esta enfermedad en los tiempos de la conquista y la colonización española. Se decía que la gota había llegado a Colombia en 1861 con un material introducido de Holanda,y de allí había pasado a Ecuador en 1865 y a Perú y Bolivia en 1947. Esta creencia desconoce losregistros históricos de la enfermedad en Sur América y las descripciones realizadas por indígenas“Aymarás”, los cuales son conocidos como los domesticadores de la papa en las montañasperuano-bolivianas. Abad (1983) observó que 17 (de los 19) cultivares de papa del Perú evaluados, fueronextremadamente susceptibles a P. infestans, los dos restantes presentaron alta susceptibilidad acuatro aislamientos, mientras que la variedades Mexicanas Rosita y Atzimba, presentaron altaresistencia a todos los aislamientos. El pepino (Solanum muricatum) presentó la raza 1,4,10,11 de P. infestans, la cual fue detectadaposteriormente en cuatro aislamientos colectados en papa a la par con las razas 0, 10,11; 1,3,7 y1,4,11 (no patogénicas a pepino) pero se desconocen las causas de tal variación (Abad,1983,Abad et al., 1995). Marín y Mira 1998 y Jaramillo et al. (1998), observaron gran diversidad de razas en losaislamientos procedentes de plantas de pepino (Solanum muricatum), tomate (Lycopersicumesculentum), papa criolla (Solanum phureja) que crecían de manera silvestre en las orillas de loscaminos o en huertas caseras en el departamento de Antioquia, Colombia. Cada aislamientoconstituía una raza, poco compleja (con pocos diferenciales afectados), mientras que aislamientosprocedentes de monocultivos de papa, en zonas frecuentemente cultivadas, presentaron pocasrazas, pero mas complejas (véase tablas 1 y 2 mas adelante). Phytophthora infestans ha sido endémico de las zonas paperas de los Andes Suramericanos pormiles de años, y la confusión se debe a la semántica de los nombres locales. Se encontró unagran variabilidad del patógeno en la Sierra del Perú, posiblemente debida a cambios somáticosgenerados por parasexualidad, puesto que solo encontraron el tipo A2 en dos aislamientos. Dadoque la papa, el pepino, posiblemente el tomate y muchas solanáceas silvestres tuberíferas tienensu origen en el Perú, el origen de este patógeno debe estar en algún lugar de los Andes Peruanos(Abad, 1983) o suramericanos puesto que en Ecuador se han reportado nuevas poblaciones enotras solanáceas silvestres (Oyarzún et al., 1998). Por otro lado Abad et al., 1995, indican que de las seis formas de DNA mitocondrialreportadas, la forma C sólo ha sido observada en un aislamiento del Perú, el cual corresponde alhaplotipo denominado I-c por Ordoñez et al., (2000) en el Ecuador y se presenta en la poblaciónEC-3 de S. betaceum (tomate de árbol). 16
  21. 21. Los aislamientos peruanos son muy simples en diversidad de marcadores molecularesincluyendo aloenzimas (Gpi 86/100, Pep 92/100) y “finger printing” (huellas dactilares) del DNAnuclear (25 loci), similares a las poblaciones viejas de Europa y Estados Unidos. Igualmente losaislamientos colectados en 1983 y 1987 ( en el Norte, 33 en el Sur) presentaron pocas razas 26patogénicas con predominio de la raza cero (r0) en las partes altas del sur en ambos años, lo queindica la ausencia de genes de resistencia de la especie S. demissum en las variedades de papanativas de dicha zona. Sólo dos aislamientos del Norte de los Andes se autofertilizaron. La rareza del tipo deapareamiento A2 en el Perú, puede ser explicada por la “selección estabilizante” que esfavorecida por un balance perfecto entre el huésped y el patógeno en los Andes. (Abad et al.,1995). Puesto que la aparición de ambos tipos de apareamiento, se reportaron en Japón desde 1937, Ko(1994) citado por Abad et al., (1995), sugiere que la aparición del tipo A2 en diferentes países, sepuede deber a que un aislamiento tipo A1 que emigró, puede autorevertirse a A2 para produciruna oospora, o por un cambio de su forma original A1 a la forma A2, inducida por elenvejecimiento, exposición a fungicidas o por estrés del medio ambiente. 4.4. Evidencias que Soportan la Teoría del Origen de P. infestans en elCentro de México Fry y Goodwin (1995), Andrivon (1996) presentan un resumen crítico sobre la historia yevidencias científicas que apoyan el origen de dicho patógeno en el Centro de México. La aparición de la forma sexual del patógeno, reportada por Niederhauser en 1953, la cual nohabía sido observada en ningún otro lugar. (En Japón en 1937, Ko citado por Abad et al., 1995). La presencia de las dos formas A1 y A2 en igual frecuencia. La población del patógeno, especialmente en el Valle de Toluca México, presenta diversascaracterísticas de virulencia. Se han detectado todos los alelos enzimáticos conocidos hasta el presente Las poblaciones de dicha localidad contienen todas las bandas de finger printing del DNA Los genes de resistencia específicos a razas son más frecuentes en el Centro de México que enlos Andes de Suramérica, ejemplo que se presenta en Solanum demisum. Según Fry et al. 1993, Matuszac y su grupo de trabajo, en 1988, observaron que aislamientosprocedentes de folíolos de papas sin asperjar con fungicidas, en el Valle de Toluca México,tenían un 50% de individuos con genotipos únicos, a pesar de la predominancia de lareproducción asexual durante la epidemia. Sin embargo, Abad (1983) encontró 15 razasdiferentes en aislamientos procedentes de papas cultivadas en Perú, de los cuales 13 procedían dela Sierra, cuatro de San Ramón (pie de la cordillera) y cinco de la Costa. El 55% de los 47aislamientos fueron patogénicos a tomate y 15% a pepino. 17
  22. 22. El Centro de México, es el segundo lugar en diversidad de especies del género Solanum,muchas de las cuales son endémicas y tuberizan, mientras que la papa (S. tuberosum ssptuberosum), solo se cultiva de manera intensiva en dicha zona a partir de los años 1950’s (Fry etal., 1993). Esto sería una evidencia de que la papa no es la planta en la cual se pudo originar elpatosistema con Phytophthora infestans, pues además las condiciones climáticas señaladas porViet (1997) en la zona de origen de la papa cultivada hace 10.000 años, época de domesticaciónde esta especie, al parecer eran adversas al desarrollo del patógeno. 4.5. Teoría de las Migraciones Fry et al. (1992-93) y Goodwin et al.(1994) a Estados Unidos y Europa. La teoría de las migraciones considera que P. infestans pudo haber sido transportado deMéxico a Estados Unidos y de allí a Europa, o que fue llevado directamente de México a Europa,y una vez introducido allí, fue dispersado por el resto del mundo con los tubérculos-semilla,indicando que al menos hubo tres eventos de migración. La primera migración ocurrió cerca de 1840, presentándose un primer reporte en FiladelfiaUSA en 1843, luego en localidades distantes de ese sitio, reportándose en la provincia marítimade Canadá, en la parte Noreste de Estados Unidos y luego en el medio Oeste de dicho país. Los primeros reportes en Europa se hicieron en Bélgica (junio de 1845). A mediados deoctubre se presentó en Irlanda y luego se esparció por el Oeste de Alemania. Bourke citado porDaly (1996), indica que lo mas probable fue que P. infestans llegó a Europa en un embarque depapas importadas a Bélgica a finales de 1843 o comienzos de 1844, para restablecer lasexistencias de papas que habían sido afectadas por enfermedades virales y pudrición seca porFusarium. Pero no se registra el origen de dichos materiales. Es posible que hubiesen sidollevados de Norte y Sur América (Andrivon, 1996, Daly,1996). 4.6. Teoría de las Migraciones de Bourke (1964), Tooley et al., (1989) yAndrivon (1996) Esta teoría postula la migración también en tres pasos. Primero de México a Sur América, deahí a Norte América y de este lugar a Europa. Teniendo en cuenta varios acontecimientos históricos y la presencia de genes específicos arazas de. P infestans en especies de papas silvestres de los Andes, indican que la introducción fuepor lo menos varios siglos atrás, desde su lugar de origen en el Centro de México, causada porvarias migraciones humanas antes y después de la conquista y desde el Norte hacia el Sur.Además es posible que P. infestans hubiese sido introducido con otras especies de plantasdiferentes a papa, aunque no se ha obtenido ninguna evidencia arqueológica o histórica(Andrivon, 1996). Una vez introducidas las poblaciones de P. infestans a Sur América, prácticamenteevolucionaron aisladamente a pesar de que las comunicaciones y el intercambio han sido activos,encontrándose el predominio del Linaje Clonal US-1, el cual fue ampliamente distribuido en todoel mundo, facilitado por el comercio del guano, lo que conduce a un flujo limitado de genes de 18
  23. 23. las poblaciones andinas, o que la introducción original fue limitada a unos cuantos genotipos(Andrivon, 1996). Según Andrivon (1996) la base genética estrecha del patógeno, combinada con la frecuenciareducida de la incidencia de tizón tardío en ciertas regiones de los Andes, redujo el tamañoabsoluto de las poblaciones, y con las altas tasas de extinción observadas, en los “linajes” de P.infestans, se llegó a la fijación rápida de un sólo linaje clonal, el US-1, el cual posiblementemigró de Sur América a Estados Unidos y Europa en la década de 1840. 4.7. Migraciones Posteriores a 1970 Durante el largo intervalo de 1840’s-1970’s no se encontraron evidencias de migraciones, dadoque los datos de evaluación de las poblaciones de P. infestans, fueron consistentes con un sololinaje clonal, el US-1 introducido por migración de localidades de mayor diversidad a zonas demenor diversidad. Por ejemplo, de México a Estados Unidos y de allí a Europa y de estecontinente a Asia, Africa y Sur América (Fry et al., 1993, Goodwin et al.,1994). Al parecer grandes cantidades de papa para el consumo doméstico fueron llevadas de México alOeste de Europa a finales de los años 1970’s. De una pila de compost o de algunos tubérculosque fueron almacenados y luego sembrados en el campo, pudo escaparse el patógeno P. infestans,el cual habría podido sobrevivir el invierno sobre los tubérculos, de los cuales surgieron las hojasen la primavera, donde creció el patógeno y se pudo dispersar a plantas de papa y de tomate, encampos vecinos, muchos posiblemente destinados a la producción de “semilla” (Fry et al .,1993). La “semilla” de papa es una fuente permanente de comercio a lo largo y ancho del mundo, conla cual se pudieron haber transportado nuevas poblaciones del patógeno que incluían el tipo deapareamiento A2, el cual aún no está reportado en algunos países como Colombia, Filipinas,Taiwán y Perú, pero se teme su dispersión con el comercio de los tubérculos “semillas”, puespara 1987, ya estaba presente en Pensilvania (US-7 en papa) y en 1989 en Columbia Británica(US-8 en papa y tomate), posiblemente procedentes de papas del Este de Washington o tomatesde la Florida (Fry et al., 1993; 1995). Las nuevas poblaciones desplazaron a las viejas, puesto que no se han descubiertorecombinaciones de genotipos nuevos y viejos; y los alelos aloenzimáticos característicos de loslinajes viejos, están ausentes en las poblaciones presentes actualmente: Esto indica que laspoblaciones que llegaron recientemente están mas adaptadas, pues mostraron una mayoragresividad, en Europa Central durante la década de 1980 (Fry et al.,1993). Según el grupo de Fry et al.(1993), la selección por genes de resistencia (R), no es unaexplicación satisfactoria para indicar el desplazamiento de esta población por las siguientesrazones: La mayoría de las variedades de papa de Europa Occidental no contienen genes R. Existió una virulencia adecuada en las poblaciones viejas. No ha habido cambios mayores en a composición de los genes R de las variedades Europeas lque coincidan con el desplazamiento 19
  24. 24. Además, el desplazamiento de P. infestans también ocurrió en otros continentes: en Japón seredujo la frecuencia del linaje clonal viejo; y la representatividad de nuevas poblaciones de P.infestans, predominó en las colecciones recientes en diferentes áreas de Corea. Una implicación práctica de la migración puede estar relacionada con la sensibilidad oresistencia del patógeno al fungicida específico de Oomycetes, Metelaxyl, cuya resistencia no fueampliamente distribuida entre los aislamientos que pertenecían a las poblaciones viejas,indicando que el problema se debió a la migración y selección de individuos resistentes, o poruna mutación y selección de novo (Fry et al., 1993). Estas observaciones son confirmadas por la FRAC (2002) que indica que al comienzo de laestación en Europa, los aislamientos sensibles al fungicida son mas abundantes, con un cambiosignificativo al final de la estación donde predominan los aislamientos resistentes. Igualmente enColombia se ha observado una mayor frecuencia de aislamientos resistentes a dicho fungicida enlos aislamientos de zonas con monocultivos de papa de variedades con un reducido número degenes R. 4.8. Las Migraciones de 1980’s: México, Estados Unidos y Canadá Según Fry y Goodwin (1995) hasta finales de los 1980s y comienzos de los 1990s, laspoblaciones de P. infestans en Estados Unidos constaban de un solo linaje clonal antiguo (US-1)con el tipo de apareamiento A1 y unos pocos diferentes (US-6), pero la situación fue cambiantepuesto que se encontraron poblaciones con el tipo de Apareamiento A2, en Pensilvania en 1987y en Columbia Británica en 1989, procedentes de tomate de la Florida, papa y tomate del Oestede Washington, y papa del Este de Washington con linajes clonales antes no observados enEstados Unidos o en Canadá, los cuales se denominaron US-7 altamente patogénico en papa ytomate y US-8 especialmente patogénico en papa. Para 1994 el genotipo US-8 de P. infetans fue el predominante en amplias zonas de cultivos depapa en Estados Unidos y Canadá, causando una de las epidemias mas severas en dicha región,por ser resistente al fungicida Metalaxyl, al igual que los genotipos US-6 y US-7, los cualesfueron producto de una migración clonal, dado que fueron inicialmente detectados en el Norte deMéxico y su resistencia al fungicida fue previamente detectada en dicha zona. (Fry y Goodwin,1995). Para desarrollar una estrategia de manejo del patógeno, es necesario tener en cuenta lacapacidad de migración de manera rápida a grandes distancias, como se observa por la presenciade un solo clon en los extremos continentales de Estados Unidos. Es posible que operen variosmecanismos de migración, pero se sugiere que la nueva población llegó del Noroeste Pacífico deMéxico sobre tomates sembrados en la zona o en frutos de tomate infectados, los cuales fueroncomercializados en la zona continental de Estados Unidos. La amplia y rápida distribución de P. infestans, junto con el desarrollo de la resistencia alMetalaxyl en dichas poblaciones, y los mecanismos diversos para el proceso de dispersión,indican que para hacer un control eficiente se debe establecer un sistema de alerta, que permitaconocer de manera oportuna, las condiciones favorables para el desarrollo de epidemias. 20
  25. 25. 4.9. Migraciones al Este de Asia Fry y Goodwin (1995) opinan que las migraciones al Asia tuvieron características diferentes alas migraciones a Europa, por cuanto sólo se detectaron aislamientos de P. infestans con el tipode apareamiento A2 en 1989 en Japón y Korea, con un genotipo aloenzimático y finger printingdel DNA, distintas a las de la población nativa y con marcada resistencia al metalaxyl, la cual havenido sustituyendo a la población originalmente establecida en dicha zona. Según Fry y Goodwin (1995) la población nativa caracterizada por el tipo de apareamiento A1y susceptible al metalaxyl, produjo oosporas con los aislamientos A2 introducidos bajo lascondiciones de laboratorio, las cuales no germinaron fácilmente, razón por la cual se consideraque la reproducción sexual, ha tenido muy poco efecto sobre la estructura genética de P. infestansen el Este del Asia y por que no decirlo a nivel mundial. 4.10. Migraciones en Sur América Las colecciones en el Perú realizadas por Abad (1983-1985) presentaron el linaje clonalpredominante a nivel mundial hasta entonces (US-1) con el tipo de apareamiento A1, con unamplio rango de especies huéspedes (107) que son afectadas de manera natural o artificial. Lascolecciones de Bolivia han sido reportadas como tipo A2 y con un solo linaje clonal, mientras enBrasil se han detectado dos clones con tipo de Apareamiento A1 y A2 respectivamente y enArgentina se descubrieron aislamientos con el tipo de apareamiento A2 ( Fry y Goodwin, 1995). 4.11. Una Nueva Migración de Colombia al Ecuador Reportes recientes de Forbes et al. 1997, indican que la estructura poblacional del patógeno P.infestans en cultivos de papa en el Ecuador, está conformada principalmente (mas del 95%) porun solo linaje clonal, EC-1, definido por análisis de marcadores como las isoenzimas glucosafosfato isomerasa (Gpi 90/100) y peptidasa (Pep 96/100), el tipo de apareamiento A1 y unadactiloscopia del DNA nuclear no reportada previamente. Tales observaciones condujeron al grupo de Forbes a sugerir una hipótesis sobre la introducciónreciente de un nuevo linaje clonal al Ecuador, que se estableció y desplazó el antiguo US-1(Gpi86/100 y Pep 92/100), dando la idea de que esta población procedía de Colombia, refutando lahipótesis de que existía una barrera dentro del Ecuador, entre las poblaciones peruanas US-1evaluadas en 1980’s y una población diferente que había sido detectada posteriormente enColombia (Forbes et al., 1997). Posteriormente detectaron las poblaciones EC-2, EC-2.1 y EC-3en especies solanáceas silvestres las primeras y la última. El grupo de investigación del patosistema Phytophthora/Solanum de la Universidad Nacionalde Colombia, ha encontrado que los aislamientos colectados y evaluados entre 1995-2002,exhiben características de las poblaciones EC-1 descritas por Forbes et al., 1997, como tipo deapareamiento A1, los fenotipos de las isoenzimas Pep (96/100) y Gpi (90/100), resistencia alfungicida Metalaxyl y los haplotipos mitocondriales II-a con mayor frecuencia en papa y I-b entomate. 21
  26. 26. CAPÍTULO III CARACTERIZACIÓN POBLACIONAL Los estudios poblacionales de Phytophthora infestans se iniciaron casi paralelamente con losprogramas de mejoramiento de la papa, para buscar e incorporar la resistencia a este patógeno.Existen marcadores moleculares, bioquímicos y fenotípicos que han posibilitado la identificaciónde aislamientos distintos en una población, producto de un organismo que tiene la posibilidad dereproducirse sexual y asexualmente, conduciendo a cambios en las poblaciones que pueden serintroducidas a otras regiones por procesos de migración. Desde que se reportó el tipo de apareamiento A2 en el Oeste de Europa en 1984, se esperaba undramático desarrollo de nuevas poblaciones del patógeno, lo que condujo a los patólogos arealizar análisis locales de las poblaciones, dado que el tipo A1 era el único tipo de apareamientoreportado fuera de México, considerado como el centro de origen de P. infestans (Fry et al.,1993). Una población se refiere a un grupo de individuos (aislamientos) de una misma especie que seencuentra estructurada o delimitada por barreras geográficas, por lo tanto, el primer indicio decambios importantes en la población lo constituyó la presencia del tipo de apareamiento A2. Ladeterminación de los alelos isoenzimáticos de glucosa-6- fosfato isomerasa (Gpi), enzima málica(Me) y peptidasa (Pep) proporcionaron la primera evidencia genética de la diploidía de P.infestans y permitió hacer las primeras comparaciones de las poblaciones. Mas recientemente seestablecieron marcadores como la sonda G57 para huella del DNA nuclear y cebadoresespecíficos para la amplificación del DNA mitocondrial. Al comparar las poblaciones de Polonia de 1985-1991, con los 153 aislamientos colectados enHolanda en 1989, se observaron diferentes, aunque tuvieron en común muchos alelosisoenzimaticos y similitud en el perfil electroforético del DNA nuclear. En contraste losaislamientos de Rusia fueron muy similares a los de Polonia y Alemania, lo que indica que lapoblación fundadora de Polonia migró con los vientos predominantes de Oeste a Este a través deEuropa. Dicha población tuvo mayor eficacia biológica, rompiendo la resistencia a genesespecíficos de una variedad local (Bronka), debido posiblemente a la recombinación sexual, quefavoreció el desarrollo de los experimentos, patogénicamente mas agresivos. En las dos últimas décadas se han estudiado las poblaciones alrededor del mundo, para lo cualse han evaluado miles de aislamientos, utilizando características fenotípicas (tipo deapareamiento, virulencia/agresividad de razas y sensibilidad a Metalaxyl), marcadoresbioquímicos (isoenzimas Gpi y Pep) y moleculares (RFLPs nuclear y mitocondrial y el análisisde finger printing usando la sonda RG57, PCR específico para detectar el tipo de apareamientoA1 con un cebador específico para A1 y análisis de ITS y microsatélites. En algunas poblaciones de P. infestans, se pueden encontrar aislamientos diploides ypoliploides; por lo tanto los aislamientos diploides en su estado vegetativo, podrían presentarfactores heterocigóticos que gobiernan la expresión fenotípica, de tal forma que en loscromosomas homólogos se pueden presentar alelos dominantes y recesivos en un solo gen. Esto 22
  27. 27. explica por qué en ciertas mutaciones que generan resistencia a un fungicida, (Metalxyl), laexpresión de la resistencia está condicionada por uno o dos genes (ver texto de la FRAC, GISI2002) con dominancia incompleta. La utilización de marcadores de resistencia a fungicidas permite determinar si se da o no unarecombinación de factores genéticos, que puede resultar de la ocurrencia de procesos sexualesque involucra cambios en el DNA nuclear o a nivel del DNA mitocondrial en el caso de lareproducción asexual. 1. Tipo de apareamiento Ha sido un factor importante en la variación de las poblaciones, aunque el tipo de apareamientoy sus marcadores no presentan una segregación mendeliana, es posible establecer los del tipo A1por la técnica basada en PCR con un “primer específico”, la cual establece una región S1adyacente al locus del tipo de apareamiento A1 (Lee et al, 1997). El tipo de apareamiento A2 tiene gran tendencia a la autofertilización (96%, n=47), mientrasque A1 es escasa ( 6%, n=69). Smarth, (2002). Pérez et al., (1997-1998) evaluaron 287aislamientos de Puno y Cusco en el Perú, observando que ninguno presentaba el tipo deapareamiento A2, tanto por ausencia de oosporas en cruces con un aislamiento testigopreviamente caracterizado como A1, como por la técnica de PCR con primers específicos, la cualpuede estar relacionada como un signo o consecuencia de anormalidades estructuralesadicionales, cercanas a dicha región y que podrían ser responsables de la segregación nomendeliana del tipo de apareamiento ( Judelson, 1996). El locus S1 fue previamente identificado por Judelson et al ., (1995) muestra una secuenciamonomérica de 1,35 Kb que evolucionó por repeticiones sucesivas a 300 Kb y que es bienconservada en el estado hemicigótico del tipo A1: Esta técnica ha sido utilizada por Gilchrist(2001) y Calderón y Castro (2002) para la determinación del tipo de apareamiento deaislamientos colombianos de P. infestans. Varios investigadores han venido evaluando los tipos de apareamiento presentes en diferentespaíses. Shaw et al. (1985), opinan que el tipo de apareamiento A2 pudo haber estado presente,pero no se detectaba por bajas frecuencias, en diferentes países por fuera de México durantevarios años. García et al., (2000) encontraron al noroeste de México que el tipo de apareamientopredominante en 1994-1995 fue el A2, el cual estaba prácticamente desaparecido en 1996-1997.La presencia de ambos tipos de apareamiento de manera simultánea sólo se observó en unospocos campos donde crecían simultáneamente papa y tomate. Spielman et al., (1991) caracterizaron por diferentes juegos de alelos los aislamientos de lospaíses que tenían estrictamente el tipo de apareamiento A1 y los que incluían ambos tipos deapareamiento. En las colecciones estrictamente A1, se encontraron los alelos Gpi (86 y 100) yPep ( 92 y 100), las cuales fueron procedentes de Estados Unidos/Canadá, Holanda entre 1951-1978, Polonia entre 1985-1987, Perú 1989, dos aislamientos de Suiza, cinco de UK y fuerondesignados como genotipos viejos. En las colecciones con ambos tipos de apareamiento (excepto Japón) no se observaron losalelos Gpi 86 y Pep 92 o fueron menos frecuentes, pero se presentaron dos alelos adicionales Gpi 23
  28. 28. 90 y Pep 83, cuyos genotipos fueron Gpi 90/100 o 100/100 y Pep 83/100 o 100/100 o encombinación con los genotipos del primer grupo. La reproducción fue predominantementeasexual en dichas poblaciones. En el Japón cada tipo de apareamiento estuvo fuertemente asociado con un genotipo diferente,el A1 con condiciones heterocigotas: Gpi 86/100 y Pep 92/100 y el A2 homocigoto con Gpi:100/100 y Pep 100/100, aunque la muestra no fue representativa, pero parece que estáconformada por individuos de nuevas y viejas poblaciones. Es así como en Estados Unidos y Canadá, se tomaron aislamientos de campos de cultivos depapa y tomate entre 1983-1989 a los cuales se les determinó el tipo de apareamiento por crucesen medios de habas, avena y granos de arroz. Se cruzaron consigo mismos y con aislamientos yaconocidos como del tipo de apareamiento A1, procedentes de México (A1 y A2), Estados Unidosy Europa. Un aislamiento A2 de México, junto con un aislamiento de Vancouver (A1) y otro dePensilvania (A1), presentaron formación de oosporas en 15 días. L pruebas de patogenicidad asmostraron que dichos aislamientos producían síntomas típicos de tizón tardío en hojas y tallos,con virulencia similar a la de los aislamientos con tipo de apareamiento A1. Al mezclaresporangios de A1+A2 produjeron oosporas en los tejidos del huésped de color marrón másoscuro que las formadas in vitro, lo que sugiere la posibilidad de formación de oosporas en elcampo. (Dehal, et al.,1991). Drenth (1994) señala la presencia del tipo de apareamiento A2 en 22 países incluido Méxicopaís en el cual se reportó desde 1956. Fry et al., (1993), señalan la presencia del tipo deapareamiento A2 en Colombia, en 1990. Sin embargo, en las evaluaciones que se han realizadopor los grupos de investigación de la Universidad Nacional de Colombia sedes Bogotá yMedellín, sobre este patógeno, no se ha detectado la presencia del tipo A2, lo cual no esdescartable si se amplía el muestreo a otras especies y zonas ecológicas. Sujkouski, et al., (1994) evaluaron los cambios genéticos en la población de P. infestans dePolonia entre 1985-1990 y encontraron que los aislamientos colectados entre 1985-87,presentaban sólo el tipo de apareamiento A1, que constaba de un sólo linaje clonal dominado porel genotipo PO-1, basados en las aloenzimas y las huellas del DNA determinadas por la sondaRG57, con genotipos idénticos a los de la población predominante en 1980’s, en los diferentespaíses por fuera de México, pero la cual desapareció después de 1988, como un posible resultadode la introducción inicial de P. infestans a Europa en 1845. La aparición del tipo A2 en Polonia, se detectó a partir de 1988, con un nuevo genotipo (PO-4),posiblemente introducido por una migración y se incrementó la frecuencia hasta 1990,alcanzando casi el 50% de los aislamientos colectados. Para 1991, el genotipo PO-4 sólorepresentaba el 12%. Sin embargo, a partir de los años 1990’s se presentó una gran diversidad degenotipos únicos (69%) que correspondían al 39% de la población muestreada, lo que indica elaporte de la recombinación genética, debido a la posible reproducción sexual, pero no hubodiferencia genética entre los aislamientos A1 y A2 (Sujkouski, et al., 1994). En las oosporas obtenidas por cruces A1xA2 in vitro, en japón y Korea (Fry y Goodwin, 1995),se han tenido dificultades para hacerlas germinar y las que lo han logrado como se observó en elEcuador, no fueron patogénicas al huésped parental ( Oliva, et al 2002), lo que indica que lareproducción sexual, no es un mecanismo impórtate en la patogenicidad de P. infestans. 24
  29. 29. Por otro lado, Miller y Johnson (2000), al inocular y llevar al campo plantas de papa, con lamisma cantidad de lesiones de tizón producidas por US-1 y US-8, no encontraron oosporas en lostejidos lesionados, las cuales sí fueron observadas en cruzamientos en el laboratorio, pero nodetectaron evidencia de recombinación de genotipos, por el sistema de huellas digitales porRFLP, manteniéndose la diferencia de cuatro bandas entre el genotipo US-8 y US-1. Sin embargo, observaron cambios a nivel de isoenzimas, los cuales no siempre se presentan(Shattock, et al.,1987, citados por Miller y Johnson, 2000), que sugieren la posibilidad de unarecombinación meiótica por autofertilización de US-8 inducida por la cercanía de US-1, dandoorigen a una solo oospora que puede continuar su multiplicación asexual. Las poblaciones viejas del Noroeste y Este de Europa han sido desplazadas por la diversidadgenética derivada de la reproducción sexual de P. infestans, evidenciada por la mezcla depoblaciones A1/A2, también presentes en importantes regiones productivas de papa y tomate enAsia y posiblemente en África y Sur América (Flier, et al. 2002). No ha sido posible responder si las viejas poblaciones vienen siendo reemplazadas por lasnuevas, debido a una migración (Fry et al., 1993, citado por Knapova, et al.,2002) o por laocurrencia local de la recombinación sexual (Drenth et al ,1994, cit por Knapova et al, 2002), lacual algunos investigadores han tenido dificultad de obtener en condiciones in vitro y otros bajocondiciones de campo. Miller y Johnson (2000) indujeron más fácilmente la formación deoosporas en el laboratorio que en el campo al igual que Oliva et al., (2002) En el Perú no ha sido reportado el tipo de apareamiento A2, aunque, Pérez et al., (1997-1998),reportan cinco poblaciones, incluida la US-1, la cual es la mas antigua con distribución mundial.Esto indica que el cambio de las poblaciones no se debe a la recombinación sexual, pues en elEcuador, donde existen ambos tipos de apareamiento, Oliva et al., (2002) no lograron laformación de oosporas patogénicas a las especies parentales de los aislamientos A1 vs. A2. Oyarzún et al., (1998) opinan que en el Ecuador las poblaciones están separadas por huéspedesy en Colombia Gilchrist (2001) observó diferencias por haplotipos mitocondriales, en losaislamientos procedentes de papa frente a los aislamientos de tomados en otras especieshuéspedes. 2. Razas Fisiológicas El desarrollo de patotipos o razas fisiológicas, fue posible a partir de los años 1950’s, cuandoBlack et al, (1953) desarrollaron una serie de clones de papa diferenciales a partir de la especiemexicana Solanum demissum con genes de resistencia vertical a Phytophthora infestans, loscuales son utilizados mundialmente para la caracterización de las razas y la determinación de losgenes que confieren la resistencia, con base en la respuesta de compatibilidad de los aislamientoscon los clones diferenciales. Abad, (1983) encontró la mayor especialización de razas del patógeno y alta frecuencia depatotipos no sólo en papa, sino en tomate y pepino en los cuales determinó los genes paravirulencia 1,2,3,4,7,10 y 11, en las razas 1.3.7 y 2.4.10.11 y Turkesteen (1997) señaló que elpepino es portador de la raza especializada 1.4.10.11, la cual es altamente patogénica a papa,mientras que la raza 0, no esporula en dicha especie. 25
  30. 30. Pérez et al., (1997-1998) evaluaron 114 aislamientos procedentes de Puno y Cusco al sur dePerú y encontraron un aislamiento que infectaba 10 clones diferenciales, excepto el R9. EnColombia en el oriente de Antioquia, se han evaluado aislamientos con igual cantidad dediferenciales afectados, excepto el R5. Esto demuestra la complejidad de virulencia de losaislamientos en ambos países, la cual se ha venido incrementando, pues según Abad en 1983, laraza mas compleja afectaba 7 diferenciales. En Colombia, para 1995 (Mazo y Patiño, 1995) reportaron que el 57% de la población evaluadainfectaba 7 clones diferenciales (tabla 1), mientras que para la colección realizada en 1997-98,(Marín y Mira,1998), reportaron la mayor frecuencia de los aislamientos colectados con 10 genesde virulencia (tabla 2). Gisi et al., (1995) en Suiza, encontraron 11 patotipos (razas fisiológicas) con 3,4,5,6,7 y 8genes de virulencia. El 65% de los aislamientos evaluados, presentaron los genes de virulencia1,3,4,7,10 y 11. Se observó que los aislamientos con menos genes de virulencia (5 y 6)presentaron el mayor porcentaje de resistencia a las fenilamidas, lo que indica que no hay unarelación directa entre la resistencia a fenilamidas y la complejidad del patógeno, mientras quePérez et al., (1998) en el Perú observaron mayor resistencia en los aislamientos con mas genes devirulencia. Tabla 1. Frecuencia de razas fisiológicas de Phytophthora infestans colectadas en eldepartamento de Antioquia, Colombia, entre 1994-1995. Mazo y Patiño,1995, López et al,1997. Aislamiento Factores de Frecuencia Patotipo Nº octal P. infestans virulencia (%) U1, U2, C4, G5 1-2-3-4-7-10-11 7446 7 55.5 E9, E10, SP11, SP12, ER13, 1-3-4-7-10-11 5446 6 15SR14, SR15, UN6, SS16, SS17 U3, UN3, UN8 1-2-3-4-7-8-10-11 7466 8 15 SV7 1-2-3-4-6-7-10-11 7546 8 5 P18 3-4-7-10-11 1446 5 5 T19 1-2-3-7-10-11 7046 6 5 P= pepino (Solanum muricatum), T = tomate (Lycopersicon esculentum). U,G,SP,C,ER;SS, UN,SV,E= papadistintas variedades La variedad mas cultivada Bintje fue la mas muestreada y la vez la que presentó el mayornúmero de patotipos (9 de los 11 presentes). Los genes de virulencia mas frecuentes fueron demayor a menor frecuencia: 4; 1=3; 7=10=11; 6; 8; 2 y 5. El gen de virulencia expresado en eldiferencial R4 estuvo presente y en el R4 siempre estuvo ausente. Cabe resaltar que Bintje es unavariedad susceptible en la cual se observó que aislamientos simples (IPO-O raza 0) y complejos(90128, raza compleja) rápidamente mostraron una reacción biotrófica (Vleehouwers et al, 2000). Sujkowski et al., (1994) señalan que antes de los 1970’s, las poblaciones de P. infestansdesarrollaron poca virulencia para las variedades de papa que poseían los genes R7, R10 y R11,lo cual fue muy común, luego de los años 1980’s. Spielman et al., (1990), evaluaron el efecto dela descendencia F1 del patógeno frente a los genes R2 y R4 de la papa y observaron que lavirulencia contra R2 está controlada por un solo locus, mientras que la virulencia contra el R4,puede estar determinada por uno o dos locus. 26
  31. 31. Según Schöber-Butin, et al., (1995), en Alemania se observó que para los 1950’s solo sepresentaban dos patotipos de P. infestans denominados como 0 y 1, para los 20 años siguientes sepresentaron los patotipos 0, 1, 4, 1.4, 1.2.3.4 y 1.3.4 presentándose hasta 4 genes de virulencia.Aunque Spielman et al., (1991) indican que los cultivares habían tenido los mismos genes R1,R3, R4 y R10 durante dicho período. En los años 1980’s se presentaron 7 razas una de las cuales presentó 7 genes de virulencia y entodas se destaca la presencia del gen 1 y prevalecía los genes 3 y 4, lo que demuestra elincremento en la complejidad del patógeno a través del tiempo en Alemania, lo que condujo aevaluaciones mas frecuentes. A partir de los años 1985, se notó un incremento en el número ycomplejidad de patotipos del patógeno (20), llegándose a observar un patotipo con nueve genesde virulencia, con ausencia de los genes 6 y 9 (Schöber-Butin, et al.,1995). Condiciones similares han sido observadas en aislamientos procedentes del Departamento deAntioquia Colombia, (Mazo y Patiño, 1995; López et al.,1997) en donde sólo han estado ausenteslos genes 5 y 9, tabla 1. El patotipo mas frecuente (55.5%) según la nomenclatura octal(Goodwin et al., 1995) fue el 7446 con 7 genes de virulencia. En los 20 aislamientos evaluados por Mazo y Patiño (1995) siempre se presentaron los genes devirulencia 10 y 11, el gen 6 sólo se presentó en un patoptipo de los seis establecidos, los cualespresentaron entre 5 y 8 factores de virulencia (tabla 1), con un promedio de 6.6, valor superior alos registrados en el mundo, según Fry y Spielman (1991), que en orden descendentecorresponden al valle de Toluca, México con 5,6 factores de virulencia, como promedio de 16aislamientos evaluados, Holanda con 4,1/14, Reino Unido 3,7/61, Perú 1,0/33 y USA-Canadá1,9/14. El denominador indica el número de aislamientos evaluados. Los aislamientos colectados dos años después mostraron una mayor complejidad en zonas conmonocultivos de papa, presentando sólo ausencia del gen 5, mientras que en zonas de mayordiversificación de cultivos o especies silvestres, se presentaba un mayor número de razasfisiológicas, pero menos complejas o virulentas por el menor número de genes compatibles conlos clones diferenciales, como en el tomate según se muestra en la tabla 2 (Marín y Mira, 1998). En dicha investigación se detectó el gen de virulencia 9 que no había sido detectado en losaislamientos evaluados por Mazo y Patiño (1995) y el 38% de los patotipos correspondieron a lamayor complejidad (10 y 9 genes de virulencia) tomados de papa y pepino de agua, mientras quelos aislamientos procedentes de tomate, pimentón, papa criolla y uno de papa Diacol Capiro,presentaron 5 o menos factores de virulencia, incluso un aislamiento de tomate sólo presentaroncompatibilidad con la variedad Alfa de papa, que no presenta genes mayores de resistencia alpatógeno. 27

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