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INTRODUCCION:   El numero de fungemias nosocomiales debidas    a las especies de Cándida se debe a la    infección de pat...
   Se trabajos con 114 muestras de sangre donde se aisló    Cándida y se identificaron las siguientes especies:   Cándid...
CONCEPTOS BASICOS:   Fosfolipasa.-Son una    clase de enzimas que    hidrolizan los enlaces    éster presentes en los    ...
   Proteasas.-Son enzimas que rompen    los enlaces peptídicos de las proteínas.    Familia de enzimas de secreción aspár...
CANDIDA: Es un hongo diploide asexual. Normalmente  se encuentra en la cavidad oral, en el tracto  gastrointestinal y en ...
GLOSARIO: Factor              de              virulencia.-  Son        moléculas       producidas       por  un patógeno,...
GLOSARIO: Gonocócica.-Un tipo de enfermedad  clasificada entre las enfermedades  infecciosas y parasitarias. Candidiasis...
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Las levaduras delgénero Candida son hongosdimorfos de distribución universalque forman parte de la floraresidente de la bo...
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MORFOGENESISSe refiere a la transición entre laslevaduras y la forma de crecimientofilamentosa que puede convertirse defor...
ENZIMASLas     enzimas     sondeterminantes         de    PROTEASASvirulencia            enCandida, ya que tienenla capaci...
PROTEASAS                            FOSFOLIPASASEn Candida albicans se han              Se han identificado cuatrodescrit...
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE            GENES EN REACCIÓN AL MEDIO            AMBIENTECandida albicans es capaz de sobrevivir ...
ADHESINA
BIOPELICULA
DIAGNOSTICOLos métodos de diagnóstico         1) Observación microscópicamicrobiológico los podemosclasificar de          ...
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICAExamen en fresco con KOH (10-30%):Facilita la observación ya que el KOH presenta efector clarifica...
Hifas y blastosporas de                             Cándida albicans en                             frotis oral. (Tinción ...
MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVOLa mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un grannúmero de medios de c...
El tubo germinal es unaextensión filamentosade la levadura, sinestrechamiento en suorigen, cuyo ancho suele serla mitad de...
Materiales y Métodos
   Las muestras de sangre fueron    recolectadas en las unidades de cuidados    intensivos (UCI), unidades de diálisis, y...
Detección de Proteinasa La proteinasa Cándida fue detectada  por la ligera modificación del método  Sabouraud Glucosado A...
   Candida albicans aislada de cavidad oral
Sabouraud Glucosado Agar   Es un método diferencial para el cultivo de hongos    con un medio de bajo pH y elevada concen...
Detección de Fosfatasa   El método ligeramente    modificada de    Samaranayake et al. Medio    de yema de huevo utilizad...
RESULTADOS:   De las 114 especies aisladas de Candida, en las    muestras de sangre se encontraron los    siguientes gene...
RESULTADOS:   El valor Pz para la actividad de proteinasa    oscilaron entre 0,17 y 1,0.   El nivel más alto de la activ...
Tabla 1. actividad de la proteinasa (mm) exhibida por candida. Aislación desangre Candida spp.        N         Mean      ...
Tabla 2. actividad de la fosfolipasa (mm) exhibida por candida spp. Aislación de sangre. Candida spp.        N         Mea...
Discusiones   El considerable aumento de    candidiasis se observa en pacientes    de las UCI, que reciben tratamiento   ...
 Se consideraron como importantes  factores de virulencia de C.albicans a las  fosfolipasas y proteinasas aspartilo. Die...
Conclusiones A pesar de que todas las cepas  aisladas fueron patogenas, no todas  las cepas de candida producen  proteina...
 La virulencia de las especies de candida  no solo se atribuye a un solo factor, sino a  una combinación de varios factor...
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  1. 1. ACTIVIDAD PROTEINASA Y FOSFOLIPASA COMO FACTORES DE VIRUELENCIA EN ESPECIES DE CANDIDA AISLADAS DE SANGREPROFESORA: Angelica MinayaGalarretaCICLO: VIINTEGRANTES: Stephany Araujo Zacarías Arnold Cuya Silva Jonathan García Puccio Ilianova Huamán Zacarías Dante Huamani Zambrano Delia Morales Aguilar
  2. 2. INTRODUCCION: El numero de fungemias nosocomiales debidas a las especies de Cándida se debe a la infección de patógenos oportunistas que tiene que evadir el sistema inmunológico, para sobrevivir, dividirse en los tejidos y diseminarse a otros órganos. El trabajo presentado nos informa que la secreción de fosfolipasas y proteinasas son factores de virulencia de especies de Cándida, aisladas de hemocultivos de pacientes en cuidados intensivos, unidades de
  3. 3.  Se trabajos con 114 muestras de sangre donde se aisló Cándida y se identificaron las siguientes especies: Cándida albicans Cándida glabrata Cándida guilliermondii Cándida kefyr Cándida krusei Cándida parapsilosis Cándida tropicales Para detectar proteinasa se utilizo el método de Staib. Para detectar fosfolipasa se utilizo el método de Samaranayake et al.
  4. 4. CONCEPTOS BASICOS: Fosfolipasa.-Son una clase de enzimas que hidrolizan los enlaces éster presentes en los fosfolípidos. Sólo la PLB1 ha demostrado ser necesaria para la virulencia en modelo animal de candidiasis.
  5. 5.  Proteasas.-Son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Familia de enzimas de secreción aspártico proteinasas (SAP), que proporcionan al hongo un sistema proteolítico La presencia de los genes de la familia SAP es única en las especies patógenas de Candida.
  6. 6. CANDIDA: Es un hongo diploide asexual. Normalmente se encuentra en la cavidad oral, en el tracto gastrointestinal y en la vagina. La microfoflora comensal aprovecha la ‘oportunidad’ para provocar infección. 4a causa más frecuente de IS.
  7. 7. GLOSARIO: Factor de virulencia.- Son moléculas producidas por un patógeno, que influencia específicamente las funciones del hospedante, para permitir al patógeno crecer. Fungemias nosocomiales.-Enfermedad en la cual la sangre esta contaminada por hongos, es frecuente en pacientes con inmunosupresión o inmunodeficiencia. Método de Staib.-Es un método para identificar microorganismos utilizando una serie especial de tintes (colores).
  8. 8. GLOSARIO: Gonocócica.-Un tipo de enfermedad clasificada entre las enfermedades infecciosas y parasitarias. Candidiasis.-Es una infección fúngica (micosis) de cualquiera de las especies Candida (todas las levaduras), de las cuales la Candida albicans es la más común.
  9. 9. ESPECIES DE CANDIDA Especie A: Candida krusei: colonias rugosas de borde irregular y de color rosa pálido. Especie B: Candida albicans: colonias brillantes de borde regular y de color verde. Especie C: Candida glabrata: colonias brillantes de borde regular y de color rosa-violeta. Especie D: especie indeterminada; no es posible su identificación, ya que no produce ningún pigmento. Especie E: Candida tropicalis: colonias brillantes de borde regular y de color azul brillante
  10. 10. Las levaduras delgénero Candida son hongosdimorfos de distribución universalque forman parte de la floraresidente de la boca, tractodigestivo y genital femenino desujetos sanos. Bajo algunascondiciones, son responsables depatologías de alto riesgo y enocasiones fatales. Puedenproducir lesiones enpiel, uñas, cavidadoral, bronquios, pulmones yalcanzar todos los órganos ysistemas mediante ladiseminación sanguínea de lalevadura.Pesenta una forma ovalada y untama;o de 5-7 um.
  11. 11. FACTORES DE VIRULENCIALa incidencia cada vez mayor deinfecciones intrahospitalarias por MORFOLOGIA CELULARCandida y su asociación enindividuos susceptibles con ciertasinmunodeficiencias hacen posibleque estos microorganismos SECRECION ENZIMATICAcomensales, se vuelvanpatógenos. Conocer losfactores de virulencia hace posible EXPRESIÓN DIFERENCIAL DEdeterminar, cómo se modifica la GENES EN REACCIÓN ALrelación que establece con su MEDIO AMBIENTEhuésped una vez que losmecanismos de resistencia se han SINTESIS DE ADHESINAS Y SUdeteriorado. CAPACIDAD DE FORMAR BIOPELICULAS
  12. 12. MORFOGENESISSe refiere a la transición entre laslevaduras y la forma de crecimientofilamentosa que puede convertirse deforma reversible a células de levadura, concrecimiento de hifa o Pseudohifa, que esuno de los atributos que capacitan aCandida albicans para invadir lostejidos, aunque la hifa puede ser idóneapara abrir la brecha entre las barrerastisulares, gracias a que su punta es el sitiode secreción de enzimas capaces dedegradar proteínas, lípidos y otroscomponentes celulares, ésta facilita suinfiltración en sustratos sólidos y tejidos.
  13. 13. ENZIMASLas enzimas sondeterminantes de PROTEASASvirulencia enCandida, ya que tienenla capacidadde romper polímerosque proporcionannutrientes accesiblespara el crecimiento de FOSFOLIPASASlos hongos, así comode inactivar lasmoléculas útiles en ladefensa delorganismo
  14. 14. PROTEASAS FOSFOLIPASASEn Candida albicans se han Se han identificado cuatrodescrito varios miembros de una fosfolipasas (PLA, PLB,PLC ygran familia de enzimas de PLD), de las cuales sólo la PLB1secreción aspártico proteinasas ha demostrado(SAP). ser necesaria para la virulencia enLas proteínas SAP tienen funciones modelo animal de candidiasis.especializadas durante el proceso Una cepa con la deleción de esteinfeccioso e incluyen la digestión de gen (conmoléculas proteínicas para adquirir menor producción de esta enzima)nutrientes,digerir o distorsionar las reduce su virulencia hasta enmembranas del huésped y facilitar 60%, comparada con la cepala adhesión, la invasión a tejidos y silvestre. La PLB1A es unala digestión de moléculas del glucoproteína de 84 kDa,que tienesistema inmunitario del huésped actividad de hidrolasapara evitar o resistir el ataque Se secreta y detecta en la puntaantimicrobiano de éste; de las hifas durante la invasión a los tejidos.
  15. 15. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES EN REACCIÓN AL MEDIO AMBIENTECandida albicans es capaz de sobrevivir y proliferarenun amplio rango de tejidos, ya sea como comensal ocomo patógeno. Durante los diferentes estados ytiposde infección las células del hongo necesitan ampliaflexibilidad, ya que cada sitio anatómico tiene suspropias presiones ambientales. Esta al tener genesque codifiquen para factores de virulencia puedereflejar la adaptación a amplio rango de condicionesambientales.La principal función del gen PHR1 se asocia con lasíntesis de la pared celular, cuya expresión es óptimaen pH cercanos a la neutralidad, como en el torrentecirculatorio o en los tejidos, mientras que en el canalvaginal la función del PHR2, que es similar pero conpH ácido. Éste es un ejemplo de cómo Candidaalbicans se adapta a condiciones fisiológicasextremas dentro del huésped.
  16. 16. ADHESINA
  17. 17. BIOPELICULA
  18. 18. DIAGNOSTICOLos métodos de diagnóstico 1) Observación microscópicamicrobiológico los podemosclasificar de • Examen en fresco con KOH (10-30%).la siguiente manera: • Blanco de calco-fluor. • Tinciones biológicas.2) Métodos basados en el cultivo• Identificación mediante criterios morfológicos• Identificación mediante criterios bioquímicos basados en sistemas enzimáticos• Identificación rápida de levaduras mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas 3) Métodos independientes del cultivo. • Detección de antígenos o anticuerpos. • Detección de metabolitos. • Detección de componentes fúngicos.
  19. 19. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICAExamen en fresco con KOH (10-30%):Facilita la observación ya que el KOH presenta efector clarificador, disolviendo losdistintos elementos celulares y permaneciendo intacta la pared celular fúngica.Blanco de calco-flúor:Se une específicamente a la quitina de las células fúngicas y emite una fluorescenciaque delimita a los elementos fúngicos. Al microscopio de fluorescencia C. albicans ydemás especies muestran una fluorescencia verde brillante; C. glabrata emite unafluorescencia más débil.Tinción Biológica:Aunque las levaduras se tiñen bien con la mayoría de los colorantes bacterianos(tinción de Gram), también disponemos de tinciones histológicas específicascomo la de plata-metenamina y la del ácido periódico de Scheffer (PAS), que nospermiten su visión bien diferenciada.
  20. 20. Hifas y blastosporas de Cándida albicans en frotis oral. (Tinción de PAS x 400).Blastosporas y tubosgerminales de Cándidaalbicans teñido con blancode calco-flúor, x1.000.
  21. 21. MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVOLa mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un grannúmero de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio deMicrobiología (agar harina de maíz, agar Wolin-Bevis, agar arroz oagar patata-zanahoria) es característica y de utilidad para la identificación deC. albicans y C. dubliniensis.. Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud(SDA), con o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento porexcelencia para la identificación de levaduras
  22. 22. El tubo germinal es unaextensión filamentosade la levadura, sinestrechamiento en suorigen, cuyo ancho suele serla mitad de la célulaprogenitora y su longitud treso cuatro veces mayor que lacélula madre.Sólo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sinembargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifasprecoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona deconstricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta pruebaes útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies deCándida, aunque no está exenta de falsos negativos.
  23. 23. Materiales y Métodos
  24. 24.  Las muestras de sangre fueron recolectadas en las unidades de cuidados intensivos (UCI), unidades de diálisis, y las unidades de oncología en los hospitales y asilos de ancianos en los alrededores de Bangalore. Un total de 114 cepas de Cándida fue recuperado de las muestras de sangre. Los aislamientos fueron identificados por tubo germinativo de información.
  25. 25. Detección de Proteinasa La proteinasa Cándida fue detectada por la ligera modificación del método Sabouraud Glucosado Agar Albúmina de suero bovino medio (2% de dextrosa, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,05%, agar al 2% mezclado después de enfriar a 50 C con 1% bovino solución de albúmina de suero)
  26. 26.  Candida albicans aislada de cavidad oral
  27. 27. Sabouraud Glucosado Agar Es un método diferencial para el cultivo de hongos con un medio de bajo pH y elevada concentración de azúcar. Recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo, etc.). 40 g/L glucosa 10 g/L pluripeptona 15 g/L agar 0,05 g/L [cloranfenicol] pH 5.6
  28. 28. Detección de Fosfatasa El método ligeramente modificada de Samaranayake et al. Medio de yema de huevo utilizado consistió en 13,0 g de agar de dextrosa Sabouraud (SDA), 11,7 g de NaCl, 0,111 g de CaCl2, y 10% de huevo estéril. La yema se centrifugó y 20 ml del sobrenadante se añadió al medio esterilizado.
  29. 29. RESULTADOS: De las 114 especies aisladas de Candida, en las muestras de sangre se encontraron los siguientes generos C. albicans (37), C. glabrata (7), C. guilliermondii (5), C kefyr (3), C. krusei (45), C . parapsilosis (5) y C. tropiccilis (12). Todos los aislamientos fueron probados para la proteinasa y la producción de fosfolípasa. En la actividad de la proteinasa se detectó en 85 (74,56%) aislamientos y la actividad fosfolipasa se detectó en 51 (44,73%) aislamientos (Tablas 1 y 2). Los aislamientos probados demostraron diversos grados de actividad fosfolipasa (valor PZ: 0.23-1.0), con el más importante actividad de la fosfolipasa.
  30. 30. RESULTADOS: El valor Pz para la actividad de proteinasa oscilaron entre 0,17 y 1,0. El nivel más alto de la actividad enzimática era para los valores de Pz cercanos a cero. ANOVA se utilizó para comparar la producción de proteinasa y fosfolipasa en diferentes organismos. No hubo diferencia significativa entre los organismos con respecto a la significancia de produccion de proteinasa y fosfolipasa (p> 0,05).
  31. 31. Tabla 1. actividad de la proteinasa (mm) exhibida por candida. Aislación desangre Candida spp. N Mean Std. Minimum Maximum DesviationC. albicans 37 0.55 0.36 0.20 1.00C. glabrata 7 0.43 0.26 0.24 1.00C. guilliermondii 5 0.56 0.40 0.19 1.00C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00C. Krusei 45 0.42 0.25 0.20 1.00C. parapsilosis 5 0.38 0.35 0.20 1.00C. tropicalis 12 0.52 0.37 0.17 1.00
  32. 32. Tabla 2. actividad de la fosfolipasa (mm) exhibida por candida spp. Aislación de sangre. Candida spp. N Mean Std. Minimum Maximum DesviationC. albicans 37 0.66 0.34 0.23 1.00C. glabrata 7 0.73 0.35 0.24 1.00C. guilliermondii 5 0.86 0.31 0.30 1.00C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00C. Krusei 45 0.73 0.33 0.24 1.00C. parapsilosis 5 0.88 0.27 0.40 1.00C. tropicalis 12 0.68 0.35 0.23 1.00
  33. 33. Discusiones El considerable aumento de candidiasis se observa en pacientes de las UCI, que reciben tratamiento oncológico, los receptores de trasplante de órganos, y otros individuos inmunocomprometidos sometidos a fuertes protocolos terapéuticos.
  34. 34.  Se consideraron como importantes factores de virulencia de C.albicans a las fosfolipasas y proteinasas aspartilo. Dieciocho de C.albicans fueron productores de fosfolipasa. Sin embargo pocas cepas de C. tropicalis, C. krusey y C. galabrata se comportaron de manera similar. C. albicans, C. kefyr, C. parapsilosis y C. tropicalis mostraron que tienen similar actividad de la proteinasa.
  35. 35. Conclusiones A pesar de que todas las cepas aisladas fueron patogenas, no todas las cepas de candida producen proteinasa y fosfolipasa como factores de virulencia. La ausencia o presencia de estas secreciones enzimáticas nos puede indicar la naturaleza menos o mas virulenta de las especies de cándida, independientemente de la especie que haya sido aislada.
  36. 36.  La virulencia de las especies de candida no solo se atribuye a un solo factor, sino a una combinación de varios factores. La C. albicans muestra una significativa actividad de la fosfolipasa frente a las cepas que no son C. albicans. Las cepas que no son C. albicans muestra mayor actividad proteinasa frente a las cepas que si son C. albicans.
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