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  • 1. 1CAPÍTULO IPLANTEAMIENTO METODOLÓGICO1.1 DESCRIPCIÓN DE LA REALIDAD PROBLEMÁTICAPuesto que en nuestra población peruana la medicina natural y alternativa esta enapogeo y hay un mayor mal uso de estas plantas medicinales se ha visto porconveniente realizar este trabajo de investigación por ello que en esta temporada haymas enfermedades aéreas se vio por conveniente realizar este trabajo para ver siesta planta podría tener un efecto antibacteriano ante cepa de Staphylococcusaureus.1.2 DELIMITACIONES Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA1.2.1 DELIMITACIONESA. DELIMITACIÓN ESPACIAL: La parte experimental del presente trabajo deinvestigación se realizó en los laboratorios de la Universidad Alas Peruanas-Filial Arequipa.B. DELIMITACIÓN TEMPORAL: El presente estudio se llevó a cabo en losmeses de marzo, abril, mayo y junio.C. DELIMITACIÓN SOCIAL:El presente trabajo de investigación beneficiara a losestudiantes y especialmente a la población por el contenido de informaciónimportante para el mejoramiento de la salud y el buen uso de estas plantasmedicinales.
  • 2. 2D. DELIMITACIÓN CONCEPTUAL:1. Área: Ciencias de la Salud.2. Campo: Farmacia y Bioquímica.3. Línea: microbiología, y biotecnología.4. Tema General: Evaluación del efecto antibacteriano del Tarwi (Lupinusmutabilis) ante cepas de Staphylococcus aureus.5. Especificación del tema: Evaluación del efecto antibacteriano del extractoacuoso de las semillas de Tarwi (Lupinus mutabilis) sobre cepas deStaphylococcus aureus, en los laboratorios de Universidad Alas PeruanasArequipa 2013.6. Problema a Investigar: El efecto antibacteriano del Tarwi (Lupinusmutabilis).1.2.2 DEFINICIÓN DEL PROBLEMAEl conocimiento de las propiedades curativas de las plantas ha sido y es un retoconstante que nos ha llevado por los caminos de la investigación para descubrir lacura de enfermedades. Lupinus mutabilis (Tarwi) es una planta poco conocida, sinembargo, es utilizada frecuentemente en la zona en la que crece, lo cual podríaocasionar que se produzca un mal uso debido al desconocimiento en cuanto a lacomposición química propia de la planta1.3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA1.3.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA A INVESTIGAR¿El Tarwi (Lupinus mutabilis) tiene efecto antibacteriano sobre Staphylococcusaureus?1.4. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN1.4.1. OBJETIVO GENERALEvaluar el efecto antibacteriano del extracto acuoso de las semillas de Tarwi(Lupinus mutabilis) sobre cepas de Staphylococcus aureus, Arequipa 2013.
  • 3. 31.4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOSDeterminar el pH, densidad, características organolépticas, del extracto acuosode las semillas de Tarwi.Establecer el efecto bacteriostático del extracto acuoso deLupinus mutabilis,sobre Staphylococcus aureus.Determinar la actividad bactericida del extracto acuoso deLupinusmutabilis,sobre Staphylococcus aureus1.5. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓNDado que las semillas del Tarwi presentan alcaloides dentro de su composiciónfitoquímica, los mismos que generalmente poseen propiedades antimicrobianas, esprobable que el extracto acuoso de las semillas de Tarwi presente actividadantibacteriana.1.6. VARIABLES E INDICADORESVARIABLE DIMENSION INDICADOR CATEGORIZACIONActividadAntibacteriana sobrelas Cepas deStaphylococcusaureus.Método dediluciónC.I.M.C.M.B.CualitativoCuantitativo1.7. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓNEn la actualidad cientos de especies vegetales son utilizadas en la medicina; Sinembargo, la ciencia moderna, analizando y estudiando los efectos terapéuticos delas plantas, quiere precisar, comparar y clasificar las diversas propiedades, no con elfin de disminuir la confianza en los productos naturales, sino más bien para agrupara las plantas de efectos similares con la finalidad de conocer los principios activosresponsables de la cura de enfermedades, de esta forma determinar sus estructurasquímicas y procurar su síntesis.
  • 4. 4En el Perú existe una diversidad cuantiosa de especies vegetales que poseenpropiedades farmacológicas con fines terapéuticos diferentes, dado que poseeclimas y microclimas variados, esto permite que se desarrollen diferentes principiosactivos.Dentro de la flora nativa del Valle del Mantaro, en Huancayo (Junín), Puno, Cusco yAyacucho, se encuentra el Tarwi (Lupinus mutabilis), especie utilizada por loscomuneros de la zona para tratar proceso infecciosos y otros fines terapéuticos;Cabe resaltar que es importante el estudio las plantas nativas, asimismo que dichosestudios presenten garantías científicas. Es debido a esto que en el presenteestudio, tiene como objetivo realizar la evaluación del efecto antibacteriano delextracto acuoso de las semillas de Tarwi (Lupinus mutabilis) sobre cepas deStaphylococcus aureus, por lo cual cabe significar un inicio o una base para eldesarrollo de futuras investigaciones sobre esta especie vegetal1.9. TIPO Y NIVEL DE INVESTIGACIÓN1.9.1. TIPO DE INVESTIGACIÓNEl tipo de investigación fue descriptivo.1.9.2. NIVEL DE INVESTIGACIÓNEl nivel de investigación fue de nivel básico.1.10. MÉTODO DE LA INVESTIGACIÓN1.10.1. INSTRUMENTOS• Tubos de ensayo• Gradilla• Papel filtro y pabilo• Balón de gas• Mechero bunsen• Trípode• Malla de asbesto• Autoclave• Pipeta Pasteur
  • 5. 5• Placas• Matraz• Tampón• Asa de necrón• Asa de digaski• Vaso beacker• Mechero y encendor• Papel kraf• Porta objetos• Microscopio• Gotero• Fiola• Jeringas de 1ml, 5ml, 20ml.• Gasa y algodón• Lapicero tinta indeleble1.10.2. EQUIPOS:• Autoclave (Allamerican, Modelo 1925X).• Balanza analítica (Nahita, Modelo 5034/120).• Incubadora (Nahita, Modelo 636/13).• Refrigeradora (LG, GR-T342GV)• PH metro (Fisher Scientific).• Densimetro1.10.3. REACTIVOS• Reactivo de Mayer• HgCl2• KI• Peróxido de hidrogeno• Agar sangre• Agua destilada estéril.• Agar manitol salado.• Agar Mueller Hinton.
  • 6. 6• Agar baird Parker• Plasma sanguíneo• H2O2• Tinción gram1.10.4. ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL1. OBTENCIÓN DE LA PLANTA(LA PARTE DEL ESTUDIO)La planta (semilla) de estudio Tarwi (Lupinus mutabilis) se obtuvó en elmercado Túpac Amaru, Juliaca.Se elegirá semillas sanas que no posean signos de infestación parasitaria.2. LIMPIEZA DE LA SEMILLA DEL VEGETALSe limpiaran las semillas ya seleccionadas.3. MOLIENDASe procederá a moler la muestra con el fin de almacenarla y conservarla paralos estudios de investigación, se utilizara un molino de grano domestico hierrohasta obtener un grado de división de la semilla adecuado 0.5mm.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓNPara el almacenamiento se trabajó con cantidades adecuadas de muestra(1kg), se utilizaran papel kraft, protegidos de la luz y la humedad.1.10.5. MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL EXTRACTO POR COCCIÓNFundamento:Se fundamenta en la extracción de los principios activos de un materialvegetal al poner en contacto la droga y el solvente (agua), a fuego lentodurante 15 minutos, después del hervor.Se pesó 20gr. de semilla de Tarwi en 100ml. de agua (concentración a 20%).CONSERVACIÓN DEL EXTRACTOEl extracto será conservado en un recipiente color ámbar previamenteesterilizado, verificando que el recipiente estuviera correctamente cerrado. Elextracto se mantendrá a una temperatura adecuada, en un lugar fresco yoscuro para prolongar su estabilidad.
  • 7. 71.10.6. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS1.10.6.1. IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDESa. Reacción de MayerSe colocara en un tubo de ensayo 2 mL del extracto acuoso, se adicionaron20 gotas de HCl al 8% y luego se agitara suavemente hasta disolver. Secalentara a baño maría por 5 minutos, para luego adicionar gota a gota elReactivo de Mayer (Preparado con bicloruro de mercurio y yoduro de potasio)hasta observar cambios.La aparición de un precipitado amarillento se considerara como pruebapresuntiva (+) de la presencia de alcaloides.b. Reacción de WagnerSe colocara en un tubo de ensayo 2 mL del extracto acuoso, se adicionaron20 gotas de HCl al 8% y luego se agitara suavemente hasta disolver. Secalentara a baño maría por 5 minutos, para luego adicionar gota a gota elReactivo de Wagner hasta observar cambios.La aparición de un precipitado marrón se considerara como prueba presuntiva(+) de la presencia de alcaloides.1.10.6.2. IDENTIFICACIÓN DE SAPONINASa. Ensayo del índice afrosimétricoFundamento: Las saponinas se caracterizan porque al entrar en contacto conel agua producen una espuma persistente, esta es formada debido a que lossaponósidos disminuyen la tensión superficial del agua.Procedimiento: Se colocara en un tubo de ensayo 1 mL del extracto acuoso,se le añadieron 5 mL de agua destilada (proporción 1:5) y se agitaravigorosamente durante 3 minutos.La formación de espuma mayor a 2mm de altura y con una duración mayor a 2minutos se considerara como prueba presuntiva positiva (+) de la presenciade saponinas.1.10.6.3. IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDESa. Reacción de ShinodaFundamento: Cuando se ponen en contacto el magnesio metálico y el HClconcentrado, el magnesio es oxidado, dando como productos el H2, que eseliminado en forma de gas y el Cloruro de magnesio (MgCl2), que es el queforma complejos con los flavonoides dando coloraciones características.
  • 8. 8Procedimiento: Se colocara en un tubo de ensayo un trozo de magnesiometálico, luego se añadirá 2 mL del extracto acuoso y unas pocas gotas deHCl al 8% v/v por la pared del tubo, agitando suavemente.La presencia de coloraciones que varían de amarillo a rojo, se consideraraprueba positiva (+) de la presencia de flavonas y flavonoles.1.10.6.4. IDENTIFICACIÓN DE TANINOSa. Reacción con FeCl3Fundamento: Los taninos al ser mezclados con sales férricas, reaccionandando lugar a coloraciones o precipitados de color verde y azul intensos,debido a la formación de tanato férrico.Procedimiento: Se colocara 1 mL del extracto acuoso en un tubo de ensayo yse le añadirá gota a gota FeCl3, luego se procederá a agitar suavemente.La coloración verde a azul nos indicara la presencia de compuestos fenólicos,sales férricas galotaninos y elagitaninos dan una coloración azul oscuro,mientras que los taninos condensados dan positivo a coloración verdeparduzco.1.10.7. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICO YFISICOQUIMICAS DEL EXTRACTO1.10.7.1. Determinación de olorSe tomó una tira de papel secante de aproximadamente 1 cm de ancho por 10cm de largo y se introdujo un extremo en la muestra. Se deberá oler y determinarsi corresponde con la característica del producto.1.10.7.2. Determinación del colorSe tomó un tubo de ensayo bien limpio y seco; se llenó hasta las tres cuartaspartes con la muestra de ensayo y se observó el color.1.10.7.3. Determinación del pHSe realizó con ayuda de un peachimetro y cinta reactivas introduciéndolo en lamuestra de ensayo.1.10.7.4. Determinación e la densidadSe realizó con ayuda del densímetro introduciéndolo en la muestra de ensayo.
  • 9. 91.10.8. IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS DE ESTUDIO1.10.8.1. Prueba de la Catalasa1Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2)en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera lasbacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final delmetabolismo aerobio de los azúcares.Procedimiento: Se colocó una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luegose transferirá una porción de colonia, proveniente de un cultivo en agar MuellerHinton, sobre el H2O2 realizándose una emulsión.La aparición de burbujas es prueba positiva para Estafilococos, la pruebanegativa indica la presencia de Estreptococos.1.10.8.2. Prueba de la Coagulasa1Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa:Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a lapared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando laformación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacterianacon plasma citratado (test en lámina).Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de unfactor (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con elfibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).Procedimiento: Se emulsionaran varias colonias en un tubo con 0,5mL deplasma sanguíneo. Se incubó a 37°C y se observara la formación del coágulo alas 4 horas y a las 18 horas. La formación de un coágulo total o parcial seconsiderara como test positivo.1.10.8.3. Tinción Gram1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar queenfríe un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un pocode muestra. - Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa),hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá paradepositar la muestra contenida en el asa.• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder arealizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos
  • 10. 10giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar laextensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina.• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijarla muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa porla llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de lasbacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos seaapenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma convioleta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dichocolorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se dejaactuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajara una temperatura ambiente de 25 grados.3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra conagua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro deagua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la partesuperior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorrodelgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También elenjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo.4) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugoldurante 1 minuto más.• El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles concolorantes y determine su fijación a las bacterias.5) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora conetanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya noescurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante.Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éstesalga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquidoazul.6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque lalámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la formaanteriormente descrita.7) Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vezse va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejaractuar durante 1 minuto.
  • 11. 118) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua,se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.1.10.8.4. Prueba de Manitol Salado1Fundamento: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para elaislamiento y diferenciación de estafilococos.Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir demuestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales deimportancia sanitaria.El medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol ypeptonas.Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC, el crecimiento sepuede identificar por el viraje de color rojo a amarillo.El S. aureus el crecimiento sin viraje, es por la alta concentración de sal inhibeotros microorganismos excepto S. aureus (por lo tanto usar la placa paraidentificación, no para aislamiento).1.10.8.5. prueba de baird parkerFundamento:En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y elextracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto delevadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan elcrecimiento de los estafilococos.Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y alcloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante. La yemade huevo permite demostrar la actividad lecitinásica.Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originancolonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevoproduciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene unazona clara más externa.Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual características decolonias pero sin la zona opaca y clara.Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioquímicas.ProcedimientoSiembra- Directa, estriando la superficie del medio de cultivo.
  • 12. 12IncubaciónEn aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 a 48 horas.Interpretación de los resultadosObservar las características de las colonias.Bacterias que reducen el telurito de potasio: colonias de color grisáceo-negro.Bacterias que no reducen el telurito de potasio: colonias del color del medio,transparentes.Bacterias con actividad lecitinásica: halo claro en el medio de cultivo alrededor dela colonia. Puede existir también un halo opaco alrededor de la colonia con unhalo claro externo.Bacterias sin actividad lecitinásica: ausencia de halo claro alrededor de lacolonia.1.10.9. PREPARACIÓN DEL INÓCULO BACTERIANO1Con un asa de kollé se tomaran 3 a 5 colonias de Staphylococcus aureusprovenientes del cultivo en agar Mueller Hinton; que se van a transferir a un tubocon 5 mL de solución salina al 0.9%.Se homogeneizaran las colonias y seguidamente se estandarizara el inóculo porcomparación de turbidez con el tubo 0.5 de la escala de Mc Farland quecorresponde a 108células/ml.1.10.10. DETERMIANCION DE LA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA1.10.10.1. Método de Macro dilución en CaldoEs un método referencial para la determinación de la sensibilidad a losantimicrobianos. Se requiere de una serie de tubos con caldo a los cuales se lesagrega el antimicrobiano en distintas concentraciones, luego se inoculan con unasuspensión estandarizada del microorganismo en estudio y se incuban bajocondiciones y tiempos recomendados.Procedimiento:Se prepara una suspensión del germen problema procedente de un cultivo de nomás de 24 horas. Se ajusta esa suspensión con el 0.5 de la escala turbidimétricade Mac Farland equivalente 108UFC por ml
  • 13. 13Se realiza una dilución posterio1:100 (fiola) para obtener una concentración de106UFC/ ml.Se realiza diluciones seriadas, el tubo n°10 no posee sangre de grado y sirvecomo control de crecimiento (T)Se agrega 1 ml de suspensión microbiana con 106UFC/ ml a la serie de 10 tubosy se incuba a 37 ° C durante 18 horas.Una vez transcurrido dicho lapso se procede a la observación a simple vista delos tubos y la interpretación de los resultados obtenidosPrimero se observa el tubo testigo (ultimo tubo de la serie) que debe tenerdesarrollo bacteriano (turbidez), y que solo contiene caldo nutritivo y lasuspensión del microorganismo. Luego se observa cual es el primer tubo de laserie que presenta turbidez, el tubo anterior a este (ultimo tubo de la serie que nopresenta turbidez) es el que corresponde a la concentración inhibitoria minina.1.10.11. CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDAEn el método de siembra incorporada o por inclusión se procede a depositar 1mlde cada dilución en placas estériles, vacías y por duplicado. Posteriormente seagrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, se agita moviendola placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular. Así, lamuestra se mezcla con el medio de agar. En cualquiera de los casos luego de lasiembra es necesario llevar las placas a estufa para permitir el crecimiento de losmicroorganismos.Se incuba durante 18 horas.Transcurrido dicho tiempo, puede determinarse el número real de UFCdelinoculo. Para obtener un resultado con precisión estadística suficiente seaplica la siguiente fórmula:N° de colonias obtenidas x el factor de diluciónml sembrados en la placa
  • 14. 141.11. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN1.11.1. TÉCNICASLa presente investigación utilizó la observación laboratorial como técnica para larecolección de los datos de la investigación:- Recopilación bibliográfica (Técnica de macro dilución en caldo, CIM, CMB).1.11.2. INSTRUMENTOSLibros, tesis, artículos científicos.1.12. COBERTURA DEL ESTUDIO1.12.1. UNIVERSOCultivo de cepas de Staphylococcus aureus, cultivadas en medio Agar MuellerHinton.1.12.2. MUESTRAColonias aisladas de Staphylococcus aureus que fueron utilizadas para lapreparación de los correspondientes inóculos.
  • 15. 15CAPÍTULO IIMARCO TEÓRICO2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOSRoque. M, Tristán, M” flavonoides y alcaloides de Lupinus mutabilis c. p. Smith conactividad antifúngica”. Instituto de química orgánica aplicada a la farmacia, unmsm.Facultad de farmacia y bioquímica, instituto de microbiología. Unmsm. Facultad defarmacia y bioquímica.RESUMENLas hojas de Lupinus mutabilisde Smith, procedente de las zonas altas deldepartamento de Lima, contiene entre otros metabolitos, flavonoides y alcaloides. Elespectro IR revela la presencia del alcaloide lupinina o hidroxilupanina. El flavonoidey el alcaloide tienen marcada acción antibacteriana y el último muestra además unaactividad antifúngica.Efecto antibacteriano del extracto alcohólico y del extracto acuoso de té verde(Camellia sinensis) sobre bacterias orales de Importancia Estomatológica,Streptococcus mutans, Streptococcus mitis y Streptococcus salivarius. UAP.2010(Villalba).
  • 16. 16RESUMENLas hojas de té verde que se utilizaron tuvieron actividad antibacteriana por lacual utilizaron para evidenciar este efecto, la técnica de difusión en pozos la cualse utilizó para realizar el presente trabajo de investigación.2.2. MARCO CONCEPTUAL2.2.1. TARWIA. DESCRIPCIÓN BOTÁNICAEs una leguminosa herbácea erecta de tallos robustos, algo leñosa. Alcanza unaaltura de 1,8-2 m. Se cultiva principalmente entre los 2.000 y 3.800 msnm, en climastemplados y fríos.Tallo. Robustos algo leñosa.Hojas. Las hojas tienen forma alargada, generalmente compuesta por ocho folíolosque varían entre ovalados a lanceolados. Se diferencia de otras especies de Lupinusen que las hojas tienen menos vellosidades. Referente las semillas de Tarwi, estánincluidas en número variable en una vaina de 5 a 12 cm y varían deforma (redonda,ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm.Flores varían en color desde el azul el morado y penden de las hojas para atraer alos insectos polinizadores. Estas emiten un aroma parecido al de la miel. La vainas de5 a 10 cms.de largoSemilla. Contienen de 2 a 6 semillas ovaladas de 0.6 a 1 cm de diámetro.B. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y HÁBITATEs una planta sudamericana, se encuentra en los países de Perú, Bolivia y Argentinaen mayor proporción, se desarrolla en cualquier época del año, habitat en suelosareno-arcillosos, pedregosos, muy húmedos.Su hábitat depende de la elevación, esta puede ser: Elevación extrema muy porencima de la línea del bosque (la elevación absoluta depende de la latitud); oelevación alta (cerca del límite del bosque), (la elevación absoluta depende de lalatitud).Depende también de las condiciones de agua, donde el período seco sinprecipitaciones dura 6 - 10 meses. Las precipitaciones alcanzan 100 - 300 mmanuales, concentrándose en invierno.
  • 17. 17Respecto a las condiciones de luz esta planta se encuentra expuesta en Pleno sol sinninguna protección. Partes planas o laderas de exposición norte.C. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICAReino: PlantaeDivisión: MagnoliophytaClase: MagnoliopsidaOrden:FabalesFamilia: FabaceaeGénero: LupinusEspecie:mutabilisNombre Científico:Lupinus mutabilisNombre Común: Tarwi.D. COMPOSICIÓN QUÍMICAEl componente más importante, según antecedentes teóricos y al que se atribuye enparte sus virtudes antibacterianas, es el alcaloide. Esta sustancia se encuentra enuna concentración mayor con relación a los demás metabolitos como son taninos,flavonoides y saponinas presentes en la planta.E. USOSEn algunos países como Perú, Bolivia y Argentina se le da un uso netamentenutricional. La medicina tradicional le atribuye propiedades anti fúngicas parainfecciones micóticas, para ectoparásitos.F. METABOLITOS SECUNDARIOSUn aspecto metabólico que distingue el reino animal del vegetal es la capacidad delas plantas para producir sustancias que no son esenciales para su supervivencia. Aesas sustancias se les denomina metabolitos secundarios, los animales superioresraramente los producen, si acaso pueden ser encontrados ocasionalmente eninsectos y otros invertebrados.El metabolismo secundario compromete aquellos procesos químicos que son únicospara una planta dada, y no son universales. Dicho metabolismo es la química queconduce a la formación de un producto natural.
  • 18. 18Especies muy relacionadas taxonómicamente del mismo género pueden tenerdistintos tipos de metabolitos secundarios, o si tienen los mismos, puedenpresentarlos en proporciones variables de uno a otro.Las plantas están constantemente expuestas a numerosos patógenos microbianos,principalmente hongos. Durante la evolución, algunas plantas han desarrolladodiversos sistemas para defenderse de sus atacantes microbianos, tales comosistemas de defensa inducibles y constitutivos o mediante proteínas anti fúngicas,polímeros estructurales resistentes a los patógenos y antibióticos. Las plantastambién utilizan los metabolitos secundarios como agentes de señalización durante lainteracción con patógenos.Su potencial radica también en la importancia para la defensa de la planta frente amicroorganismos, los metabolitos secundarios también permiten atraer amicroorganismos simbiontes. Así es el caso de los flavonoides que producen lasleguminosas para atraer a las bacterias fijadoras de nitrógeno.Las plantas han sido utilizadas por el hombre a lo largo de muchos años como fuentepara elaborar medicinas, conservantes, aromatizantes o pigmentos. Además de serimportantes como medicamentos, también hay evidencias de que los metabolitossecundarios son importantes para nuestro estado de salud en general.G. ALCALOIDESLos alcaloides son compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos denitrógeno, generalmente en anillo heterocíclico y con actividad fisiológica específica.Son sustancias de origen biológico y sobre todo de origen vegetal. Por lo generalpresentan un nitrógeno heterocíclico, como amina primaria (R-NH2), secundaria (R’-NH) o terciaria (R’’-N).Son particularmente activos en el Metabolismo vegetal. Se los considera comodepósitos para síntesis proteicas y estimulantes o reguladores de actividades como elcrecimiento, metabolismo y reproducción.2.2.2. Staphylococcus aureusA. GENERALIDADESConocido como Staphylococcus aureus o comúnmente Estafilococo dorado, esuna bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva, productora de coagulasa, catalasa,inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo.
  • 19. 19Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presenciafísica de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la entero toxinaestafilocócica secretada por la bacteria.En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante delas infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de queesta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, loque permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrentesanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personalsanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente.Puede mantenerse viable por 6-14 semanas en pus y se necesitan 15 minutos deexposición al alcohol de 70° para su eliminación.B. DIVISIÓN TAXONÓMICAReino: BacteriaPhillum: FimicutesClase: BacilliOrden: BacillalesFamilia: MicrococcaceaeGénero: StaphylococcusEspecie: S. aureus.C. ESTRUCTURA ANTIGÉNICAEn la estructura de la pared celular, los estafilococos contienen polisacáridos,proteínas antigénicas y también otras sustancias importantes. El peptidoglucano (unpolímero polisacárido formado por la unión de subunidades) suministra elexoesqueleto rígido de la pared celular. La exposición a un ácido fuerte o a lalisozima destruye a los peptidoglucanos. El peptidoglucano es importante en lapatogenia de la infección: induce la producción de interleucina-1 (pirógeno endógeno)y de anticuerpos opsónicos en los monocitos; y puede atraer químicamente a losleucocitos polimorfonucleares, posee actividad parecida a endotoxina, genera unfenómeno de Shwartzman localizado y activa al complemento.Los ácidos teicoicos, polímeros de glicerol o fosfato ribitol, están unidos alpeptidoglucano y pueden ser antigénicos. Los anticuerpos antiteicoicos detectablesmediante difusión en gel pueden observarse en pacientes con endocarditis activa porS. aureus.
  • 20. 20Algunas cepas del S. aureus poseen cápsulas que inhiben la fagocitosis por losleucocitos polimorfonucleares a menos que se encuentren presentes anticuerposespecíficos.D. ENFERMEDADESSíndrome del choque tóxico (SST). Infecciones intrahospitalarias.Durante la convalecencia, después de las intervenciones quirúrgicas o dequemaduras graves, uno de los principales riesgos consiste en la infección de lostejidos lesionados por microorganismos típicos del ambiente hospitalario cuyas másdestacadas características son su invariable virulencia y multirresistencia a losantimicrobianos; las especies bacterianas más frecuentes en este rubro sonPseudomonas aureginosa y Staphylococcus aureus. Una vez que el agente infectanteha colonizado los tejidos dañados, puede penetrar al torrente circulatorio,ocasionando septicemias y, consecuentemente endocarditis, artritis, meningitis, etc.
  • 21. 21CAPÍTULO IIIANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS3.1. POBLACIÓN Y MUESTRA3.1.1. POBLACIÓN:Cultivo de cepa de Staphylococcus aureus, cultivadas en medio Agar MuellerHinton.3.1.2. MUESTRAColonias aisladas de Staphylococcus aureus que fueron utilizadas para lapreparación de los correspondientes inóculos3.2. NIVEL Y GRADO DE SIGNIFICANCIAEl nivel de confianza es de 95% y el grado de significancia es 0.053.3. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSCUADRO No. 1Determinación fitoquímica y pHExtracto acuoso de TarwiColor Amarillo claroSabor AmargoOlor CaracterísticoPH 6.7Densidad 1.5Fuente: Propia
  • 22. 22CUADRO No. 2Identificación de metabolitos con potenciaMetabolito Ensayo ResultadoAlcaloidesR. Wagner +R. Mayer +Taninos R. Cloruro Férrico +/-Flavonoides R. Shinoda +Saponinas I. Afrosimétrico +Leyenda: (+) Presenta; (+/-) presencia regular; (-) no presentaFuente: PropiaInterpretación: Según el cuadro No. 2 se pudo observar la presencia de alcaloides,saponinas y flavonoides, y en regular presencia los taninos.CUADRO No. 3CIM (turbidez)No. de tubo CIM (turbidez)Extracto + aguapeptonada-1 (100 µg/ml) -2 (50 µg/ml) -3 (25 µg/ml) -4 (12.5 µg/ml) -5 (6.25 µg/ml) +6 (3.12 µg/ml) +7 (1.6 µg/ml) +8 (0.8 µg/ml) +9 (0.4 µg/ml) +Inoculo + aguapeptonada+Fuente: PropiaLeyenda: (+) presencia de turbidez, inhibición de crecimiento bacteriano.(-) no presencia de turbidez, crecimiento bacteriano.
  • 23. 23CAPÍTULO IVCONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESCONCLUSIONESPRIMERA: Se concluye que el extracto acuoso de Tarwi presenta efecto antibacterianofrente a Staphylococcus aureus.SEGUNDA:Se determinó que el extracto de la semilla de Tarwi (Lupinus mutabilis)obtuvóun pH de 6.7, densidad 1.5, color amarillo claro, olor característico, sabor amargo.TERCERA:Se determinó que el extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) tieneactividad bacteriostática, ya que se observó la presencia de turbidez en el tubo 5(concentración de 6,25 µg/ml).CUARTA:Se determinó que el extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) no tieneefecto bactericida a una concentración del 20 %.
  • 24. 24RECOMENDACIONES1. Realizar estudios posteriores con concentraciones mayores a 20% para poderdeterminan el efecto bactericida del extracto acuoso de semilla de Tarwi (Lupinusmutabilis).2. Se recomienda continuar con el trabajo, realizando estudios cuantitativos del efectoantibacterianodel extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) frente a cepas deStaphylococcus aureus.
  • 25. 25BIBLIOGRAFIALIBROS1. Diaz R., Gamazo C., Goñi I., Manual Práctico de Microbiología, 2° Edición, EditorialMasson, 2006.2. Kennethj. Ryan Md, C. George Ray, Md. Microbiology, Prescott, Harley Y Klein. McGraw-Hill.Interamerican.20053. Martínez Miranda Migdalia; Cuéllar Cuéllar Armando. Farmacognosia y productosnaturales. 1° Ed. La Habana, Cuba: Editorial Félix Varela.ARTICULOS Y REVISTAS CIENTIFICAS1. AGUWA, C. C.; LAWAL, A. M., Pharmacologic studies on the active principIes ofCalliandra portoticensis leaf extracts. J-Ethnopharmacol. Jan; 22(1): 63-71, 2005.2. ALARCÓN DE LA LASTRA, C.; LÓPEZ, A.; MOTILVA, V. Gastroprotección andprostaglandin E2 generation in rats by flavonoids of Dittrichia viscose. Planta Med. Dec;59(6): 497-501, 2002.3. ALARCÓN DE LA LASTRA, C.; MARTÍN, M. J. Antiulcerogenicity of the flavonoidfraction fron Bidens aurea: comparison with Ranitidine and Omeprazole. J.Ethnopharmacology. May; 42(3): 161-8, 19944. Bucay Morocho, Luis Carlos. Estudio Farmacognóstico y actividad antimicrobianade la violetilla (Hybanthus parviflorus). Universidad de Chimborazo, Riobamba Ecuador.20095. Sarmiento LA. Efecto antibacteriano del extracto alcohólico y del extracto acuosode té verde (Camellia sinensis) sobre bacterias orales de Importancia Estomatológica,Streptococcus mutans, Streptococcus mitis y Streptococcus salivarius. UAP.2010. [Tesispara optar al título de Cirujano Dentista]. Arequipa. Universidad Alas Peruanas. 2010.
  • 26. 26ANEXO NRO1TITULO: Preparación del Material y equipos. (Fuente: Propia)Figura 1 figura 2 figura 3 figura 4 figura 5ANEXO NRO2TITULO: Preparación de agares y extracto (Fuente: Propia)Figura 6 figura 7 figura 8ANEXO NRO3TITULO: Plaqueado (Fuente: Propia)Figura 9 figura 10 figura 11ANEXO NRO4TITULO: Medición de pH y pruebas fitoquimicas (Fuente: Propia)Figura12 figura 13 figura 14TITULO: Inoculo y escala (Fuente: Propia)
  • 27. 27Figura 15figura 16 figura 17ANEXO NRO5TITULO: Pruebas experimentales (Fuente: Propia)Figura 18 figura 19 figura 20ANEXO NRO6TITULO: Crecimiento de cepas (Fuente: Propia)Figura 21 figura 22 figura 23ANEXO NRO7TITULO: Incubación y congelamiento (Fuente: Propia)Figura 24 figura 25
  • 28. 28ANEXO NRO8TITULO: Identificación y realización de CIM-CMB (Fuente: Propia)Figura 26 figura 27 figura 28C.E. C.I.C.I.E.(-) C.I.E.(+)Leyenda: C.E.= Crecimiento estéril (agua peptonada+extracto)C.I.= Crecimiento de inoculo (agua peptonada+bacteria)CIE= Crecimiento inoculo y extracto (agua peptonada+bacteria+extracto)