Extraccion de adn arn y proteinas

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Extraccion de adn arn y proteinas

  1. 1. EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS: EL PASADO Y EL PRESENTE CURSO: BIOQUÍMICA II DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica. INTEGRANTES:  Apaza Gonzales, Pamela  Fernández Lugo, Ana Cecilia  Huamán Benites, angie  Miguel Buendía, Rosaura  Pozo Cuya, Mireya  Uribe Pinta, Elizabeth  Vargas Inga, Damel
  2. 2. INTRODUCCIÓNLa extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamentalutilizado en la biología molecular.Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidosvivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo,mano de obra y su rendimiento es limitado.Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden serutilizados para extraer biomoléculas puras.Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y lavelocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce lacontaminación cruzada.
  3. 3. ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos almacenan lainformación genética delos organismos vivos y son losresponsables de la transmisiónhereditaria.Gran parte del desarrollo físico deun organismo a lo largo de su vidaesta programado en estas moléculas.Las proteínas que elaboraran suscélulas y las funciones que realizaranestán todas registradas en esta cintamolecular. Existen dos tipos: el ADN yel ARN.
  4. 4. EL ADNEs una macromolécula muy larga , filamentosa y formadapor desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto poruna base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupofosfato.  Hay 2 cadenas helicoidales de polinucleótidos enrolladas a lo largo de un eje común.  Estas cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de bases.
  5. 5. EL ARNEl ARN tiene una sola hebra.La pentosa de los nucleótidosconstituyentes es ribosa.Sus cuatro bases son: A, G, C, U.Es la molécula que dirige las etapasintermedias de la síntesis proteica.
  6. 6. TIPOS DE ARNARNm: Actúa como molde y transporta lainformación para la síntesis proteína. ARNt: transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis proteica. ARNr: Recibe la información genética. Traduce las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela donde se sintetiza las proteínas.
  7. 7. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSHISTORIA • Dr Friedrich Miescher realizó la primera extracción de ADN. • Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química de las células.1869 • Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirúrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.
  8. 8. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MÉTODOS EXTRACCIÓN EN CONVENCIONALES FASE SÓLIDA Tiocianato de guanidinio- Matrices de fenol- Sílica cloroformo Extracción Partículas de alcalina vidrio Método de Tierra de Extracción CTAB Diatomeas Centrifugación en gradiente de Perlas bromuro de etidio- cloruro de cesio. Magnéticas Purificación de ARN Poli (A) por Material de cromatografía de intercambio celulosa de oligo (dT). aniónico
  9. 9. PROTEÍNASLas proteínas desempeñanun papel fundamental para lavida y sonlas biomoléculas más versátilesy más diversas. Son imprescindibles para elcrecimiento del organismo.Realizan una enormecantidad de funcionesdiferentes.
  10. 10. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNASHISTORIA • Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las sustancias Albuminoides.Siglo XVIII • El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera descripción de PROTEÍNA. • Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El 1893 azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales. • Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la Segunda Guerra Mundial. • Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está 1940 fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del ataque a Pearl Harbor.
  11. 11. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de filtración en gel. Cromatografía de afinidad. Electroforesis en gel. Southwestern Blotting o immunoblotting.
  12. 12. OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS ALL IN ONE SISTEMA DE EXTRACCIÓN AUTOMATIZADO
  13. 13. TERMINOLOGÍA • Es un proceso por el cual átomos, iones o ADSORCIÓN: moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material. • Es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional enAGENTE CAOTRÓPICO: macromoléculas tales que proteínas, ADN o ARN y las desnaturaliza.CTAB (BROMURO DE • Es una sal de amonio cuaternarioHEXADECILTRIMETILAMONIO): LISIS CELULAR: • Es la rotura de la membrana celular.
  14. 14. TERMINOLOGÍA • Para homogeneizar células y tejidos en una MICROPISTILOS EPPI escala de medición Eppendorf® para tubos dePARA TUBOS DE ENSAYO: ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta). • Es una denominación utilizada para referirse a PELLET O PELET pequeñas porciones de material aglomerado o comprimido. SDS O NADS(DODECILSULFATO SÓDICO • Es un compuesto tensoactivo iónicoO LAURILSULFATO SÓDICO) • Es un tubo de microcentrífuga de forma de un pequeño contenedor cilíndrico de TUBOS EPENDORF plástico, con un fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento.
  15. 15. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR MÉTODOS CONVENCIONALES
  16. 16. LOS PASOS GENERALES PARA LAEXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN • EXTRACCIÓN: – Lisis de las células que contienen a los AN – Inactivación de nucleasas –Clarificación: separación de los AN de los restos celulares • PURIFICACIÓN: – De otros AN no deseados – De Lípidos, carbohidratos – De sales y otros compuestos orgánicos
  17. 17. LISIS CELULAREl procedimiento ideal delisis celular debe tener lafuerza necesaria para romperel material de inicio (células otejido) y la delicadezrequerida para preservar lasmoléculas de interés (ADN oARN).
  18. 18. MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS MÉTODOS MECÁNICOS MÉTODOS NO MECÁNICOS - AGENTES QUÍMICOS- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO Detergentes: CTAB , SDS ENZIMÁTICOS- CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN - Proteasas:- ULTRASONIDO lisozima Gluconasas peptidasas - ARNasa
  19. 19. CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DE ADN
  20. 20. MÉTODOSCONVENCIONALES
  21. 21. 1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):Fundamento del método:Extracción de ácidos nucleicos utilizando unasolución del agente caotrópico de Tiocianato deGuanidino que genera lisis celular y degradaciónde proteínas con la liberación de los ácidosnucleicos.Posteriormente el uso de solventes orgánicosfenol- cloroformo que permiten su separación derestos de proteínas, lípidos y la posteriorprecipitación de los ácidos nucléicos usandoetanol o isopropanol.
  22. 22. EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI Muestra vegetal - LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR PULVERIZAR EN - DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E EL MORTERO INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS. SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH BÁSICO < 11 CENTRIFUGA FENOL CLOROFORMO ADN FASE ACUOSA SUSPENSIÓNADN , RESTOS DEPROTEÍNAS Y LIPIDOS PROTEÍNAS CENTRIFUGA Y LÍPIDOS DISUELTOS FASE SÓLIDARESTOS DE ALTO PESOMOLECULAR ALCOHOL ETÍLICO PURO CENTRIFUGA ADN EN FORMA DE FILAMENTOS PELLET DE ADN
  23. 23. EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI Homogenizado de muestra vegetal pulveriza previamente y conservada en nitrógeno líquido a -196°C SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH REDUCIDO - ACETATO DE SODIO – FENOL - CLOROFORMO CENTRIFUGACIÓN A 4°C ALCOHOL ISOPROPÍLICO FASE ACUOSA ARN TOTAL FASE ACUOSA PELLET DE ARN TOTAL FASE ORGÁNICA ARN TOTAL ADN, PROTEÍNAS Y LIPIDOS DISUELTOS
  24. 24. 2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA Fundamento del método: Se basa en las diferencias en la desnaturalización y renaturalización del ADN plasmídico y el ADN cromosómico al aplicar NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico como el Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y Acetato de potasio. Se usa principalmente para extracción de ADN plasmídico de E. coli.
  25. 25. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA -Lisis celular Crecimiento de Cultivo bacteriano -Desnaturaliza de E. coli  Proteínas  ADN cromosómico Detergente SDS + NaOH ADN plasmídico Cosecha de cultivo bacteriano pH FUERTEMENTE ALCALINO DEL MEDIO Acetato pH NEUTRO DEL de MEDIO potasio -ADN plasmídico -Precipitación: se mantiene en  ADN cromosómico. CENTRIFUGAMOS solución  proteínas .
  26. 26. 3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB Fundamento del método: - Elaborado por Murray y Las células vegetales Thompson en 1980. pueden lisarse con el detergente iónico bromuro - Adecuado para extraer y de cetiltrimetil amonio purificar ADN de vegetales y (CTAB), que forma un especialmente indicado para complejo insoluble con los eliminar los polisacáridos y ácidos nucleicos en medio los compuestos polifenólicos hiposalino. De ese modo, que dañarían al ADN. los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.
  27. 27. PASOS: 2.- Suspender la 1.- Se debe moler la muestra en muestra después de solución tampón 3.-Centrifugo, elimino congelación con de extracción, que el sobrenadante y lavo. Nitrógeno líquido contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. ADN 5.-Añado etanol 4.- Incrementando la puro y ARNasa concentración salina
  28. 28. EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR Y NUCLEAR
  29. 29. EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
  30. 30. DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
  31. 31. 4.- CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl- Técnica usada para la Mini preparación de ADN plasmídico .- Requiere de cultivo bacterial a gran escala.- Separa ADN plasmídico superenrrollado del ADN plasmídico circular que está en estado relajado, concentrándolos por centrifugación en una gradiente de Bromuro de Etidio – Superenrrolado: DNA circular. Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.) Covalentemente DNA que no se ha cerrado y muy empacado. empacado.
  32. 32. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl• Fundamento del método: El BrEt ingresa y se intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmídico en estado relajado que en el ADN plasmídico superenrrollado. pudiéndose separar por centrifugación en el gradiente de densidad de CsCl.
  33. 33. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNAGRADIENTES DE CLORURO DE CESIO CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA + BROMURO DE ETIDIO CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
  34. 34. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsClGRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
  35. 35. GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl
  36. 36. 4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, enque contiene en su extremo 3, una extensión relativamente grande de200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poliA+.Cromatografía de afinidadPermite separar el conjunto de los mRNA celulares de otrosácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos enla columna, merced a la hibridación que va a producirse entresus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-Tque contiene la resina cromatográfica.
  37. 37. Mediante purificación depoli(A)-ARN: hay ARNmcon una cola depoliadeninas, mas de 100,llamada poli(A), estos ARNse pueden aislar porcromatografía en columnade celulosa de oligo dTcelulosa. La cola poli(A)hibridará con la cadenaoligo dT, fijándose en lacolumna. Después de lavarlos ARN no fijados elARNpoli(A) se eluye y seprecipita con alcohol etílicofrío.
  38. 38. Existen 2 métodos utilizados para la purificación de ARN poli(A) Cromatografía en Cromatografía de columnas de oligo (dT) loteLa cromatografía en columnas es trabaja con ARNusada normalmente para la mamífero en pocaspurificación de grandes cantidades de cantidades de muestrasARN Poli (A) no radiactivo aislado de que pueden sercélulas mamíferas. radiactivos o no
  39. 39. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE SÓLIDA Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los métodos convencionales. Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido de sales del buffer. La interacción de los puentes de hidrógeno con una matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas El proceso de Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por absorción está medio de un intercambio aniónico basado en lossiguientes principios y mecanismos de exclusión por afinidad y tamaño.
  40. 40. La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por eluso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas. Partículas de vidrio Tierra de diatomeas TIPOS soporte sólido (fase estacionaria). Matrices de sílica Transportadores de intercambio aniónico PASOS DE FASE SÓLIDA lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y elución. Tiras de 8 columnas Placa de 96 columnas
  41. 41. Puede ser hecho utilizando un buffer a un• Acondicionar la pH particular para convertir la superficie o columna para la grupos funcionales sobre el sólido dentro adsorción de la muestra de una forma química particular• Luego la muestra la cual ha sido degradada por el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la columna• El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la solución enlazante
  42. 42. PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASESÓLIDA 1. se acondiciona la columna para la absorción de la muestra. Esto puede ser 5. Luego los ácidos nucleicos se hecho usando un tampón a un pH eluyen con un tampón de máxima definido salinidad 2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el solido es decir en una forma particular de química 6. se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los 3. El ácido nucleico deseado se absorberá a restos de impurezas la columna con la ayuda de un alto pH y concentración de sal de la solución enlazadora. 7. finalmente, se reconstituye el 4. La muestra que fue degradada mediante el ADN de elevada pureza en un uso de solución amortiguadora se aplica a la tampón de baja salinidad para su columna posterior utilización o almacenamiento
  43. 43. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICALa matriz de silica hidratada la cual fue El principio de está basada enpreparada por reflujo de óxido de la elevada afinidad de lassilicio en hidróxido de sodio o cadenas de ADN cargadashidróxido de potasio en una negativamente con respecto aproporción molar de aproximadamente las partículas de sílica cargadas2: 1 respectivamente a 10: 1 por al positivamente.menos cerca de 48 horas habían sidointroducidas en la purificación delADN. El ADN se enlaza a la matrizinorgánica y es liberada en aguacaliente.
  44. 44. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las cadenas de ácidos nucleicos. DNA eluye de la sílica en agua DNA se une a la sílica en NaI
  45. 45. Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicasfacilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurredebido al mecanismo y principio similar al de la absorción decromatografía de adsorción.Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílicey partículas de vidrio puede ser usada para separar ácidonucleico de otras sustancias en la presencia de solucionesde sales caotrópicas.
  46. 46. TIERRA DE DIATOMEAS (DIATOMITA)Es una roca sedimentaria silícea formadapor micro-fósiles de diatomeas, algasmarinas unicelulares que secretan unesqueleto silíceo llamado frústula.
  47. 47. PROPIEDADES • Baja densidad. • Alta porosidad. • Dureza . • Capacidad abrasiva suave. • Conductividad térmica muy baja. • Alta resistencia a la temperatura. • Capacidad muy alta para absorber líquidos.
  48. 48. Filtro-ayudaPRINCIPALES Porosidad y Poder USOS Absorbente Purificación de ADN
  49. 49. DIATOMITALa diatomita puede ser utilizadopara la retirada del DNA enpresencia del agentecaotrópico altamente concentradotal como el ioduro de sodio,guanidinium hydrochloride yguanidinium thiocyanate.
  50. 50. DIATOMITA La diatomita tiene contenido de sílice hasta en un 94%. Ha sido usado para filtración y enQuitan el DNA trenzada doble cromatografías.pero no el ARN o las proteínas. La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampón que contiene alcohol. Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un tampón bajo en sal o en agua destilada.
  51. 51. PURIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO BASADO EN PARTÍCULAS MAGNÉTICASLa separación magnética es unamanera simple y eficiente el cuales utilizado actualmente en lapurificación de ácido nucleicos.
  52. 52. Se utilizan Preparados A partir detransportadores biopolímeros. magnéticos. Materiales con  Polímeros una gran área sintético superficial , son  Vidrio poroso preferidos para  Basado en ser usados en la materiales adherencia de magnéticos ácidos inorgánicos nucleicos.
  53. 53. ÓXIDO DE HIERROÓxido de hierro (II, III) u óxido ferroso férrico (Fe3O4). Los momentos magnéticos de los distintos cationes de hierro del sistema se Magnetita encuentran fuertemente acoplados. Esta moléculas van actuar como un imán.
  54. 54. Purificación de ácido nucleico basado en partículas magnéticas Purificación de ácidos nucleicos Uso de perlas magnéticas en baseimplica cuya superficie tiene a:microesferas una carga que se puedecambiar basándose en el pH magnéticas .o tampón. A pH bajo, están cargados positivamente,atrayendo a las moléculas de El ácido nucleico ADN con carga negativa y es luego eluído de permitiendo que las las partículas proteínas y los contaminantes que se magnéticas con un elimina mediante lavado. tampón de elución.
  55. 55. MATERIAL DE INTERCAMBIO ANIONÍCOEl ejemplo mas popular que se utiliza en elprincipio del intercambio iónico es « Resinade intercambio iónico». Se basa En la interacción entre grupos cargados positivamente de la celulosa de dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y fosfatos cargados negativamente del ADN .
  56. 56. Una resina de intercambio iónico puedeconsiderarse como una estructura decadenas hidrocarbonadas.Estas cadenas se encuentran unidastransversalmente formando una matriztridimensional que proporciona rigidez a laresina y entrecruzamiento que determina laestructura porosa interna de la misma.
  57. 57. Cromatografía de intercambio iónico TIPOS DE CromatografíaElectroforesis EXTRACCION de filtración en en gel DE gel PROTEINAS Cromatografía de afinidad
  58. 58. Proteínas Seroalbúmina extracelulares1) Solubilizar a la proteína y separarla Liberarse de la Proteínas citoplasmáticas célula.(lisis celular)
  59. 59. Lisis celular Técnica Principio Ejemplos Digestión enzimática Daños en paredes Lisozimas/ bacterias celulares Método químico Detergentes o agentes SDS, CTAB, tiocianato caotrópicos de guanidina Método físico Choque osmótico solución tampón
  60. 60. Comparación de las envolturas celularesbacterianas. Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1-membrana citoplasmática, 2-peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas,5-ácido liproteico.Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membranainterna), 2-espacio periplasmático, 3-membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas,8-lipopolisacáridos, 9-porinas
  61. 61. 2 ) Eliminarrestos celulares Mediante centrifugación
  62. 62. CROMATOGRAFIA 2 fases Móvil Estacionaria(Liquido o gas) (Papel o gel
  63. 63. Aspectos históricos de la cromatografía  La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.  En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados. Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.  En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo  Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica. Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.
  64. 64. Aspectos históricos de la cromatografía  A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial. En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948.  Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica. Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados
  65. 65. Cromatografía de Filtración en Gel Fase fija Fase móvil Formada por polímeros biológicos o sintéticos Tampón en el cual, la mezcla de proteínas se encuentra disuelta Polímeros  forma de pequeñas bolitas. Diámetro  10-250 µm.Estos se hinchan con una disolución de tampón Agarosa acuosa y se introducen en una columna Dextrano poliacrilamida
  66. 66. Cromatografía de Filtración en Gel oCromatografía de exclusión
  67. 67. Cromatografía de intercambio iónico • Sustancias ionizables: • DEAE =DIETILAMINOETIL fase • CM = CARBOXIMETIL estacionaria • Tienen carga (+) • Proteínas con carga (-) se unen al CM y quedan retenidas. • Las proteínas neutras y las que Fase móvil tienen carga (+) eluyen libremente. • Usar tampón con elevada concentración de NaCl
  68. 68. Cromatografía de intercambio iónico
  69. 69. Las proteínas cargadas negativamente se unen a la fase estacionariaLas proteínas cargadas positivamente Fase estacionaria eluyen FASE ESTACIONARIA
  70. 70. Ofrece la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y purificación de biomoléculas En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando mientras que otras pasan por la columna
  71. 71. Las proteínas La unión entre el Después dedeseada se eluye ligando y eliminar losde la columna moléculas diana de contaminantes, elmediante una las proteínas debe ligando acopladosolución que ser reversible para debe conservar sucontiene una alta permitir que las afinidad de uniónconcentración de la proteínas deban específica para lasforma soluble del eliminarse en una proteínas dianaLigando. forma activa
  72. 72. TIPOS DE MOLÉCULAS DIANALIGANDOEnzima Análogo de sustrato, inhibidor, cofactorAnticuerpo Antígeno, virusLectina Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célulaácido nucleico Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de ácido, la proteína de unión de ácido nucleicohormonas y Receptor, proteína portadoravitaminaEl glutatión Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GSTLos iones Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína ymetálicos residuos / triptófano en sus superficies
  73. 73. Existen numerosas variaciones de esta técnica en función delequipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en lascuales se va a llevar a cabo la separación: Electroforesis Electroforesis en gel Isoelectroenfoque capilar de poliacrilamida Electroforesis Electroforesis en gel Electroforesis en papel. de agarosa. bidimensional Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad.
  74. 74. Es uno de los métodos más utilizados parala purificación, análisis y caracterización deproteínas según su relación tamaño a cargaeléctrica en el que se utiliza una corrienteeléctrica controlada.usándose como base una matriz gelatinosa,ya sea de agarosa o poliacrilamida
  75. 75. COMO OBTENGO LA POLIACRILAMIDA POLIACRILAMIDA se mezcla acrilamida en  Es químicamente inerte, de diferentes proporciones propiedades uniformes, capaz , con el agente de ser preparado de forma entrecruzante N,N’ rápida . metilen bis acrilamida  Es un gel transparentes con estabilidad , insolubles en Además tiene la ventaja agua, y que permiten buena de que variando la visualización de las bandas concentración de durante tiempo prolongado polímeros, se puede modificar de manera  Tiene un amplio rango de controlada el tamaño pHs, temperatura y fuerza del poro iónica.
  76. 76. La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse acabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).Las diferencias entre uno y otro son : SDS-PAGE cuando las proteínas se ND-PAGE las proteínas solubilizan en presencia del mantienen su estructura detergente aniónico SDS , éste se tridimensional y las une a las proteínas, rompiendo diferentes cadenas interacciones hidrofóbicas y polipeptídicas pueden desnaturalizándolas. Las proteínas permanecer unidas, desnaturalizadas de la muestra separándose no sólo en adoptarán una estructura en forma función de su carga de bastoncillo con una serie de eléctrica, sino también moléculas de SDS cargadas según su tamaño y negativamente a lo largo de la forma cadena polipeptídica. Las proteinas se separan en base a su masa molecular
  77. 77. Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que essometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a travésdel gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separarmoléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (oaquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráficomuestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distintacantidad y tamaño de la muestra de proteínas.
  78. 78. Marcadores de pesomolecular:Mezcla de diferentesproteínas preteñidasde las que conocemos elpeso molecular.Por comparación podemosaveriguar el PM aparentede nuestra proteína
  79. 79. SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTTINGEs un método utilizado enBIOLOGÍA MOLECULAR; Muchas de las proteínas enlazadas por ADN enEl método lleva el nombre la célula deben serde su inventor, el británico Aisladasbiólogo Edward Southern . individualmente yFue descrito por primera vez caracterizadas paraen 1981. definir la función del gen.
  80. 80. método que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar proteínas de unión a ADNEs una técnica de detección Es un proceso que se utilizade moléculas de ácido para el análisis del ADN.ribonucleico (ARN) de unasecuencia dada dentro deuna mezcla compleja.
  81. 81. SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING1. Se separan las proteinas 2. Las proteinas separadas son mediante electroforesisen transferidas en un filtro de gel de poliacrilamida sodio membrana de nitrocelulosa dodecilsulfato difluoruro de polivinilideno 3. Las proteinas unidas a la menbrana se incuban luego con sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica de ADN para las proteínas absorbidas y analizarlas
  82. 82. ELECTROFORESISSe separan las proteínas o los ácidosnucleicos en un gel de electroforesisTRANSFERENCIA (BLOTTING)Se transfieren las bandas de proteínas o deácidos nucleicos desde el gel hacia unamembrana de nitrocelulosa (flechas azules)para que puedan reaccionar con la sondaradioactiva.Se añaden Anticuerpos radiactivos contrauna proteína o sondas radioactivas deácidos nucleicos (con secuencia conocida).Se espera a que reaccionen (A). Se colocala membrana de nitrocelulosa sobre unaplaca fotográfica y se revela (B).
  83. 83. Extracción de biomoleculas All-In-One Para la extraccion de acidos nucleicos se siguieron los pasos de Chomczynski y Sacchi (1987). Este método involucra la lisis celular con isotiocianato de guanidinio y fenol en una solución de una fase.
  84. 84. El homogeneización de la muestra:Permite la disgregación de laestructura celular para facilitar lasalida de los ácidos nucleicos. Estocon la utilización de SDS. Este método implica la lisis de la célula en presencia de agentes desnaturantes fuertes de proteínas (isotiocianato de guanidinio y fenol) en una solución monofásica.
  85. 85. Extracción Fenol-Cloroformo: ADN y/o ARN MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1) PH: reducido desproteiniza e inhibe nucleasas FASE ACUOSA: ARN FASE ORGANICA: ADN Y PROTEINASEl ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica porprecipitación con etanol o isopropanol .ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.
  86. 86. Sistema de extracción automaticaEs un Sistema de instrumentación muy grande, complejo ycostoso, diseñado para un alto volumen de procesamiento de MagNA Pure LC 2.0muestras.El hecho de automatizar el proceso de extracción de ácidosnucleicos es beneficioso para una serie de razones:Reduce el tiempo de trabajo.Disminuye los costos laborales.Aumenta la seguridad de los trabajadoresAumenta la reproducibilidad calidad de los resultados.Sobre todo minimiza el riesgo de contaminación cruzada.
  87. 87. Oprimir el botón desistema de manipulación de partícula Inicio. El ADN es eluídoparamagnética para procesar la muestra y 3 en un tampón de eluciónproporcionar un rendimiento constante y al final del procesopureza ya que no hay detectablecontaminación cruzada , entre lasmuestras Colocar el cartucho del 2 reactivo dentro de la El proceso de extracción completo máquina. dura unos 20 minutos desde el comienzo hasta el final Añadir la muestra 1 líquida al cartucho del reactivo. SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS
  88. 88. Magna pure Pequeño tamaño basado en el uso de partículas magnéticas. El ácido nucleico obtenido es altamente puro Ausencia de contaminación cruzada mediante filtros Hepa. Descontaminación por rayos uv  Demora Máximo de 30 minutos Es posible trabajar con un amplio rango de muestras (sangre total, suero, plasma, tejidos, células en cultivo, etc.),Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas dealta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica
  89. 89. Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicosMagNA Pure LC 2.0 (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales) Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas mononucleadas, células blancas, tejidos vegetales Realiza labores de pre-pcr en distintos formatos 1 2 Unidad Unidad inicio procesamiento 3 Unidad de elución y post-elución
  90. 90. La automatización haayudado en el aumento Por lo tanto las estaciones de del rendimiento y trabajo robótico para extracciónmejora la fiabilidad del de ácidos nucleicos deben cumplir proceso con una verdadera ¨Walk-away¨ , automatización, lo que significa un proceso totalmente automatizado un sistema portátil de extracción , ofrece varias ventajas , tales como la mano de obra reducida, reducción de los residuos y aumento de la velocidad
  91. 91. conclusiones• Las técnicas generales de purificación y extracción de ácidos nucleicos; tanto los métodos convencionales como los métodos modernizados gracias al desarrollo de la tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a los investigadores y científicos a adquirir mejores resultados y es esencial en una gran cantidad de aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de parentesco, para detectar enfermedades hereditarias, para conocer los genes de una persona, clonación, etc. Automatización de ácido nucleico , este proceso de extracción es potencialmente beneficioso para un número de razones entre ellas , para reducir el tiempo detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la calidad de aumentar los resultados

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