Biochemia harpera

14,181
-1

Published on

0 Comments
6 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
14,181
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
288
Comments
0
Likes
6
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Biochemia harpera

  1. 1. BIOCHEMIA HARPERA
  2. 2. a LANGE medical book Harper's Biochemistry Twenty-second Edition Robert K. Murray, MD, PhD Professor of Biochemistry Universtty of Toronto Daryl K. Granner, MD Professor and Chairman Department of Moiecuiar Physiology and Biophysics Professor of Medicine Vanderbitt University Nashville, Tennessee Peter A. Mayes, PhD, DSc Reader in Biochemistry Royał Veterinary College University of London Victor W. Rodwell, PhD Professor of Biochemistry Purdue University West Lafayette, Indiana Prentice-Hall International Inc.
  3. 3. Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell BIOCHEMIA HARPERA Wydanie III Redaktor naukowy tłumaczenia Franciszek Kokot IHhl. Medyczna CM ID 1816004318 50LAT Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL
  4. 4. Copyright for the Polish Edition by ydawnictwo Lekarskie PZWL J994, 1995 Z oryginału angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22 Copyright © 1990 by Appleton Lange Ali Rights Reserved i rozdz. 60, 64 z oryginału angielskiego Harper's Btochemistry ed. 23 Copyright © 1993 by Appleton Lange Alt Rights Reserved pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tłumaczyli Doc. med. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 12—19) Prof. dr hab. MIECZYSŁAW CHORĄŻY (rozdz. 35—42) Prof. dr hab. MARIAN DRÓŻDŻ (rozdz. 57, 58) Prof. dr hab. ZOFIA KILAŃSKA (rozdz. 2—5) Prof. dr hab. LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ (rozdz. 1, 6, 32, 33) Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (rozdz. 44—56, 60, 62 i przedmowa) Prof. dr hab, WANDA MAŁGORZATA KRAJEWSKĄ (rozdz. 7, 10, l i, 34) Prof. dr hab. EUGENIUSZ KUCHARZ (rozdz. 63) Prof, dr hab. BOHDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 59) Prof. dr hab. ANNA LIPIŃSKA (rozdz. 8, 9, 30, 31) Prof. dr hab. JERZY VETULANI (rozdz. 64) Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 43, 61) Prof. dr hab. MARIUSZ ZYDOWO (rozdz. 20—29) Projekt okładki i strony tytułowej Anna Dluiewaka Redaktorzy Krystyna Chąjęcka, Renata Piotrowska-Siemdzka Redaktor techniczny Joanna Głodowska Korektorzy Zespół 1SBN83-200-1798-X Wydawnictwo Uliatskie PZWL Warszawa ]»5 Wydanie Iii Cieszyńska Drukarnia Wydawnicza ul. Pokoju I, 43-400 Cieszyn Zam. nr 2543/K-94
  5. 5. PRZEDMOWA / 5 Przedmowa do wydania polskiego Do rąk Czytelnika oddajemy tłumaczenie 22. wydania „Biochemii Harpera". W trakcie tłu- maczenia ukazało się wydanie 23. tej książki, wzbogacone o kitka nowych rozdziałów w sto- sunku do wydania 22. Dlatego też, chcąc do- starczyć Czytelnikom możliwie aktualnej wie- dzy, postanowiono włączyć do wydania 22. dwa nowe rozdziały z wydania 23. („Erytrocyty i leukocyty" oraz „Podłoże biochemiczne nie- których chorób neuropsychiatrycznych"), uwzględniając stan wiedzy z końca 1992 r. Jako redaktor naukowy, odpowiedzialny za obecne polskie wydanie książki, kieruję wyrazy głębokiego szacunku i podziękowania do wszy- stkich Współtłumaczy za trud włożony w tłu- maczenie poszczególnych rozdziałów. Pragnę podkreślić, że tłumaczenie książki natrafiało na duże trudności w zakresie mianownictwa bio- chemicznego, często nie ustabilizowanego nie tylko w skali naszego kraju, lecz także między- narodowej. Toteż sądzę, że wartość merytorycz- na, a nie nomenklaturowa, będzie głównym kryterium oceny książki przez Czytelników. Pragnę wyrazić nadzieję, że i obecne wydanie „Biochemii Harpera" nie tylko spełni wymaga- nia „starych" Czytelników tej książki, lecz także przysporzy jej wielu nowych Czytelników i przyjaciół. Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot
  6. 6. PRZEDMOWA / 7 Przedmowa „Biochemia Harpera" dostarcza zwięzłej, choć dostatecznie szerokiej, wiedzy dotyczącej podstaw biochemii i biologii molekularnej. Za- wiera ona liczne przykłady na to, że wiedza biochemiczna jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów podtrzymujących zdrowie oraz przyczyn i racjonalnego leczenia licznych cho- rób, jakimi są szczególnie zainteresowani leka- rze i inni pracownicy opieki zdrowotnej. Zmiany dokonane w wydaniu 22. Dwa cele przyświecały autorom przygotowu- jącym obecne wydanie: 1) przedstawienie moż- liwie najnowszej wiedzy biochemicznej, potrzeb- nej przy studiowaniu medycyny oraz 2) dostar- czenie studentom medycyny i innych nauk dotyczących zdrowia książki interesującej i lu- bianej przez użytkownika. Odzwierciedleniem tego jest układ i treść nowego wydania. • Wszystkie rozdziały zostały przeredagowane z uwzględnieniem ważnych postępów wiedzy biochemicznej. • We wstępie większości rozdziałów zasygnali zowano główne problemy będące ich treścią. • Zredukowano szczegółowe omawianie dru- gorzędowych szlaków metabolicznych. • Liczne ryciny zmodyfikowano w celu po prawienia ich czytelności. • Włączono nowe rozdziały dotyczące „Wody i pH", „Witamin rozpuszczalnych w wo dzie", „Witamin rozpuszczalnych w tłusz czach", „Utleniania kwasów tłuszczowych i ketogenezy", „Żywienia" i „Przemiany kse- nobiotyków". • W ostatnim rozdziale, który jest również nowy, znajduje się zwięzłe omówienie bio chemicznych aspektów przyczyn i mechaniz mów chorób. Na podstawie historii choroby 8 chorych zilustrowano użyteczność wiedzy biochemicznej dla medycyny. Przedstawione przypadki dotyczą głównych klas przyczyn chorobowych. Rozdział ten, wraz z suple mentem omawiającym testy laboratoryjne, stanowią pomost wypełniający dotychczaso wą lukę dzielącą biochemię od kliniki. Układ książki Tekst składa się z 3 rozdziałów wprowadzają- cych i 6 głównych działów. Dział 1 jest poświęcony białkom i enzymom, będącym końmi roboczymi organizmu. Ponie- waż większość reakcji zachodzących w komór- kach ludzkich ma charakter enzymatyczny, jest istotne zapoznanie się z właściwościami en- zymów przed omawianiem innych problemów. W dziale II przedstawiono a) różne reakcje komórkowe, w których zachodzi utylizacja lub wytwarzanie nośników energetycznych oraz b) szlaki syntezy i rozkładu węglowodanów i lipidów. Ponadto przedstawiono funkcję po- szczególnych związków należących do wymie- nionych klas cząsteczek. W dziale III omówiono poszczególne amino- kwasy i ich losy oraz przemiany tych związków przebiegające ze zużytkowaniem lub wytwarza- niem energii. W dziale IV przedstawiono strukturę i funkcję kwasów nukleinowych oraz szlak DNA-tRNA->białka. W tej części opisano również zasady technologii rekombinacji DNA, tj. zagadnienie o niezwykłych implikacjach w dyscyplinach biomedycznych. Treścią działu V są hormony i ich kluczowa rola w komunikacji międzykomórkowej i regu- lacji poszczególnych szlaków metabolicznych. Po to, aby hormony mogły zadziałać na komór- kę, muszą mieć kontakt z błonami komór- kowymi. Nic więc dziwnego, że początek tego działu jest poświęcony strukturze i funkcjom błon. Dział VI składa się z 7 specjalnych roz- działów, w tym nowego rozdziału omawiające- go przemianę ksenobiotyków i biochemiczne aspekty niektórych chorób. W suplemencie podano zwięzłą interpretację wyników badań laboratoryjnych i główne ich implikacje diagnostyczne.
  7. 7. 8 / PRZEDMOWA Podziękowanie Autorzy czują się szczególnie usatysfakcjono- Autorzy pragną wyrazić podziękowanie Pa- wam szeroką akceptacją i poparciem książki nu Aleksandrowi Kugushewowi; wiele zmian w ca^m świecie. Przedruki licznych wydań dokonanych w tym wydaniu nie mogłoby być opublikowanych w języku angielskim ukazały zrealizowanych bez Jego stałego zainteresowa- sie w Japonii, Libanie, na Tajwanie, Filipinach nia, rady, „popychania sprawy" i zachęcania. oraz w Korei. Ponadto książkę przetłumaczono Nasza wdzięczność należy się również na- na jązy^ włoski, hiszpański, francuski, portu- szym zawodowym Kolegom i Przyjaciołom galski, japoński, polski, niemiecki, serbsko-cho- z całego świata za przekazane sugestie, mające rwacki i grecki, na celu poprawienie książki. Zachęcamy ich, aby w dalszym ciągu wykazali zainteresowanie _ RKM książką i nie szczędzili wysiłku w jej ulepszaniu. _ DKG Za szczególnie cenne uważamy opinie wyrażone _ PAM przez studentów. , ■ _ VWR
  8. 8. SPIS TREŚCI / 9 Spis treści 1. Biochemia i medycyna — Robert K. Murray ........................................................... 11 2. Biomolekuły i metody biochemiczne — Robert K. Murray .................................... 16 3. Woda i pH — Victor W. Rodwell .............................................................................. 26 Część I. Budowa oraz funkcje białek i enzymów ................................... 35 4. Aminokwasy — Victor W. Rodwell ........................................................................... 35 5. Peptydy — Victor W. Rodwell ................................................................................. 49 6. Białka: struktura i właściwości — Victor W. Rodwell ............................................ 59 7. Białka; mioglobina i hemoglobina — Vtctor W. Rodwell ...................................... 70 8. Enzymy: właściwości ogólne — Victor W. Rodwell ............................................... 82 9. Enzymy: kinetyka — Victor W. Rodwell ................................................................... 94 10. Enzymy: mechanizmy działania — Victor W. Rodwell ............................................ 110 11. Enzymy: regulacja aktywacji — Victor W. Rodwell ............................................... 118 Część II. Bioenergetyka i metabolizm węglowodanów oraz lipidó w 131 12. Bioenergetyka — Peter A. Mayes ........................................................................... 131 13. Utlenianie biologiczne — Peter A. Mayes ................................................................ 139 14._ Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące — Peter A. Mayes ............................................................................ 147 15. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes .............................. 161 16. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes ............................................ 173 17. Zarys przemian pośrednich — Peter A. Mayes ........................................................ 188 18. Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA— Peter A. Mayes ............... 198 y 19. Glikoliza i utlenianie pirogronianu —Peter A. Mayes ........................................... 207 20. Metabolizm glikogenu — Peter A. Mayes ................................................................ 217 v 21. Glukoneogeneza i kontrola stężenia glukozy we krwi — Peter A. Mayes ............ 226 22. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz — Peter A. Mayes 239 23. Biosynteza kwasów tłuszczowych — Peter A. Mayes ............................................. 251 24. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza — Peter A. Mayes ........................ 260 25. Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów — Peter A. Mayes ............................................................................................................................. 274 26. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów — Peter A. Mayes ............................. 284 27. Transport i magazynowanie lipidów — Peter A. Mayes ......................................... 294 28. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu — Peter A. Mayes ........................... 314 29. Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek — Peter A. Mayes .................................................................................................. 329 Część III. Metabolizm białek i aminokwa sów ......................................... 337 30. Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w pożywieniu — Victor W. Rodwell ......................................................................... 337 31. Katabolizm białek i azotu aminokwasów — Victor W. Rodwell ........................... 344 32. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów — Victor W. Rodwell ............. 357
  9. 9. 10 / SPIS TREŚCI 33. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty — Victor W. Rodwell . 385 34. Porfiryny i barwniki żółciowe — Robert K. Murray ............................................... 398 Część IV. Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych ................................................................... 415 35. Nukleotydy — Victor W. Rodweil ............................................................................ 415 36. Metabolizm nukleotydów purynowych i pi rym idy nowych — Victor W. RoJwell . 425 37. Struktura i funkcja kwasów nukleinowych — Dary! K. Granner .......................... 443 38. Organizacja i replika DNA — Dary/ K. Granner ........................................................ 456 39. Synteza, przekształcenie i metabolizm RNA — Dary/ K. Granner ........................ 476 40. Synteza białek i kod genetyczny — Dary/ K. Granner ............................................ 491 41. Regulacja ekspresji genu — Dary/ K. Granner ........................................................ 508 42. Technologia rekombinacji DNA — Dary/ K. Granner ............................................ 529 C zę ś ć V. Bi oc he mi a ze wną trz k o mór k owe j i we w ną tr z k o mó r k o we j k o mu ni k a c j i ........................................................... 549 43. Błony: struktura, organizacja i funkcja — Dary/ K. Granner .................................... 549 44. Charakterystyka układów hormonalnych — Dary I K. Granner ............................. 573 45. Działanie hormonów — Dary! K. Granner ................................................................ 584 46. Przysadka mózgowa i hormony podwzgórza — Dary/ K. Granner ......................... 599 47. Hormony tarczycy — Dary/ K. Granner .................................................................. 612 48. Hormony regulujące przemianę wapniową — Dary/ K. Granner ........................... 619 49. Hormony kory nadnerczy — Dary/ K. Granner ........................................................ 629 50. Hormony rdzenia nadnerczy — Dary! K. Granner .................................................. 645 51. Hormony gonadalne — Dary I K. Granner ................................................................ 652 52. Hormony trzustki i żołądkowo-jelitowe — Dary/ K. Granner ................................. 671 C z ę ś ć VI . Za ga d ni e ni a w ybr a ne ............................................................................ 693 53. Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie — Peter A. Mayes . . . 693 54. Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach — Peter A. Mayes . . 710 55. Żywienie — Peter A. Mayes ...................................................................................... 721 56. Trawienie i wchłanianie — Peter A. Mayes ............................................................. 734 57. Glikoproteiny i proteoglikany — Robert K. Murray ............................................... 749 58. Białka osocza, immunoglobitliny i czynniki krzepnięcia — Elizabeth J. Harfenist Robert K. Murray ............................................................. 770 59. Białka kurczliwe i strukturalne — Victor W. Rodwell, Robert K. Murray, Frederick W. Keetey ................................................................... 794 60. Metabolizm ksenobiotyków — Robert K. Murray ................................................. 817 61. Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe — Robert K. Murray .................................... 824 62. Biochemia a choroby — Robert K. Murray ............................................................. 842 63. Erytrocyty i leukocyty — Robert K. Murray .............................................................. 865 64. Podłoże biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych — Robert K. Murray ................................................................................................... 887 Dodatek ................................................................................................................................ 910 Skróty spotykane w biochemii ......................................................................................... 930 Skorowidz .........................................................................................................................'. 935
  10. 10. Biochemia i medycyna Robert K. Murray, MD, PhD WPROWADZENIE Biochemia jest to nauka zajmująca się różno- rodnymi molekułami i związanymi z nimi reak- cjami chemicznymi, które zachodzą w żywych komórkach i organizmach. Każda informacja wykraczająca poza skrajnie powierzchowną wiedzę o życiu — we wszystkich jego zróż- nicowanych przejawach — wymaga poznania biochemii. Co więcej, studenci medycyny, zdo- bywając solidną porcję wiedzy z zakresu bio- chemii, będą w stanie skonfrontować zarówno w praktyce, jak i w pracy badawczej 2 pod- stawowe problemy wszystkich nauk medycz- nych: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia to chemia życia Biochemię można, bardziej konwencjonalnie, zdefiniować jako naukę dotyczącą chemicznych podstaw życia (gr. bios — życie). Komórka jest strukturalną jednostką organiz- mu żywego. Rozważenie tej koncepcji prowadzi do funkcjonalnej definicji biochemii, jako nauki zajmującej się chemicznymi składnikami żywych komórek oraz reakcjami i procesami, którym one ulegają. Zgodnie z nią biochemia obejmuje przepastne obszary biologii komórki i całość biologii molekularnej. Zadaniem biochemii jest opisanie i wyjaśnienie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych zachodzących w żywych komórkach Głównym celem biochemii jest dogłębne po- znanie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych związanych z życiem ko- mórki. Aby wypełnić to zadanie, biochemicy usiłują wyizolować liczne molekuły znajdujące się w komórkach, określić ich strukturę i zanali- zować, jak funkcjonują. Przykładem takich dzia- łań są próby zrozumienia molekularnych pod- staw skurczu — procesu związanego przede wszystkim, ale nie wyłącznie, z komórkami mięśniowymi, co wymaga oczyszczenia wielu cząsteczek zarówno prostych, jak i złożonych, a następnie poddania ich szczegółowym bada- niom strukturalno-funkcjonalnym. Dzięki tym wysiłkom ustalono niektóre cechy molekular- nych podstaw skurczu mięśni. Kolejnym zadaniem biochemii jest usiłowa- nie docieczenia, jak powstało życie. Wiedza na ten fascynujący temat pozostaje nadal w powi- jakach. Zasięg biochemii jest tak niezmierzony, jak samo życie. Gdziekolwiek to życie się pojawia, tam zachodzą procesy chemiczne. Biochemicy badają je w mikroorganizmach, roślinach, owa- dach, rybach, ptakach, u niższych i wyższych ssaków oraz u ludzi. Studenci nauk biomedycz- nych będą zainteresowani zwłaszcza biochemią 2 ostatnich grup. Należy jednak docenić rów- nież biochemię mniej skomplikowanych form życia, często bezpośrednio związaną z bioche- mią człowieka. Ma przykład współczesne teorie regulacji aktywności genów i enzymów u ludzi emanują z pionierskich badań dotyczących droż- dży piekarskich i bakterii. Dziedzina rekom- binacji DNA wyłoniła się z doświadczeń na bakteriach i ich wirusach. Szybkość namnażania się (multyplikacji) i łatwość wyekstrahowania ich materiału genetycznego czynią je odpowied- nimi dla genetycznych analiz i manipulacji. Wie- dza zdobyta z badania genów wirusów od- powiedzialnych za niektóre typy raka u zwierząt (wirusowych onkogenów) zapewniła gruntowny wgląd, w jaki sposób komórki ludzkie stają się nowotworów ymi.
  11. 11. 12 / ROZDZIAŁ 1 Znajomość biochemii jest istotna dla wszystkich nauk przyrodniczych, z medycyną włącznie Biochemia kwasów nukleinowych leży w ser- cu genetyki; z kolei zastosowanie metod genety- cznych staio się kluczowe do wyjaśnienia wielu dziedzin biochemii. Fizjologia, badająca funk- cjonowanie organizmu, niemal kompletnie po- krywa się z biochemią. Immunologia posługuje się licznymi technikami biochemicznymi, a wiele podejść immunologicznych znalazło S2erokie zastosowanie w biochemii. Farmakologia i far- macja opierają się na rzetelnej znajomości bio- chemii i fizjologii, zwłaszcza że większość le- ków jest metabolizowana w reakcjach katalizo- wanych enzymatycznie, a skomplikowane in- terakcje pomiędzy lekami najlepiej zrozumieć za pomocą biochemii. Trucizny oddziałują na rea- kcje i procesy biochemiczne i to jest domeną toksykologii. Biochemiczne podejście znajduje coraz więcej zastosowania w badaniu podsta- wowych aspektów patologii (nauki o choro- bach), np. stany zapalne, uszkodzenia komórek 1nowotwory. Wiehi przedstawicieli mikrobiolo gii, zoologii i botaniki posługuje się niemal wyłącznie metodami biochemicznymi. Te po wiązania nie są zaskoczeniem, ponieważ życie, jak wiadomo, polega na reakcjach i procesach biochemicznych. Istotnie, dawne bariery mię dzy naukami przyrodniczymi padają, a bio chemia coraz bardziej staje się ich wspólnym językiem. Wzajemne oddziaływanie między biochemią a medycyną pobudza stały postęp w obu tych dziedzinach Jak wspomniano na początku tego rozdziału, 2główne problemy pracowników nauk medycz nych, a zwłaszcza lekarzy, to: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia zapisała się na trwałe w obu tych fundamentalnych zagadnieniach medycyny. Fak- tycznie wzajemne oddziaływanie biochemii i medycyny to tak, jak szeroka dwukierunkowa ulica. Analizy biochemiczne wyjaśniły wiele aspektów z dziedziny zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie różnych przejawów zdrowia i choroby otwiera coraz to nowe obszary przed biochemią. Wzajemna współpraca medycyny i biochemii ma ważne implikacje filozoficzne dla tej pierw- szej. Jak długo postępowanie lekarskie będzie mocno zakorzenione w gruntownej znajomości biochemii oraz innych pokrewnych nauk pod- stawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, żywie- nia), tak długo medycyna praktyczna będzie miała racjonalną podstawę do zastosowania coraz to nowych osiągnięć wiedzy. Kontrastuje to jaskrawo z kultem niekonwencjonalnej me- dycyny, która często opiera się na niczym więcej niż na micie, pobożnych życzeniach i braku bazy intelektualnej. PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE SĄ PODSTAWĄ ZDROWIA Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) defi- niuje zdrowie jako stan w pełni dobrego samo- poczucia fizycznego, umysłowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub zniedołęż-nienia. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie może być rozważane jako sytuacja, » której wszystkie z wielu tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrz komórkowych, zachodzących w organizmie, przebiegają z szybkością adekwatną do jego maksymalnego przetrwania wstanie fizjologicznym. Badania biochemików znajdują oddźwięk w odżywianiu i medycynie prewencyjnej Głównym warunkiem zachowania zdrowia jest pobieranie w pożywieniu optymalnej ilości związków chemicznych; głównymi z nich są witaminy, niektóre aminokwasy, pewne kwasy tłuszczowe, różne substancje mineralne i woda. Wiele zagadnień z biochemii oraz żywienia dotyczy badania różnych aspektów tych właśnie związków chemicznych, wobec czego współ- działanie obu wymienionych dyscyplin jest bar- dzo ścisłe. Ponadto, ze względu na dążenie do obniżenia rosnących kosztów opieki lekarskiej, najprawdopodobniej większy nacisk zostanie położony na systematyczne działania w celu zachowania zdrowia i zapobiegania chorobom, tj. na medycynę prewencyjną. Zatem podejście żywieniowe do przeciwdziałania np. miażdżycy tętnic i nowotworom prawdopodobnie uzyska rosnące poparcie. Zrozumienie znaczenia od- żywiania zależy jednak w rozległym zakresie od znajomości biochemii.
  12. 12. BIOCHEMIA i MEDYCYNA / 13 Każda choroba ma biochemiczne uzasadnienie Wszystkie choroby są manifestacją zaburzeń w cząsteczkach, reakcjach chemicznych i proce- sach. Główne czynniki odpowiedzialne za po- wstawanie chorób u ludzi i zwierząt są wymie- nione w tab. l-l. Wszystkie one mogą wpłynąć na jedną lub więcej zmian chorobotwórczych w reakcjach chemicznych lub molekułach or- ganizmu. Tabela 1 -1. Główne przyczyny chorób, wpływają- ce na różnorodne mechanizmy biochemiczne w ko- mórce lub organizmie* 1. Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, eks tremalne temperatury, nagle zmiany ciśnienia atmosferycznego, promieniowanie, szok elekt ryczny 2. Czynniki chemiczna i leki: pewne związki toksyczne, środki terapeutyczne itp. 3. Czynniki biologiczne: wirusy, riketsje, bak terie, grzyby, wyższe formy pasożytów 4. Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie poje mności tlenowej krwi, zatrucie enzymów ok sydacyjnych 5. Genetyczna: wrodzone, molekularne 6. Reakcje immunologiczne: anafilaksja. cho roba autoimmunologiczna 7. Zaburzania w odżyw ianiu: niedobory i nad miary 8. Zachwiania równowagi wewnątrzwy- dzielniczej: niedobory i nadmiary hormonów * Zaadaptowano za zgodą z: Robbins SL, Cot-ram RS, KumarV: The Pathologic Bas/s of D/sease, wyd. 3, Saunders, 1984. Badania biochemiczne pomagają w diagnozie, prognozie i leczeniu Istnieje bogata dokumentacja potwierdzająca zastosowanie biochemii w zapobieganiu cho- robom, diagnozie i leczeniu chorób. Wiele do- wodów na to można znaleźć w kolejnych roz- działach tej książki. Jednakże na tym etapie, w celu zilustrowania ogromu przedmiotu i zain- teresowania nim Czytelnika, wydaje się nie- zbędne podanie 7 krótkich przykładów. 1. Człowiek musi pobrać pewną liczbę złożo- nych cząsteczek organicznych, zwanych witami- nami, aby utrzymać zdrowie. Witaminy są, ogólnie rzecz biorąc, zamieniane w organizmie na bardziej kompleksowe cząsteczki (koenzy- my), które odgrywają kluczową rolę w wielu reakcjach komórkowych. Brak którejś z wita- min w pożywieniu znajduje oddźwięk w spowo- dowanej tym faktem chorobie, takiej jak gnilec lub krzywica (wynikłej odpowiednio z niedoboru witaminy C lub D). Wyjaśnienie kluczowej roli witamin, lub też ich aktywnych biologicznie pochodnych w komórkach zwierzęcych i ludz- kich jest głównym wspólnym problemem bio- chemików i dietetyków od przełomu naszego stulecia. Gdy tylko ustalono, że dana choroba jest wywoływana brakiem jakiejś witaminy, wówczas stało się racjonalne jej leczenie poda- waniem brakującej witaminy. 2. Fakt, iż wiele roślin- afrykańskich jest pozbawionych jednego lub kilku istotnych, czyli niezbędnych, aminokwasów, które muszą być dostarczone z zewnątrz w celu utrzymania zdro wia, pomógł wytłumaczyć wyniszczające nie dożywienie białkowo-energetyczne (kwashior- kor), będące chorobą tych, dta których owe rośliny stanowią główne źródło białka. Leczenie niedoboru istotnych aminokwasów jest tu roz sądną konsekwencją, ale, niestety, nie zawsze możliwą do przeprowadzenia. Polega ono na zapewnieniu wyważonej diety, zawierającej od powiednie ilości wszystkich niezbędnych ami nokwasów. 3. Grenlandzcy Eskimosi (ang. Inuit) spoży wają duże ilości oleju rybnego bogatego w nie które wiełoRienasycone kwasy tłuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids; skrót — PUFA). Badania wykazały, że odznaczają się oni małym stężeniem cholesterolu w osoczu i rzadką za chorowalnością na miażdżycę tętnic. Te obser wacje wywołały żywe zainteresowanie możliwo ścią stosowania PUFA w celu zmniejszenia stężenia cholesterolu. Zarówno choroby wywołane brakiem wita- min, jak i te spowodowane niedoborem istot- nych aminokwasów, to przykłady zaburzeń odżywiania (p. tab. 1-1). Miażdżyca tętnic może być uważana za przykład zaburzenia spowo- dowanego nieprawidłowym odżywianiem, ale wiążą się z nią także inne, np. genetyczne, czynniki. 4. Stan znany jako fenyloketonuria (ang. phenylketonuria; skrót — PKU) nie leczony prowadzi do ciężkich zaburzeń umysłowych już w dzieciństwie. Podstawa biochemiczna PKU jest znana od ponad 30. lat. Jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie (tab. 1-1), spowo-
  13. 13. 14 / ROZDZIALI dowane brakiem lub małą aktywnością enzy- mu, który przekształca fenyloalaninę w tyrozy- nę. W konsekwencji niedoboru enzymu, fenylo-alanina i niektóre jej metabolity, takie jak fenyloketony, gromadzą się w tkankach i niszczą rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy. Odkąd udowodniono naturę biochemicznego zaburzenia w PKU, kolejnym logicznym krokiem stało się leczenie dzieci z fenyloketonu-rią dietą o małej zawartości fenyloalaniny. Gdy tylko masowe testy biochemiczne na rozpoznanie PKU zaraz po urodzeniu okazały się możliwe do przeprowadzenia, wówczas stało się realne skuteczne leczenie tej wady metabolicznej. 5. Mukowiscydoza (łac. fibrosis cystica) jest to znana choroba gruczołów wydzielania ze wnętrznego i gruczołów potowych, uwarunko wana genetycznie (p. tab. 1-1), Charakteryzuje ją nienaturalnie lepka wydzielina, która zatyka przewody wydzielnicze trzustki i oskrzeliki. Chorzy na mukowiscydozę mają także zwięk szone ilości chlorków w pocie. Ofiary tej choro by często umierają w młodym wieku na zakaże nie płuc. Bardzo niedawno (1989 r.) wyizolowa no i zsekwencjonowano gen związany z tą chorobą. Prawidłowy gen koduje łańcuch 1480 aminokwasów białka transbłonowego, które wydaje się być kanałem dla chlorków lub, prawdopodobnie, jakimś regulatorem takiego kanału. Nieprawidłowością u prawie 70% cho rych na mukowiscydozę wydaje się być delecja 3 nukleotydów w DNA, co powoduje brak w tym transmembranowym białku aminokwasu w pozycji 508, tj. reszty fenyloalaniny. W ja ki sposób ta delecja uszkadza czynność owego transbłonowego białka i powoduje gęs ty śluz, czeka Jeszcze na opracowanie. To ważne zadanie powinno Ułatwić odnalezie nie nośników genu fibrosis cystica i spowo dować racj onalniej sze leczenie niż obecne. Prawdopodobnie możliwe byłoby przygoto wanie leku, który korygowałby zaburzenie w białku transbłonowym, a także nie jest wy kluczone, że można by wprowadzać prawid łowy gen do komórek płuc w wyniku leczenia genetycznego. 6. Analiza mechanizmu działania toksyny bakteryjnej, powodującej cholerę, dostarczyła ważnego czynnika do zrozumienia przyczyny klinicznych objawów tej choroby (obfita bie gunka, utrata elektrolitów i wody z organizmu). 7. Odkrycie, iż komary przenoszące zarodźce (plazmodia) powodujące zimnicę są w stanie wytworzyć w sobie barierę ochronną o podłożu biochemicznym na działanie środków owado- bójczych, ma ważne implikacje w próbach wye- liminowania tej choroby. Ten przykład i po- przednie reprezentują choroby powodowane przez czynniki biologiczne (p, tab. 1-1), Wiele analiz biochemicznych naświetla mechanizmy chorób, które z kolei inspirują badania w określonych działach biochemii Wstępne obserwacje, poczynione w począt- kach naszego stulecia przez angielskiego lekarza Archibalda Garroda na małej grupie wrodzo- nych wad metabolicznych, wzbudziły poszuki- wanie biochemicznych przyczyn tego stanu. Badania dotyczące genezy przyczyn choroby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako hiper-cholesterolemia rodzinna, będącej przyczyną zaawansowanej miażdżycy tętnic w młodym wieku, umożliwiły radykalny postęp w dziedzinie receptorów komórkowych i mechanizmów przyswajania cholesterolu przez komórki. Prace z zakresu onkogenów w komórkach rakowych zwróciły uwagę na mechanizmy molekularne związane z kontrolowaniem prawidłowego wzrostu komórkowego. Te i wiele innych przykładów ilustruje, jak obserwacje poczynione w klinice mogą otworzyć szerokie obszary funk- cjonowania komórek dla badań biochemicz- nych. TA KSIĄŻKA POMOŻE POWIĄZAĆ WIEDZĘ Z ZAKRESU BIOCHEMII Z PROBLEMAMI KLINICZNYMI Końcowy rozdział podsumowuje wiele kon- cepcji, pojawiających się w tekście, dotyczących powiązania biochemii z patologią. Przykładami są tutaj także mechanizmy biochemiczne działa- jące w poszczególnych chorobach, które powo- duje każda z 8 przyczyn wymienionych w tab. 1-1. W suplemencie omówiono również pod- stawowe rozważania stosowane podczas inter- pretacji wyników biochemicznych testów labo- ratoryjnych wykonywanych rutynowo w prak- tyce klinicznej. Głównym celem tych starań jest pomoc i zachęta dla Czytelnika, aby umiał przetransponować wiedzę z zakresu biochemii w swoją działalność kliniczną. Wykorzystanie badań biochemicznych w od- niesieniu do chorób można podsumować w 5 punktach.
  14. 14. BIOCHEMIA I MEDYCYNA / 16 Takie badania mogą: 1) odkryć przyczyny choroby, 2) zaproponować racjonalne i skuteczne jej leczenie, 3) umożliwić masowe testy do wczesnej diag nozy, 4) ułatwić monitorowanie postępówchoroby, 5) ułatwić ocenę skutku leczniczego. Suplement do tej książki opisuje najważniej- sze rutynowe biochemiczne testy diagnostyczne, używane do wykrywania chorób (tzn. do celów określonych w pkt. 3, 4 i 5). Posłuży on za pożyteczne źródło informacji przy omawianiu biochemicznej diagnostyki chorób (np. zawału serca, ostrego zapalenia trzustki).
  15. 15. 2 Biomolekuły i metody biochemiczne Robert K. Murray, MD, PhD WPROWADZENIE Celem niniejszego rozdziału jest przedstawie- nie 5 zagadnień istotnych dla zrozumienia bio- chemii oraz wskazania głównych kierunków pomagających w przyswojeniu wiedzy niniej- szego podręcznika. Omówiono więc zwięźle kolejno: 1. Skład chemiczny organizmu i podstawowe klasy cząsteczek w nim występujących. 2. Budowę struktur komórkowych i sposobu ich wydzielania. 3. Wagę rozwiązań doświadczalnych i właś ciwego dobom metod stosowanych w biochemii. 4. Główne osiągnięcia w biochemii oraz 5. Słabo rozwinięte działy biochemii dotyczą ce m.in. rozwoju, różnicowania, funkcji mózgu, nowotworów i innych chorób człowieka. Wobec powyższego być może staną się one dla niektórych Czytelników motorem przyszłe- go ich udziału w badaniach nad tymi pro- blemami. ORGANIZM LUDZKI SKŁADA SIĘ Z KILKU PIERWIASTKÓW, KTÓRE TWORZĄ RÓŻNE CZĄSTECZKI Główne pierwiastki to: węgiel (C), wodór <H), tten (O) i azot (N) Skład chemiczny organizmu ludzkiego został poznany, a podstawowe jego składniki przed- stawiono w tab. 2-1. Węgiel, tlen, wodór i azot stanowią główne składniki większości biomole-kuł. Fosfor jest składnikiem kwasów nukleinowych i innych związków, a w fprmie zjonizowa-nej jest również szeroko rozprzestrzeniony w organizmie człowieka. Wapń odgrywa kluczową rolę w licznych procesach biologicznych i znaj- duje się w centrum wielu aktualnie prowadzo- nych badań. Pierwiastki wyszczególnione w ko- lumnie 3. tab. 2-1 pełnią różnorakie funkcje. Większość z nich spotyka się w codziennej praktyce lekarskiej u chorych z zaburzeniami równowagi elektrolitowej (K.+, Na+ , Cl" i Mga+ ), niedokrwist ością spowodowaną nie- doborem żelaza (Fe2+ ) lub chorobami tarczycy (I"). Tabela 2-1. Przybliżony skład chemiczny organiz- mu ludzkiego (w przeliczeniu na suchą masę)* Pierwiastek Procent Pierwiastek Procent Węgiel 50 Potas 1 Tlen 20 Siarka 0,8 Wodór 10 Sód 0,4 Azot 8,5 Chlor 0,4 Wapń 4 Magnez 0,1 Fosfor 2,5 Żelazo 0,01 Mangan 0.001 Jod 0,00006 * Cytowane za zgodą z: West ES, Todd WR: Textbook of Biochemistry, 3 wyd., Macmillan, 1961. Główne biopołinrtery to DNA, RNA, białka, polisacharydy i złożone lipidy Jak przedstawiono w tab. 2-2, główne zespoły biocząsteczek w komórkach i tkankach wy- ższych zwierząt (włączając człowieka) to: DNA, RNA, białka, polisacharydy i lipidy. Te złożone cząsteczki są zbudowane z prostych cząsteczek, które także wymieniono w tab. 2-2. Cegiełki
  16. 16. BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 17 budulcowe DNA i RNA (ogólnie znane jako kwasy nukleinowe) to odpowiednio deoksyry-bonukleotydy i rybonukleotydy, natomiast budujące białka to aminokwasy. Polisacharydy są zbudowane z prostych węglowodanów: w przypadku gfikogenu (głównego polisacharydu występującego w tkankach ludzkich) cegiełką budulcową jest glukoza. Kwasy tłuszczowe mogą być uważane za jednostki budulcowe lipidów, chociaż lipidy nie są polimerami kwasów tłuszczowych. DNA, RNA, białka i polisacharydy zalicza się do hiopolimerów, ponieważ składają się z powtarzających się cegiełek budulcowych (monomerów). Te złożone cząsteczki stanowią istotne „tworzywo życia". Większość przed- stawionego tekstu będzie wiec związana z opi- sem różnych biochemicznych właściwości tych biopolimerów i monomerów. Takie same złożo- ne cząsteczki znaleziono również wśród niż- szych organizmów, chociaż cegiełki budulcowe w niektórych przypadkach mogą się różnić od tych przedstawionych w tab. 2-2, np. bakterie nie mają glikogenu i triacylogliceroli, ale mają one inne poiisacharydy i lipidy. Białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne stanowią główne komponenty organizmu ludzkiego Skład chemiczny organizmu ludzkiego przed- stawiono w tab. 2-3. Główne jego komponenty to: białka, tłuszcze, węglowodany, woda i skład- niki mineralne. Woda stanowi główny składnik, choć jej ilość waha się w szerokim zakresie wśród różnych tkanek. Polarny charakter i zdol- ność tworzenia wiązań wodorowych czynią wo- dę idealnym rozpuszczalnikiem w organizmie. Szczegółowe znaczenie właściwości wody zo- stanie przedstawione w rozdz. 3. Tabela 2-3. Prawidłowy skład chemiczny człowie- ka o masie ciała 65 kg* Kilogramy Procent Białka 11 17,0 Tłuszcze 9 13,8 Węglowodany 1 1,5 Woda** 40 61,6 Składniki mineralne 4 6,1 Tabela 2-2. Główne złożone biomolekuły organi- czne komórek i tkanek. Kwasy nukleinowe, białka i polisacharydy są biopolimerami zbudowanymi z poniżej przedstawionych jednostek budulco- wych. Lipidów ogólnie nie zalicza się do bio- polimerów i nie wszystkie lipidy zawierają kwasy tłuszczowe jako jednostki budulcowe Blomolekula Jednostka budulcowa Podstawowe funkcje DNA Deoksyry bo- Materiał genetyczny nukleotyd RNA Rybonukle- Matryca w biosyntezie otyd białek Białko Aminokwasy Różnorodność pełnio- nych funkcji w komór- kach (np, enzymy, ele- menty kurczliwe) Polisacha- Glukoza Krótkotrwałe magazy- rydy nowanie energii w po- (glikogen) staci glukozy Lipidy Kwasy tłu- Różnorodne, np. skła- szczowe dniki błon komórko- wych, długotrwałe magazynowanie ener- gii w postaci triacylo- gliceroli 2 Biochemia ■ * Cytowane za zgodą z: Davidson SD, Pas-smore R, Brock JF: Human Nutrition and Dietetics, wyd. 5, Churchill Livingstone, 1973. ** Zawartość wody może różnić się między różnymi tkankami, występując w małej ilości (22,5%) w kościach bezszpikowych, Zawartość procentowa wody wykazuje tendencje zmniejsza- nia, gdy zwiększa się odsetek lipidów w organizmie. KOMÓRKA PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ ŻYCIA W XIX w. w badaniach Schleidena i Schwan-na oraz innych pionierów, takich jak Virchow uznano komórkę za podstawową jednostkę aktywności biologicznej. Jednakże dopiero bezpośrednio po II wojnie światowej 3 wydarzenia zapoczątkowały okres nierównomiernego rozwoju w biochemii i biologii komórki. Były to: 1) zwiększająca się dostępność mikroskopu elektronowego, 2) wprowadzenie metod pozwalających rozbijać komórki, w warunkach względnie łagodnych, zapewniających ich funkcje, oraz 3) zwiększająca się dostępność wysokoobrotowej ultra wirówki z chłodzeniem, zapewniającej wy- tworzenie siły odśrodkowej wystarczającej do
  17. 17. 18 / ROZDZIAŁ 2 rozdzielenia rozbitych komórek, bez ich prze- grzewania. Zastosowanie mikroskopu elektro- nowego ujawniło wiele nie znanych wcześniej lub słabo widocznych składników komórko- wych, których rozbicie i ultrawirowanie po- zwoliło na ich wydzielenie i analizę in vitro, Hepatocyt szczura — modelowa komórka eukariotyczna Schemat strukturalny komórki wątroby {he-patocytu) szczura przedstawiono na ryc. 2-1. Hepatocyt jest prawdopodobnie najczęściej badaną komórką ze wszystkich komÓTek pod względem biochemicznym, częściowo z powodu łatwej jej dostępności w stosunkowo dużych ilościach odpowiednich do frakcjonowania i ba- dania różnorodności jej funkcji. Hepatocyt za- wiera główne organelle występujące w komór- kach eukariotycznych (tab. 2-4). Są to: jądro komórkowe, mitochondria, siateczka śródplaz-matyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego, lizosomy, peroksysomy, błona komórkowa i niektóre elementy cyt o szkieletu. Do rozbicia komórek i wydzielania organelli i wewnątrzkomórkowych cząsteczek stosuje się techniki fizyczne W celu zbadania funkcji dowolnej organelli należy, w pierwszej kolejności, wydzielić ją we względnie czystej formie, wolnej od większych zanieczyszczeń innymi elementami struktural- nymi komórki. Utarty sposób, który pozwala to osiągnąć, nazywa się frakcjonowaniem subko-mórkowym i ogólnie wymaga 3 operacji, tj. ekstrakcji, homogenizacji i wirowania. Większość pionierskich badań w tym zakresie wykonano wykorzystując wątrobę szczura. Ekstrakcja. Pierwszy etap w kierunku izo- lowania określonej organelli (czy cząsteczek) stanowi jej ekstrakcja z komórek, w których się znajduje. W większości organelle i biomolekuły są nietrwałe i tracą biologiczną aktywność; mu- szą więc być ekslrahowane w warunkach łagod- nych (np. stosowanie roztworów wodnych i po- zbawionych ekstremalnych wartości pH, ciś- nienia osmotycznego i wysokich temperatur). Rzeczywiście, większość metod izolowania or- ganelli wykorzystuje temp. 0 — 4°C (tj. w chło- dni lub utrzymywanie badanego materiału w pojemnikach z lodem). Znaczna utrata ak- tywności może mieć miejsce w temperaturze pokojowej, częściowo wskutek działania róż- nych enzymów trawiennych (proteaz, mikleaz, itd.), uwolnionych podczas rozbijania komó- Cytozol Ryc. 2-1. Schemat komórki wątroby szczura z jej głównymi organellami. rek. Ogólnie stosowany roztwór do ekstrakcji organelli komórkowych zawiera 0,25 mol/l sa- charozy (izotonicznej), doprowadzonej do pH 7,4 za pomocą 0,05 mol/l buforu Tris (trishyd-roksymetyloaminometan) — kwas solny i jony K+ i Mg2+ o stężeniu zbliżonym do wartości fizjologicznych; ten roztwór jest nazywany umownie STKM. Nie wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji są tak łagodne jak STKM; np. rozpuszczalniki organiczne wykorzystywane do ekstrakcji lipidów i kwasów nukleinowych. Homogenizacja. Aby wyekstrahować or- ganelle (lub biocząsteczkę) z komórek, najpierw należy rozbić komórki w łagodnych warun- kach. Narządy (np. wątroba, nerka, mózg) i zawarte w nich komórki mogą być rozbite w sposób standardowy przez homogenizację, podczas której napędzany ręcznie lub mechani- 3 i steczka Srńdplazmatyczna Rybosom Aparat Golgiego Błona cytoplazmatyczna Lizosom
  18. 18. BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 19 Tabeła 2-4. Główne organelle wewnątrzkomórkowe i ich czynnością W zestawieniu podano tylko podstawowe funkcje związane z każdą z tych struktur. W wielu przypadkach w organellach może przebiegać kilka szlaków metabolicznych, procesów czy reakcji Organella lub frakcja* Znacznik (Marker) Główne czynności Jądro komórkowe DNA Miejsce chromosomów Miejsce syntezy RNA zależnej od DNA (transkrypcja) Mitochondrium Dehydrogenaza bursztynianowa Cykl kwasu cytrynowego, oksydacyjna fosforyiacja Rybosom* Duża zawartość RNA Miejsce biosyntezy białek (translacja mRNA w biatka) Siateczka śród-piazmatyczn a GI u kozo - 6 -fosfataza Rybosomy związane z błonami są głównym miejscem biosyntezy białek Biosynteza różnych lipidów Utlenianie wielu ksenobiotyków (cytochrom P-450) Uzosom Fosfataza kwaśna Miejsce licznych hydrolaz (enzymów katalizujących rea- kcje degradacyjne) Błona cytoplaz-matyczn a Na+ /K + -ATPaza, 5'-nukleotydaza Transport cząsteczek do i z komórek Wewnątrzkomórkowa adhezja i wymiana Aparat Golgiego Galaktozylo-tr ansferaza Wewnątrzkomórkowy rozdział białek Reakcje glikozylacji Reakcje powstawania siarczanów Peroksysom Katalaza Oksydaza moczanowa Degradacja niektórych kwasów tłuszczowych Wytwarzanie i degradacja nadtlenku wodoru Cytoszkielet* Brak swoistych znaczników** Mikrof i lamenty, mikrotubule; filamenty pośrednie Cytozol* Dehydrogenaza mlecza nowa Enzymy glikoltzy, syntezy kwasów tłuszczowych * Orga nel la sta nowi wewnątrzkomórkową substrukturę otoczoną btoną i wydzieloną pr zez wirowanie przy dużej sile odśrodkowej. W związku z powyższym rybosomy, cytoszkielet i cytozol nie są organellami. Zamieszczono je w tabeli ze względu na ich izolowanie przez wirowanie różnicowe. Mogą być rozpatrywane jako struktury wewnątrzkomórkowe lub frakcje. Organeile izolowane w toku pojedynczego cyklu wirowania różnicowego nie są czyste. W celu uzyskania czystych frakcji jest wymagane wielokrotne powtórzenie cyklu oczyszczania, ** Frakcje cytokszkieletowe mogą być ocenione za pomocą mikroskopii elektronowej lub przez analizę elektroforetyczną charakterystycznych dla nich białek. cznie ttok obraca się w szklanej probówces odpowiednich rozmiarów, zawierającej pocięte kawałki narządu we właściwym środowisku, takim jak STKM. Kontrolowane obroty tłoka powodują cięcie i rozbijanie komórek, uwal- niając ich składniki do roztworu sacharozy. Otrzymana zawiesina, zawierająca wiele nie naruszonych organelli, nazywa się homogena-łem. Wirowanie. Frakcjonowanie składników homogenatu przez wirowanie różnicowe jest techniką o kluczowym znaczeniu w biochemii, W klasycznej metodzie stosuje się serię 3 od-wirowań przy stopniowo zwiększających się szybkościach (ryc. 2-2), z których każde dostar- cza osadu i supernatantu. Supernatant na każ- dym etapie poddaje się odwirowaniu. Takie postępowanie pozwala otrzymać 3-krotnie osad, nazywany odpowiednio frakcją jądrową, mitochondrialną i mikrosomalną. Żadna z tak uzyskanych frakcji nie reprezentuje w pełni czystych organelli. Jednakże, na podstawie ba- dań w mikroskopie elektronowym oraz analizy aktywności odpowiednich enzymów — znacz- ników (ang, markerów) i składników chemicz- nych (np. DNA i RNA), stwierdzono, że głów- nymi elementami opisywanych 3 frakcji są odpowiednio: jądra komórkowe, mitochondria i mikrosomy. Znacznikowy enzym lub składnik chemiczny jest jednym z parametrów prawie
  19. 19. 20 / ROZDZIAŁ 2 • i . ■:-:-: -i p 600 g x 10 min. ,Homogenat , Supernatant (1) 15,000 g x 5 min Frakcja Jądrowa 105,000 g x 60 min Supernatant (31 Ryc. 2-2. Schemat rozdziału frakcji wewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania różnicowego. Zhomogenizowaną tkankę (np. wątrobę) początkowo poddaje się wirowaniu przy małej sile odśrodkowej, która dostarcza frakcji jądrowej {zawierającej jądra komórkowe i nienaruszone komórki) oraz supernatantu (1). Supernatant (1) dekantujesię i poddaje wirowaniu przy średniej sile odśrodkowej, które prowadzi do otrzymania frakcji mitochondrialnej {zawierającej mitochondria, lizosomy i peroksysomy) i supernatantu (2). Supernatant ten poddaje się dekantacji oraz wirowaniu przy dużej sile odśrodkowej. Osad z tego wirowania stanowi frakcję mikrosomainą (zawierającą mieszaninę wolnych rybosomów oraz gładką i szorstką siateczkę śród plaż maty czną) i końcowy, klarowny płyn — supernatant {3). Ten ostatni odpowiada cytozolowi, czyli sokowi komórkowemu. Różne modyfikacje tego podstawowego schematu wirowania różnicowego umożliwiają izolację każdej organelli komórkowej we względnie czystym stanie. wyłącznego występowania w określonej orga- nelli, np. fosfataza kwaśna — w lizosomach, DNA — w jądrze komórkowym (tab. 2-4). W ten sposób znacznik może stanowić wskaźnik obecności lub braku w poszczególnej frakcji organelli, w których on występuje. Frakcja mikrosomalna (mikrosomy) zawiera głównie mieszaninę gładkiej i szorstkiej (siateczka śród-plazmatyczna z połączonymi z nią rybosomami) siateczki śródplazmatycznej oraz wolnych rybosomów. Zawartość ostatniego supernatantu odpowiada rozpuszczalnej frakcji cytopiazmy (cy-tozoł). Modyfikacja tej podstawowej metody wirowania różnicowego przez stosowanie odmiennych środowisk do homogenizacji tkanek, różnych technik wirowania (np. ciągły lub skokowy gradient stężenia sacharozy) pozwala wydzielić lepiej lub gorzej oczyszczone postacie wszystkich organelli komórkowych przedstawionych na ryc. 2-1 i wymienionych w tab. 2-4. Opisany powyżej schemat frakcjonowania może znaleźć zastosowanie, w ogólnym zarysie, do większości narządów i komórek. Jednak frakcjonowanie komórek tym sposrobem musi być ocenione przez analizę w mikroskopie elektronowym w celu standaryzacji metody. Nie należy przeceniać znaczenia badań frakcjonowania struktur komórkowych w rozwoju biochemii i biologii komórki. Stanowi ono jedno z waż- niejszych rozwiązań doświadczalnych (patrz ni- żej) i głównie dzięki jego wykorzystaniu wyjaś- niono funkcje organelli, przedstawionych w tab. 2-4. Informacje o funkcjach poszczególnych organelli, przedstawione w tej tabeli, stanowią główne osiągnięcia badań biochemicznych (patrz niżej). Rozwiązanie doświadczalne obejmuje 3 etapy Rozwiązanie doświadczalne stosowane w biochemii obejmuje 3 główne etapy: 1) izo- lowanie biomolekul i organelli (p. powyżej: Wi- rowanie), 2) określenie struktury biomolekuł oraz 3) analizy, z wykorzystaniem różnych pre- paratów, funkcji i metabolizmu biomolekuł (tj. syntezy i degradacji). Izolowanie biomolekuł Wyjaśnienie funkcji biomolekuł, podobnie jak w przypadku organelli, wymaga przede wszystkim wydzielenia ich w czystej postaci. W tabeli 2-5 przedstawiono główne metody Supernatan t ( 2) Frakcja mllochondfialna , Frakcja ml kro BO matna
  20. 20. BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 21 wykorzystywane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. W tym podrozdziale nie podano szczegółów metodycznych, niektóre z nich zo- staną krótko opisane w różnych miejscach tego podręcznika. Połączenie kilku metod jest pra- wie zawsze nieodzowne w oczyszczaniu bio- molekuł do stanu jednorodności (wolnych od zanieczyszczeń innymi biomolekułami). Należy podkreślić, że postępy biochemii są uwarun- kowane rozwojem nowych metod analizy, oczy- szczania i badania struktury. Na przykład bio- chemię lipidów zrewolucjonizowało wprowa- dzenie chromatografii ciecz owo-gazowej i chro- matografii cienkowarstwowej. Analiza błon bio- logicznych i wielu białek przysparzała ogrom- nych trudności, aż do chwili wprowadzenia elektroforezy w żelu poliakryloamidowym zawie- rającym SDS (SDS-PAGE). Wprowadzenie de- tergentu — siarczanu dodecylu sodu (SDS) — pozwala „rozpuścić" wiele białek do analizy elektroforetycznej, które przedtem uchodziły Tabela 2-5. Główne metody stosowane do roz- działu i oczyszczania biomolekuł. Większość z nich jest użyteczna do analizy składników obecnych w ekstraktach komórkowych i innym materiale biologicznym. Połączenie kilku technik pozwala oczyścić większość biomolekuł. Zaleca się Czytel- nikowi podręczniki przedstawiające szczegółowe opracowania metod wykorzystywanych w bada- niach biochemicznych Frakcjonowanie za pomocą soli (np. wytrąca- nie siarczanem amonu) Chromatografia Bibułowa Jonowymienna (wymieniacze anionowe i kationo- we) Powinowactwa Cienkowarstwowa Cieczowo-gazowa Cieczowa wysokociśnieniowa Filtracja żelowa Elekt roto re za Bibułowa Wysokonapięciowa Na agarozie Na octanie celulozy W żelu skrobiowym W żelu poliakryloamidowym W żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS U Itra w i rowan i e raczej za nierozpuszczalne. Rozwój metod sek-wencjonowama i klonowania DNA dokonał przewrotu w badaniach kwasów nukleinowych i biologii w ogóle. Określanie struktury biomolekuł Kiedy biocząsteczki zostaną oczyszczone, wtedy należy określić ich strukturę. Pozwoli to na szczegółowe znalezienie zależności między ich budową a Funkcją. Główne metody, wyko- rzystywane w analizie budowy biomolekuł, przedstawiono w tab. 2-6. Są one znane Czytel- nikowi, który ma pewien zakres wiedzy z chemii organicznej. Znana swoistość niektórych en- zymów czyni je bardzo użytecznymi narzędzia- mi w wyjaśnieniu właściwości strukturalnych pewnych biomolekuł. Udoskonalenia w ich roz- dzielaniu dokonano dzięki postępowi teoretycz- nemu i technologicznemu, w wyniku wprowa- dzenia spektrometrii masowej i spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), które stały się metodami z wyboru do oznacza- nia budowy. Na przykład budowa bardzo zło- żonych łańcuchów węglowodanowych, wykryta w niektórych biomolekulach, takich jak gliko-proteiny, obecnie często może być wyjaśniona dzięki spektroskopii wysokorozdzielczej NMR. Najbardziej wnikliwej informacji o budowie biomolekui dostarcza dyfrakcja promieniami X i krystalografia. Zastosowanie ich było prze- łomem w wyjaśnieniu szczegółów budowy róż- nych białek i enzymów oraz natury podwójnego heliksuDNA. Tabela 2-6. Główne metody stosowane w okreś- leniu struktur biomolekuł Analiza elementarna Spektrofotometria w świetle nadfioletowym i wi- dzialnym Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia jąd- rowego rezonansu magnetycznego Zastosowanie kwasowej lub zasadowej hydrolizy do degradacji btomolekufy w badaniu jej pod- stawowych składników Zastosowanie enzymów swoiście degradujących biomolekuły (np. proteazy, nukleazy, glikozydazy) Spektrometria masowa L Metody swoistego sekwencjonowania {np. białek, kwasów nukleinowych) Krystalografia rentgenowska
  21. 21. 22 / ROZDZIAŁ 2 Analiza czynności i metabolizmu biomolekuł Początkowe badania biochemiczne człowieka i zwierząt wykonywano na poziomie „całego organizmu". Przykładem były badania oddy- chania i śledzenie losu trawionych związków. Wkrótce stało się jasne, że cały organizm jest zbyt złożonym obiektem, aby można było uzys- kać ostateczne odpowiedzi na wiek postawio- nych pytań. Rozpoczęto zatem rozwijać pro- stsze postępowania in vitro, które usuwały wiele komplikacji powstających w doświadczeniach na całym organizmie. W tabeli 2-7 podsumowa- no różne typy postępowania preparatywnego, dostępne obecnie w badaniach procesów bio- chemicznych; większość danych przedstawio- nych w tym podręczniku otrzymano przez ich zastosowanie. Wykaz metod przedstawiono w zmniejszającym się porządku stopnia ich złożoności. Zarówno wykorzystanie badań na poziomie całego organizmu, jak i inne metody postępowania mają swoje ograniczenia. Przy- Tabela 2-7. Kolejność postępowania w badaniu procesów biochemicznych Poziom badań (metoda) Uwagi Organizm zwierzęcy Wyizolowany, perfundowany narząd Skrawki tkankowe Komórki Homogenat Wydzielone organelte komórkowe Pod Struktury organelli komórkowych Izolowanie i charakterystyka metabolitów i enzymów Klonowanie genów kodu- jących enzymy i białka Badania mogą obejmować: 1) usunięcie narządu (np. hepatektomia) 2) zmiany w diecie (np. głodzenie) 3) podawanie leków (np. fenobarbital) 4) podawanie toksyn (np. tetrachlorek węgla) 5) wykorzystanie zwierząt z określoną chorobą {np. cukrzyca) 6) stosowanie wyrafinowanych technik, jak spektroskopia NMR i to mografia emisji pozytronowej Badania na tym poziomie są często fizjologiczne, ale ich interpretacja może być utrudniona przez wpływ na narządy układu krążenia i układu nerwowego Szczególnie użyteczne narządy: wątroba, serce i nerka. Takie podejście pozwala badać narząd poza wpływem innych narządów lub układu nerwowego. Zastosowanie perfuzji zapewnia, że czynności narządu są podtrzymywane przez kilka godzin Często używa się skrawków wątroby. Skrawki narządu, odizolowane od innych wpływów; preparaty takie wykazują jednakże tendencję do degradacji w ciągu niewielu godzin, częściowo, z powodu niedo- statecznego odżywienia 1. Szczególnie przydatne dla komórek krwi, które można stosunkowo łatwo oczyścić 2. Stosowanie komórek w kulturach tkankowych jest niezbędne w wielu dziedzinach biologii 1. Zapewnia preparatykę w układach bezkomórkowych 2. Możliwość dodawania lub usuwania określonych składników (np, przez dializę) i analiza ich wpływu 3. Możliwość frakcjonowania przez wirowanie indywidualnych orga nelli komórkowych Szeroko stosowane w badaniach czynności mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej, rybosomów, itp. Szeroko wykorzystywane, np. w badaniach czynności podstruktur mitochondriów Istotna część analizy reakcji chemicznych lub szlaków metabolicznych Izolowanie sklonowanych genów jest istotne dla badań ich budowy i regulacji, może stanowić podstawę w określaniu sekwencji amino-kwasowych kodowanych przez nie enzymów lub białek
  22. 22. BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 23 czyną fałszywych wyników (artefaktów) do- świadczeń in ntro może być np. homogenizacja komórek, uwalniająca enzymy, które mogą częściowo trawić składniki komórkowe. STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZŁOŻONE I WIELOPOZIOMOWE Niniejsza książka w większości będzie doty- czyła złożonych procesów biochemicznych (np. biosyntezy białka, skurczu mięśnia), łącznie ze szlakami metabolicznymi. Szlak metaboliczny stanowi serie reakcji odpowiedzialnych za bio- syntezę bardziej złożonego związku, zbudowa- nego z jednego lub wielu prostych związków, czy za degradację związku do jego końcowych produktów. O istnieniu złożonego procesu bio- chemicznego można wnioskować na podstawie obserwacji poczynionych na poziomie całego organizmu, np. obserwując człowieka można stwierdzić, że mięśnie szkieletowe się kurczą. Wiemy, że glukoza służy jako źródło energii dla ludzi i innych organizmów zwierzęcych, a zatem można wnioskować, że musi ona być degrado- wana (metaboiizowana) w organizmie w celu uzyskania energii. Jednakże, aby zrozumieć w pełni przebieg tego procesu w komórkach ludzkich, a wiedza nasza o tym jest wciąż niekompletna, należy przeprowadzić analizy na różnych poziomach. Na rycinie 2-3 przedsta- wiono schematycznie różne typy obserwacji i analiz, które są nieodzowne w celu zrozumienia procesów biochemicznych, takich jak rozkład glukozy w celu uzyskania energii (proces znany jako gjikoli/a). Schemat ten stosuje się do podstawowego poziomu wszystkich głównych procesów biochemicznych omawianych w ni- niejszej książce i przedstawienia ogólnej strate- gii w ich wyjaśnianiu. Powinien on się przypo- minać wtedy, kiedy każdy z opisywanych głów- nych procesów biochemicznych (np. glikoliza, utlenianie kwasów tłuszczowych) będzie rozpat- rywany, chociaż nie zawsze punkt wyszczegól- niony na rycinie będzie z nim związany. Wiele ważnych punktów, przedstawionych w tabeli 2-7 i na ryc. 2-3, zasługuje na dyskusję. Wnioskowania o obecności procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego na poziomie całego organizmu zwierzęcego Badanie mechanizmów jago kontroli in vtvo ł Badanie wpływu swoistych chorób (np. wrodzone bloki metaboliczne, nowotwór itp,) na Jego przebieg Umiejscowienie procesu w Jednym (lub więcej) narząd z ie(ach) Umiejscowienie procesu w Jednej (lub więcej) organem czy frakcji komórkowej Przedstawienie reakcji zaangażowanych w jego przebieg t Oczyszczanie uczestniczących w nim Indywidualnych substratOw, produktów, enzymów, koenzymów I innych składników t Badanie mechanizmów Jego kontroli In vttro t Ustalenie mechanizmów reakcji zaangażowanych w Jego przebieg Ftekonstytucja przebiegu procesu (szlaku) ł Badanie procesu na poziomie genu za pomocą rekombinacji DNA Ryc. 2-3. Schemat ogólnego postępowania w analizie procesu biochemicznego lub szlaku metaboliczne go. Wyszczególnione etapy nie muszą być stosowane dokładnie w wymienionej kolejności. Wykorzystanie ich prowadzi zwykle do wyjaśnienia szczegółów procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Schemat ten znajduje zastosowanie we wszystkich głównych szlakach metabolicznych przedstawionych w następnych rozdziałach niniejszej książki.
  23. 23. 24 / ROZDZIAŁ 2 1. Aby. zrozumieć proces biochemiczny na po- ziomie molekularnym, pomimo możliwości po- jawienia się artefaktów, nieodzowne jest wyizo- lowanie i identyfikacja każdego z jego skład- ników w czystej postaci. Liczne przykłady tego będą spotykane później. 2. Istotna jest także możliwość rekonstytucji procesu w warunkach in vitro przez systematyczną jego odbudowe z indywidualnych składników. Jeżeli po rekon- stytucji z jego składników proces nie przebiega, oznacza to, że pewien krytyczny składnik został utracony i nie został wprowadzony do układu. 3. Ostatnie zdobycze technologiczne (np. spekt- roskopia NMR i tomografia emisji pozytrono-wej; ang. PET scanning) pozwalają wykrywać pewne biomolckuły na poziomie narządu i rejestrować zmiany ich ilości w czasie. Takie rozwiązania wskazują, że staje się możliwe wykonywanie wyrafinowanych analiz wielu procesów biochemicznych na poziomie in vivo. 4. Jeżeli wyniki badań uzyskiwanych na różnych poziomach pokrywają się, to ma się prawo wnioskować, że został poczyniony rzeczywisty postęp w zrozumieniu procesu biochemicznego. Jeśli pojawią się duże rozbieżności przy zastosowaniu różnych rozwiązań doświadczalnych, to ich przyczyny muszą być badane aż do uzyskania racjonalnego wyjaśnienia. 5. Przedstawione sposoby preparatywne i poziomy analiz mogą być wykorzystane w badaniu różnic biochemicznych u zwierząt ze zmienionym stanem metabolicznym {np. głodzenie, karmienie) lub swoistymi chorobami (np. cukrzyca, rak). 6. Większość przedstawionych metod i rozwiązań można wykorzystać w badaniach prawidłowych i zmienionych chorobowo komórek lub tkanek człowieka. Jednakże należy uwzględnić warunki (czas) pobierania takiego materiału i szczególnie brać pod uwagę względy etyczne prowadzenia doświadczeń z materiałem ludzkim. Zastosowanie radioaktywnych i ciężkich izotopów przyczyniło się do wyjaśnienia procesów biochemicznych Wprowadzenie izotopów do badań w bio- chemii w latach 30. naszego wieku stanowiło punkt zwrotny, zatem ich zastosowania za- sługują na specjalną wzmiankę. Przed ich uży- ciem bardzo trudno było „naznaczyć" biomole-kuły, aby można było łatwo śledzić ich los „metaboliczny". Pionierskie doświadczenia, zwłaszcza Schoenheimera i wsp., wprowadzają- ce niektóre izotopy trwałe (np. 2 D, l5 N), połą- czone z ich detekcją na drodze spektrometrii masowej, znalazły zastosowanie w rozwiązywa- niu wielu problemów biochemicznych. Na przy- kład pewne zsyntetyzowane aminokwasy, cukry i kwasy tłuszczowe, zawierające odpowiednie trwałe izotopy, podaje się zwierzętom lub in vitro w toku preparatyki, aby śledzić ich los metaboliczny (np. okres połowicznego rozpadu, przemianę w inne biomolekuły). Związki zna- kowane trwałymi izotopami wykorzystano do poznania wielu aspektów metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Z tych doświadczeń wynika jasno, że metabolizm jest bardzo aktyw- nym procesem, a większość związków w komór- ce jest stale syntetyzowana i degradowana, choć z odmienną szybkością. Te odkrycia, zdaniem Schoenheimera, zwróciły uwagę na „dynamicz- ny charakter metabolizmu". Tabela 2-8. Główne izotopy stosowane w bada- niach biochemicznych Izotopy trwale Izotopy promieni ot wó rcze 2 D"N "C M Ca 131 1 Późniejsze wprowadzenie izotopów radioak- tywnych oraz przyrządów umożliwiających po- miar ich aktywności było także niezmiernie ważne. W tabeli 2-8 przedstawiono główne trwałe i radioaktywne izotopy wykorzystywane w układach biologicznych. Zastosowanie zarów- no izotopów trwałych, jak i radioaktywnych jest fundamentalne dla rozwoju każdego działu bio- chemii. Badania za ich pomocą złożonych i pro- stych biomolekuł zarówno in vivo, jak i in vitro budzą zaufanie. Ogromny postęp, poczyniony ostatnio w sekwencjonowaniu kwasów nuklei- nowych, a także w oznaczaniu substancji wy- stępujących w-układach biologicznych w nie- zwykle małych ilościach stosując metody radio-immunologiczne, opiera się na wykorzystaniu izotopów.
  24. 24. BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 25 BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGIĘ KOMÓRKI I MEDYCYNĘ Poniżej dokonano podsumowania głównych osiągnięć w dziedzinie biochemii, zwłaszcza w odniesieniu do biochemii człowieka. Obej- mują one: • Ustalenie pełnego składu chemicznego komó rek, tkanek i organizmu oraz wydzielenie i określenie budowy podstawowych związ ków w nich występujących. • Dostarczenie informacji, przynajmniej na ogólnym poziomie, o funkcjach wielu pro stych, a także głównych złożonych biomole- kuł (opisanych w dalszych rozdziałach książ ki), W centrum zainteresowania pozostaje DNA, materiał genetyczny, z którego infor macja jest przenoszona na 1 z typów RNA (informacyjny RNA, czyli mRNA), który z kolei dyktuje kolejność (sekwencje) amino kwasów w białkach. Przepływ informacji z DNA może być zapisany następująco: DNA-> RNA-+ białko. • Wydzielenie głównych organelli komórek zwierzęcych i ustalenie ich podstawowych funkcji. • Stwierdzenie, że prawie wszystkie reakcje przebiegające w komórkach katalizują en zymy; oczyszczono i zbadano wiele enzymów oraz przedstawiono obszernie właściwości i mechanizmy ich działania. • Przedstawienie szlaków metabolicznych syn tezy i degradacji głównych prostych i złożo nych biomolekuł. Szlak syntezy danego związ ku w zasadzie różni się od szlaku jego de gradacji. • Wyjaśnienie licznych aspektów regulacji me tabolizmu. • Przedstawienie, w szerokim zakresie, w jaki sposób komórki zachowują i wykorzystują energię. • Wyjaśnienie wielu aspektów budowy i funkcji różnych błon występujących w komórkach, których głównymi składnikami są białka i li pidy. • Przedstawienie, w ogólnym zarysie, sposobu działania głównych hormonów • Wykrycie biochemicznych podstaw wielu chorób. POZOSTAŁO WIELE DO ZBADANIA Zdając-sobie sprawę, jak wiele zgromadzono wiadomości biochemicznych, należy ocenić, jak niewiele jeszcze wiadomo w wielu działach tej nauki. Dwa istotne problemy, wymagające wy- jaśnienia, dotyczą ustalenia biochemicznych podstaw rozwoju i różnicowania oraz funkcji mózgu. Chociaż obecnie dobrze poznano naturę chemiczną materiału genetycznego, prawie nic nie wiadomo o mechanizmach, które włączają i wyłączają geny w czasie rozwoju. Zrozumienie regulacji genów stanowi klucz do poznania, jak różnicują się komórki i jak zmieniają się w ko- mórki nowotworowe. Wiedza o podziale komór- kowym i wzroście komórek prawidłowych i no- wotworowych oraz o ich regulacji jest bardzo skąpa. Rzeczywiście nic nie wiadomo na temat biochemicznych podstaw złożonych zjawisk ncuronalnych, takich jak świadomość i pamięć. Bardzo ograniczona jest również nasza wiedza 0 mechanizmach wydzielania komórkowego. Pomimo pewnego postępu, molekularne pod stawy większości głównych chorób genetycznych nie są wyjaśnione, ale wiele nadziei niesie tech nologia rekombinacji DNA, zwiastując zauwa żalny rozwój w tej dziedzinie w ciągu kilku najbliższych lat. Ludzki genom może być zsekwencjonowany w następnym stuleciu lub wcześniej. Wiadomo- ści uzyskane przez tak ogromny wysiłek będą potężnym wyzwaniem dla biologii człowieka 1medycyny. PIŚMIENNICTWO Freifelder D: Physicał Biochemistry: Appiicalions to Biochemistry and Molecułar Biology. Fceeman, 1982.Fruton JS: Mołecuks and Life; Historical Essays on the Interplay of Ckemistry and Biology. Wiley- -Interscience, 1972, Weinberg RA: The molecules of life. Sci Am (Oct) 1985; 253: 48. [Entire issue is of interest.]
  25. 25. 3 Woda i pH Vicłor W. Rodwelł, PhD WPROWADZENIE Biochemia dotyczy w większości właściwości i reakcji chemicznych związków organicznych. Często jednak się zapomina, że w komórkach żywych większość reakcji chemicznych przebie- ga w środowisku wodnym. Woda jest czynnym składnikiem w wielu reakcjach biochemicznych i jest ważnym czynnikiem determinującym właś- ciwości makrocząsteczek, takich jak białka. Woda dysocjuje do jonów OH~ i H+ . Termin pH stosuje się do określenia stężenia jonów wodorowych w komórkach oraz płynach ustro- jowych i stanowi kluczowe pojęcie w biochemii i medycynie. Grupy funkcyjne (aminowe, kar-boksylowe itd.) biomolekuł dysocjują przy określonej wartości pH, a wiele ich właściwości biologicznych i fizycznych zależy od tej dyso-cjacji. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Wiadomo, że dla zdrowia nieodzowna jest stałość środowiska wewnętrznego organizmu, utrzymywana we względnie wąskich granicach. Dotyczy to ogólnego rozmieszczenia wody, a także utrzymywania pH i stężenia różnych elektrolitów, np. Na+ , K+ , Ca2+ , Mg2+ i fos- foranów w organizmie. Ogólna zawartość wody w organizmie mężczyzny waha się w granicach 55—65% masy ciała; mniejsza wartość odnosi się do osób otyłych. Dane dla kobiet są mniej- sze, średnio o ok. 10%. Dwie trzecie wody organizmu stanowi płyn wewnątrzkomórkowy (ang. intraceliular fluid; skrót — ICF), zaś pozostałą część reprezentuje płyn pozakomór-kowy (ang. extracellular fluid; skrót — ECF). Około 25% ECF występuje' w osoczu. Regulacja równowagi wodnej jest złożona i za-ieży przede wszystkim od podwzgórza, kont- rolującego pragnienie, hormonu antydiuretycz-nego (ADH) i czynności nerek. Stany niedoboru wody i nadmiaru wody ustrojowej są powszechne. W wielu przypadkach towarzyszy im niedobór lub nadmiar jonów sodowych. Przyczynami niedoboru wody mogą być: 1) zmniejszone jej pobieranie (np. podczas śpiączki) lub 2) nadmierne jej wydalanie (np. utrata z moczem w cukrzycy, przy silnych potach przez skórę, w ostrej biegunce u dzieci, w przebiegu chslery). Nadmiar wody ustrojowej powodują: 1) zwiększone pobieranie (np. przy nadmiernym podawaniu płynów dożylnie) bądź 2) zmniejszone jej wydalanie (np. w ostrej niewydolności nerek). U osób zdrowych pH płynu pozakomórko-wego utrzymuje się w granicach 7,35—7,45. Bufor wodorowęglanowy (HCOf/H2CO3) odgrywa szczególnie ważną rolę w tym względzie. Kiedy pH osiąga wartość poniżej 7,35, wtedy dochodzi do stanu określanego jako kwasica, jeżeli zaś pH przekroczy wartość 7,45 występuje zasado wica. Zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej można zwykle rozpoznać oznaczając pH krwi tętniczej, pCO2 oraz ogólną zawartość COj we krwi żylnej, znając poprzednio wymienione wartości, stężenie HCOf. Istnieją liczne przyczyny kwasicy (ketoacydoza cukrzycowa, kwasica mleczanowa itp.) i zasadowicy (wymioty kwaśną treścią żołądkową, działanie nie- których leków moczopędnych itp.). Znajo- mość patogenezy zaburzeń równowagi wodnej i równowagi kwasowo-zasadowej jest podstawą właściwej diagnozy i ich leczenia. Wymaga to zatem poznania tych właściwości wody, które umożliwiają jej odegranie kluczowej roli w bio- chemii.
  26. 26. WODA I pH / 27 Cząsteczka wody wykazuje budowę tetraedryczną Cząsteczka wody ma postać nieregularnego czworościanu (tetraedr) z atomem tlenu w jego środku (ryc. 3-1). Dwa wiązania z wodorem są skierowane w 2 rogi czworościanu, podczas gdy 2 pozostałe rogi są zajęte przez niesparowane elektrony na zhybrydyzowanych orbitalach 2sp3 . Kąt pomiędzy 2 atomami wodoru a tle- nem (105°) jest nieco mniejszy niż kąt tetraed-ryczny (109,5c ), co przyczynia się do utworzenia nieznacznie skośnego czworościanu. Ryc. 3-2. Tetraedryczna struktura amoniaku. Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody Nierównomierne rozmieszczenie ładunku w cząsteczce wody przyczynia się do utworzenia dipolu (cząsteczki biegunowej) Lekko pochyla struktura czworościanu wody jest przyczyną nierównomiernego rozmieszcze- nia w niej ładunku. Przeciwległa do 2 atomów wodoru strona tlenu jest stosunkowo bogata w elektrony, natomiast druga strona, zawierająca względnie odsłonięte jądra wodoru, tworzy obszar o ładunku miejscowo dodatnim. Pojęcie „dipol" oznacza taką cząsteczkę, jak woda, w której ładunek elektryczny (elektrony) jest rozmieszczony nierównomiernie. Amoniak, podobnie jak woda, jest tetraedryczną cząsteczką dipolową W cząsteczce amoniaku kąty między wiązania- mi atomów wodoru (107°) są zbliżone do kąta tetraedrycznego nawet bardziej niż w wodzie {ryc. 3-2). Wiele związków organicznych budują- cych komórki jest dipolami, np. alkohole, fos-folipidy, aminokwasy i kwasy nukleinowe. STRUKTURA TETRAEDRYCZNA I DIPOLARNY CHARAKTER WODY UŁATWIAJĄ REAKCJE W stanie ciekłym woda jest stabilizowana przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, które tworzą strukturę wielkocząsteczkową przypominającą strukturę lodu Cząsteczki wody, z powodu dwubiegunowego charakteru, tworzą uporządkowane układy (przypominające płatki śniegu). Jednakże upo- rządkowanie takie, jak w cząsteczce wody, nie ogranicza się do lodu. Woda w stanie ciekłym wykazuje strukturę wielkocząsteczkową, która jest ściśle równoległa do rozkładu geometrycz- nego cząsteczek wody w lodzie. Zdolność cząs- teczek wody do łączenia się ze sobą zarówno w stanie ciekłym, jak i stałym wynika z dipolar-ncgo charakteru wody. Pozostaje ona w stanie ciekłym z powodu przemijającego charakteru jej kompleksów wielkocząsteczkowych (okresu półtrwania asocjacji — dysocjacji cząsteczek wody — ok. 1 as). W stanie stałym każda cząsteczka wody asocjuje z 4 innymi cząsteczkami wody. W stanie ciekłym liczba asocjują-cych cząsteczek jest nieco mniejsza (ok. 3,5) i w tym stanie woda swoją budową wielkocząsteczkową, z wyjątkiem przemijającej natury wewnątrzcząsteczkowych interakcji, przypomi- na lód w znacznie większym stopniu niż można było początkowo przypuszczać. Dipolarny charakter cząsteczek wody sprzyja ich wzajemnemu łączeniu się w uporządkowa- nym, precyzyjnym szyku, wynikającym z we- wnętrznej geometrii cząsteczki wody (ryc. 3-3).
  27. 27. 28 / ROZDZIAŁ 3 Vł Ryc. 3-3. Strona Iswa: Asocjacja 2 dipoiarnych cząsteczek wody. Linia kropkowana przedstawia wiązanie wodorowe Strona prawa: Asocjacja cząs- teczki wody (środkowej) z 4 innymi cząsteczkami wody za pomocą wiązań wodorowych. Struktura ta jest typowa dla lodu i w mniejszym stopniu dla wody w stanie ciekłym. Oddziaływanie elektrostatyczne między jąd- rem wodoru jednej cząsteczki wody a wolną parą elektronów drugiej nazywa się wiązaniem wodo- rowym. W porównaniu do wiązań kowalencyj- nych, wiązania wodorowe są raczej słabe. Roze- rwanie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie ciekłym) wymaga ok. 18,8 kJ/mol (4,5 kca!/mol), tj. ok. 4% energii wymaganej do rozerwania wiązania O—H w wodzie (461 kJ/mol=llO kcal/mol). Słabe wiązania wodorowe odgrywają istotną rolę w biochemii, włączając stabilizacje struktury białek i kwasów nukleinowych Wiązania wodorowe, które są słabe, lecz mogą powstawać w dużych ilościach, odgrywają istotną rolę w biochemii. Liczne wiązania Ryc. 3-4. Powstawanie wiązań wodorowych mię- dzy cząsteczkami etanolu i wody, między 2 cząs- teczkami etanolu oraz między tlenem grupy kar-bonylowej peptydu i wodorem grupy aminowej sąsiadującego peptydu. wodorowe narzucają uporządkowanie struktury nie tylko wodzie, lecz także innym cząsteczkom dipolowym, tak odmiennym od wody, jak alkohole, DNA i białka. Tworzenie wiązań wodorowych między przedstawicielami cząste- czek ważnych fizjologicznie związków przed- stawia ryc. 3-4. Powstawanie ich nie ogranicza się do cząsteczek wody. Atomy wodoru, połą- czone z atomami azotu, mogą uczestniczyć także w wiązaniach wodorowych. Problem ten będzie rozpatrywany w dalszej części książki w związku z omawianiem trójwymiarowej struk- tury białek oraz reguł łączenia się (parowania) zasad azotowych w DNA, Cząsteczki wody wykazują niewielką, ale fizjologicznie ważną, tendencję do dysocjacji, tj. tworzenia małych ilości jonów OH- i H Cząsteczki wody wykazują ograniczoną ten- dencję do dysocjacji (jonizowania) na jony H + iOH": H2O ~ H+ + OH" Ponieważ jony są w ciągłym ruchu, twcTrząc cząsteczki wody i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy atom wodoru Jub tlenu wy- stępuje jako jon, czy jako część cząsteczki wody. W danym momencie może być jonem, a w na- stępnym częścią cząsteczki. Jonów oraz cząs- teczek wody nie rozpatruje się pojedynczo. Wiedząc, że 1 g wody zawiera 3,46 x 1022 cząs- teczek, jonizację wody można opisać statystycz- nie. Należy znać prawdopodobieństwo występo- wania wodoru w formie jonu lub części cząste- czki wody. W przypadku gdy prawdopodobieństwo wy- stępowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01 oznacza to, że atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem, a 99 szans na sto — istnienia w cząsteczce wody. Faktyczne prawdopodo- bieństwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi ok. 0,0000000018, tj. 1,8 x 10~9 . Zatem jest on prawie w całości częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, ze w czys- tej wodzie na każdy jon wodorowy i hydroksy- lowy przypada 1,8 x 109 , tj, 1,8 mld cząsteczek wody. Jony wodorowe i hydroksylowe mają jednak znaczny wpływ na właściwości wody. Tendencję wody do dysocjacji wyraża się następująco: [H2O] VH ,, CH3 — CHj— CHj — CH
  28. 28. WODA I pH / 29 W nawiasach przedstawiono stężenia molo- we jonów wodorowych, hydroksylowych i nie-zdysocjowanych cząsteczek wody*, a K nazwano stalą dysocjacji. Aby obliczyć stalą dysocjacji dla wody, natęży przypomnieć, że 1 mol ma masę 18 g. Jeden litr (1) (1000 g) wody zawiera zatem 1000:18 = 55,56 mol. Stężenie molowe czystej wody wynosi więc 55,56 mol. Ponieważ prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 x 10~9 , stężenie molowe jonu H+ (lub jonów OH~) w wodzie oblicza się, mnożąc prawdopodobień- stwo 1,8 x 10~* przez stężenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik= 1,0 x 10"7 mol/l. Teraz można wyliczyć wartość K dla wody: [H+] [ O H ] [ 1 0 7 ] [ 1 0 7 ] [55,56] 14 = 1,8 x 1O" 1S mol/l Duże stężenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianom przez dysocjację. Stąd wygodnie jest rozpatrywać wodę jako zasadniczo niezdysocjowaną (stalą). Stała ta może być włączona w stałą dysocjacji K, jako nowa stała Kw, zwana iloczynem jonowym wody. Stosunek między Kw a K przedstawiono poniżej: 1,8 x 10- 16 mol/l [HZO] Kw = (K) [HtO] = [H+] [ O H ] = - 1,8x10 16 mol/l) (55,56 mol/l) = = 1,00 x 10" 14 (mol/l) 1 Stałą K wyraża się w molach na litr, zaś Kw — w mol2 na litr2 . Z nazwy wynika, że iloczyn jonowy Kw jest liczbowo równy iloczynowi stężeń molowych jonów H + i OH ~: Kw = [H+] [ O H ] W temperaturze 25°C Kw = (10~7 )2 m 10~14 (mol/f)2 . Natomiast w temperaturach poniżej 25°C wartość Kw jest większa, zaś powyżej 25°C mniejsza niż 10~14 . W temperaturze ciała ludz- kiego (37°C) stężenie H+ w wodzie jest nieco większe niż 10~7 mol/l. W ramach ustalonych granic wpływu temperatury, wartość Kw = 10~1 '1 (mol/1)2 dla wszystkich roztworów wodnych, nawet dla tych, które zawierają kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stalą ta będzie wykorzystywana do obliczenia wartości pH roztworów kwaśnych i zasadowych. pH JEST UJEMNYM LOGARYTMEM STĘŻENIA JONÓW WODOROWYCH, A ŚCIŚLEJ AKTYWNOŚCI JONÓW WODOROWYCH Termin pH wprowadził w 1909 r. Sórensen, definiując pH jako ujemny logarytm stężenia jonówwodorowych: pH = -log[H + ] Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła*, jest na ogół wystarczająca do celów biochemicz- nych. Aby obliczyć pH roztworu należy: 1) oznaczyć stężenie jonów wodorowych (H+ ), 2) obliczyć logarytm dziesiętny (H+ ), 3) pH jest ujemną wartością znalezioną w punkcie (2). Na przykład w przypadku czystej wody w temp. 25°C: pH = -log[H*] = -logiO Małe wartości pH odpowiadają dużym stęże- niom jonów H+ , a duże — małym stężeniom H+ Kwasy określa się dawcami protonów, a zasa- dy biorcami protonów. Wyróżnia się mocne kwasy (np. HC1, H2SO4) całkowicie zdysocjo-wane, nawet w mocnych roztworach kwaśnych (niskie pH), oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjujące w roztworach kwaśnych. Podobnie można wyróżnić mocne zasady (np. KOH, NaOH) i słabe zasady (np. Ca(OH)2>. Tylko mocne zasady dysocjują przy małych wartościach pH. Większość związków organicznych w komórkach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufos-forylowane związki pośrednie, które zawierają * scisie mówiąc, wyrażenia w nawiasacn reprczen- ---------------------------------------------------------------------------------- tują raczej aktywność molową niż stężenie molowe. * pH= — log (aktywności H + ) K [HZO] = 0,018 x 10 [OHK -[-7]= 7,0 Ściśle mówiąc, wyrażenia w nawiasach reprezen-
  29. 29. 30 / ROZDZIAŁ 3 silnie kwasową grupę pierwszorzędowego kwa- su fosforowego. Poniższe przykłady ilustrują sposób oblicza- nia pH roztworów kwaśnych i zasadowych: Przykład. Jakie jest pH roztworu, w któ- rym stężenie jonu wodorowego wynosi 3,2 xlO"4 mol/l? Stężenie (mol/1) (a) (b) Molowość KOH [0H-] 2 KOH [OH-j z wody Całość [0H-] 2,0 xicr 2 2,0 xl O" 2 1,0x10" 7 2,00001 x10~ 2 2,0x10" 6 2,0x10~ e 1,0x10" 7 2,1 x10" 6 = -log (3,2x10"*) = -log (3,2) -logCIO" 4 ) =-0,5+4 = 3,5 Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stężenie jonu hydroksylowego wynosi 4,0 x 10"4 mol/l? Aby rozwiązać to zadanie, należy określić ilościowo wartość pOH, które jest równe —log [OH~]; wartość tę można wyprowadzić z definicji K: [OH-] = 10" 14 zatem log [H + ] + log [ O H ] = log 10" lub pH + pOH = 14 A następnie: [ O H ] = 4,0 x 1 0 * pOH = -log [ O H ] = -log (4,0 x 10 4 ) = -log (4,0) - 1og(10" 4 ) = -0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz pH = 14 - pOH = 14 - 3,4 = 10,6 Przykład. Jakie jest pH roztworu (a) 2,0xl0"! mol/l KOH, (b) 2,0 x 10"* mol/l KOH? W roztworach tych jony OH~ pochodzą z 2 źródeł: KOH i wody. Ponieważ pH określa całkowite stężenie jonów [H+ ] (pOH — cał- kowite [OH ]) należy obydwa źródła brać pod uwagę. W pierwszym przypadku udział wody w całkowitej puli [OH~] jest nieistotny, czego nie można powiedzieć w drugim przypadku. W momencie podjęcia decyzji o znaczeniu udziału wody, pH można wyliczyć jak powyżej. , W przedstawionych przykładach przyjęto za- łożenie, że mocna zasada KOH jest w pełni zdysocjowana, a stężenie molowe jonów OH~ równa się stężeniu molowemu KOH. Założenie to jest słuszne dla względnie rozcieńczonych roztworów mocnych zasad i kwasów lecz nie dotyczy słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, że te słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjują w roztworach, należy przed obliczeniem całkowitego [H+ ] (lub całkowitego [OH~]) oraz obliczeniem pH, obliczyć stężenie H+ (lub stężenia OH~) z danego stężenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystując stałą dysocjacji. Biomolekuły zawierają grupy funkcyjne czynne o istotnym znaczeniu fizjologicznym, które zachowują się jak słabe kwasy Wiele związków organicznych żywych komó- rek ma grupy funkcyjne, typowe dla słabych kwasów lub zasad. Jedna lub więcej grup funk- cyjnych — głównie grupy karboksylowe, ami- nowe lub utworzone w wyniku drugorzędowej dysocjacji fosforanowej estrów fosforanowych — występują we wszystkich białkach i kwasach nukleinowych, większości koenzymów oraz me- tabolitów pośrednich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomórkowego pH na budowę i ak- tywność biochemiczną tych związków, należy poznać sposób dysocjacji (równowagi protono- Tabela 3-1. Przykłady słabych kwasów i sprzężo- nych z nimi zasad Kwas Sprzężona zasada CH3COOH CH3COO- CH3NH3 CH3NH2 OH O" H+N NH N NH
  30. 30. WODA I pH / 31 wej) grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i kli- nicznych rozdział i identyfikacja tych związków opiera się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych. Protonowa forma kwasu (HA lub RNH+) od- nosi się do kwasu, zaś nieprotonowa (A~ lub RNH2} — do sprzężonej z nim zasady (tab. 3-1). Podobnie można opisać zasadę (np. A~ lub RNH2) i sprzężony z nią kwas (np. HA lub RNH+) (lac. conitmgere — połączyć razem). Względną moc słabych kwasów i zasad wyra- ża sie ilościowo przez ich stale dysocjacji, które obrazują ich tendencje do jonizacji. Poniżej podano wyrażenia stałej dysocjacji (K.) dla 2 przedstawicieli słabych kwasów: i R—NH+ R—COOH ++ R—COO + IR-COO ] [H + ] [R—COOH] *+ R—NH2 [R—MH2] [H [R-NHj] Z powyższych równań, odnoszących K do [H+ ] i do stężenia niezdysocjowanego kwasu i sprzężonej z nim zasady, wynika, że gdy IR—COO] = R—COOH lub gdy [R—NHZ] = [R— NHj] to wtedy K = [H+] Można to wyrazić słowami: gdy rodzaj jonów zasocjowanych (protonowych) i zdysocjowanych (sprzężone zasady) występuje w równych stęże- niach, wówczas przeważające stężenie jonów wo- dorowych [H+ ] jest równe liczbowo stałej dyso- cjacji K. Jeśli obliczy się logarytmy powyższego rów- nania i obie strony pomnoży się przez — I, to [H+] -log[H Ponieważ wartości liczbowe K dla słabych kwasów są ujemnymi liczbami wykładniczymi, wygodniej jest wyrażać K jako pK, gdzie: pK = -l og K Tabela 3-2. Stałe dysocjacji i wartości pK dla przedstawicieli kwasów karboksylowych Kwas K pK Octowy 1,76x10 5 4,75 Gluta rowy (1-rz.) 4,58 x10" 5 4,34 (2-rz,) 3,89x10"6 5,41 Cytrynowy (1-rz.) 8,40x10" 4 3,08 (2-rz.) 1,80x10" E 4,74 (3-rz.) 4,00x10" 6 5,40 Należy odnotować, że pK odnosi się do K tak, jak pH do stężenia H + . W tabeli 3-2 przedstawiono wartości K i pK dla kwasu mono-, di- i trikarboksylowego. Należy pod- kreślić, że grupy mocniejszych kwasów mają mniejsze wartości pK. Z definicji —log K opisuje się jako pK, zaś — log [H+ ] jako pH. W związku z tym można ostatnie równanie zapisać pK = pH tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w którym stężenia postaci protonowej i niepro tonowej są równe. Wartość pK kwasu można oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5 równoważ- nika* zasady na równoważnik kwasu. Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie odpowiadać pK kwasu. Charakter słabych kwasów i buforów, które są roztworami słabych kwasów i ich soli opisuje równanie Hendersona--Hasselbalcha Wartość pH roztworu zawierającego słaby kwas jest zależna od stałej dysocjacji tego kwasu, jak przedstawiono powyżej dla słabo kwaśnej wody. Zależność tę opisuje, w przystęp- * Według układu SI pojęcie równoważnika chemi- cznego nie jest używane, jednak w tym tłumaczeniu określenie to świadomie utrzymujemy {przyp. red. nauk. tłum.). R -N H H K = K logK
  31. 31. 32 / ROZDZIAŁ 3 nej formie, równanie Hendersona-Hasselbal-cha, wyprowadzone poniżej. Słaby kwas HA dysocjuje w następujący sposób: HA~ H + +A" Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi: " [HA] Po pomnożeniu na krzyż: [H+] [ A ] = K[HA] Po podzieleniu obu stron przez [A~] Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1 pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10 pH = pK + ■ lo g - 1,0 - Po zlogarytmowaniu obu stron: i 10 o ■o 0,8 ■og[H+] [A ] log K + log I % li 1* 08 Po pomnożeniu przez — 1 -fc»g[H+] = -logK - log Po podstawieniu zamiast —log H+ i —log K odpowiednio pH i pK otrzymuje się [HA] pH = pK - log [A] i oj- pK pK pK pK pK pK pK -3 -2 -1 0 +1 +2 +3 łtyc. 3-5. Typowa krzywa miareczkowania wy- kreślona na podstawie wyników obliczeń z rów- nania Hendersona-Hasselbalcha. Z kolei usuwa się znak minus, odwracając ostatni człon równania: pH = pK 4 log Ta ostatnia forma równania, opisywana jako równanie Hendersona-Hasselbalcha, służy do wyliczania równowagi protonowej, np.: 1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie w połowie, tj. A~ =[HA]. W tych warunkach pK +- log— =pK + 0 Jeśli równanie zastosuje się dla różnych sto- sunków [A-]/[HA] w zakresie 10M0"3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartości pH. to otrzymany wynik opisuje krzywą miarecz- kowania słabego kwasu (ryc, 3-5). Roztwory słabych kwasów i ich soli buforują pHw przypadku dodania lub usuwania protonów Roztwory słabych kwasów i sprzężonyct z nimi zasad (lub słabych zasad i sprzężonycl z nimi kwasów) wykazują zjawisko buforowa nia, tj. zdolności utrzymywania pH. Wartość pt roztworu buforowego po dodaniu mocnego kwasi lub mocnej zasady nie zmienia się bardziej niż p< dodaniu takiej samej objętości wody. Zjawisk* pK + (-1) [HA] [HA ] [ A ] [HA] [ A ] [HA] pH = pK + tog
  32. 32. WODA I pH / 33 buforowania można najlepiej zilustrować po- przez miareczkowanie słabego kwasu lub zasady wykorzystując pH-metr. W innym rozwiązaniu można obliczyć przesunięcie pH, które ma miejsce w przypadku dodania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawio- nym przykładzie, zbuforowany roztwór (mie- szanina słabego kwasu i sprzężonej z nim zasa- dy, pK = 5,0) wykazuje początkowo w jednej z 4 wartości pH. Można obliczyć przesuniecie pH, które wystąpi, jeśli zostanie dodany 0,1 mmol/1 K.OH na każdy milirównoważnik kwasu w roztworze (o stężeniu 1 mmol). 5,00 5,37 5,60 5,86 0,50 0,70 0,80 0,88 0,50 0,30 0,20 0,12 1,00 2.33 4,00 7,33 Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA. Punkt {) wskazuje pK o wartości 5,0. Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje 0,60 0,80 0,90 0,98 0,40 0,2 0 0,1 0 0,02 1,50 4,00 9,00 49,0 0,176 0,602 0,95 1,69 5,18 5,60 5,95 6,69 0,18 0,23 0,35 0,83 Zmiana pH, wywołana przez dodanie 1 mmol jonów OH~ różni się znacznie w zależności od pH. Przy wartościach pH zbliżonych do wartości pK, roztwory buforowe utrzymują skuteczniej pH, co określa się ich efektem buforującym. Roztwory słabych kwasów i sprzężonych z nimi zasad są najskuteczniejszymi układami buforowymi w zakresie pH równym pK + 2,0 jednostki pH. Oznacza to, że aby zbuforować roztwór w pH X, można wykorzystać słaby kwas lub zasadę, których pH nie różni się od pH X więcej niż o 2 jednostki pH. Na rycinie 3-6 przedstawiono ładunek eJekt-ryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH. Ładunek ułamkowy —0,5 nie oznacza, że poje- dyncza cząsteczka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz wyraża statystyczne praw- dopodobieństwo, że ma ona ładunek —0,5. Przyjęcie ładunku elektrycznego makrocząste- czek jako funkcji pH stwarza podstawę dla wielu użytecznych technik rozdziału, włączając eiektroforetyczny rozdział aminokwasów, bia- łek osocza i nieprawidłowych hemogJobin. W komórkach żywych bufory fosforanowy i wodorowęglanowy, oprócz białczanowych, stanowią podstawowe bufory. PIŚMIENNICTWO Segel IM: Biochemical Calcuiations. Wiley, 1968. 3 — Biochemia f 1,0- 2 3 4 5 6 7 8Początkowe pH [" ] początkowe [A f/[HA]końcowe Kortcowe pH ipH
  33. 33. CZĘŚĆ I Budowa oraz funkcje białek i enzymów Aminokwasy 4 Victor W. Rodweli, PhD WPROWADZENIE Żywe komórki wytwarzają makrocząsteczki (białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), które służą jako składniki strukturalne, katalizatory, hormony, receptory lub magazyny informacji genetycznej. Te makrocząsteczki są biopolime-rami, utworzonymi z jednostek monomerycz-nych lub cegiełek budulcowych. Jednostkami monomerycznymi w kwasach nukleinowych są nukleotydy, w złożonych polisacharydach — pochodne cukrowe, a w białkach — L-a-amino-kwasy. Chociaż białka mogą także zawierać poza aminokwasami, dodatkowe substancje (np. hem, cukrowce, tłuszcze), ich trójwymiarową strukturę i właściwości biologiczne warunkuje w głównej mierze rodzaj aminokwasów, kolejność, w jakiej łączą się ze sobą w łańcuchu polipeptydowym oraz ich przestrzenne ułożenie,, względemsiebie. Aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje w komórkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektóre biologicznie ważne substancje, które wywodzą się z aminokwasów. genne) muszą być dostarczane w pożywieniu, ponieważ nasz organizm nie może ich syn- tetyzować w ilościach niezbędnych do pod- trzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdro- wia (dorośli). Metabolizm aminokwasów przy- czynia się do powstania wielu biomedycznie ważnych związków. Na przykład dekarboksyla-cja pewnych aminokwasów prowadzi do powstania amin, wśród których cześć pełni ważne funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-a-minomasłowy [GABA]). Liczne choroby są spowodowane nieprawidłowościami transportu aminokwasów do komórek. W pewnych warunkach może dojść do pojawienia się w moczu znacznej ilości jednego lub wielu aminokwasów — takie stany określa się jako aminoacydurie. WSZYSTKIE AMINOKWASY ZAWIERAJĄ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE Aminokwasy zawierają 2 grupy funkcyjne, tj. aminową i karboksylową. W a-aminokwasach obie te grupy połączone są z tym samym (a) ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niektóre aminokwasy wydają się być zaan- gażowane w przenoszeniu impulsów w układzie nerwowym, czego przykładem są glicyna i kwas glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo- H a R-C-NHj I COOH Dwie formy przedstawienia j.-amino- Ryc. 4-1. kwasu. OH
  34. 34. 36 / ROZDZIAŁ 4 atomem węgla (ryc. 4-1). Chociaż w przyrodzie występuje ok. 300 aminokwasów, tylko 20 z nich występuje w białkach (tab. 4-3). Cał- kowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-ami-nokwasów. Należy podkreślić, że białka wszystkich form życia — roślin, zwierząt, drobnoustrojów — zawierają te same 20 aminokwasów. Przyczyną tego jest uniwersalność kodu genetycznego, co stanie się oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia później (p. rozdz. 30). W skład niektórych białek wchodzą pochodne aminokwasów, utworzone po ich włączeniu w cząsteczkę białka (p. lab. 6-4). Z wyjątkiem glicyny, dla której R (R — łań- cuch boczny aminokwasu) stanowi atomwodoru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki związane z atomem węgla et-aminokwasów są różne. Tetrąędryczne. ułożenie 4 różnych podstawni- ków wokół atomu węgla a (tzw. węgiel asymet- ryczny) nadaje aminokwasom właściwość op-.tyczna. (zdolnośćTjio_ _skręcania . płaszczyzny światła spolaryzowanego). Chociaż pewne aminokwasy występujące w białkach są prawo-skrętne, a niektóre lewoskrętne, w pH 7,0 wszystkie mają bezwzględną konfigurację porównywalną z konfiguracją aldehydu L-glicery-nowego, stąd opisuje się je jako L-a-amino-kwasy. Ogólne reakcje chemiczne aminokwasów można przewidzieć znając właściwości grup funkcyjnych Grupy funkcyjne aminokwasów — karbok-sylowa i aminowa — wykazują typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikację, acyla- RÓWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASÓW W zależności od pH otaczającego środowiska aminokwas może mieć ładunek dodatni, ujemny lub nie mieć żadnego ładunku Aminokwasy zawierają co najmniej 2 zjoni-zowanc, słabo kwaśne grupy: —COOH i —NHt- W roztworze obie formy tych grup. jedna naładowana, a druga obojętna, występują w równowadze protonowej: R—COOH « R—COO" + H+ H + W równowadze tej R—COOH i R—NH^ re- prezentują związki protonowe lub kwaśne, na- tomiast R—COO~ i R—NH2 — zasady sprzę- żone (protonobiorców) z odpowiednimi kwasa- mi. C hociaż z aró wno R —C OOH jak i R NH; są słabymi kwasami, R—COOH jest znacznie silniejszym kwasem niż R—NHr W pH osocza krwi czy przestrzeni śródkomór-kowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy kar-boksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony karboksyjowe — R—COO~. Przy tych wartościach pH większość grup aminowych występuje w formie zasocjowanej (protonowej) — R—NH3. Ze względu na przeważającą postać zjonizowaną aminokwasów we krwi i większości tkanek, należy przedstawić ich budowę tak, jak na ryc. 4-2A. Należy pamiętać, że struktura B (ryc. 4-2) nie może istnieć w żadnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w którym cofa się jonizacja grupy karboksylowej, znacznie słabsza kwaśna grupa aminowa będzie występować także w formie protonowej. Przybliżone wartości pKa dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynoszą odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszącym 2 jednostki poniżej wartości pKa, kwas w ok. 99% ma formę protonową. Jeżeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odłącza się znacznie wcześniej niż z grupy R—NH 3 • W każdym wystarczająco wysokim pH do utworzenia przewagi grupy aminowej R—NH2 musi być również obecny jon karboksylowy (R—COO~). Jednakże w wielu reakcjach, poza równaniami równowagi protonowej, stosuje się wzory aminokwasów w formie B. NH, + 0- * Hydroliza = rozerwanie wiązania kowalencyjne- go przy udziale cząsteczki wody. Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego ami- nokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjo- logicznego (A). Postać B (niezjonizowana) nie występuje w żadnym pH, ale jest często' używana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwa- sów. NHj II O 8
  35. 35. AMINOKWASY / 37 Tabela 4-1. Słabo kwaśne grupy aminokwasów występujących w białkach Sprzężony kwas Sprzężona zasada Przybliżona wartość pK a-Karboksylowa R—COOH R—COO" 2.1 ±0,5 Nie a-kar boksy Iowa (aspara-ginian, glutaminian) R—COOH R—COO" f 1---------R 4,0 + 0,3 Imidazolowa (histydyna) r v 6,0 ^-Aminowa R-NH + R—NH2 9,8 ±1,0 s-Aminowa (lizyna) R- NH^ R—NHa 10,5 Fenolowa OH (tyrozyna) 10,1 Guanidynowa (arginina) H NH2 1 11+ R—N—C—NH2 H NH j II R—N—C—NH2 12,5■ Sulf hydry Iowa (cystein3) R—SH R-S- 8,3 Względną moc słabych kwasów wyrażają wartości pK, Względną moc słabych kwasów wyraża się przez ich stale dysocjacji Ka lub przez ich pK — ujemny logarytm ze stałej dysocjacji: Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy którym nie jest on obdarzony żadnym ładunkiem i nie porusza się w polu elektrycznym Strukturę aminokwasu alifatycznego, takie- go jak alanina, w pH odpowiadającym punk- towi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3. W tabeli 4-1 przedstawiono wartości pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasów spotyka- nych w białkach. Całkowity ładunek (algebraiczna suma wszys- tkich dodatnio i ujemnie naładowanych grup) aminokwasu zależy od pH lub stężenia protonów otaczającego środowiska. Możliwość zmiany ła- dunku aminokwasów i ich pochodnych, przez umiejętne sterowanie pH, ułatwia fizyczny roz- dział aminokwasów, peptydów i białek. Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. Chociaż jon obojnaczy alani- ny ma grupy obdarzone ładunkiem elektrycznym, nie wędruje w polu elektrycznym. ♦ Dla wygody zapis Ka lub pKtt będzie stosowany, w przypadku aminokwasu z tylko dwiema lecz opuszczony później w przypisach dotyczących grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma symboli. niejasności w wyliczeniu pl. Ponieważ wartość NrV

×