Unidad 4. Genética microbiana
Objetivos
Conocer
-Los mecanismos de la herencia
-La relación entre la estructura y función ...
UNIDAD IV.- Genética microbiana
Tema 9.-.Principios generales (8h): Introducción. Estructura del
ADN y el ARN. Replicación...
Términos y conceptos
• genética: estudio de la herencia
• gen: segmento de ADN que
codifica un producto funcional
• genoma...
Estructura del ácido nucleíco
El experimento de Alfred D. Hershey y Martha Chase (1952)Introducción
El Dogma central
El AD...
nucleósido = base nitrogenada + azucar
pentosa
Enlace
fosfodiester
Estructura del ADN
• base nitrogenada
– A, T, G, C
• az...
Estructura del RNA
• bases nitrogenadas
– A, G, C, U (en lugar de T)
• azúcar pentosa
– ribosa
• en general se compone de ...
Replicación DNA
• proceso complejo que implica a numerosas enzimas y proteínas
• en general, el proceso es similar en todo...
Mecanismo del círculo rodante
Replicación DNA (continuación)
• mecanismo del círculo rodante
– se observa durante la repli...
Mecanismo de la replicación del ADN
-la mejor conocida es la de Escherichia coli
-se cree que la de eucariotas es similar
...
Mecanismos de la ADN polimerasa III Mecanismos de la ADN ligasa
Replicación
Modelo hipotético de la actividad
en la horquilla de replicación: el
modelo se recoge en cinco etapas.
1. Las DNA girasa, ...
Algunos datos curiosos sobre la replicación
∀ ≥ 30 proteínas se requieren para replicar el cromosoma de E. coli
• se reali...
Estructura del Gen
• gen
– secuencia lineal de nucleótidos con unos puntos determinados de inicio (el tsp) y
de terminació...
Promotor: secuencia de
nucleótidos que sirve de
reconocimiento y unión a
la RNA polimerasa
Sentido de la RNA polimerasa
Re...
transcripción
Región líder: secuencia 5’ que es
transcrita pero no es traducida
Secuencia Shine-Dalgarno o secuencia de un...
La transcripción de DNA produce 4 tipos de RNA
tRNA, rRNA, mRNA y RNA reguladores
frecuentemente da como
resultado mRNA po...
exón intrón
Maduración del RNA
“RNA splicing”
monogénico
RNA nuclear
heterogéneo
5′ cap of eucaryotic mRNA
Transcripción e...
La maduración del Pre-RNA se produce en un
complejo de gran tamaño que se denomina
partícula procesadora (spliceosome) que...
El Código genético
• Forma en la que se almacenan en el genoma las instrucciones genéticas para las
síntesis de polipéptid...
biotecnología ya que cuando se transfiere un gen de un organismo a otro el gen solo
será interpretado si el organismo rece...
Balanceo (Wobble)
Se denomina a la flexibilidad en las reglas de apareamiento
• perdida del apareamiento entre bases
– la ...
El ribosoma
• procariotas
– 70S ribosomas = subunidades 30S + 50S
• eucariotas
– 80S ribosomas = subunidades 40S + 60S
– l...
Los genes que codifican los genes del
tRNA tienen región promotora, líder,
codificante, espaciadora y remolque
La región l...
Síntesis de proteínas (iniciación, elongación y terminación)
• traducción
– la secuencia de nucleótidos del mRNA se traduc...
↓ resto del tRNA
aminoácido
tRNA y activación de los aminoácidos
(AAs) (Continuación)
Glutamil tRNA sintetasa unida al tRN...
Iniciación de la síntesis de proteínas
• implica a las subunidades ribosomales y a numerosas moléculas adicionales
– amino...
Reacción de transpeptidación
Traducción
Transpeptidación: Catalizado por la peptidil transferasa (localizada en la 50S). El
péptido crece en un aminoácido y se tr...
Translocación
• el peptidil t-RNA se desplaza del sitio
A al sitio P
• el ribosoma desplaza un codón a lo
largo del mRNA p...
Terminación de la síntesis de proteínas
• tiene lugar en alguno de los siguientes
codones de terminación
– UAA, UAG, and U...
Plegamiento de la proteína y
chaperomes moleculares
• Chaperones moleculares
– ayudan al
plegamiento del
polipéptido nacie...
Maduración de proteínas
• eliminación de una parte del polipéptido antes del plegamiento
– inteinas – porción eliminada
– ...
Regulación
Regulación
•Control de los elementos y procesos celulares.
•A corto plazo (segundos) los seres vivos pueden mod...
Tipos de expresión del mRNA:
• Constitutiva: No hay control sobre su expresión, los genes (denominados constitutivos) se e...
Tipos de regulación genética
• Control del inicio de la transcripción
– Regulación negativa
– Regulación positiva
• Contro...
Control negativo
Un operón
promotor operador
• el objetivo es sintetizar el
enzima de una ruta solo cuando
el sustrato de ...
Control negativo
(continuación)
en general un producto
final de una ruta. Activa al
represor
promotor operador
Genes estru...
Control positivo
• la presencia de una proteína reguladora (activador)
en la región reguladora promueve la transcripción
•...
en nivel de cAMP depende de las
condiciones ambientales
Control positivo de una ruta biosintética
• se ejerce sobre el
pro...
Sistemas globales de regulación
• afecta a numerosos genes y rutas simultáneamente
• regulón
– colección de genes o operon...
Regulación del operón gal
El operón gal de E. coli consiste en 3 genes estructurales: GalE, GalT y GalK que son
transcrito...
Atenuación
• regulación de la transcripción modificando el comportamiento de los ribosomas
– el avance de los ribosomas de...
ej.: el operón
triptófano en
Escherichia coli
región líder del operón
Estructura del mRNA en ausencia de ribosomas. Los se...
Se transcribe el operón
No se transcribe el operón
No se transcribe el operón
No se traduce el mRNA
Triptófano disponible ...
Regulación (Control de la terminación de la transcripción)
Yanofsky C (2000) Transcription
attenuation: once viewed as a novel
regulatory strategy. J Bacteriol. 182:1-8.
Transcripci...
Control de la traducción
Un ejemplo es el del gen pyrC que codifica
la dihidroorotasa, un enzima de la
biosíntesis de piri...
Regulación con factores sigma y control de la esporulación
Regulación
• diferentes factores sigma reconocen diferentes pro...
RNA antisentido y el control de las porinas
Regulación
• RNA antisentido (antisense RNA)
– tiene secuencias complementaria...
Altuvia, Shoshy and Wagner, E. Gerhart H. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9824-9826
Regulación
Regulación de RNAs di...
Sistema de fosfotransferencia de dos componentes
• Ej.: Esporulación en Bacillus subtilis
• Ej.: Quimiotaxis en Escherichi...
• Ej.: Quimiotaxis en E. coli
Sistema de fosfotransferencia de dos componentes (continuación)
Regulación
El sistema de qui...
Regulación
Mazurie et al. Genome Biology 2005 6:R35
doi:10.1186/gb-2005-6-4-r35
Representación de las rutas de
regulación
...
Transferencia genética horizontal
• transferencia de genes de un
organismo maduro e
independiente (donador) a
otro (recept...
Tipos de plásmidos bacterianos
• pequeñas moléculas de ADN de doble hebra que, en general, son circulares
• son replicones...
Recombinación microbiana y plásmidos
Recombinación: proceso en el que una o
más moléculas de ácidos nucleicos se
reorganiz...
• Recombinación bacteriana: varios tipos
de recombinación
– recombinación general
– recombinación específica de sitio
inte...
Recombinación
• incorporación de una hebra
simple de DNA en el cromosoma
para formar un heteroduplex
• se ha propuesto que ocurre
durant...
Elementos transponibles
-Transposición: movimiento de fragmentos de ADN en el genoma
-Elementos transponibles (transposone...
Integronesintegrones
Se diferencian de los transposones en: (i) no tienen secuencias repetidas en los
extremos como las se...
Conjugación bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre células
Cruce F+
x F-
• F+
= donador, contien...
Conjugación Hfr
• Cepa Hfr: donador que contiene el factor F integrado en el cromosoma
• tanto los genes plasmídicos como ...
Transformación
• toma de ADN (desnudo) del medio ambiente e
incorporación en un receptor de forma heredable
• célula compe...
Transducción • transferencia de genes bacterianos con virus
• Fagos virulentos
– se reproducen empleando el ciclo de vida ...
Transducción generalizada
• cualquier parte del genoma bacteriano puede ser transferido
• tiene lugar durante el ciclo lít...
Organización de los genes en cromosomas
Genes procariotas versus eucariotas
• procariotas (y virus)
– la información codif...
En los procariotas numerosos genes se organizan el operones. Todos los genes de un
operon se transcriben desde un promotor...
Genómica microbiana Genómica
• estudio de la organización molecular de los
genomas, su contenido de información, y los
pro...
Patrones generales
• a pesar de la conservación en las secuencias de proteínas, la organización de los
genomas es muy vari...
• DNA microarrays (DNA chips)
– soporte sólido (ej. vidrio) que tiene anclado ADN en
matrices (puntos) muy ordenadas (las ...
• proteoma
– la colección completa de
proteínas que produce un
microorganismo
• Proteómica: estudio del
proteoma
• una apr...
Genómica en el diseño de vacunas
• Diferentes aproximaciones al diseño de vacunas,
consecuencia de la introducción continu...
Mutaciones y su base química
• mutaciones
– cambio estable y heredable en la secuencia de nucleótidos
– puede tener o no a...
Cómo tienen lugar las mutaciones
• espontáneamente
– se desarrollan en ausencia de agentes externos
– suelen ocurrir al az...
Detección y aislamiento de mutantes
• las mutaciones son poco frecuentes (1 de cada 107
a 1011
células)
• para encontrar m...
Selección de mutantes
• empleo de condiciones
ambientales en las que puede
crecer el mutante deseado
– ej, selección de re...
Test de carcinogenicidad
• se basa en la observación de que
la mayor parte de los
carcinógenos son también
mutágenos
• el ...
Reparación de ADN
Reparación de ADN
Sobre la cadena de ADN se muestra los
principales lugares en los que se daña el ADN.
L...
Reparación SOS
• sistema de reparación inducible
• se emplea para reparar daños grandes que paran la replicación, dando
lu...
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9. Genética Microbiana

  1. 1. Unidad 4. Genética microbiana Objetivos Conocer -Los mecanismos de la herencia -La relación entre la estructura y función del gen -Las diferentes aplicaciones de la microbiología -Los fundamentos de la regulación genética Asimilar La información genética se transmite con gran fidelidad, y las mutaciones tienen un gran significado evolutivo Comprender y discutir Las ventajas e inconvenientes del desarrollo de la Biotecnología
  2. 2. UNIDAD IV.- Genética microbiana Tema 9.-.Principios generales (8h): Introducción. Estructura del ADN y el ARN. Replicación. Estructura de gen. Transcripción. Traducción. Regulación. Recombinación. Transferencia horizontal. Plásmidos. Transposones. Conjugación. Transformación. Transducción. Estructura de los genomas. Genomica, transcriptómica y proteómica. Mutaciones. Reparación
  3. 3. Términos y conceptos • genética: estudio de la herencia • gen: segmento de ADN que codifica un producto funcional • genoma: la suma de todo el material genético de un organismo o virus o viriones • haploide – un serie de genes • diploide – dos series de genes • clon: población de células que son genéticamente idénticas • genotipo: serie específica de genes que posee un organismo o virus • fenotipo: serie de características observables El ADN como material genético • se estableció a través de varios experimentos críticos – Fred Griffith (1928) – Oswald T. Avery, C. M. MacLeod, and M. J. McCarty (1944) – Alfred D. Hershey and Martha Chase (1952) Experimento de transformación de Griffith con neumococos Introducción
  4. 4. Estructura del ácido nucleíco El experimento de Alfred D. Hershey y Martha Chase (1952)Introducción El Dogma central El ADN como material genético (continuación)
  5. 5. nucleósido = base nitrogenada + azucar pentosa Enlace fosfodiester Estructura del ADN • base nitrogenada – A, T, G, C • azúcar pentosa – desoxirribosa • normalmente una doble hélice compuesta de dos hebras complementarias – reglas de emparejamiento • A con T • G con C las dos cadenas de polinucleótidos son antiparalelas Estructura del ADN y el ARN
  6. 6. Estructura del RNA • bases nitrogenadas – A, G, C, U (en lugar de T) • azúcar pentosa – ribosa • en general se compone de una sola hebra – puede enrollarse alrededor de si mismo • forman estructuras con forma de horquilla (hair-shaped structures) con apareamiento de bases complementarias y organización helicoidal • reglas de apareamiento – A con U – G con C Tipos de RNA • Cuatro tipos – RNA ribosómico (rRNA) – RNA transferente (tRNA) – RNA mensajero (mRNA) – RNA reguladores: Pequeños RNA (snRNA) -pequeñas moléculas encontradas en el núcleo eucariota-, aRNA (antisense RNA) y RNAi (RnA interferente) • difieren por su estructura y función Organización del ADN en la célula círculo cerrado en su forma extendida forma superenrrollada • en eucariotas – moléculas lineales – asociadas con histonas – enrolladas en unidades repetidas denominadas nucleosomas • difiere entre eucariotas y procariotas • en procariotas – círculo cerrado en forma superenrrollada asociado con proteínas básica Estructura del ADN y el ARN
  7. 7. Replicación DNA • proceso complejo que implica a numerosas enzimas y proteínas • en general, el proceso es similar en todos los organismos • semiconservativa – cada hebra parental es conservada – las dos hebras parentales se separan y sirven de molde para la síntesis de una nueva •en procariotas -bidireccional desde un único origen de replicación -replicón porción del genoma que contiene un origen y se replica como una unidad • en eucariotas – bidireccional – múltiples orígenes de replicación Horquilla de replicación las dos horquillas de replicación se mueven en sentido contrario Replicación
  8. 8. Mecanismo del círculo rodante Replicación DNA (continuación) • mecanismo del círculo rodante – se observa durante la replicación de pequeños genomas circulares – ej.: la conjungación de algunos plásmidos y la replicación de algunos virus y viriodes Replicación
  9. 9. Mecanismo de la replicación del ADN -la mejor conocida es la de Escherichia coli -se cree que la de eucariotas es similar -la ADN polimerasa III sintetiza el ADN Helicasas: desenrollan las hebras; Girasas: liberan la tensión del desenrollamiento Sintetizado por la primasa (primosoma) SSB SSB: proteínas de unión al ADN monocatenario. Mantienen separadas las dos hebras desenrolladas Cadena conductora: Síntesis continua. La hebra se extiende 5’-> 3’ desde su extremo Cadena rezagada: Síntesis discontinua. ADN ligasa: Une los fragmentos de ADN Movimiento de la horquilla Replicación
  10. 10. Mecanismos de la ADN polimerasa III Mecanismos de la ADN ligasa Replicación
  11. 11. Modelo hipotético de la actividad en la horquilla de replicación: el modelo se recoge en cinco etapas. 1. Las DNA girasa, las helicasas y las proteínas de unión (SSB) desenrollan el DNA para producir segmentos monocatenarios 2. El primosoma sintetiza un cebador de RNA 3. El replisoma tiene dos complejos de DNA polimerasa III. Una polimerasa copia de forma continua la cadena conductora. La cadena rezagada forma un lazo a través de la otra polimerasa para que ambas cadenas puedan replicarse simultáneamente. Cuando la DNA polimerasa III se encuentra con un fragmento de Okazaki completo libera la cadena rezagada 4. La DNA polimerasa I elimina el cebador de RNA y rellena los huecos con DNA complementario 5. La DNA ligasa sella los huecos y une los dos fragmentos 1 2 3 4 5 Replicación
  12. 12. Algunos datos curiosos sobre la replicación ∀ ≥ 30 proteínas se requieren para replicar el cromosoma de E. coli • se realiza con gran precisión – frecuencia de error = 10-9 o 10-10 por base replicada – gracias a la actividad de comprobación y corrección de la ADN polimerasa I y III • es muy rápida – en procariotas de 750 a 1,000 pares de bases/s – en eucariotas de 50-100 pares de bases/s Replicación
  13. 13. Estructura del Gen • gen – secuencia lineal de nucleótidos con unos puntos determinados de inicio (el tsp) y de terminación (el terminador) – codifica un polipéptido, un tRNA, un rRNA o snRNA o algún otro tipo • cistrón – gen que codifica un polipeptido • Marco de lectura (ORF) – organización de codones tal que pueden ser leídos de forma que dan lugar a un producto genético 5’ 5’ 3’ 3’ N-terminal C-terminal Transcripción Traducción Estructura del gen
  14. 14. Promotor: secuencia de nucleótidos que sirve de reconocimiento y unión a la RNA polimerasa Sentido de la RNA polimerasa Región codificante: región que especifica la secuencia de aminoácidos en un polipéptido Hebra molde: hebra que contiene la información codificante y dirige la síntesis de RNA Estructura del gen Estructura de un promotor tsp Estructura del gen
  15. 15. transcripción Región líder: secuencia 5’ que es transcrita pero no es traducida Secuencia Shine-Dalgarno o secuencia de unión a los ribosomas: sitio de reconocimiento del ribosoma Región remolque: secuencia 3’ que es transcrita pero no es traducida Terminador: señal de la terminación de la transcripción Estructura del gen Estructura del gen
  16. 16. La transcripción de DNA produce 4 tipos de RNA tRNA, rRNA, mRNA y RNA reguladores frecuentemente da como resultado mRNA poligénico (policistrónico) Catalizado por un única RNA polimerasa compuesta por el núcleo del enzima (α2ββ′) y un factor sigma que dirige el núcleo central al promotor. Los terminadores procariotas son de dos tipos: •dependientes del factor rho (no tienen poli U y a menudo no forman hairpin •hairpin + 6 uridinas Transcripción en procariotas: Diferentes factores sigma permiten a la RNA polimerasa reconocer diferentes promotores Transcripción
  17. 17. exón intrón Maduración del RNA “RNA splicing” monogénico RNA nuclear heterogéneo 5′ cap of eucaryotic mRNA Transcripción en eucariotas • Tiene varias RNA polimerasas • mRNA monogénico • Los promotores contienen tres elementos comunes – la caja TATA~ 30 bases antes del inicio de la transcripción – la caja CAAT~ 75 bases antes del inicio de la transcripción – la caja GC ~ 90 bases antes del inicio de la transcripción Transcripción
  18. 18. La maduración del Pre-RNA se produce en un complejo de gran tamaño que se denomina partícula procesadora (spliceosome) que contiene el pre-RNA, snRNAs y proteínas Algunas moléculas de rRNA sufren un proceso de automaduración y constituyen lo que se denomina Ribozimas: Moléculas de RNA con actividad catalítica. Transcripción
  19. 19. El Código genético • Forma en la que se almacenan en el genoma las instrucciones genéticas para las síntesis de polipéptidos • colinearidad: – la secuencia de pares de bases de ADN corresponde a secuencias de aminoácidos en el polipéptido codificado • los codones codifican para aminoácidos específicos (en general 20 aminoácidos salvo algunos casos en los que emplean seleniocisteina, seleniometionina o pirrolisina –en algunas arqueas) • se emplea un código de 3 bases combinando las 4 que componen el RNA (A, U, G, C) • 64 combinaciones posibles (43 ) (61 tripletes con sentido para aminoácidos y 3 sin sentido o codones de terminación) • los aminoácidos son codificados por más de un codón Traducción
  20. 20. biotecnología ya que cuando se transfiere un gen de un organismo a otro el gen solo será interpretado si el organismo receptor posee los codones necesarios •el código genético está degenerado es decir existen hasta 6 codones diferentes para un determinado aminoácido •el código genético es casi universal •el de la tabla se aplica a casi todos los procariotas (bacterias y arqueas) •en los genes mitocondriales de plantas y microorganismos UGA codifica triptófano en lugar de terminación. Este mismo codón puede codificar seleniocisteina •en algunas arqueas UAG codifica pirrolisina •algunos ciliados (como Paramecium) y la bacteria Mycoplasma tienen códigos ligeramente diferentes •todos los organismos no emplean los mismos codones es decir no tienen los 61 tRNAs necesarios para interpretar el código completo •La diferencia en el uso de codones de un organismo a otro es muy importante en • a veces la secuencia de nucleótidos del mRNA puede ser alterada en lo que se denomina RNA editing (en plantas el codón nuclear CGG es convertido en UGG) Traducción
  21. 21. Balanceo (Wobble) Se denomina a la flexibilidad en las reglas de apareamiento • perdida del apareamiento entre bases – la tercera posición del codón es menos importante que la primera o segunda posición • evita que las células tengan que sintetizar tantos tRNA diferentes • minimiza el efecto de las mutaciones • La inosina (I) es un nucleósido que puede aparearse con la adenosina, la citosina y el uracilo • La inosina se obtiene mediante la desaminación de la adenina (otra forma de edición del tRNA) Traducción
  22. 22. El ribosoma • procariotas – 70S ribosomas = subunidades 30S + 50S • eucariotas – 80S ribosomas = subunidades 40S + 60S – los ribosomas mitocondriales y cloroplásticos se asemejan a los ribosomas procariotas El ribosoma 70S permite alinear el ribosoma con el mRNA uniéndose a la RBS otros rRNAs – pueden tener un papel catalítico 20 nm Traducción
  23. 23. Los genes que codifican los genes del tRNA tienen región promotora, líder, codificante, espaciadora y remolque La región líder, espaciadora y remolque se eliminan durante la maduración Los genes que codifican los genes del rRNA también tienen región promotora, líder, codificante, espaciadora y remolque las regiones espaciadoras y de remolque pueden codificar moléculas de tRNA Genes que codifican tRNA y rRNA Precursor tRNA Traducción
  24. 24. Síntesis de proteínas (iniciación, elongación y terminación) • traducción – la secuencia de nucleótidos del mRNA se traduce en una secuencia polipeptídica • el sentido de la síntesis es N terminal → C-terminal • el sitio de traducción es el ribosoma que puede formar complejos polirribosómicos: mRNA y varios ribosomas tRNA y activación de los aminoácidos (AAs) • unión del aminoácido al tRNA • catalizado por las aminoacil tRNA sintetasas complementario al codón del mRNA lugar de unión del aminoácido Los brazos D y Ψ tienen pirimidinas poco frecuentes – en general hay, como mínimo, uno para cada AA – en algunos casos un mismo aminoacil tRNA sintetasa es bifuncional bas cargan inicialmente la forma ácida y luego la inan a misma aminoacil tRNA sintetasa puede activar támico y glutamina a aminoacil tRNA sintetasa puede activar tanto pártico como asparragina Traducción
  25. 25. ↓ resto del tRNA aminoácido tRNA y activación de los aminoácidos (AAs) (Continuación) Glutamil tRNA sintetasa unida al tRNA y al ATP Traducción extremo 3’ del tRNA
  26. 26. Iniciación de la síntesis de proteínas • implica a las subunidades ribosomales y a numerosas moléculas adicionales – aminoacil-tRNA iniciador • N-formilmetionina-tRNA – es el tRNA iniciador bacteriano • eucariotas y arqueas emplean metionina-tRNA – factores de iniciación (IFs) • Posicionan adecuadamente el ribosoma en el extremo 5’ del mRNA Traducción initiation codon Codón de iniciación Elongación de la cadena polipeptídica • Sitios de unión al tRNA en los ribosomas – sitio P (sitio peptidil o donador): une al tRNA iniciador o al peptidil-tRNA creciente – sitio A (sitio aminoacil): une el aminoacil-tRNA que se incorpora – sitio E (sitio de salida): al que se une brevemente el tRNA saliente • ciclo de elongación – adición secuencial de aminoácidos a la cadena polipeptidica – tiene tres fases • unión del aminoacil t-RNA • reacción de transpeptidación • translocación – implica numerosos factores de elongación (EFs)
  27. 27. Reacción de transpeptidación Traducción
  28. 28. Transpeptidación: Catalizado por la peptidil transferasa (localizada en la 50S). El péptido crece en un aminoácido y se transfiere al sitio A Traducción
  29. 29. Translocación • el peptidil t-RNA se desplaza del sitio A al sitio P • el ribosoma desplaza un codón a lo largo del mRNA para que un nuevo codón se sitúe en el sitio A • el tRNA vacío abandona el sitio P con ayuda de una translocasa (EF-G) Traducción
  30. 30. Terminación de la síntesis de proteínas • tiene lugar en alguno de los siguientes codones de terminación – UAA, UAG, and UGA – UAA es el más frecuente • tres factores de liberación (RFs) – ayudan a reconocer los codones de terminación • dominios – regiones del polipéptido estructuralmente independientes – separadas unas de otras por porciones de polipéptidos menos estructuradas • en eucariotas – los dominios se pliegan independientemente y correctamente después de su síntesis – los chaperones moleculares no son importantes • en procariotas – el polipéptido no se pliega hasta que se sintetiza el polipéptido completo – los chaperones moleculares son importantes Plegamiento de proteínas – eucariotas versus procariotas Traducción
  31. 31. Plegamiento de la proteína y chaperomes moleculares • Chaperones moleculares – ayudan al plegamiento del polipéptido naciente – protegen a la célula contra el daño térmico • ej.:.HSP, heat- shock proteins – ayudan en el transporte de las proteínas a través de la membrana Traducción Impiden que el polipéptido se pliegue inadecuadamente durante su síntesis Permite la liberación de DnaK y DnaJ Permiten el plegamiento final
  32. 32. Maduración de proteínas • eliminación de una parte del polipéptido antes del plegamiento – inteinas – porción eliminada – exteinas – porción que permanece en la proteína Traducción • Fueron descubiertas en 1990 en el gen de una ATPasa vacuolar de Saccharomyces cerevisiae • Actualmente se han identificado más de 100 en los 3 dominios de los seres vivos
  33. 33. Regulación Regulación •Control de los elementos y procesos celulares. •A corto plazo (segundos) los seres vivos pueden modificar la actividad de numerosos componentes celulares a través de modificación covalente de proteínas (modificación postraduccional). Esto no modifica la cantidad de proteínas sino su actividad. •Ej: fosforilación de proteínas •También, a corto plazo, puede alterar la estabilidad de las proteínas aumentando la degradación de proteínas frente a su síntesis •Ej.: activando la proteolisis •A largo plazo pueden modificar la expresión de los genes, la estabilidad de los transcritos, y la traducción •Ej: Regulación genética Observación: Los genes y operones se escriben en minúscula y cursiva y los productos de su expresión en mayúscula normal Ej.:el gen lacZ codifica la proteína LacZ
  34. 34. Tipos de expresión del mRNA: • Constitutiva: No hay control sobre su expresión, los genes (denominados constitutivos) se expresan igual en cualquier circunstancia independientemente de las condiciones ambientales. Algunos de estos genes codifican enzimas constitutivos • Adaptativa: Se controla su expresión, los genes están regulados. Pueden dar lugar a enzimas inducibles y a enzimas reprimibles Regulación • enzimas inducibles – su nivel se eleva en presencia de un inductor • pequeña molécula, en general un sustrato de una ruta catabólica en la que participa el enzima. De esta forma solo se inducen cuando son necesarios • enzimas reprimibles – su disminuye en presencia de un co-represor • en general, es el producto final de una ruta en la que el enzima participa • Ventajas – regulación de la expresión génica (la síntesis de un determinado mRNA) – permite conservar la energía y materia prima – mantiene el balance entre las diversas proteínas celulares – permite la adaptación, a largo plazo, a los cambios en el entorno Regulación de la síntesis de mRNA • Desventajas – requiere el desarrollo y mantenimiento de sistemas reguladores
  35. 35. Tipos de regulación genética • Control del inicio de la transcripción – Regulación negativa – Regulación positiva • Control de la terminación de la transcripción – Atenuación – Antiterminación • Control de la traducción • Control de la estabilidad del transcripto • Regulación con factores sigma • Regulación con RNA antisentido • Otros tipos – Metilación de ADN – Superenrrollamiento del ADN Regulación
  36. 36. Control negativo Un operón promotor operador • el objetivo es sintetizar el enzima de una ruta solo cuando el sustrato de la ruta está disponible en general un sustrato de la ruta. Inactiva al represor Genes estructurales Genes estructurales Control negativo de una ruta catabólica 1. Genes transcritos 2. Genes no transcritos Represor activo Represor inactivoInductor • la presencia de una proteína reguladora (el represor) en el lugar de regulación (el operador disminuye la síntesis de mRNA • proteínas represoras – existen en forma activa e inactiva – inductores y correpresores modifican la actividad del represor • se ejercen sobre el operador Regulación (Control del inicio de la trasncripción)
  37. 37. Control negativo (continuación) en general un producto final de una ruta. Activa al represor promotor operador Genes estructurales Genes no transcritos Control negativo de una ruta biosintética Un operón Genes estructurales Genes transcritos • el objetivo es sintetizar el enzima de una ruta solo cuando el producto final de la ruta no está disponible Regulación (Control del inicio de la transcripción)
  38. 38. Control positivo • la presencia de una proteína reguladora (activador) en la región reguladora promueve la transcripción • ej., operón lactosa – regulada por la proteína CAP (proteína activadora del catabolismo) y el AMP cíclico (cAMP) • CAP también se denomina CRP (proteína receptora de cAMP) CAP: puede funcionar tanto como controlador positivo como negativo reconoce y se une a la región reguladora del operón lac Regulación (Control del inicio de la trasncripción)
  39. 39. en nivel de cAMP depende de las condiciones ambientales Control positivo de una ruta biosintética • se ejerce sobre el promotor Regulación (Control del inicio de la trasncripción)
  40. 40. Sistemas globales de regulación • afecta a numerosos genes y rutas simultáneamente • regulón – colección de genes o operones controlados por una proteína reguladora común. Ej. El regulón CRP Represión por catabolito • tiene lugar cuando el operón está controlado por otro catabolito distinto al sustrato inicial de la ruta • permite el empleo preferente de un nutriente frente a otro cuando ambos están disponibles – una fuente de carbono frente a otra (glucosa frente a lactosa) – un fuente de nitrógeno frente a otra (amonio frente a nitrato) • ej., represión por catabolito de la lactosa y otros operones por glucosa – la glucosa, a través del sistema fosfotransferasa, inhibe una adenilato ciclasa (enzima que sintetiza cAMP) y disminuye los niveles de cAMP, esto bloquea la unión de la proteína CAP al operón de la lactosa y disminuye las síntesis de mRNA y,en consecuencia la de proteína. – En ausencia de glucosa el cAMP aumenta y la proteína CAP activa la transcripción de numerosos operones lac, gal ara. La lactosa no se consume hasta que toda la glucosa ha sido consumida Crecimiento en el que el organismo cambia de estrategia metabólica Regulación (Control del inicio de la trasncripción)
  41. 41. Regulación del operón gal El operón gal de E. coli consiste en 3 genes estructurales: GalE, GalT y GalK que son transcritos desde dos promotores solapados PG1 y PG2 . La regulación es compleja ya que GalE (una epimerasa que convierte UDP-glucosa en UDP-galactosa) es necesaria para la formación de UDP-galactosa para biosíntesis de la pared celular incluso cuando no emplea galactosa como fuente de carbono. Igual que el operón lac, el operón gal es controlado por CAP-cAMP. Este regulador se une en la región -35 activado las transcripción desde PG1 e inhibiendo la transcripción desde PG2. Cuando las células crecen en glucosa (no se forma complejo CAP- cAMP) la transcripción tiene lugar desde PG2. El represor del operón es GalR, que a gran concentración, forma tetrámeros que se unen a los dos operadores y reprime por completo la transcripción. A baja concentración, GalR forma dímeros que se unen a un solo operador y permiten la actividad del promotor PG2 Regulación (Control del inicio de la trasncripción)
  42. 42. Atenuación • regulación de la transcripción modificando el comportamiento de los ribosomas – el avance de los ribosomas depende de la presencia de los aminoácidos necesarios en la traducción. Si estos no están presentes la traducción no avanza. • observado en bacterias en las que la transcripción y la traducción se simultanean (la traducción de un mRNA tiene lugar a medida que éste es sintetizado) – el avance de la transcripción depende de las estructura del mRNA que se está sintetizando. La formación de una horquilla de terminación provoca la terminación de la transcripción. En presencia de ribosomas la estructura puede ser distinta. • operón que codifica las enzimas para la ruta biosintética del triptófano • esta regulado por una proteína represora, TrpR, bajo el control del triptófano como correpresor •el objetivo es no iniciar la transcripción si el triptófano ya está disponible • también está regulado por atenuación • el objetivo es terminar la transcripción si el triptófano ya está disponible ej.: el operón triptófano en Escherichia coli Regulación (Control de la terminación de la trasncripción)
  43. 43. ej.: el operón triptófano en Escherichia coli región líder del operón Estructura del mRNA en ausencia de ribosomas. Los segmentos 1 y 2 y 3 y 4 se aparean Región líder entre el operador y el primer gen estructural trpE: contiene un atenuador y la secuencia de un péptido líder AtenuadorSecuencia del péptido lider Codones de triptófano (Trp) • Se basa en la capacidad que tiene el RNA de la región líder de formar tres estructuras secundarias de RNA (los segmentos numerados (1, 2, 3,4) contienen secuencias complementarias): •la pausa de transcripción •La horquilla formada por los segmentos 1 y 2 arresta momentáneamente la transcripción •el antiterminador alternativo •La horquilla formada por los segmentos 2 y 3 impide la formación del terminador •el terminador de transcripción •La horquilla formada por los segmentos 3 y 4 y la secuencia poli-U forman un terminador de transcripción En presencia de ribosomas y Trp el péptido líder se sintetiza hasta su codón de terminación. Debido a la presencia de ribosomas los segmentos 1 y 2 no se aparean. Los segmentos 3 y 4 si se aparean y forma un terminador de transcripción Terminador independiente de Rho Regulación (Control de la terminación de la transcripción)
  44. 44. Se transcribe el operón No se transcribe el operón No se transcribe el operón No se traduce el mRNA Triptófano disponible para formar trp-tRNA Ausencia de triptófanoAusencia de triptófano Un ribosoma sintetiza el péptido líder y se detiene en el codón de terminación Un ribosoma se detiene en los codones para trp en la región 1 y obliga a la región 2 a unirse con la 3. La región 4 permanece monocatenaria y no se forma el sitio de terminación Regulación (Control de la terminación de la transcripción)
  45. 45. Regulación (Control de la terminación de la transcripción)
  46. 46. Yanofsky C (2000) Transcription attenuation: once viewed as a novel regulatory strategy. J Bacteriol. 182:1-8. Transcripción de la región líder del operón trp de E. coli. Las parejas de números 1:2, 2:3, y 3:4 corresponden a las parejas de segmentos de RNA que forman estructuras secundarias (la estructura de pausa inicial de la transcripción (1:2), el antiterminador (2:3), y el terminador (3:4)). Cuando la RNA polimerasa se une al promotor trp e inicia la transcripción, la polimerasa se detiene en el loop de pausa 1:2. Si un ribosoma no se une rápidamente al mRNA (un indicador de limitaciones en la síntesis de proteínas) entonces se forma un terminador con los segmentos 3:4 y la RNA polimerasa es desprendida léntamente La unión de un ribosoma al complejo en pausa también desprende la RNA polimerasa. •Si hay un adecuado suministro de Trp el ribosoma continua hasta el codón de terminación del péptido líder. Esto bloquea la formación del antiterminador 2:3 y se forma el terminador 3:4, parando la transcripción. •Si no hay Trp el ribosoma continua hasta el codón Trp-Trp. Esto impide la formación del loop 1:2, lo que favorece la formación del antiterminador. Regulación (Control de la terminación de la transcripción)
  47. 47. Control de la traducción Un ejemplo es el del gen pyrC que codifica la dihidroorotasa, un enzima de la biosíntesis de piridina. • Los niveles del enzima varían hasta 10 veces en función de la disponibilidad de piridina sin que para ello se modifiquen los niveles de mRNA • La transcripción puede comenzar en cualquiera de los siguientes 4 nucleótidos: 5’ CCGG 3’ • Cuando las pirimidinas están en exceso se inicia por la citosina 2 y se permite la formación de un bucle que impide la unión de los ribosomas a la RBS • Cuando las pirimidinas no están en exceso la transcripción comienza por Guanina 4. Entonces no se forma el bucle y los ribosomas se pueden unir Regulación
  48. 48. Regulación con factores sigma y control de la esporulación Regulación • diferentes factores sigma reconocen diferentes promotores • sustitución de los factores sigma modifican la expresión de los genes y operones Ej. Bacillus subtilis factores sigma y esporulación • se sintetizan solo cuando la célula cambia de un crecimiento vegetativo a esporulación • da lugar a la trascripción de genes relacionados con la esporulación Ciclo de la formación de esporas de Bacillus sp. Muerte programada de la célula madre en el desarrollo de la esporulación de B. subtilis. Las señales ambientales e internas son integradas al nivel de Spo0A, que activa la cascada de los factores sigma de esporulación. El factor sigma terminal K controla el final de la esporulación –la formación del cortex, la cubierta y la expresión de las autolisinas CwlC and CwlH-
  49. 49. RNA antisentido y el control de las porinas Regulación • RNA antisentido (antisense RNA) – tiene secuencias complementarias a algunos componentes del mRNA necesarios para su expresión (RNA diana) – se une al RNA diana e inhibe su función Ej.: Porinas (proteínas de la membrana externa) • diferentes porinas son producidas bajo diferentes condiciones – E. coli sintetiza la proteína OmpC cuando crece en el intestino y la porina OmpF en ambientes diluidos • El RNA antisentido micF se une al mRNA que se traducirá en OmpF y bloquea su traducción cuando la bacteria está en el intestino
  50. 50. Altuvia, Shoshy and Wagner, E. Gerhart H. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9824-9826 Regulación Regulación de RNAs diana a través de OxyS (recuadro izquierdo) y DsrA (recuadro derecho).Los RNAs diana se muestran en azul y el antisentido en rojo. Las regiones de interacción se muestran en verde (no se guarda proporcionalidad en los tamaños). Los signos positivos y negativos indican activación e inhibición respectivamente. RBS indica la posición aproximada del sitio de unión a los ribosomas. Hfq es el factor Q del huésped. Los pares de círculos anaranjados representan los ribosomas.
  51. 51. Sistema de fosfotransferencia de dos componentes • Ej.: Esporulación en Bacillus subtilis • Ej.: Quimiotaxis en Escherichia coli • la transferencia de grupos fosforilo controla la transcripción de genes y la actividad de proteínas • En el sistema de dos componentes el primer componente percibe una señal en su extremo N-terminal y se autofosforila en su extremo C terminal. El segundo componente regula su respuesta en función del fosfato que le transfiere el primer componente Regulación La activación de las quinasas A y B inicia un sistema de fosfotransferencia de dos componentes que activa al regulador de la transcripción Spo0A
  52. 52. • Ej.: Quimiotaxis en E. coli Sistema de fosfotransferencia de dos componentes (continuación) Regulación El sistema de quimiotaxis está diseñado para controlar la rotación flagelar en dirección contraria (ccw) o a favor (cw) de las agujas del reloj.
  53. 53. Regulación Mazurie et al. Genome Biology 2005 6:R35 doi:10.1186/gb-2005-6-4-r35 Representación de las rutas de regulación • Las relaciones entre elementos se indican con líneas • Si uno regula positivamente (activa) al otro se indica con una flecha • Si inhibe, la línea termina en una recta • Las líneas onduladas indican transformación o síntesis • La regulación no transcripcional se indica con líneas discontinuas
  54. 54. Transferencia genética horizontal • transferencia de genes de un organismo maduro e independiente (donador) a otro (receptor) • exogenote – DNA que es transferido al receptor • endogenote – genoma del receptor • merozigoto – célula receptora que es temporalmente diploide como resultado del proceso de transferencia Transferencia genética horizontal Tipos principales de transferencia genética horizontal Transferencia genética vertical •Es la que ocurre desde los ascendientes a los descendientes mediante replicación
  55. 55. Tipos de plásmidos bacterianos • pequeñas moléculas de ADN de doble hebra que, en general, son circulares • son replicones tienen su propio origen de replicación – pueden existir en una sola copia o en múltiples copias • curado – se denomina a la eliminación de un plásmido – puede ser espontánea o inducida mediante tratamientos que inhiben la replicación de plásmido pero no la reproducción del huésped • Episomas: plásmidos que pueden existir tanto integrados en el cromosoma como sin integrar • Plásmidos conjugativos: tiene genes que codifican los pili y pueden transferir copias de ellos mismos a otras bacterias durante la conjugación • Plásmidos suicidas: no tienen un replicón que funcione en el huésped final • Plásmidos de expresión de proteínas • Plásmidos de clonación de fragmentos de ADN • Plásmidos de resistencia (antibióticos, metales, etc) • Plásmidos Col (codifican colicinas – un tipo de bacteroicinas, proteínas que destruyen otras bacterias) • Otros (de virulencia, metabólicos) Plásmidos bacterianos Plásmidos bacterianos
  56. 56. Recombinación microbiana y plásmidos Recombinación: proceso en el que una o más moléculas de ácidos nucleicos se reorganizan o combinan para producir una nueva secuencia de nucleótidos •en eucariotas frecuentemente tiene lugar como resultado del entrecruzamiento durante la meiosis Recombinación
  57. 57. • Recombinación bacteriana: varios tipos de recombinación – recombinación general – recombinación específica de sitio integración de genomas víricos – recombinación replicativa (por transposición) • tipo de recombinación más común • intercambio recíproco entre parejas de cromosomas homólogos • el resultado de la ruptura y unión de la hebra de ADN da lugar al entrecruzamiento Recombinación Recombinación general: puede ser recíproca o no recíproca Recombinación general recíproca
  58. 58. Recombinación
  59. 59. • incorporación de una hebra simple de DNA en el cromosoma para formar un heteroduplex • se ha propuesto que ocurre durante la transformación bacteriana Recombinación Recombinación general no recíproca
  60. 60. Elementos transponibles -Transposición: movimiento de fragmentos de ADN en el genoma -Elementos transponibles (transposones): segmentos de ADN que contienen los genes necesarios para la transposición -muy extendidos en bacterias, arqueas y eucariotas Tipos de elementos transponibles • secuencias de inserción (elementos IS): contienen solo los genes que codifican los enzimas necesarios para la transposición (se denominan con la letra IS seguida de un número, ej.. IS5) • ej., transposasa Effectos: • mutaciones en regiones codificantes: ej., deleción de material genético • modifica la traducción la transcripción • activación de genes • generación de nuevos plásmidos. Ej. Plásmidos de resistencia Elementos transponibles IR= Secuencias inversamente repetidas • Transposones compuestos: llevan genes adicionales a los necesarios para la transposición. Se denominan Tn seguido de un número, Ej. Tn524) – Transposones conjugativos: además de los genes para la transposisción tienen genes para la conjugación
  61. 61. Integronesintegrones Se diferencian de los transposones en: (i) no tienen secuencias repetidas en los extremos como las secuencias IS y, (ii) los elementos contienen una integrasa específica de sitio como la que se encuentra en los fagos y no tiene numerosas productos genéticos asociados con la transposición. Los integrones son elementos móviles de ADN que pueden capturar genes (generalmente de resistencia a antibióticos con su propio lugar de integración attC). Se componen de un gen integrasa (int) próximo a un lugar de recombinación (attI site) y un promotor (Pant). Según el tipo de integrasa se diferencian 3 clases de integrones La organización de los integrones de clase I se muestra a continuación. Los genes aadB, oxa2, aadA2 y oxa 2 se van integrando secuencialmente.
  62. 62. Conjugación bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre células Cruce F+ x F- • F+ = donador, contiene el factor F (formación de pilus y transferencia de plásmido) • F- = receptor, no contiene el factor F • El factor F se replica mediante el mecanismo del círculo rodante y el duplicado se transfiere al receptor • el recipiente se convierte en F+ • el donador permanece como F+ Conjugación
  63. 63. Conjugación Hfr • Cepa Hfr: donador que contiene el factor F integrado en el cromosoma • tanto los genes plasmídicos como los cromosómicos son transferidos • Debido a que la ruptura antes de la conjugación tiene lugar en el gen F, la cepa receptora no se convierte en F+ (salvo que se transfiera todo el cromosoma) • Además de para la transferencia de genes, la conjugación permite mapear (determinar la organización) d Conjugación Conjugación bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre células
  64. 64. Transformación • toma de ADN (desnudo) del medio ambiente e incorporación en un receptor de forma heredable • célula competente – capaz de tomar ADN • puede ser una forma importante de intercambio genético en la naturaleza Transformación artificial • transformación realizada en el laboratorio con especies que normalmente no son competentes (ej., E. coli) • numerosas técnicas son empleadas para hacer las células competentes de forma transitoria. Ej.: tratamiento con Cl2Ca, hace las células más permeables al DNA Transformación
  65. 65. Transducción • transferencia de genes bacterianos con virus • Fagos virulentos – se reproducen empleando el ciclo de vida lítico • Fagos atemperados – se reproducen empleando el ciclo lisogénico Ciclos de vida del fago Lambda forma integrada del genoma viral bacteria que contiene un profago Transducción
  66. 66. Transducción generalizada • cualquier parte del genoma bacteriano puede ser transferido • tiene lugar durante el ciclo lítico • durante el ensamblado viral, los fragmentos del ADN del huésped son erróneamente empaquetados en el fago – partícula de transducción generalizada Transducción especializada • también denominada restricted transduction • llevada a cabo por fagos atemperados que establecen el ciclo lisogénico • solo una porción específica del genoma bacteriano es transferida • tiene lugar cuando el profago es cortado incorrectamente Transducción
  67. 67. Organización de los genes en cromosomas Genes procariotas versus eucariotas • procariotas (y virus) – la información codificante está generalmente contigua • eucariotas – la mayoría de los genes tienen secuencias codificantes interrumpidas por secuencias no codificantes • exones – secuencias codificantes • intrones – secuencias no codificantes • en la mayor parte de los organismos las pautas de lectura (ORFs ) no se solapan • algunas bacterias y algunos virus tienen genes solapados Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Escherichia coli Fago X174 Estructura de los genomas
  68. 68. En los procariotas numerosos genes se organizan el operones. Todos los genes de un operon se transcriben desde un promotor en un único mRNA. Se muestra el operón tuf- s10 de Borrelia burgdorferi ( enfermedad de Lyme) En eucariotas los genes no forman operones y contienen intrones. Ej.: Receptor de la hormona de crecimiento Estructura de los genomas
  69. 69. Genómica microbiana Genómica • estudio de la organización molecular de los genomas, su contenido de información, y los productos genéticos que codifica • dividido en 3 áreas – genómica estructural • naturaleza física de los genomas – genómica funcional • como funciona un genoma – genómica comparativa • compara los genomas de diferentes organismos • numerosos genomas han sido completados. Actualmente (26.3.2007) – 748 bacterianos – 41 de arqueas – 139 de eucariotas • su examen ha permitido formular numerosas hipótesis sobre los genomas microbianos Descubrimientos interesantes • el génoma mínimo – basado en el análisis del genoma de Mycoplasma genitalium • el más pequeño de los genomas procariotas • ~108-121 genes no son necesarios para el crecimiento en el laboratorio • ~265-350 genes necesarios para el crecimiento en el laboratorio • la mayor parte de los genes identificados tienen función desconocida (proteínas hipotéticas) – ej., Mycoplasma genitalium: 22% tienen función desconocida – e.g., Haemophilus influenzae: > 40% tienen función desconocida – e.g., Methanococcus jannaschii: 66% tienen función desconocida – e.g., E. coli: ~2500 de 4288 genes tienen función desconocida Genómica
  70. 70. Patrones generales • a pesar de la conservación en las secuencias de proteínas, la organización de los genomas es muy variable • la transferencia horizontal de genes parece haber sido muy importante en la evolución de las bacterias y las arqueas Genómica funcional (determina como funcionan los genomas) • las 3 aproximaciones más comunes se abordan a través de proyectos OMA y son: – Genómica: secuenciación y anotación de genoma (identificación de genes y fases codantes) – Transcriptómica: estudio de la expresión genética al nivel de RNA – Proteómica: estudio de la expresión genética al nivel de proteínas Genómica DNA chips • Permiten el estudio masivo de la expresión de genes al nivel del RNA (el transcriptoma)
  71. 71. • DNA microarrays (DNA chips) – soporte sólido (ej. vidrio) que tiene anclado ADN en matrices (puntos) muy ordenadas (las sondas) • Este ADN consiste en la secuencia parcial y complementaria del RNA o cDNA de un gen con el que puede hibridar • incubado con mRNA o cDNA (dianas), que hibridan con el ADN anclado al soporte – Este RNA está marcado con fluorocromos – Los genes que se expresan se iluminan en el chip Genómica Estudio masivo de la expresión de genes, RNA.       ADN diana (cDNA) con marcadores fluorescentes Sondas de ADN Soporte de vidrio Chip de ADN con el ADN diana hibridado
  72. 72. • proteoma – la colección completa de proteínas que produce un microorganismo • Proteómica: estudio del proteoma • una aproximación frecuente es la electroforesis en dos dimensiones • Las proteínas pueden identificarse posteriormente mediante espectroscopía de masas (MALDI TOF) Estudio masivo de la expresión de genes, Proteínas MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) Espectrometría de masas mediante ionización-desorción por láser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo Genómica
  73. 73. Genómica en el diseño de vacunas • Diferentes aproximaciones al diseño de vacunas, consecuencia de la introducción continua de una serie de nuevas tecnologías. Los progresos realizados en inmunología molecular y biotecnología en las últimas dos décadas han desplazado las vacunas clásicas basadas en células enteras de patógenos muertos (a) hacia vacunas con subunidades. La aplicación de la tecnología del ADN recombinante ha dado como resultado la producción de vacunas atenuadas vivas (b) mediante la inactivación de los genes responsables de la patogenicidad. La manipulación del ADN ha revolucionado la posibilidad de clonar, purificar, y crear subunidades antigénicas para eliminar los efectos tóxicos al mismo tiempo que se mantiene la inmunogenicidad de la proteína (c). Además, bacterias y virus atenuados o no patógenas pueden ser manipulados para que expresen proteínas de otro organismo (d). La posibilidad de obtener la secuencia completa de un organismo marca el comienzo de la era genómica que abre nuevas perspectivas en el diseño de vacunas. La totalidad de los antígenos potenciales de un organismo puede ser identificada en el genome mediante análisis in silico. Los antígenos potenciales son clonados, purificados y sometidos a un análisis inmunológico. El proceso completo da lugar a la identificación de un número reducido de candidatos de vacunas. (e). • Trends in Biotechnology (2005) 23 (2):57-108 Genómica
  74. 74. Mutaciones y su base química • mutaciones – cambio estable y heredable en la secuencia de nucleótidos – puede tener o no algún efecto sobre el fenotipo de un organismo, de hecho la mayor parte de las mutaciones son neutras en ese sentido Mutaciones y mutagénesis • las mutaciones pueden clasificarse, de forma no excluyente, según su efecto en el fenotipo – mutaciones morfológicas • cambia la morfología de la célula o la colonia – mutaciones letales • matan al organismo – mutaciones condicionales • se expresan solo bajo ciertas condiciones (ej.. alta temperatura) – mutaciones bioquímicas • cambio en la capacidad metabólica de un organismo • auxotrofos – tienen mutaciones en una ruta biosintética – no pueden sintetizar el producto de una ruta – requiere el producto de esa ruta como nutriente en medios de cultivos mínimos • El término auxotrofo se contrapone al término prototrofo (denominación que se aplica a cepas que pueden crecer en medio mínimo, sin suplementos) – mutaciones de resistencia • resistencia a patógenos , productos químicos y antibióticos Mutaciones
  75. 75. Cómo tienen lugar las mutaciones • espontáneamente – se desarrollan en ausencia de agentes externos – suelen ocurrir al azar • mutación dirigida (adaptativa) – mutaciones que son el resultado de la hipermutación seguida de selección • inducida – desarrollada tras la exposición a un mutágeno Mutaciones espontáneas • Son el resultado de : – errores en la replicación del ADN – daño del ADN – inserción de transposones Mutaciones inducidas • provocada por agentes químicos o físicos que dañan o alteran le química del ADN o que interfieren con los mecanismos de reparación de ADN Mutaciones
  76. 76. Detección y aislamiento de mutantes • las mutaciones son poco frecuentes (1 de cada 107 a 1011 células) • para encontrar mutantes se necesitan métodos de detección sensibles y/o métodos que aumentan la frecuencia de mutación Mutaciones Tratamiento de células de E. coli con un mutágeno como la nitrosoguanidina Soporte Superficie de tercio pelo esterilizada Inoculación de una placa con medio completo e incubación. Tanto las bacterias de tipo salvaje como los supervivientes mutantes formarán colonias Placa maestra (medio completo) Réplica (medio completo) Réplica (medio sin lisina) Los auxótrofos de lisina no crecen Todas crecen
  77. 77. Selección de mutantes • empleo de condiciones ambientales en las que puede crecer el mutante deseado – ej, selección de revertientes desde auxotrofía a prototrofía Mutaciones Tratamiento de auxotrofos de lisina (Lys- ) con un mutágeno como la nitrosoguanidina o la radiación UV para producir revertientes Siembra en un medio mínimo (carente de lisina) Incubación Solo crecen los prototrofos capaces de sintetizar lisina
  78. 78. Test de carcinogenicidad • se basa en la observación de que la mayor parte de los carcinógenos son también mutágenos • el test de mutagenicidad se emplea para identificar compuestos potencialmente carcinogénicos – e.g., Test de Ames • tasa de reversión en presencia de un carcinogeno potencial > tasa de reversión en ausencia de un carcinogeno potencial •entonces, si el agente es un mutágeno puede ser carcinógeno Mutaciones Cultivo de auxótrofos de histidina de Salmonella Medio completo con una pequeña cantidad de histidina Medio completo con una pequeña cantidad de histidina Medio completo con un agente mutágeno y una pequeña cantidad de histidina Medio completo co un agente mutágen y una pequeñ cantidad de histidin Revertientes espontáneos Revertientes inducidos por e
  79. 79. Reparación de ADN Reparación de ADN Sobre la cadena de ADN se muestra los principales lugares en los que se daña el ADN. Las depurinaciones (pérdida de las purinas) se indica con flechas rojas. Los sitios que pueden sufrir un ataque hidrolítico se indican con flechas verdes y los que pueden sufrir una oxidación se indican con flechas azules • Comprobación de la lectura (proofreading) – corrección de errores en el apareamiento de bases realizado durante la replicación – los errores son corregidos por la ADN polimerasa • otros mecanismos reparan apareamientos incorrectos y el ADN dañado, estos son: Reparación por escisión de una hebra, la otra se usa como molde Eliminación de lesiones (Fotoreactivación de dímeros de timina) Reparación postreplicativa (la metilación de ADN permite distinguir cadenas nuevas y viejas) Reparación por recombinación: • repara el ADN en ambas hebras • implica la recombinación con una molécula no dañada – en células que se dividen rápidamente otra copia de cromosoma esta disponible • La proteían RecA cataliza la recombinación
  80. 80. Reparación SOS • sistema de reparación inducible • se emplea para reparar daños grandes que paran la replicación, dando lugar a numerosas brechas – La proteína RecA inicia la reparación mediante recombinación – La proteína RecA actúa también como una proteasa, destruyendo una proteína represora y así aumentando la proporción de enzimas de reparación por excisión Reparación de ADN Proceso de reparación SOS: En ausencia de daños, los genes de reparación se expresan en E. coli a niveles bajos debido a la unión de la proteína represona LexA en sus operadores (O). Cuando la proteína RecA se une a una región dañada, destruye la proteína LexA y los genes de reparación se expresan de

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