Manual Micologia

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Manual Micologia

  1. 1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE MANUAL DE PRACTICAS DE MICOLOGIA Departamento de Parasitología Rama de Fitopatología Dr. José A. Quintero Benítez Dr. Miguel A. Apodaca Sánchez Ing. Jesús G. Loredo Vega Ing. Dagoberto Fierro Corrales Juan José Ríos, Ahome, Sinaloa, agosto del 2008.
  2. 2. INDICE INTRODUCCION..............................................................................................................i INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE FITOPATOLOGIA...........................................................................................................ii PRACTICA # 1 CONTABILIDAD DE ESPORAS.........................................................1 PRACTICA # 2 ESTERILIZACION DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO...................................................................................................2 PRACTICA # 3 PREPARACION Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO................5 PRACTICA # 4 AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATOGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS.................................................................................................10 PRACTICA # 5 ELABORACION DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATGENOS...........................................................................................................13 PRACTICA # 6 SINTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATOGENOS.......17 PRACTICA # 7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS FITOPATOGENOS.........................................................................................................20 PRACTICA # 8 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES...............................................................................23 PRACTICA # 9 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES..........................................................................25 PRACTICA # 10 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES............................................................27 PRACTICA # 11 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES......................................................29
  3. 3. Laboratorio de fitopatología INTRODUCCION La vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se reproduce para el caso particular de la micología. El presente manual se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas para que los estudiantes que estén cursando la materia de micología, tengan las herramientas básicas para trabajar en el manejo de hongos en el laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen los procedimientos empleados para el análisis de muestras de vegetales en la identificación y/o detección de hongos fitopatógenos, también se incluyen los pasos a seguir en la esterilización del material a utilizar por ejemplo cristalería y medios de cultivo, así como el manejo del material vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar su patogenicidad e identificación, además se incluyen las diferentes fórmulas para la elaboración de medios de cultivo para tal fin. En el presente trabajo, siempre serán bien recibidas las críticas constructivas por parte de colegas y estudiantes para mejorarlo y/o actualizarlo de manera constante. i
  4. 4. Laboratorio de fitopatología INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE FITOPATOLOGIA El laboratorio constituye un lugar de trabajo para la enseñanza y la investigación. Los mayores peligros que presenta no lo son ni el fuego ni las descargas eléctricas, sino el “descuido y la irresponsabilidad” de los usuarios. Para la conservación y mejor servicio de los laboratorios de fitopatología, las personas que deseen usarlo deberán apegarse a las siguientes disposiciones: LIMPIEZA Los materiales de desecho deberán depositarse en el recipiente de basura, no dejarlos nunca sobre la mesa o tirarlos al suelo. El material de vidrio que se use deberá llevarse inmediatamente al lavadero para que el ayudante lo tenga limpio para su uso inmediato. El material usado por los alumnos en actividades extra-clase, deberá ser lavado por el mismo. Cuando no se utilicen las mesas de trabajo, deberán permanecer libres de polvo y de otros materiales: no dejar materiales innecesarios sobre ellas. Cuando el caso lo amerite, se deberán cubrir el material (tubos, cajas de petri, material vegetal, etc…) con un papel polietileno, indicando su nombre y la fecha en que lo deja. EL MATERIAL QUE NO REUNA ESTAS CONDICIONES, PODRA SER DESECHADO POR EL AYUDANTE O ENCARGADO DE LIMPIEZA. ii
  5. 5. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 1 CONTABILIDAD DE ESPORAS Para realizar esta práctica se hace con la ayuda de un contador de esporas llamado Hemacitómetro (Improved Neubauer). Y un microscopio biológico compuesto. El conteo de esporas se realiza de la siguiente manera: De una o varias cajas de Petri con micelio bien desarrollado del hongo, se deposita en un matraz Erlenmeyer con agua destilada estéril. El contenido se licua y forma una solución concentrada de esporas. Con una pipeta se toma una alícuota y se deposita en el portaobjeto graduado del Hemacitometro. Las esporas observadas se contaran en los ocho cuadros más grandes se suman y se dividen entre ocho y el resultado se multiplica por 10,000, obteniendo así la concentración de esporas por mililitro. 1
  6. 6. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 2 ESTERILIZACION DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con materiales y equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada antes de usarlos. La esterilización es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o materiales libres de organismos vivos. Los métodos de esterilización pueden ser químicos o físicos. Entre los métodos físicos se encuentra el calor, las radiaciones y la filtración. El método químico incluye el uso de gases o sustancias líquidas con propiedades biocidas. 1. Esterilización mediante calor seco. Este procedimiento es apropiado para esterilizar cristalería e instrumentos de metal. Se lleva a cabo en estufas u hornos alimentados por energía eléctrica o por gas. El periodo de exposición varía según la temperatura del horno, en este laboratorio generalmente se expone el material por tres horas a 140-180 oC, para esterilizar material de vidrio o metal. *No esterilizar medios de cultivo con calor seco. 2. Esterilización con calor húmedo. Es el método más rápido y eficaz, usándose ollas de presión (express) o autoclaves. El principio se basa en el uso de vapor de agua a presión, contenidos en recipientes herméticamente cerrados. Los medios se esterilizan normalmente a 15-20 libras por pulgada cuadrada (120 oC) por espacios de 15-20 minutos. El suelo y otros materiales pueden requerir tiempos mayores a 30 minutos, según se desee esterilizar o pasteurizar. 3. Esterilización por filtración. Se usa en el caso de sustancias no termoestables (algunos azucares, sueros o extractos), utilizando para ello filtros de porcelana o de membrana millipore. Estos filtros evitan el paso de esporas, bacterias, aun de las más pequeñas, de tal forma que las sustancias pasan libres de contaminantes. 4. Esterilización por radiación. Se usa generalmente para esterilizar cuartos o cámaras de transferencia de cultivos, comúnmente mediante luz ultravioleta. 5. Esterilización mediante sustancias químicas. Se usan gases o líquidos. Entre los gases, el más usado es el oxido de propileno, sobre todo para esterilizar material vegetal, aunque también puede usarse para material termosensible. El suelo puede ser esterilizado con gases tales como mezclas 2
  7. 7. Laboratorio de fitopatología de bromuro de metilo y cloropicrina a altas dosis. Este método requiere de recipientes cerrados y es peligroso, por lo que su uso es muy limitado. 6. Esterilización con líquidos. La esterilización con líquidos no es común. En laboratorio es frecuente la desinfección con alcohol o hipoclorito de sodio, pero esta práctica no es una esterilización en sentido estricto. OBJETIVOS Conocer los métodos comunes de esterilización en el laboratorio de fitopatología. MATERIALES Y METODOS ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO 1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal. 2). Introducir el material a utilizar. 3). Cierre el recipiente correctamente. 4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión. 5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de escape. El tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15 libras/pulgadas cuadradas. 6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, reglando la flama del mechero. 7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero presión antes de sacar con cuidado el material caliente. ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia. ESTERILIZACION CON CALOR SECO 1). Deposite el material seco y limpio en la estufa. 2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor. 3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el termómetro y cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura requerida (100-180 oC). 4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato. ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire frío o caliente se revientan. 3
  8. 8. Laboratorio de fitopatología RESULTADOS: la práctica será demostrativa. DISCUSION: anote observaciones y enriquezca la información aquí mencionada, consultando bibliografía. Señale diferencias entre esterilización y pasteurización. BIBLIOGRAFIA Echando, E. 1971 Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera Hermanos. Sucesores. 89 pp. López, A. G. F. 1979. Manejo de hongos fitopatógenos. Departamento de Parasitología Agrícola. UACH. 135 pp. Diversos textos de microbiología: Bryan, Burdon. Pelckzar, etc. 4
  9. 9. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 3 PREPARACION Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCION Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalar que la mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran: 1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios. 2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. 3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave u olla express. 4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo. 5. La mayoría de los hongos crecen bien a Ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungoso. 5
  10. 10. Laboratorio de fitopatología 6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular. El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible. Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser: 1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc… se requieren en forma de extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave. 2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maíz, agar etc… son los más usados. 3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser: a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas. b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante. c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa. 6
  11. 11. Laboratorio de fitopatología PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes. A continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de fitopatología en el mundo. OBJETIVOS Aprender a elaborar los medios de cultivo más comunes usados en el aislamiento de hongos fitopatógenos. a) Elaboración de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayoría de hongos y bacterias. Papa partida 200 gr Dextrosa (glucosa) 13 gr Agar 18-16 gr Agua destilada 1000 ml 1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua. 2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver. 3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle ambos líquidos, agregue la dextrosa y homogenice. 4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la esterilización. 5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20 libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del momento en que se alcance la presión ya mencionada. 6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo. Los tubos 7
  12. 12. Laboratorio de fitopatología de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar) para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A ciertos medios selectivos también se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u otros fungicidas pero en dosis bajas (mg/lt). b). Elaboración de V8-agar. Para Phycomycetes y otros Jugo V8 200 ml Carbonato de calcio 3 gr Agar 16-18 gr Agua destilada 800 ml Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y el agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el agar. Una vez que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vacíe el medio en recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos. c). Elaboración de agua-agar. Phycomycetes y otros. No crecen bacterias. Agar 16 gr Agua destilada hasta completar 1000 ml Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez disuelto, lleve el volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes apropiados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión. 8
  13. 13. Laboratorio de fitopatología RESULTADOS Serán los medios en si, elaborados correctamente. DISCUSION Complemente la información de la introducción, discuta las dificultades, ventajas y desventajas de cada medio. Indique como cultivar royas y cenicillas. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p. López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México. 9
  14. 14. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 4 AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATOGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS INTRODUCCION El aislamiento consiste en el proceso de separación de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial. El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el más común en un laboratorio de fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida, sin embargo, puede tener objetivos didácticos o de investigación sobre taxonomía, fisiología y genética microbiana. Es común también cuando se quiere tener cepas puras en la evaluación de productos químicos in Vitro. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biología de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo: a) pueden ocurrir mutaciones b) se puede perder parcial o totalmente su patogenicidad, c) los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variación, d) existen hongos que no se pueden cultivar (parásitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las técnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar y de la propia experiencia del investigador. OBJETIVOS Aprender a aislar y cultivar hongos fitopatógenos MATERIALES Y METODOS INDUCCION AL DESARROLLO MICELIAR Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere tener a un hongo en cultivo puro. 10
  15. 15. Laboratorio de fitopatología 1. Lavar el material enfermo con agua corriente y secar. 2. Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos queden de 0.3 a 0.5 cm de longitud. 3. Desinfectar los trocitos (ver anexos al final de la práctica). 4. Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua destilada estéril y secarlos perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones. 5. Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, selle la caja con cinta adhesiva e incube de 20 a 25 oC. INDUCCION A LA ESPORULACION Se recomienda para aislar hongos que esporulen abundantemente y que atacan las partes aéreas de las plantas. 1. Colocar en una caja de Petri 1 o 2 hojas de papel kleenex y humedecerlo con agua destilada estéril (cámara húmeda). 2. Pasar la sección del tejido infectado a la cámara Húmeda. 3. Después de 24-72 hrs, observar con el microscopio estereoscopico, tomar las esporas con agujas de disección y transferir a una caja de Petri con PDA. PURIFICACION DE CEPAS Es raro que al hacer una siembra o aislamiento, se obtenga solo al hongo deseado, normalmente también crecen microorganismos contaminantes de los cuales es necesario apartar al organismo de interés. Este proceso se denomina purificación y normal mente consiste en cortar puntas de micelio del borde de la colonia en crecimiento, mediante aguja de disección flameada. Esta pequeña porción del hongo y agar se deposita en otras cajas con medio de cultivo estéril y de esta forma se obtienen cultivos puros. Es aconsejable hacer aislamientos que la muestra sea fresca (pocas horas) y que se siembre a partir del borde de lesiones en crecimiento activo, de lo contrario la purificación se dificulta, en ocasiones es necesario utilizar medios selectivos con antibióticos y fungicidas para purificar cepas (la experiencia es clave). 11
  16. 16. Laboratorio de fitopatología DESINFECCION Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de organismos que invaden los tejidos muertos por el patógeno. Estos contaminantes dificultan el aislamiento, por lo que generalmente es necesaria una desinfección previa a la siembra. Entre los desinfectantes más usuales se tienen a: 1. Hipoclorito de sodio. El desinfectante más usado es el blanqueador de uso domestico (cloralex), basta mezclar una parte de esta sustancia en cinco partes de agua destilada para obtener el producto deseado ya que el blanqueador viene al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el tiempo de exposición varía de 30 a 90 segundos; el material viejo o muy contaminado se puede tratar por 2 a 3 minutos siempre que no se elimine el patógeno. 2. Alcohol etílico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30 segundos, el uso de alcohol al 95% es peligroso por su flameabilidad. RESULTADOS Describa brevemente que organismos obtuvo con cada una de las técnicas de aislamiento. DISCUSION Mencione las dificultades, ventajas y desventajas de las técnicas usadas. Mencione cuales fueron los contaminantes y en base a que los identifico. *Apoyarse en el instructor. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-290 p. López, A.G.F. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 12
  17. 17. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 5 ELABORACION DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATGENOS INTRODUCCION Por su tamaño microscópico, los hongos generalmente no pueden observarse a simple vista, a excepción de hongos macroscópico que por su propio tamaño pueden ser observados superficialmente sin aparatos, siempre y cuando no se requiera estudiar detalles de las esporas, etc. Para su observación al microscopio compuesto, los hongos requieren ser preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de rutina se hacen preparaciones temporales desechables, pero si se desea preservar especimenes por largo tiempo es necesario elaborar montajes permanentes, los que de hacerse correctamente duran uno o varios años en buenas condiciones. Para hacer un montaje de calidad, se requiere paciencia y experiencia, además de la destreza individual, sin embargo, todo fitopatólogo debe intentar hacer buenas preparaciones, ya que actividades prácticas tales como el diagnostico de enfermedades dependen de alto grado de buenas preparaciones. OBJETIVOS Aprender a preparar montajes microscópicos de especimenes fungosos. MATERIALES Y METODOS MONTAJE CON AGUJA DE DISECCION Es útil para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la superficie del hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo. Es la técnica obligada para hacer preparaciones a partir de raíces infectadas. El procedimiento consiste en: 1. Colocar una pequeña gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 13
  18. 18. Laboratorio de fitopatología 2. con la punta de la aguja humedecida tome o roce ligeramente las esporas y/o micelio que desee montar, evite tomar material excesivo ya que dificulta la observación posterior. De ser necesario, puede auxiliarse del microscopio estereoscopico para hacer mejor el trabajo. 3. Transferir el material a la gota del medio de montaje, coloque cuidadosamente un cubreobjetos y observe con los objetivos 10x y 40x. 4. Para montajes temporales use agua o lactofenol, para preparaciones permanentes use lactofenol y selle con esmalte para uñas. MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVA Es la técnica más rápida y fácil, sobre todo para personas inexpertas. Las preparaciones son exclusivamente temporales. No usar para hacer montajes a partir de raíces, especialmente si estas presentan suelo adherido. El método consiste en: 1. Colocar una gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 2. cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande que la longitud del portaobjetos, no use trozos de cinta más pequeños o más grandes. 3. Tomar la cinta por los extremos con dos de los dedos, deposite suavemente la parte engomada sobre la superficie del hospedante o crecimiento del hongo en medio de cultivo, evite presionar demasiado, pues tomara material en exceso y/o también se pegaran setas u otras estructuras de la planta que dificultaran la observación. 4. Tome la cinta con las dos manos y péguela sobre el portaobjetos, vigile que la cinta pegue rápidamente en ambos extremos del cristal, pues de lo contrario despegara fácilmente, observe al microscopio con los objetivos 10x y 40x. Las mejores preparaciones no son aquellas que presentan mucho material, sino las que contienen las estructuras típicas del hongo, más aun si se encuentran bien separadas y arregladas en forma estética. 14
  19. 19. Laboratorio de fitopatología CORTES DE CUERPOS FRUCTIFEROS Cuando se quieran observar estructuras que se encuentran parcial o totalmente inmersas en el hospedante y/o encerradas en cuerpos fructíferos, es necesario hacer cortes transversales que permitan observar perfectamente la forma y ubicación interna de las esporas, estos cortes se pueden hacer con aparatos especiales, pero generalmente se efectúan de manera manual mediante el siguiente método: 1. Coloque el material enfermo bajo el microscopio de disección, separe una porción superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando no dañar los cuerpos fungosos, esto facilitara los cortes de los cuerpos ya que solo manejaremos una pequeña porción de tejido, el tamaño de la muestra puede variar, pero se aconseja dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/- 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto depende de muchos factores tales como el tamaño de los cuerpos a cortar, consistencia del tejido etc., la experiencia es básica. 2. Con una navaja de rasurar sin usar, separe el tejido adyacente que se encuentra adelante y a los lados del cuerpo fructífero; este quedara delimitado y listo para los cortes definitivos. 3. Coloque el dedo índice de la mano izquierda junto al cuerpo a cortar, cuide de no presionar directamente al cuerpo, de tal forma que al recargar la navaja en el dedo índice, este guíe y regule el espesor de los cortes, estos deben ser lo más delgado posible (cortes transversales de un solo tajo). 4. Los cortes que van quedando adheridos o por un lado de la navaja, se toman con una aguja de disección humedecida y se transfieren al portaobjetos, en el que previamente se a depositado una gota de medio de montaje. Coloque al portaobjetos y observe al microscopio. MEDIOS DE MONTAJE 1. Agua destilada. Útil para montajes temporales, se puede agregar detergente en bajas cantidades para reducir la formación de burbujas. 2. Lactofenol. Aunque existen otros medios, este es uno de los más usados por su fácil preparación y alta eficiencia, además también funciona como solución fijadora y restauradora de la turgencia del material. 15
  20. 20. Laboratorio de fitopatología PREPARACION DEL LACTOFENOL Fenol (cristales) 20 gr Ácido láctico 20 ml Glicerina 40 ml Agua destilada 20 ml Para obtener una mezcla rápida, calentar ligeramente el agua hasta disolver el fenol, agregue enseguida la glicerina y el ácido láctico, se pueden agregar (opcional) colorantes tales como el azul algodón u otros, para teñir las esporas y para que la observación sea más agradable a la vista. ABLANDAMIENTO DE TEJIDOS SECOS Las tres técnicas descritas se pueden hacer con tejido fresco y seco. En el caso de cortes de material seco o duro se puede reblandecer los trozos a cortar en una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 2%, esto facilita los cortes, el periodo de exposición es variable, pero comúnmente basta de 3 a 5 minutos, la exposición prolongada reblandece excesivamente los tejidos y/o desintegra las estructuras fungosas. RESULTADOS Se considera como tales los montajes en si. DISCUSION Se discuten las dificultades obtenidas con cada una de las técnicas; ventajas y desventajas de cada una. BIBLIOGRAFIA Echando, E. 1971. Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera Hermanos. 13-14 p. Streeta, R.B. 1972 Tha Diagnosis of Plant diseases, Univ. Arizona Press. López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. UACH. 25-29 p. 16
  21. 21. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 6 SINTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATOGENOS INRODUCCION De manera sencilla podemos decir que una enfermedad es toda alteración de la fisiología o de la estructura normal de la planta, lo suficientemente prolongada para producir síntomas visibles y ocasionar daños en la calidad y/o cantidad de la producción. En consecuencia, los síntomas son manifestaciones visibles de tal anormalidad, cada enfermedad fungosa es causada generalmente por un solo patógeno y presenta síntomas que son característicos; si bien es cierto que algunas enfermedades presentan síntomas idénticos, por lo que se requieren estudios de laboratorio para diferenciarlas. Por lo anterior, el conocimiento de los síntomas es indispensable para el diagnostico de enfermedades, sobre todo a nivel de campo, las enfermedades fungosas pueden agruparse en base a los síntomas principales, de la siguiente manera: 1. Enfermedades vasculares. Estos hongos atacan principalmente los vasos conductores, el micelio, esporas y algunos productos de su metabolismo taponean o destruyen los vasos, evitando el flujo de agua y nutrientes hacia la parte superior de la planta, a consecuencia de lo anterior generalmente se derivan tres tipos de síntomas: a) Marchitamiento. El sistema conductor es bloqueado gradualmente y la planta muestra flacidez que inicialmente se observa solo en horas calurosas, al paso del tiempo la planta muere. b) Amarillamiento. Puede o no presentarse con la marchitez, pero generalmente se presenta al inicio de la enfermedad, cuando los tejidos están parcialmente incluidos por el hongo. Se inhibe la síntesis de clorofila o esta se destruye por la acción de toxinas fungosas. c) Defoliación. La obstrucción del sistema vascular o el ataque directo al follaje provocan desprendimiento de hojas. 2. Enfermedades de tipo necrótico. Algunos hongos invaden inicialmente los tejidos parenquimatosos, si bien es cierto que con el tiempo también alcanzan los vasos conductores, los síntomas más comunes de este tipo son: 17
  22. 22. Laboratorio de fitopatología a) Manchas foliares. Estos hongos parásitos destruyen la lámina foliar, ramas o superficies de frutos, las manchas son de tamaño pequeño, es decir que solo alcanzan un tamaño y forma determinada a pesar de que el ambiente sea favorable, con frecuencia las lesiones están limitadas por las nervaduras principales. b) Tizones. El patógeno causa manchas necróticas extensivas en cualquier órgano de la parte aérea de la planta, las lesiones crecen de forma relativamente indefinida mientras existan condiciones ambientales favorables, los órganos afectados presentan aspecto de quemaduras por fuego. c) Pudriciones. Estos patógenos producen enzimas que destruyen la lámina media de la pared celular y como resultado, las células pierden su integridad, se plasmolizan y mueren. Las pudriciones pueden ser blandas o secas. 3. Enfermedades hiperplasicas. Algunos patógenos estimulan anormalmente las células, induciendo su división excesiva (hiperplasia) o provocan su crecimiento exagerado (hipertrofia), a simple vista se aprecian tumores o agallas en distintos órganos de la planta. OBJETIVOS Reconocer distintos tipos de síntomas causados por hongos fitopatógenos. MATERIALES Y METODOS 1. Identifique los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione su instructor. 2. Describa en forma sencilla al menos un tipo de síntomas típico representativo de cada grupo, señalando: color, tamaño, forma, borde, consistencia etc. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la enfermedad. 3. Haga un dibujo sencillo pero explícito de cada tipo de síntomas que observe. RESULTADOS Se consideran los dibujos y la descripción 18
  23. 23. Laboratorio de fitopatología DISCUSION Señale como diferenciar síntomas de enfermedades causadas por hongos y bacterias. indique que tan confiable resulta la identificación en base a síntomas, en caso de dos enfermedades que observe en el mismo cultivo, señale brevemente como diferenciarlas en base a síntomas (por ejemplo, tizón temprano y tizón tardío en papa). BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA. México. 284 p. González, L.C. Introducción a la Fitopatología IICSA. Walker, J.C. Patología Vegetal. OMEGA. Barcelona, España. 19
  24. 24. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 7 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS FITOPATOGENOS INTRODUCCION. Los hongos causan enfermedades mediante un proceso que indica cuando las esporas (o micelio) que germina y el patógeno penetra a los tejidos sanos, al paso de días y meses el patógeno invade los tejidos, produciendo sobre la superficie del hospedante nuevas generaciones de esporas. La identificación de enfermedades se basa en gran parte en el reconocimiento de síntomas típicos de cada enfermedad, en caso de duda o de enfermedades poco conocidas, es necesario un estudio de laboratorio para determinar la causa del problema. En laboratorio, el fitopatologo analiza las plantas y en base al microorganismo detectado a los síntomas y apoyándose en literatura especializada da un diagnostico del problema, sin embargo estos diagnósticos con frecuencia tienen alto grado de incertidumbre, ya que es raro encontrar a un solo microorganismo asociado a la enfermedad en estudio, en ocasiones hay 2, 3, 4 o más organismos creciendo en los tejidos enfermos. Aquí cabe la interrogante ¿ cuál de todos es el causante del problema en estudio?. El diagnostico rápido y preciso es indispensable para tomar medidas de control, diagnósticos equivocados conducen a fallas en el control, que pueden conducir a pérdidas totales, por lo anterior, el investigador tiene que probar experimentalmente en ocasiones a todos los microorganismos asociados para establecer la causa de la enfermedad. Los ensayos que se utilizan para probar la capacidad de un organismo para causar una enfermedad, se denominan “pruebas de patogenicidad”. Estas pruebas tienen que satisfacer cuatro reglas o postulados fueron desarrollados por Roberto Koch en el siglo pasado y señalan que: 1. El microorganismo debe estar asociado con la enfermedad, a su vez esta no debe aparecer sin que el microorganismo este o haya estado presente. 20
  25. 25. Laboratorio de fitopatología 2. El microorganismo debe aislarse en cultivo puro y deben establecerse sus caracteres específicos (forma, tamaño, fisiología, etc.) 3. El microorganismo puro debe reproducir los síntomas de la enfermedad cuando se inocule en plantas sanas de la misma variedad o tipo del cual fue aislado, este proceso deberá efectuarse bajo ambiente favorable a la enfermedad. 4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante inoculado y debe mostrar las mismas características en cultivo, que el microorganismo inoculado originalmente en plantas sanas. En el caso de parásitos obligados, es necesario hacer adaptaciones que permiten cumplir los postulados de Koch. OBJETIVOS Conocer la metodología para probar la patogenicidad de hongos fitopatogenos y cumplir los postulados de Koch. MATERIALES Y METODOS 1. Colecte frutos de tomate enfermos por pudrición agria (Geotrichum candidum), observe y describa los síntomas, observe al microscopio el cuerpo (micelio y esporas) del hongo y haga dibujos detallados de estos. 2. Desinfecte frutos de tomate sumergiendolos en hipoclorito de sodio al 2% por dos minutos, los frutos deberán estar sanos y sin golpes, de preferencia maduros y consistencia firme. 3. Provoque heridas de 0.5 a 1.0 cm de profundidad en los frutos desinfectados, para ello utilice una aguja de disección esterilizada, a la flama de un mechero. 4. Coloque sobre las heridas un disco pequeño de PDA-hongo (micelio y esporas) o gotas de agua esteril con esporas en suspensión de cultivos jóvenes y puros de Geotrichum candidum. Tome otros frutos desinfectados e inocúlelos de la misma forma, pero sin causar heridas previas, deje frutos con o sin heridas sin inocular, como testigos. 5. Coloque los frutos inoculados y no inoculados por separado, en una bolsa o recipiente que contenga papel absorbente humedecido con agua destilada estéril (cámara humeda). 6. Incube de 2 a 4 días a temperatura de 25 a 39 oC. 21
  26. 26. Laboratorio de fitopatología 7. Al detectar síntomas de la enfermedad en los frutos inoculados, proceda a hacer el reaislamiento de manera similar a como realizó el aislamiento, cheque las características del hongo desarrollando en los frutos inoculados antes de hacer el reaislamiento. 8. Compare las características morfológicas del hongo inoculado, compare también los síntomas reproducidos artificialmente con los que presentaron los frutos infectados naturalmente. RESULTADOS Incluya dibujos del hongo observado en frutos colectados en el mercado y el obtenido en frutos inoculados. Describa los síntomas de la enfermedad. DISCUSION Discuta brevemente la importancia de este tipo de pruebas, señale si los síntomas de los frutos inoculados y del patógeno reaislado corresponden a los síntomas y características del patógeno originalmente inoculado. Indique sí se cumplieron los 4 postulados. Indique como probaría la patogenicidad del mildiu del pepino. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p. González, L.C. 1981. Introducción a la Fitopatología. IICA. San José Costa Rica. 12-13 p. Bauer, L.I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados. 22
  27. 27. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 8 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES INTRODUCCION Los phycomycetes son hongos de habitat acuático o semi acuático que abarcan a numerosos géneros y especies de gran importancia agrícola. El cocnocimiento de la sintomatología, biología, morfología y control es de interés fundamental para el parasitólogo. El control de enfermedades se basa en une identificación correcta del patógeno, de ahí que sea importante conocer las características más sobresalientes de los principales géneros de esta clase. OBJETIVOS Conocer y diferenciar las características morfológicas de los principales géneros de importancia agrícola de la clase phycomycetes. MATERIALES Y METODOS 1. Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o de cultivos proporcionados por el laboratorio, los montajes se harán con cinta o aguja, tal como se señalo en prácticas anteriores (de ser necesario, hacer cortes). 2. Usando los montajes frescos o preparaciones permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio compuesto los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: tipo de micelio, esporangios, esporangioforo y oosporas. 4. Se estudiaran los siguientes géneros: a) Pythium b) Phytophthora c) Peronospora d) Bremia e) Plasmopara f) Pseudoperonospora g) Rhizopus 23
  28. 28. Laboratorio de fitopatología h) Albugo i) Otros. RESULTADOS Se presentarán los dibujos tal y como se hicieron en laboratorio. DISCUSION Se señalara como diferenciar a esta clase de las tres restantes. Indique también como diferenciar entre si los géneros observados, para ello consulte literatura al respecto. Brevemente indique los síntomas que provocan las especies dibujadas. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley. México. Alexopoulos, C.J. Introducción a la Micología. Frezz, M.J. 1950. Las especies de Phytophthora en la Argentina. Ministro de Agricultura, Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 24
  29. 29. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 9 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES. INTRODUCCION La mayor parte de los géneros y especies de importancia agrícola de la región, pertenecen a esta clase. La sintomatología varía desde pudriciones de la raíz y tallo, manchas y tizón en el follaje así como marchitez y pudriciones en frutos. El conocimiento de la forma y color de las esporas y/o cuerpos fructíferos es indispensable para la identificación de estas especies. El diagnóstico correcto es pre-requisito para el control de las enfermedades causada por estos o cualquier patógeno. En ese sentido, el conocimiento de la morfología de cada género es de vital importancia para el fitopatólogo. OBJETIVOS Conocer y diferenciar en base a morfología los principales géneros de importancia agrícola de la clase Deuteromycetes. MATERIALES Y METODOS. 1. Elabore preparaciones temporales mediante la técnica de la aguja, cinta adhesiva o cortes. 2. Use las preparaciones señaladas o montajes permanentes proporcionados por su instructor y observe al microscopio compuesto con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: micelio septado, conidios y conidioforos, esporodoquios y sinemas, acervulos y picnidios. 4. Se estudiaran los siguientes géneros: a) Oidium b)Oidiopsis c)Alternaria d) Helminthosporium 25
  30. 30. Laboratorio de fitopatología e) Corynespora f) Botrytis g) Geotrichum h) Aspergillus i) Phymatotrichum j) Colletotrichum k) Macrophomina l) Rhizoctonia m) Sclerotium RESULTADOS Se consideran como tales los dibujos originales elaborados en laboratorio. DISCUSION Mencione en base a que se puede diferenciar esta clase de las tres restantes. Indique brevemente las características más importantes de cada género, apoyandose en literatura adecuada. Indique los síntomas provocados por las especies dibujadas. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. Ed. LIMUSA-Wiley. México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología, EUDEBA, Buenos Aires, Argentina. Barnett, H.L. 1960. Ilustrated genera of imperfecti fungi. Burguess, Minneapolis. 26
  31. 31. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 10 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES. INTRODUCCION Los miembros de esta clase se caracterizan porque producen esporas de origen sexual en bolsas o sacos membranosos llamados ascas. Esta clase es de gran importancia sobre todo en zonas frescas o frías y de alta humedad relativa, en el noroeste de México no es común encontrar a la fase sexual de estos hongos, no así la fase asexual (conidios) de algunas especies de gran importancia, tales como la cenicilla. OBJETIVOS Reconocer algunos géneros de importancia agrícola de la clase Ascomycetes. MATERIALES 1. Use las preparaciones permanentes que le proporcione el instructor para observar al microscopio, en caso de haber material disponible, haga montajes temporales de estructuras de Ascomycetes siguiendo la técnica de raspado con agujas o haciendo cortes de material vegetal con cuerpos fructíferos. 2. Dibuje cada espécimen resaltando: ascosporas y cuerpos fructíferos. 3. Se observaran los géneros: a)Erisyphe b)Uncinula c) Ceratocystis d) Sclerotinia e) Phyllacora f) Otros 27
  32. 32. Laboratorio de fitopatología RESULTADOS Se consideran como tales a los dibujos hechos en laboratorio. DISCUSION Señale como diferenciar a los Ascomycetes de otras clases, anote la sintomatología y características de los principales géneros observados. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley, México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología, EUDEBA. Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México. 28
  33. 33. Laboratorio de fitopatología PRACTICA # 11 IDENTIFICACION DE GENEROS DE IMPORTANCIA AGRICOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES. INTRODUCCION Esta clase es de gran importancia fitopatológica ya que incluye a los chahuixtles o royas, así como a los carbones, estas enfermedades causan pérdidas de millones de dólares al año en diversas zonas agrícolas del mundo, algunos basidiomycetes causan pudrición de raíces de árboles o atacan madera. El conocimiento de la sintomatología y de las características morfológicas de estos hongos es importante para las enfermedades que causan, por lo antes dicho en esta práctica se pretende que el estudiante se relacione con estos dos aspectos indispensables para el diagnóstico de royas y carbones. OBJETIVOS Identificar y diferenciar los principales géneros causantes de royas y carbones. MATERIALES Y METODOS 1. Elabore preparaciones temporales mediante el método de la aguja y cinta. 2. Use estas preparaciones temporales o montajes permanentes proporcionados por su instructor para observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espécimen cuidadosamente., resaltando las características más importantes: uredosporas y teliosporas. 4. Se observaran los géneros: a) Puccinia b)Uromyces c) Phragmidium d) Hemileia 29
  34. 34. Laboratorio de fitopatología e)Neovossia f) Ustilago g) Entiloma h) Otros RESULTADOS Se consideran como tales a los dibujos hechos en laboratorio. DISCUSION Se describirán los síntomas observados para cada enfermedad. Señale como diferenciar a royas y carbones de otras enfermedades. Apoyarse en literatura especializada. BIBLIOGRAFIA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley, México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología. EUDEBA, Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatógenos, Universidad Aut 30

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