Legionelosis

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UN BUEN TEMA PARA ECHARLE UN VISTASO

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Legionelosis

  1. 1. Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón Coordinador: Carmen Pelaz Antolín Autores: Vicente Ausina Vicente Catalán Emilia Cercenado Carmen Pelaz Antolín ISBN: 84-609-9044-3 I
  2. 2. INDICE:ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO1. Introducción2. Manifestaciones clínicas y tratamiento3. Epidemiología4. Ecología y transmisión de la bacteria5. Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por Legionella 5.1. Definición de caso 5.2. Cultivo e identificación de Legionella 5.3. Detección de Legionella por inmunofluorescencia directa 5.4. Diagnóstico serológico 5.5. Detección de antígeno de Legionella pneumophila en muestras de orina 5.6. Detección de Legionella en muestras clínicas con técnicas de PCR6. Prevención y control de la legionelosis 6.1. Medidas generales de prevención y control 6.2. Prevención y control de legionelosis en hospitales 6.2.1. Circunstancias favorecedoras de la legionelosis hospitalaria 6.2.2. Fuentes de exposición hospitalarias 6.3. Detección de Legionella en muestras de agua 6.3.1. Cultivo e identificación de Legionella en muestras de agua 6.3.2. Detección de antígeno de L. pneumophila serogrupo 1 en muestras de agua 6.3.3. Detección de Legionella en muestras de agua por técnicas de PCR 6.4 Investigación de brotes de legionelosis 6.4.1. Definición de brote 6.4.2. Creación de un grupo de trabajo 6.4.3. Estudio epidemiológico6.4.4. Estudio ambiental 6.4.5. Formulación de hipótesis 6.4.6. Medidas a tomar 6.4.7. Estudios de epidemiología molecular6.4.8. Elaboración de un informe7. BibliografíaDOCUMENTOS TÉCNICOS1. PNT-LP-01. Detección de Legionella en muestras clínicas mediante cultivo2. PNT-LP-02. Detección de Legionella en muestras de agua mediante cultivo3. PNT-LP-03. Identificación de los aislados de Legionella4. PNT-LP-04. Detección de anticuerpos frente a Legionella pneumophila en suero mediante inmuno- fluorescencia indirecta (IFI)5. PNT-LP-05. Detección de antígeno de Legionella pneumophila en orina6. PNT-LP-06. Procedimientos para la prevención y control de la legionelosis en los hospitales7. PNT-LP-07. Tipificación molecular de Legionella pneumophila mediante polimorfismo de fragmentos de ADN amplificados (AFLP)ÍNDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS1. Propósito y alcance2. Fundamento3. Documentos de consulta4. Muestras5. Reactivos6. Aparatos y material7. Procedimiento8. Obtención y expresión de resultados9. Responsabilidades10. Anotaciones al procedimiento11. Limitaciones del procedimiento12. Bibliografía13. Anexos II
  3. 3. Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón20.DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Y CONTROL DE LA LEGIONELOSIS. 2005 Coordinador: Carmen Pelaz Antolín Autores: Vicente Ausina Vicente Catalán Emilia Cercenado Carmen Pelaz Antolín 1
  4. 4. 1. INTRODUCCIÓN del lugar geográfico y del grupo de pacientes La familia Legionellaceae incluye un género, investigados, habiéndose observado tambiénLegionella, que a su vez engloba 48 especies y más fluctuaciones temporales. Es más frecuente ende 70 serogrupos. Más de la mitad de las especies personas entre 40 y 70 años, aunque cada vez sehan causado patología en el hombre, pero Legionella detectan más casos en personas más jóvenes. Espneumophila origina más del 90% de las infecciones. dos a tres veces más frecuente en varones que enL. pneumophila comprende 16 serogrupos, siendo el mujeres y es rara en niños. El riesgo de contraer laserogrupo 1 el más frecuentemente aislado en enfermedad depende del estado de salud de laspacientes (más del 80 % de los casos confirmados). personas afectadas, aumentando el riesgo en Legionella es un bacilo gramnegativo inmunodeprimidos, diabéticos, pacientes conampliamente distribuido en ambientes acuáticos enfermedad pulmonar obstructiva crónica, ennaturales y artificiales, y además, es un parásito personas de edad avanzada, así como en fumadoresintracelular de amebas y otros protozoos de agua y alcohólicos.dulce, en los que utiliza un mecanismo de La legionelosis puede adquirirse en el hospital ymultiplicación intracelular similar al usado en las en la comunidad. Dentro de la legionelosiscélulas del organismo humano. La enfermedad se hospitalaria se pueden definir los casos en tresproduce cuando individuos susceptibles inhalan la niveles según el grado de informaciónbacteria contenida en aerosoles procedentes de una epidemiológica y microbiológica: (i) Brote cuando sefuente ambiental contaminada. producen dos o más casos relacionados epidemiológicamente en el mismo hospital. (ii) Casos2. MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y agrupados cuando éstos se producen sin coincidir enTRATAMIENTO el tiempo. (iii) Casos esporádicos cuando éstos se La legionelosis puede tener dos presentaciones producen de forma aislada en el tiempo. En laclínicas diferentes: la enfermedad del legionario y la comunidad, también se puede presentar laFiebre de Pontiac. En la primera, la enfermedad enfermedad en forma de brotes, casos agrupadossuele manifestarse como una neumonía, aunque el (asociados a la misma instalación o edificio sinespectro clínico puede variar desde una enfermedad coincidir en el tiempo) y casos esporádicos, y laleve-moderada hasta la enfermedad grave con fallo adquisición de la enfermedad puede estar asociadamultiorgánico. La Fiebre de Pontiac, es una a instalaciones de varios tipos de edificios,enfermedad autolimitada que da lugar a un cuadro incluyendo los hoteles.clínico similar al de la gripe. En los últimos años se ha producido un notable La neumonía causada por Legionella es incremento del diagnóstico de casos y brotes declínicamente indistinguible de otras neumonías y se legionelosis, tanto en nuestro país, como en el restocaracteriza por un período de incubación que oscila del mundo. Sin embargo, la precocidad en elentre 2 y 10 días, aunque este periodo podría ser diagnóstico, debido a la utilización de pruebas dealgo mayor. El comienzo de la enfermedad suele ser detección de antígeno en orina, ha determinado unaabrupto, con fiebre alta, malestar general, debilidad, disminución de la mortalidad de la enfermedad.mialgias, dolor de cabeza y tos inicialmente no En España, la legionelosis es una enfermedad deproductiva, y frecuentemente requiere declaración obligatoria desde 1995 (Real Decretohospitalización. El patrón radiológico también es 2210/1995 de 28 de diciembre). Los casos y lossimilar al de otras neumonías, siendo común el brotes de legionelosis identificados en el Estadoinfiltrado alveolar. Por tanto, el diagnóstico de la español se declaran desde los Servicios deenfermedad debe realizarse por métodos Vigilancia Epidemiológica de las Comunidadesmicrobiológicos. Las manifestaciones Autónomas al Centro Nacional de Epidemiología, aextrapulmonares generalmente incluyen confusión, través de la Red Nacional de Vigilanciadiarrea y dolor pleural, a veces los primeros síntomas Epidemiológica. La información sobre el número deson diarrea, dolor muscular y moderada cefalea. La casos diagnosticados se completa con datos delenfermedad puede llegar a cursar con confusión estudio epidemiológico relacionado con su aparición,mental e insuficiencia respiratoria y renal. tanto en el ámbito comunitario como en el El tratamiento de los pacientes con nosocomial. El número de casos y brotes notificado aantimicrobianos, generalmente macrólidos o la mencionada Red ha sufrido una tendenciaquinolonas, es eficaz, y en pacientes hospitalizados creciente en nuestro país. En 2000 se declararoncon neumonía comunitaria el tratamiento empírico 752 casos (tasa de 1,91 por 100.000 habitantes) y endebería incluir fármacos eficaces frente a L. 2004 la cifra ascendió a 1.074 casos (2,62 porpneumophila, ya que el retraso en la aplicación de un 100.000). Los brotes declarados tambiéntratamiento adecuado se ha asociado con un aumentaron. En el quinquenio 2000-2004 seaumento de la mortalidad de la enfermedad. notificaron 184 brotes en los que resultaron afectadas 1.825 personas, mientras que en el3. EPIDEMIOLOGÍA quinquenio anterior (1994-1999) las cifras fueron 43 Los datos sobre la incidencia de la neumonía por brotes y 483 casos. Estos datos proceden del CentroL. pneumophila son variables, suponiendo del 2 al 15 Nacional de Epidemiología.% de las neumonías comunitarias que requierenhospitalización. Estas diferencias parecen depender 2
  5. 5. 4. ECOLOGÍA Y TRANSMISIÓN DE LA BACTERIA en el aire) conteniendo la bacteria, generados por Legionella es una bacteria que se encuentra sistemas de agua contaminados. En ocasiones se haampliamente distribuida en los ecosistemas considerado la microaspiración de agua contaminadaacuáticos de todo el mundo (como ríos, lagos, para justificar algunos casos de legionelosisfuentes termales, tierra húmeda y lodos, agua de nosocomial. No se ha demostrado la transmisión delluvia, etc.), donde es capaz de sobrevivir en un la bacteria persona a persona, ni se ha documentadoamplio rango de condiciones físico-químicas. Sin la existencia de reservorios animales.embargo, la mayor parte de los casos de legionelosis El conocimiento del nicho ecológico de Legionellase asocian a ambientes acuáticos creados o proporciona una información de gran utilidad paramanipulados por el hombre, en los que la entender la transmisión de la bacteria, siendo este eltemperatura del agua se encuentra por encima de la primer paso para abordar el control de sutemperatura ambiente. Legionella es una bacteria diseminación. Aunque Legionella es una bacteriatermotolerante, capaz de multiplicarse entre los 20 y ampliamente distribuida en ambientes acuáticos, su45ºC; puede sobrevivir entre los 40 y 60ºC, presencia en un sistema de agua no es suficienteinactivándose por encima de los 70ºC. para implicar a una cepa como agente causal de La transmisión de Legionella es aérea y la vía de infección. La aparición de la enfermedad depende deentrada al organismo humano es a través del una serie de requisitos encadenados que se vensistema respiratorio, fundamentalmente mediante la favorecidos por una serie de factores, como seinhalación de aerosoles (dispersión de gotas de agua detalla en la Figura 1.Figura 1. Requisitos y factores que intervienen en la transmisión de Legionella (Adaptado de en ASHRAE 2000) Transmisión de Legionella Ambientales Clínicos FACTORES SUCESOS SUCESOS FACTORES Temperatura, pH Síntomas Nutrientes 1. Supervivencia en el 7. Diagnóstico Pruebas Microorganismos reservorio natural Vigilancia Minimización Temperatura del riesgo Estancamiento (Prevención) 6. Multiplicación en fagocitos Virulencia Biofilm, nutrientes 2. Amplificación Limpieza, biocidas humanos Temperatura, 3. Diseminación 5. Exposición Edad Humedad (aerosolización) Inmunidad 4. Transmisión Meteorología Susceptibilidad Enfermedad Producción gotas del Tiempo exposición hospedador Distancia Tamaño gota Carga bacterianaPor otra parte, Legionella consigue nutrientes en su amplificadores de Legionella spp. Hasta ahora sehábitat natural que son aportados por otros conocen cinco géneros de amebas (Acanthamoeba,microorganismos: bacterias (Pseudomonas, Naegleria, Hartmanella, Vahlkamphia yAcinetobacter, Flavobacterium, Alcaligenes), Echinamoeba) y un género de protozooamebas, protozoos ciliados y otros, que en el caso (Tetrahymena) capaces de permitir el crecimientode los sistemas de agua, como cañerías, intracelular de L. pneumophila.acumuladores e interiores de las torres de Además, las biocapas integran algasrefrigeración, se hallan dentro de biocapas (biofilms) (cianobacterias) que se adhieren a las paredes deque recubren las superficies. Las amebas y las conducciones y depósitos de agua. La formaciónprotozoos se consideran hospedadores naturales y de biocapas se ve favorecida por el estancamiento 3
  6. 6. del agua, por la existencia de ramales o tramos - Enfermedad del legionario: enfermedad respiratoriaciegos de uso infrecuente, por la disminución del aguda con diarrea y vómitos. La mitad de los casosflujo de agua, por los materiales usados en la pueden presentar signos focales de neumonía,construcción de las cañerías o de las bombas, y por fiebre alta, cefalea y mialgias y una tercera partela temperatura del agua. Las biocapas facilitan el confusión mental o delirio.crecimiento de Legionella, y paralelamente la - Fiebre de Pontiac: síndrome febril agudo yprotegen frente a la acción de los biocidas y las autolimitado.técnicas de prevención aplicadas contra ella, comoson el hipercalentamiento o la hipercloración. 5.2. CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE Legionella En la literatura científica aparecen recogidas una El aislamiento de la bacteria en cultivo es elvariedad de instalaciones relacionadas con método de referencia y proporciona un diagnósticocasos/brotes de legionelosis, como son la red de de confirmación de la infección causada pordistribución de agua sanitaria (caliente o fría), de Legionella. Es el único método disponible queedificios como hospitales y hoteles, torres de permite detectar infecciones causadas por cualquierarefrigeración o condensadores evaporativos, equipos de las especies y serogrupos de Legionellade terapia respiratoria, piscinas climatizadas con (aproximadamente 15-20 % de las infecciones semovimiento de agua, aguas termales en centros de deben a especies o serogrupos diferentes de L.rehabilitación y recreo, cruceros, barcos, fuentes pneumophila serogrupo 1). Tiene comoornamentales, viviendas particulares, inconveniente el tiempo que tarda en crecer elhumidificadores, máquinas productoras de hielo, microorganismo, de 3 a 10-12 días.unidades de transplantes y unidades de odontología. La sensibilidad del cultivo en muestras respiratorias oscila entre un 20 y un 80% y varía en5. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS función del tipo de muestra, siendo la especificidadINFECCIONES CAUSADAS POR Legionella del 100%. Esta baja sensibilidad se debe, entre5.1. DEFINICIÓN DE CASO otros, a los siguientes factores: la naturaleza de laSegún el protocolo recogido en la Red Nacional de bacteria que crece con dificultad aún en mediosVigilancia Epidemiológica, los casos de legionelosis selectivos, la limitada supervivencia de la bacteria ense clasifican en: las muestras clínicas, la aplicación de una terapia1) Caso confirmado: caso con clínica compatible y antibiótica previa a la toma de muestra y la confirmado con alguna de las siguientes pruebas experiencia microbiológica requerida para su de laboratorio: aislamiento. - Aislamiento de cualquier especie o serogrupo Aunque se puede considerar un método tedioso e de Legionella a partir de secreciones incluso de difícil realización, es muy recomendable respiratorias, tejido pulmonar o sangre. su utilización de forma rutinaria, ya que permite - Seroconversión: aumento del título de realizar posteriores estudios que ayudan a mejorar el anticuerpos en 4 veces o más, en sueros conocimiento de la bacteria, como las tomados en la fase aguda y convaleciente de la investigaciones epidemiológicas para detectar las enfermedad, siempre que el título de la segunda posibles fuentes de infección, o la realización de muestra sea ≥ 128, frente a L. pneumophila estudios de sensibilidad frente a antimicrobianos. serogrupo 1, por inmunofluorescencia indirecta. Las muestras recomendadas para realizar el cultivo - Demostración de antígeno de L. pneumophila de la bacteria incluyen secreciones respiratorias, tejido serogrupo 1 en orina. pulmonar y sangre y, en función del tipo y nivel de2) Caso sospechoso o probable: caso con clínica contaminación, pueden ser agrupadas en: compatible y/o resultado positivo en alguna de las A) Secreciones respiratorias contaminadas: esputo siguientes pruebas de laboratorio consideradas expectorado y muestras del tracto respiratorio inferior presuntivas: contaminadas con microbiota del tracto respiratorio - Título alto de anticuerpos (>256) frente a L. superior, como aspirados, lavados o cepillados pneumophila serogrupo 1 en suero tomado en bronquiales. fase convaleciente. B) Secreciones respiratorias no contaminadas: - Seroconversión: aumento del título de muestras del tracto respiratorio inferior no anticuerpos en 4 veces o más, en sueros contaminadas, como las obtenidas con cepillo tomados en la fase aguda y convaleciente, telescopado y por aspiración pulmonar trasparietal. siempre que el título de la segunda muestra sea C) Tejidos: tejido pulmonar obtenido por biopsia o ≥128, frente a cualquier especie o serogrupo de necropsia, o tejido de otros órganos. D) Otras Legionella, por inmunofluorescencia indirecta. muestras menos frecuentes, como líquido pleural, - Observación microscópica de cualquier especie líquido cefalorraquídeo (LCR) o sangre. o serogrupo de Legionella en extensiones de Para el cultivo de Legionella se utiliza un medio secreciones respiratorias o tejido pulmonar por específico, BCYEα (buffered charcoal yeast extract inmunofluorescencia directa, utilizando suplementado con α-cetoglutarato), que contiene los anticuerpos policlonales o monoclonales elementos requeridos por la bacteria, como hierro y marcados con fluoresceína. cisteína, y un medio selectivo suplementado conLa definición clínica de caso es la siguiente: antibióticos, BMPA (BCYEα suplementado con 4
  7. 7. polimixina, cefamandol y anisomicina). Para el primer muestras clínicas. Se realiza con reactivosaislamiento las placas deben incubarse a 35-37ºC, en polivalentes, algunos de los cuales están disponiblescondiciones de aerobiosis y humedad, y aunque el comercialmente. Estos reactivos contienen uncrecimiento de la bacteria generalmente empieza a anticuerpo monoclonal capaz de reconocer todos los erser visible a partir del 3 día de incubación, los serogrupos de L. pneumophila. Los anticuerpos,cultivos se deben mantener en estas condiciones 10- marcados con fluoresceína, se unen a los antígenos12 días antes de considerarlos negativos. Pequeñas de la pared de L. pneumophila, un posterior lavadocantidades de CO2 (2,5-5%) pueden favorecer el elimina los anticuerpos no fijados y al examinar lacrecimiento de algunas especies. Cuando se procesan extensión con un microscopio de fluorescencia semuestras contaminadas (esputo) se recomiendan puede observar la fluorescencia en la pared de estastratamientos de descontaminación, ya que ayudan a bacterias.eliminar la microbiota acompañante y favorecen el Su realización está indicada cuando interesereconocimiento de las colonias de Legionella. Los alcanzar un diagnóstico etiológico rápido en unatratamientos utilizados son de 2 tipos, calor (50ºC 30 neumonía o en otra infección sospechosa de estarmin) y tratamiento ácido (pH de 2,2 durante 5 min). causada por Legionella. La sensibilidad del método Como la mayoría de las cepas de Legionella oscila entre el 25 y el 75% siendo la especificidad delempleadas en el control de los medios de cultivo se 95%. Sin embargo, es un método que tiene muchasadaptan rápidamente a los medios tras sucesivos limitaciones por lo que debe interpretarse consubcultivos, se recomienda la utilización de un tejido cautela. Un resultado negativo no excluye lainfectado con la bacteria para comprobar el posibilidad de que el paciente esté infectado porcrecimiento. Legionella y un resultado positivo debe interpretarse Aunque el género Legionella comprende 48 como un diagnóstico presuntivo. Por ello,especies y más de 70 serogrupos, la mayoría de los actualmente no se recomienda su utilización comocultivos recuperados de muestras de pacientes único método diagnóstico.pertenecen a la especie L. pneumophila, siendo L.pneumophila serogrupo 1 el que se identifica con 5.4. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICOmayor frecuencia. Se debe tener en cuenta que Se han desarrollado una variedad de pruebasmientras L. pneumophila crece bien en los medios de para detectar anticuerpos específicos en muestrascultivo utilizados, no ocurre lo mismo con otras de suero, incluyendo inmunofluorescencia indirectaespecies, que crecen con más dificultad, requieren (IFI), microaglutinación y métodos de enzimo-más tiempo y, en ocasiones pueden llegar a perderse inmunoensayo (ELISA), así como ensayos deen subcultivos sucesivos. hemaglutinación indirecta y contrainmunoelectro- Las especies de Legionella pueden identificarse foresis. La IFI ha sido el método diagnóstico máspor una variedad de métodos. Estos incluyen la utilizado durante años y por ello, el más evaluado,inmunofluorescencia (IF) con anticuerpos poli o principalmente para L. pneumophila serogrupo 1. Lasmonoclonales, aglutinación en porta o con partículas pruebas de microaglutinación presentan la ventajade látex, ensayos con anticuerpos género- de que por su facilidad de realización permitenespecíficos mediante dot-blot en colonias y ensayar un gran número de muestras a la vez,amplificación específica del ADN mediante técnicas presentando una sensibilidad del 80% y unade PCR. También se pueden utilizar algunas especificidad que oscila entre el 97 y 99%. Tambiénpruebas bioquímicas, aunque no suelen ser muy existen disponibles ensayos de ELISA para laútiles debido a que aportan resultados variables. detección de anticuerpos frente a Legionella, aunque También recientemente se han desarrollado éstos no han sido suficientemente evaluados.métodos de secuenciación de fragmentos de genes, La IFI se realiza utilizando un sustrato antigénicoutilizando como dianas el gen 16S ribosomal o el gen de L. pneumophila serogrupo 1 inactivado con calor, omip (macrophage infectivity potentiator). La un pool conteniendo antígenos de varios serogrupos.identificación se realiza por comparación de la Estos antígenos están comercializados,secuencia obtenida con las secuencias conocidas e estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobreincluidas en las bases de datos de secuencias los que se añaden diluciones seriadas del suero delexistentes. En el caso del fragmento 16S ribosomal paciente. La detección de anticuerpos en el suero delse utiliza la base de datos “Gene Bank Database” paciente se realiza mediante una reacción antígeno–(www.ncbi.nlm.nih.gov) y en el caso del gen mip la anticuerpo que se revela con una antiglobulinabase de datos del EWGLI (www.ewgli.org). humana marcada con fluoresceína, que permite la visualización de los microorganismos con un5.3. DETECCIÓN DE Legionella POR microscopio de fluorescencia. La sensibilidad de la IFIINMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA oscila entre 78-91%, siendo la especificidad del 99%. La microscopía directa con anticuerpos Para la determinación del título de anticuerpos enfluorescentes es un método rápido y fue el primer el suero de un paciente es preferible realizar unmétodo diagnóstico usado para detectar Legionella ensayo de IFI en una pareja de sueros, tomados enen tejido pulmonar y secreciones respiratorias. La la fase aguda y convaleciente de la enfermedad,inmunofluorescencia directa es un procedimiento de para demostrar una seroconversión (aumento deltinción que permite detectar con rapidez la presencia título al menos al cuádruple). Se considera positivade cualquier serogrupo de L. pneumophila en una seroconversión en la que el segundo suero 5
  8. 8. presente un título ≥ 1/128. La seroconversión se siendo la especificidad en ambos casos del 100%.produce en alrededor del 70-80% de los casos La utilización de la técnica del RIA exigía disponer deconfirmados con cultivo, se puede producir en la instalaciones adecuadas para trabajar con isótoposprimera semana tras el inicio de los síntomas, radioactivos, por lo que ha sido sustituida poraunque también puede requerir de 6 semanas a 2 técnicas de enzimoinmunoensayo (EIA) de similaresmeses en aparecer, e incluso no producirse. características, que se han incorporado a muchos Cuando se cuenta con un suero único la laboratorios.interpretación de los resultados en más compleja, ya En la actualidad existen varias técnicas de EIAque el nivel de anticuerpos de la población general comercializadas, siendo las de Binax, Biotest ypuede variar de unos lugares a otros, y en general Bartels las más utilizadas. La sensibilidad empleandoeste nivel no se conoce. Por ello, títulos superiores a orina concentrada es similar en los tres EIA (80-1/256 son sugerentes de enfermedad reciente o 90%), con una especificidad del 98-100%,pasada, pero títulos inferiores a este valor deben destacando la elevada sensiblidad del EIA de Bartelsconsiderarse negativos. Por otro lado, un resultado empleando orina directa (60-75%), que casi permitenegativo no descarta la enfermedad, ya que en obviar la necesidad de concentrar la orina. El diseñoocasiones se han detectado fallos en la producción propio de estas técnicas y la baja incidencia dede anticuerpos. infecciones por Legionella en algunas áreas provoca Para aumentar la sensibilidad es importante que se tenga tendencia a acumular muestras hastautilizar reactivos que detecten inmunoglobulinas tener un número suficiente para optimizar lostotales (IgG, IgM e IgA). pocillos, con el consecuente retraso en la obtención Aunque la IFI ha sido una herramienta de los resultados, lo cual atenta directamente contradiagnóstica de gran utilidad, las limitaciones que la principal ventaja de estas técnicas.presenta y el tiempo requerido en tener un resultado Hoy día, se dispone también de una técnica dehacen que en los últimos años haya disminuido su inmunocromatografía (ICT) más rápida, que ofreceuso, sin embargo es de gran utilidad para realizar resultados en 15 minutos o menos dependiendo dediagnósticos retrospectivos y en investigaciones la concentración de antígeno en la orina. Esepidemiológicas. técnicamente menos compleja que las técnicas de EIA, no requiere equipamiento específico y se realiza5.5. DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE L. de forma individualizada. Los resultados obtenidospneumophila EN MUESTRAS DE ORINA son absolutamente equiparables con los de las En el transcurso de un episodio neumónico por L. técnicas de EIA en sensibilidad y especificidad,pneumophila se libera antígeno específico que exhibiendo específicamente una concordancia globalpuede detectarse en la orina. La detección de este con el EIA de Binax del 98%.antígeno ofrece un diagnóstico rápido de Todas las técnicas descritas detectan con unaconfirmación de neumonía por L. pneumophila gran sensibilidad el antígeno de L. pneumophilareciente o pasada, por lo que estos ensayos se serogrupo 1, siendo además capaces de detectar “indeberán realizar únicamente en presencia de un vitro” antígeno soluble de todos los serogrupos de L.cuadro clínico compatible, o con menor sospecha pneumophila. El EIA de Biotest es el único queclínica en el caso de brotes hospitalarios. Estas según el fabricante tiene capacidad para detectartécnicas han revolucionado el diagnóstico de esta todos los serogrupos de L. pneumophila, así comoenfermedad y han mostrado ser extraordinariamente otras especies de Legionella, aunque no garantiza laútiles, ya que permiten la detección de un mayor misma sensibilidad para todos los serogrupos ynúmero de casos y la aplicación de un tratamiento especies.antibiótico específico en las fases iniciales de la La capacidad de detectar antígeno de otrosenfermedad. También permiten el reconocimiento serogrupos está en función de las característicastemprano de brotes epidémicos, favoreciendo una propias de cada antígeno, como la capacidad derápida respuesta en la aplicación de medidas pasar a la orina, la cantidad excretada y supreventivas. inmunogenicidad. Los antígenos de otros serogrupos El antígeno detectado es un componente soluble de L. pneumophila podrían no excretarse por ladel lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de orina, ya que pueden pasar a través de las paredesLegionella, es termoestable, y es detectable desde el de los capilares glomerulares o no hacerlo, eninicio de la sintomatología, y en algunos casos hasta función de su tamaño y de su carga.muchos meses después (en algún caso hasta más Es interesante destacar que el tratamientode 1 año), no viéndose los resultados claramente térmico de la orina no supone la desaparición de lainfluenciados por la administración previa de positividad y sí la eliminación de falsos positivos enantibióticos. muestras negativas. También es importante conocer Estos antígenos se han detectado por varias que la concentración del antígeno presente en latécnicas, como aglutinación con partículas de látex, orina por ultrafiltración selectiva incrementahemaglutinación pasiva y radioinmunoensayo (RIA). significativamente la sensibilidad sin que se veaLa primera técnica disponible comercialmente que afectada la especificidad.demostró ser una técnica útil, sensible y específica,fue el RIA, que presentaba una sensibilidad del 60%en orina directa y del 80% en orina concentrada, 6
  9. 9. 5.6. DETECCIÓN DE Legionella EN MUESTRAS ver muy incrementado en el diagnóstico etiológico deCLÍNICAS POR TÉCNICAS DE PCR las neumonías atípicas adquiridas en la comunidad. La gran ventaja que presenta el aislamiento en Sin embargo, estos ensayos basados en la PCRcultivo como método de referencia es la son escasos y aún se encuentran en fasedisponibilidad del microorganismo, lo cual permite la experimental, por lo que ninguno de ellos se utilizarealización de posteriores estudios de en la actualidad de forma rutinaria en el diagnósticocaracterización con fines taxonómicos y de infecciones causadas por Legionella. A esto hayepidemiológicos. Sin embargo, el aislamiento en que añadir la presencia de inhibidores en lascultivo de este microorganismo presenta una serie de muestras clínicas, como hemoglobina, urea odificultades como son: 1) La pérdida progresiva de heparina, que pueden dar lugar a la aparición deviabilidad de la bacteria tras la toma de muestra. 2) falsos negativos debidos a inhibición de laEl enmascaramiento de las colonias cuando se amplificación, por lo que es fundamental laprocesan muestras contaminadas (esputo), donde el preparación de la muestra de modo que se eliminenéxito en el aislamiento de la bacteria está eficazmente estos inhibidores.correlacionado con el número de estosmicroorganismos presentes en la muestra. 3) El 6. PREVENCIÓN Y CONTROL DE LAtiempo requerido para la obtención de los resultados, LEGIONELOSISque en ocasiones es alto. 6.1. MEDIDAS GENERALES DE PREVENCIÓN Y Para solventar estos inconvenientes, en los CONTROLúltimos tiempos, se han desarrollado métodos Conocer los factores que favorecen la transmisióndiagnósticos basados en la detección de ADN de de Legionella y su nicho ecológico (detalladosLegionella en muestras humanas, utilizando métodos anteriormente) proporciona una información de grande hibridación con sondas génicas específicas o utilidad a la hora de abordar la prevención de labasados en la reacción en cadena de la polimerasa enfermedad. El desarrollo de la enfermedad depende(PCR). La reacción de PCR consiste en la principalmente de la intensidad de la exposición aamplificación “in vitro” de ADN o ARN mediante la aerosoles, medida por el tiempo de exposición y poracción de una ADN polimerasa termorresistente (Taq la concentración de la bacteria en el aerosol y, de lapolimerasa), a partir de una secuencia definida de susceptibilidad de las personas expuestas. Por ello,una cadena de ADN utilizada como punto de inicio. las medidas de prevención y control de laAunque estas técnicas han revolucionado en los enfermedad que se proponen van en dosúltimos años el campo diagnóstico de las direcciones, de un lado evitar las condiciones queenfermedades infecciosas debido a su gran rapidez, favorecen la supervivencia y multiplicación de lasensibilidad, especificidad y versatilidad, sin bacteria, mediante la limpieza de las instalaciones yembargo, en el caso de Legionella, los primeros el control de la temperatura del agua, y de otro lado,ensayos no cumplieron las expectativas y en alguna controlar la eliminación de los aerosoles, evitandoocasión una vez comercializados fueron retirados del que su eliminación se realice en zonas muymercado. A pesar de estos inicios poco transitadas, en lugares cercanos a ventanas o tomasprometedores, se han desarrollado métodos dirigidos de aire de otros sistemas, o en lugares donde lasprincipalmente a tres dianas del cromosoma personas expuestas sean especialmentebacteriano: el gen mip (macrophage infectivity susceptibles.potentiator) y los genes 5S rRNA y 16S rRNA del En general, en instalaciones que acumulan aguaribosoma. Los productos de amplificación se y pueden generar aerosoles los aspectos técnicosdetectan mediante la visualización de los amplicones que ayudan a minimizar la multiplicación de lacon bromuro de etidio tras su separación en geles de bacteria se pueden resumir en, al menos, 5 puntos:agarosa, mediante hibridación con sondas 1) Evitar temperaturas de almacenamiento oespecíficas o mediante secuenciación. distribución de agua comprendidas entre 25ºC Sin embargo, uno de los principales y 45ºC.inconvenientes de la PCR convencional es que se 2) Evitar la presencia de suciedad, latrata de un método cualitativo, por lo que el empleo acumulación de sustratos y la formación dede diferentes sondas marcadas fluorogénicamente biocapas.en un sistema de PCR a “tiempo real” está 3) Evitar el estancamiento del agua,desplazando el uso de la PCR convencional. Este especialmente importante en lugares dondemétodo permite la cuantificación del número de hay escasez de agua, en instalaciones concélulas presentes en la muestra, y además reduce el funcionamiento intermitente (por temporadariesgo de contaminaciones y el tiempo requerido en baja, períodos vacacionales, reparaciones,el procesamiento de las muestras, eliminando la etc.), así como en sistemas de aguanecesidad de un análisis posterior de los amplicones complejos, como por ejemplo los sometidos aobtenidos. Si a esto se añade la posible utilización modificaciones.de una PCR múltiple que además de detectar L. 4) Evitar la utilización de materiales quepneumophila permita la detección simultánea de favorecen el crecimiento de microorganismos,otros microorganismos causantes de neumonía, o que se degraden por efecto del cloro o lacomo Chlamydophila pneumoniae y Mycoplasma temperatura, o que sean de difícil limpieza.pneumoniae, el valor de esta metodología se podría 7
  10. 10. 5) Poner todos los medios disponibles para que Concentración de enfermos de riesgo. En los el sistema opere correctamente y en buenas hospitales hay enfermos con diferentes tipos de condiciones de mantenimiento. Es importante inmunodepresión y, por tanto, con un riesgo elevado introducir programas de revisión, limpieza y de desarrollar formas graves de legionelosis. Los desinfección periódicas, así como realizar casos de legionelosis de adquisición nosocomial muestreos y análisis periódicos. tienen unos costes asociados y una mortalidad másPara aplicar estas medidas debe organizarse un plan alta que los comunitarios.de mantenimiento de las instalaciones en el que es Los factores que más predisponen para laimportante contemplar, al menos, los siguientes adquisición de la enfermedad se concentran en elaspectos: ámbito hospitalario: tratamiento inmunodepresor 1) Cada instalación debe conocerse en su (terapia antirrechazo en los enfermos con transplante totalidad, mediante la elaboración de planos, de médula ósea u órgano sólido), y una serie de que deben ser completos y actualizados. procesos de base, como neoplasias, quimioterapia También se deben identificar los puntos de la citotóxica, diabetes, insuficiencia renal terminal y instalación que presenten un riesgo de diferentes procesos que exigen el uso de exposición a aerosoles (puntos de riesgo), glucocorticoides. Existe también un moderado teniendo en cuenta a las personas (número y incremento del riesgo en personas de más de 65 estado de salud) expuestas. Todo ello para años, fumadores, pacientes con enfermedad adoptar un plan de medidas encaminadas a respiratoria crónica o insuficiencia cardiaca y en los disminuir este riesgo. alcoholicos. En los enfermos con SIDA, aunque la 2) El plan de mantenimiento debe incluir una incidencia de legionelosis es similar a la de la clara distribución de tareas entre personal población no infectada por el VIH, la enfermedad suficientemente entrenado, y se debe suele ser más grave. establecer un sistema ágil de comunicación Algunos autores han señalado también la fuerte entre todos los responsables. asociación existente entre Legionella y cirugía, 3) Existencia de un libro de mantenimiento debido a que cerca del 90% de los casos actualizado en el que se registren todas las nosocomiales publicados se han producido en incidencias y actividades realizadas y se pacientes operados. Estos autores han indicado que reflejen los resultados obtenidos. las infecciones por Legionella aumentan con el uso Estos aspectos se encuentran recogidos en el de anestesia general y la intubación endotraqueal;Real Decreto 865/2003, en Órdenes o Decretos de han insistido también en el hecho de que los factoresprevención de legionelosis de algunas Comunidades de riesgo para la legionelosis nosocomial son losAutónomas (Madrid, Valencia, Cataluña, Galicia, mismos que los de las neumonías por aspiración.Extremadura, Navarra, Andalucía, Cantabria, Estructuras de soporte hidromecánico que favorecendetalladas en orden cronológico de su publicación), y la contaminación de las aguas. El reservorio clínicoen la norma UNE 100030 IN 2001. de Legionella en los hospitales es, con gran frecuencia, el sistema de distribución de agua6.2. PREVENCIÓN Y CONTROL DE sanitaria caliente, aunque también puede verseLEGIONELOSIS EN HOSPITALES implicado el circuito de agua sanitaria fría. En losSe ha revisado detalladamente la prevención de últimos años las torres de refrigeración han perdidolegionelosis en hospitales, según la legislación protagonismo como origen de los casos devigente en nuestro país, las recomendaciones de legionelosis nosocomial.diferentes organismos internacionales y las Los hospitales suelen ser edificios grandes, queexperiencias profesionales de Sabrià y cols. disponen de redes de agua sanitaria caliente6.2.1. Circunstancias favorecedoras de la complejas y, a menudo, de torres de refrigeración. Silegionelosis hospitalaria bien ambos sistemas son reservorios conocidos de En los centros sanitarios coinciden una infección por Legionella, en los últimos años laconstelación de factores que favorecen la incidencia mayoría de casos esporádicos y brotes dey gravedad de las legionelosis. Se han documentado legionelosis en hospitales se han relacionado con lamuchos brotes prolongados en hospitales, que se exposición al agua de las redes de agua sanitariahan atribuido a la contaminación de los sistemas de que con frecuencia están colonizadas por Legionella.abastecimiento de agua. Muchos hospitales Diferentes estudios han demostrado que ladescriben experiencias de casos o brotes sucesivos colonización de los sistemas de agua sanitaria de losen el tiempo, que en la mayor parte de las ocasiones hospitales por Legionella oscila entre el 12 y el 80%.suelen corresponder a legionelosis nosocomial Entre los factores que condicionan la contaminaciónendémica, situación frecuente en la actualidad. de las aguas de los centros sanitarios destacan el Actualmente se consideran muy poco probables diseño del sistema de distribución de agua sanitaria,los brotes nosocomiales asociados a torres de la antigüedad del mismo, la temperatura, el pH, larefrigeración, sin embargo, estas instalaciones han composición iónica y la conductividad del agua, asíestado implicadas en brotes de legionelosis como los materiales empleados para la fabricacióncomunitaria, produciendo en ocasiones un elevado de cañerías y válvulas. Además, el volumen, lanúmero de casos, por lo que también deben ser disposición y la antigüedad de los acumuladoresconsideradas. influyen en la concentración de Legionella. 8
  11. 11. Las siguientes variables han sido relacionadas nebulizadores y equipos de terapia respiratoria,con la colonización de los hospitales por Legionella: material de irrigación, piscinas de hidroterapia,tamaño del hospital, presencia de acumuladores de equipos de extinción de incendios utilizadosgran tamaño, baja temperatura en los puntos recientemente y cubitos de hielo producidos porperiféricos del sistema de agua caliente e máquinas situadas en plantas de hospitalización,intercambiadores de calor antiguos. entre otras fuentes. Es también un hecho probado que uno de los Aunque las torres de refrigeración son una causafactores clave de la legionelosis nosocomial es el de poco probable de brotes nosocomiales, éstasla amplificación del inóculo. La reapertura de tramos también deben ser consideradas.del circuito de agua sanitaria reparados, en los queha hiperproliferado Legionella, justifican muchos de 6.3. DETECCIÓN DE LEGIONELLA EN MUESTRASlos brotes hospitalarios. DE AGUA La despresurización y el consiguiente Legionella es una bacteria ampliamenteestancamiento del agua en las plantas más elevadas distribuida en ambientes acuáticos, sin embargo, sudel hospital durante las horas de máximo consumo, o presencia en un sistema de agua no es suficientela reparación y puesta en marcha de una bomba de para que se produzca enfermedad.recirculación, son circunstancias que amplifican La búsqueda de Legionella en una muestra deenormemente el inóculo bacteriano y ponen en agua puede tener diferentes finalidades: 1) Detectarpeligro a la población hospitalaria. las fuentes de infección implicadas en brotes/casos Otro aspecto determinante de la colonización por de legionelosis. 2) Determinar la eficacia deLegionella es la temperatura de las aguas, ya que tratamientos aplicados en instalaciones asociadas aLegionella es termotolerante. Desde el año 1.998, el casos, o incluidas en los planes de mantenimiento,Reglamento de Instalaciones Térmicas de Edificios en cumplimiento de la legislación de prevención de(RITE) (Real Decreto 1751/1998), a diferencia de legionelosis vigente. 3) Conocer la situación de lasotras reglamentaciones previas más tolerantes, instalaciones de riesgo en los hospitales en relaciónobliga a que las temperaturas de acumulación sean a Legionella, en cumplimiento de los programas decomo mínimo de 55ºC (siendo recomendables los prevención de legionelosis, con independencia de su60ºC), de forma que en el punto más distal de la red relación con casos.la temperatura mínima sea de 50ºC. De todos La finalidad de estos análisis es la detección de lamodos, las altas temperaturas influyen bacteria en la instalación a estudiar, por lo quenegativamente en la vida de las cañerías, pueden deben optimizarse todos los pasos delincrementar los depósitos calcáreos que facilitan la procedimiento, incluyendo la toma de muestra, quecolonización por Legionella y disminuyen la será diseñada en función de la finalidad del análisis.capacidad desinfectante del cloro al facilitar su Un resultado negativo no excluye la presencia deevaporación. la bacteria en la instalación analizada, por lo que no Otro aspecto importante a tener en cuenta es la debe trasmitir una sensación (falsa) de seguridad. Unformación de biocapas en el interior de cañerías, resultado positivo debe acompañarse de una medidaacumuladores e interiores de las torres de correctora que disminuya o elimine la bacteria.refrigeración, donde Legionella utiliza la presencia de Los métodos disponibles de detección deotros microorganismos (bacterias, amebas, Legionella en aguas incluyen el cultivo eprotozoos ciliados y algas) para su supervivencia y identificación de la bacteria, el enzimoinmunoensayomultiplicación. Por ejemplo, los sistemas de (EIA) de similares características al utilizado en ladistribución de agua sanitaria se hallan detección de antígeno en muestras de orina, y lafrecuentemente colonizadas por Hartmannella amplificación de un fragmento específico del genomavermiformis. La formación de estas biocapas se ve de la bacteria mediante técnicas de PCR.favorecida por el estancamiento del agua, existencia 6.3.1. Cultivo e identificación de Legionella ende ramales o tramos ciegos de uso infrecuente, la muestras de aguadisminución del flujo de agua, los materiales usados El aislamiento de la bacteria en cultivo es elen la construcción de las cañerías o de las bombas, método de referencia y se basa en la norma ISOy la temperatura del agua. Las biocapas facilitan el 11731/98. Es el único método disponible que permitecrecimiento de Legionella y la protegen frente a la detectar cualquier especie y serogrupo deacción de los biocidas y las técnicas de prevención Legionella. Se ha demostrado que L. pneumophila esaplicadas contra ella, como son el la especie más frecuentemente recuperada dehipercalentamiento o la hipercloración. muestras ambientales, siendo la prevalencia del6.2.2. Fuentes de exposición hospitalarias serogrupo 1 similar a la de la suma de otros El hospital ofrece múltiples fuentes potenciales de serogrupos de L. pneumophila, a diferencia de lo queexposición. Los aerosoles más habitualmente ocurre en humanos, donde L. pneumophilaimplicados en la aparición de legionelosis serogrupo 1 es el predominante.nosocomial son los generados por las duchas y El cultivo permite la realización de estudiosgrifos de agua caliente de los lavabos. posteriores, como las investigaciones La colonización orofaríngea y la aspiración de epidemiológicas dirigidas a detectar las fuentes deagua sanitaria podrían explicar algunos casos. Se infección causantes de los casos, ensayos dehan descrito casos asociados con el uso de sensibilidad frente a productos biocidas y análisis 9
  12. 12. moleculares. Tiene como inconveniente el tiempo previamente concentraciones conocidas de L.que tarda en crecer el microorganismo, de 3 a 12-15 pneumophila serogrupo 1. Así, para agua potable eldías. límite de detección es 70 ufc/ml y el volumen de Antes de realizar el cultivo de Legionella a partir muestra recogida no debe ser inferior a 1 L. Parade muestras de agua, es necesario realizar una aguas procedentes de torres de refrigeración el límiteadecuada toma de muestra. Para su aislamiento en de detección es de 800 ufc/ml con un volumen decultivo, al igual que ocurre en el procesamiento de muestra de al menos 100 ml, y de 200 ufc/ml paramuestras clínicas, estos microorganismos requieren volúmenes no inferiores a 500 ml. No se debenmedios específicos, como BCYEα que contiene los recoger sedimentos ni restos de las paredes de loselementos requeridos por la bacteria (hierro y cisteína) depósitos.y medio selectivo suplementado con antibióticos, como En cuanto a la especificidad del test, no se hanGVPC (BCYEα suplementado con glicina, observado reacciones cruzadas con bacterias comovancomicina, polimixina y cicloheximida). Se Staphylococcus aureus, Acinetobacter spp.,obtienen colonias visibles a partir del 3º-7º día de Aeromonas hydrophila, Citrobacter freundii,incubación a 35-37ºC y en condiciones de aerobiosis Citrobacter koseri, Enterobacter cloacae, Escherichiay humedad, aunque en ocasiones pueden requerir coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella terrigena, Yersiniahasta 12-15 días de incubación. Pequeñas ruckeri, Pseudomonas aeruginosa y diferentescantidades de CO2 (2,5-5%) pueden favorecer el especies de otros bacilos gramnegativos no 8crecimiento de algunas especies. Como en las fermentadores, a concentraciones superiores a 10muestras de agua la concentración de Legionella ufc/ensayo. La única excepción con la que se puedepuede ser baja, y además puede ir acompañada de producir una reacción cruzada es Pseudomonasotro tipo de microbiota, es necesario concentrar y fluorescens.reducir la microbiota acompañante presente en las Un resultado negativo no descarta la presencia demuestras antes de inocular los medios de cultivo. la bacteria en la muestra de agua analizada, ya que Los métodos de identificación de los cultivos son L. pneumophila serogrupo 1 podría encontrarse enlos mismos que los utilizados en la identificación de concentraciones inferiores al límite de detección delcultivos de origen humano. método. También se produce un resultado negativo6.3.2. Detección de antígeno de L. pneumophila si la muestra de agua contiene una Legionellaserogrupo 1 en muestras de agua distinta de L. pneumophila serogrupo 1. Además, el Se ha desarrollado un método capaz de detectar método no diferencia entre bacterias vivas oantígeno de L. pneumophila serogrupo 1 en muertas, por lo que no está recomendada sumuestras de agua mediante un ensayo de EIA, que utilización después de la aplicación de tratamientosestá disponible comercialmente (Binax, Portland, con biocidas, ya que se podrían obtener falsosUSA). Aunque el mismo fabricante tiene positivos debido a la presencia de bacterias muertas.comercializados ensayos parecidos para la 6.3.3. Detección de Legionella en muestras dedeterminación de antígeno en muestras de orina y agua con técnicas de PCRmuestras de agua, los ensayos no son Al igual que con las muestras clínicas, la granintercambiables y cada uno de ellos debe usarse ventaja que presenta el aislamiento en cultivo comoúnicamente con el tipo de muestra para la que fué método de referencia es la disponibilidad de ladiseñado. Este un ensayo de EIA ofrece una bacteria, para la realización de estudios posteriores.alternativa rápida para la detección de antígeno de L. Sin embargo, también presenta una serie depneumophila serogrupo 1 en muestras de agua, inconvenientes, como son la imposibilidad detanto potable como de torres de refigeración. detectar bacterias viables no cultivables y el El ensayo puede realizarse en menos de 1 hora y enmascaramiento de los cultivos cuando lasen el mismo lugar de la toma de muestra, y se se muestras proceden de sistemas biocontaminados.realiza en unos tubos de reacción que contienen el Además, el tiempo requerido para la obtención de unanticuerpo al que se añade la muestra de agua y el resultado es generalmente largo de cara a laanticuerpo conjugado con peroxidasa. Los antígenos necesidad de establecer una actuación rápida ante lade L. pneumophila serogrupo 1 quedarán unidos por presencia de la bacteria.un lado a los anticuerpos de las paredes del tubo y Para salvar estas dificultades, en los últimos añospor otro a los anticuerpos con la peroxidasa. Tras también se han desarrollado métodos de detecciónvarios lavados se eliminan los antígenos no unidos, y de Legionella basados en la amplificación del ADNla presencia de peroxidasa se revela añadiendo un cromosómico en muestras de agua mediante PCR.colorante combinado con peróxido de hidrógeno. Se Los ensayos se han dirigido fundamentalmente a lasproduce un color azul que se tornará amarillo tras la mismas dianas utilizadas con muestras respiratorias,adición de la solución de parada. Finalmente se mide el gen mip y los genes ribosómicos 5S ARNr y 16Sla intensidad del color amarillo con un ARNr. Básicamente, la investigación de Legionellaespectrofotómetro, y la absorbancia leída será por PCR se efectúa en 3 fases: 1) Concentración porproporcional a la cantidad de antígeno de L. filtración o centrifugación. 2) Lisis bacteriana,pneumophila serogrupo 1 existente. extracción y purificación de los ácido nucleicos. 3) La sensibilidad de este ensayo se ha determinado Amplificación de una o varias secuencias específicasestudiando aguas en las que se inocularon mediante PCR. La visualización de los productos amplificados se ha realizado en geles de agarosa 10
  13. 13. teñidos con bromuro de etidio o mediante hibridación - Control de proceso negativo: consiste en unao secuenciación. muestra de agua estéril, que se procesa de igual Al igual que en las muestras clínicas, uno de los modo que las muestras a analizar y que permiteprincipales inconvenientes de la PCR convencional controlar la contaminación en todos los procesoses que se trata de un método cualitativo. El empleo que se efectúan.de un sistema de PCR a “tiempo real” permite la - Recta de calibrado: en el caso de la PCR acuantificación del número de células presentes en la “tiempo-real”, paralelamente a las muestrasmuestra, reduce el riesgo de contaminaciones, así ensayadas se preparará una recta de calibrado,como el tiempo requerido en el procesamiento de las como mínimo de cinco puntos de concentraciónmuestras, eliminando la necesidad de un análisis diferentes y que se analizarán por triplicado cadaposterior de los amplicones obtenidos. uno de ellos.Recientemente se ha publicado la detección y - Control negativo de PCR: consiste en unacuantificación de L. pneumophila basada en la muestra de agua estéril que se amplificaamplificación del gen dotA (defective organelle paralelamente a las muestras y que permitetrafficking), un gen implicado en la infectividad del garantizar la ausencia de contaminación por ADN.microorganismo. - Control positivo de PCR: consiste en una muestra Otro de los inconvenientes de la PCR es la conteniendo un número de copias conocido delimposibilidad de diferenciar entre células vivas y fragmento diana de Legionella. En el caso demuertas, debido fundamentalmente a la persistencia PCR cuantitativa, se emplearán dos muestras condel ADN una vez que la bacteria ha muerto. Para número de copias diferentes que se interpolaránsolventar este problema se han comenzado a en la recta de calibrado preparada.emplear moléculas diana diferentes, que se emplean - Control interno de inhibición (CIP): debe ser uncomo marcadores de viabilidad, y uno de los mejores fragmento de ADN que se amplifica con el mismocandidatos propuestos es el ARNm, debido juego de cebadores que el fragmento diana, peroprincipalmente a su corto tiempo de vida medio. De que tiene un tamaño diferente en el caso de laesta manera, mediante una reacción de PCR a PCR convencional, o bien que hibrida con unatiempo real previa se puede obtener un ADNc sonda de secuencia diferente en el caso de laespecífico, que se puede amplificar por PCR como PCR cuantitativa o a “tiempo-real”. De este modocualquier muestra de ADN, permitiendo la detección se puede evaluar en cada muestra la presenciade células con actividad metabólica, y en de inhibidores de la reacción.consecuencia, células vivas. La automatización del proceso de preparación de También la gran variedad de inhibidores de la muestras, y el desarrollo de un método que permitaPCR que pueden encontrarse presentes en muestras la detección y tipificación de L. pneumophilamedioambientales puede dificultar su desarrollo. Se serogrupo 1 en el mismo ensayo, incrementarán elhan descrito varios métodos para su eliminación valor de esta metodología.como: 1) La filtración a través de resinas deexclusión molecular o de intercambio iónico como el 6.4. INVESTIGACIÓN DE BROTES DEChelex-100® (Bio Rad), para evitar la materia LEGIONELOSISorgánica y metales pesados. 2) La adición de La aparición de varios casos de legionelosis debepolivinilpirrolidona para la eliminación de fenoles. 3) hacer sospechar un origen ambiental común, debidoLa separación de las células mediante partículas a la proliferación y emisión de Legionella a partir deinmunomagnéticas. Sin embargo, actualmente no algún sistema contaminado. Ello debe desencadenarexiste un método universalmente aceptado que una rápida investigación multidisciplinar que incluyapermita obtener resultados reproducibles en todo tipo aspectos epidemiológicos, microbiológicos yde muestras, por lo que resulta necesario seguir ambientales, con el objetivo de identificar, en eldesarrollando nuevos métodos de eliminación de menor tiempo posible, el foco productor de losinhibidores de la reacción. aerosoles contaminados origen de la infección. Los Un resultado obtenido mediante PCR resultados obtenidos en la investigación deben serconvencional se debe expresar como presencia o concordantes y, en cualquier caso, su valoraciónausencia de Legionella (o L. pneumophila en el caso debe ser conjunta para orientar y garantizar unade investigar la especie en lugar del género) en el correcta interpretación de los mismos.volumen de agua analizado, o como el número de La aparición de un brote debe hacer reforzar lascélulas de Legionella en el volumen de agua medidas de vigilancia clínica y epidemiológica de laanalizado, en el caso de una PCR cuantitativa o a neumonía, la disponibilidad de métodos para su“tiempo real”. Además, se deberá incluir en los diagnóstico, así como reforzar las medidas deensayos una serie de controles necesarios para su vigilancia ambiental y la capacidad de intervención.validación, como los que se indican a continuación: El estudio de un brote de legionelosis debe incluir, - Control proceso positivo: consiste en una muestra al menos los aspectos que se detallan a de agua estéril conteniendo una número conocido continuación. de células de L. pneumophila que se procesa de 6.4.1. Definición de brote igual modo que las muestras a analizar y que Un brote de legionelosis se define como la permite comprobar la eficacia de los procesos aparición de 2 o más casos relacionados que se efectúan. epidemiológicamente. 11
  14. 14. 6.4.2. Creación de un grupo de trabajo toma se realiza en ausencia de desinfectantes. En En este grupo deben participar técnicos de todos edificios/instalaciones que hayan sido sometidos alos servicios relacionados con la investigación, tratamiento de desinfección, se deben dejar pasar alservicios de neumología (incluso servicios de menos 15 días desde el tratamiento para realizar laurgencias), microbiología clínica, vigilancia toma de muestras.epidemiológica, sanidad ambiental, y microbiología 6.4.5. Formulación de hipótesisambiental. Es importante mantener una estrecha Con los datos del estudio epidemiológico y loscolaboración entre todos los especialistas que derivados de la investigación ambiental seintervienen y realizar reuniones periódicas para establecerá la hipótesis más plausible sobre la/sconsensuar los pasos a seguir y cómo se han de posible fuente/s de infección causante de los casos.realizar. En caso de que se considere necesario La hipótesis será comprobada posteriormenteinformar a la opinión pública, se definirá con claridad mediante los estudios epidemiológicos analíticos,quién y cómo se informará. como los de cohorte y de casos y controles, y los de6.4.3. Estudio epidemiológico epidemiología molecular. Los estudios Para la definición de caso se utilizarán los epidemiológicos serán especialmente útiles cuandocriterios epidemiológicos (acotando el período de no se resuelva el brote con las medidas adoptadas.tiempo y el área geográfica implicada) y los de 6.4.6. Medidas a tomardiagnóstico clínico y microbiológico recogidos en los En función del tipo de infección y de losprotocolos de las enfermedades de declaración resultados de la investigación ambiental, yobligatoria de la Red Nacional de Vigilancia pendientes de comprobar la hipótesis establecida, seEpidemiológica (Centro Nacional de Epidemiología). deben tomar las primeras medidas de prevención Después de aceptar la definición de caso se que se consideren más oportunas para controlar elprocederá a realizar una encuesta epidemiológica brote. Algunas de estas medidas se encuentranque incluya las variables de persona, lugar y tiempo, recogidas en el Real Decreto 865/2003 y eny las variables de exposición de los pacientes a las Decretos de algunas Comunidades Autónomas, yposibles fuentes de infección. El estudio de la básicamente son de 3 tipos: limpieza y desinfección,aparición de casos en el tiempo ayuda a determinar reparación de defectos estructurales o deel período posible de exposición. La localización funcionamiento y paralización parcial o total de lageográfica de los casos puede ayudar a filiar el instalación.origen del brote y a delimitar el área en el que se Una vez terminada la investigación del brote yrealizarán los estudios ambientales. Los casos establecidas las conclusiones que de ella deriven sepueden agruparse en función del lugar de residencia, adoptarán las medidas de prevención a largo plazolugar de trabajo, visitas frecuentes a lugares que se consideren más eficaces.comunes, estancia en algún complejo concreto, 6.4.7. Estudios de epidemiología molecularcomo hospital, hotel, balneario, centro de ocio, o L. pneumophila serogrupo 1 es la más implicadabien distribuirse heterogéneamente por todo un área en infección humana y también es la más distribuidageográfica. en el ambiente, por lo que la identidad de especie y6.4.4. Estudio ambiental serogrupo no será suficiente para implicar una cepa Es fundamental que los expertos comunitarios de como causante de un brote de legionelosis. Por ello,sanidad ambiental investiguen las posibles fuentes resulta imprescindible tipificar las cepas procedentesde infección en el área geográfica relacionada con de los pacientes y las ambientales, mediante sulos casos, siguiendo la normativa indicada en el Real estudio genotípico. La epidemiología molecular es,Decreto 865/2003 y en los Decretos u Órdenes en estos casos, de gran interés para corroborar lapublicados en la Comunidad Autónoma implicada. hipótesis establecida inicialmente y adoptar medidas La encuesta ambiental debe recoger información de prevención eficaces.sobre cada instalación, sus condiciones higiénico- Para realizar estos estudios es imprescindiblesanitarias y régimen de funcionamiento. Además contar con cultivos del mayor número posible dedebe recoger cualquier incidencia ocurrida en el pacientes y con cultivos del mayor número deperíodo anterior (al menos un mes) a la aparición de instalaciones relacionadas posible. Se halos primeros casos, sobre todo las incidencias que demostrado la coexistencia de varias cepasimplicaron la parada y nueva puesta en Legionella diferentes en una misma instalación, porfuncionamiento de la instalación. lo que es importante identificar al menos 5 ó 6 El estudio ambiental debe incluir la toma de colonias de cada muestra analizada.muestras de agua de las instalaciones revisadas, La genotipificación de los cultivos de losque tiene por objeto detectar la presencia de la pacientes define de manera precisa el tipo debacteria mediante su aislamiento en cultivo y su Legionella que produce los casos, siendo éste el queposterior identificación. se busca entre los cultivos ambientales. Para ello se Es importante que la toma de muestras de agua comparan los cultivos humanos y ambientalesse realice lo antes posible, y siempre, antes de mediante técnicas de epidemiología molecularproceder a la aplicación de cualquier tratamiento de (genotipificación).desinfección. Si las muestras de agua se toman Muchas han sido las técnicas utilizadas parapasadas 48-72 horas desde la aparición de los discriminar los aislados de Legionella: análisis deprimeros casos, no se tiene la seguridad de que la plásmidos, electroforesis de proteinas (PAGE), 12
  15. 15. análisis multienzimático, digestión del ADN tipificación molecular de L. pneumophila serogrupo 1.cromosómico (RFLP), digestión del ADN Los resultados obtenidos con el estudio de seiscromosómico en combinación con hibridación con genes, flaA, pilE, Asd, mip, mompS y proA, que sonsondas (ribotipificación), digestión del ADN los que se han empleado en el primer estudio pilotocromosómico con enzimas de restricción de corte de SBT en el EWGLI, son muy prometedores,poco frecuente (PFGE). También se han utilizado existiendo actualmente una base de datos a la quediferentes tipos de amplificación del ADN, como la se puede acceder para la asignación de alelosamplificación arbitraria (AP-PCR), la amplificación al (www.ewgli.org).azar (RAPD), o de regiones repetidas en el Aunque los brotes de legionelosis puedencromosoma (REP-PCR), o de fragmentos aparecer en distintos ámbitos (hospitalario,intergénicos repetidos en el cromosoma (ERIC). Otra comunitario o relacionado con viajeros) la estrategiatécnica utilizada en la caracterización molecular de para la tipificación epidemiológica de los cultivos de Legionella es la combinación de la digestión del Legionella puede ser la misma. En la Figura 2 seADN con la amplificación de los fragmentos de detalla la estrategia propuesta por el EWGLI para larestricción (AFLP), que además, cuenta con una investigación de brotes de legionelosis asociadosbase de datos europea a la que se puede acceder con viajes, basada en la combinación de tipificación(www.ewgli.org) para la asignación de tipos. con anticuerpos monoclonales junto con un método Actualmente, la necesidad de disponer de molecular.métodos de caracterización molecular que ofrezcan 6.4.8. Elaboración de un informeresultados rápidos y reproducibles, con la posibilidad Una vez cerrado el brote clínicamente y terminadasde ser compartidos en tiempo real por diferentes las primeras investigaciones se debe elaborar unlaboratorios, ha llevado al desarrollo de métodos de informe que incluya los aspectos más relevantes ysecuenciación de genes basados en técnicas de las primeras conclusiones, independientemente deMLST (multilocus sequence typing). Una variante de que algunas investigaciones parciales continúen.esta técnica es el SBT (sequence-based typing) en laque se emplean tanto genes “housekeeping” comogenes devirulencia, y ha sido empleada para laFigura 2. Estrategia abordada por el EWGLI para la tipificación epidemiológica de en la investigación delegionelosis asociada a viajeros (Fry y cols. 1999) 13
  16. 16. 7. BIBLIOGRAFÍA 5. Stout JE. Laboratory diagnosis of Legionnaaires’7.1 GENERAL disease: the expanding role of the Legionella urinary1. Bartlett JG, Breiman RF, Mandell LA, File TM Jr. antigen test. Clin Microbiol Newsl 2000; 22:62-64.Community-acquired pneumonia in adults: Guidelines for 6. Vergis EN, Yu VL. New directions for future studies ofmanagement. Clin Infect Dis 1998;26:811-838. community-acquired pneumonia: optimizing impact on2. Edelstein PH. Antimicrobial chemotherapy for patient care. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18:847-Legionnaires´ Disease: time for a change. Anne Intern Med 851.1998; 129: 328-30.3. Fields BS, Benson RF, and Besser RE. Legionella and 7.5 DETECCIÓN DE Legionella EN MUESTRASLegionnaires disease: 25 years of investigation. Clin CLÍNICAS CON TÉCNICAS DE PCRMicrobiol Rev 2002;15:506-526. 1. Ballard AL, Fry NK, Chau L, Surman SB, Lee JV,4. Pasculle AW. Update on Legionella. Clin Microbiol Newsl Harrison TG, Towner KJ. Detection of Legionella2000; 22:97-101. pneumophila using a real-time PCR hybridation assay. J5. Swanson MS, Hammer BK. Legionella pneumophila Clin Microbiol 2000; 38:4215-4218.pathogenesis: a fateful journey from amoebae to 2. Bernander S, Hanson HS, Johansson B, von Steding K.macrophages. Annu. Rev Microbiol 2000; 54:567-613. A nested polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in clinical specimens. Clin7.2 IDENTIFICACIÓN DE Legionella Microbiol Infect 1997; 3: 95-101.1. Benson RF and Fields BS. Classification of the genus 3. Cloud JL, Carroll KC, Pixton P, Erali M and Hillyard DR.Legionella. Semin Respir Infect 1998; 13:90-99. Detection of Legionella species in respiratory specimens2. Fry NK, Warwick S, Saunders NA and Emblet TM. The using PCR with sequencing confirmation. J Clin Microbioluse of 16S ribosomal RNA analysis to investigate the 2000; 38:1709-1712.phylogeny of the family Legionellaceae. J Gen Microbiol 4. Hayden, R.T.; Uhl, J.R.; Qian, X.; Hopkins, M.K.; Aubry,1991; 137:1215-1222. M.C.; Limper, A.H.; Lloyd, R.V.; and Cockerill, F.R. Direct3. Ratcliff RM, Lanser JA, Manning PA and Heuzenroeder detection of Legionella species from bronchoalveolarMW. Sequence-based classification scheme for genus lavage and open lung biopsy specimens: comparison ofLegionella targeting the mip gen. J Clin Microbiol 1998; LightCycler PCR, in situ hybridization, direct fluorescence36:1560-1567. antigen detection, and culture.J Clin Microbiol 2001; 39:2618-2626.7.3 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 5. Jaulhac B, Nowicki M, Bornstein N, Meunier O, Prevost1. Plouffe JF, File TM, Breiman RF, Hackman BA, Salstrom G, Piemont Y, Fleurette J and Monteil H. Detection ofSJ, Marston BJ and Fields BS. Reevaluation of the definition Legionella spp. In bronchoalveolar lavage fluids by DNAof Legionnaires´ Disease: use of the urinary antigen assay. amplification. J Clin Microbiol 1992; 30: 920-924.Community Based Pneumonia Incidence Study Group. Clin 6. Lisby, G., and Dessau, R. Construction of a DNAInfect Dis 1995; 20:1286-1291. amplification assay for detection of Legionella species in2. Wilkinson, H.W., Cruce, D.D. and Broome, C.V. Validation clinical samples. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;of Legionella pneumophila indirect immunofluorescence 13:225-231.assay with epidemic sera. J Clin Microbiol 1981; 13:139-146. 7. Rantakokko-Jalava K, Jalava J. Development of3. Wilkinson, H. W.,Fikes B. J. and Cruce D. D. Indirect conventional and real-time PCR assays for detection ofimmunofluorescence test for serodiagnosis of Legionnaires’ Legionella DNA in respiratory specimens. J Clin Microbioldisease: evidence for serogroup diversity of Legionnaires’ 2001; 39:2904-2910.disease bacterial antigens and for multiple specificity of 8. Welti SM, Jaton K, Altwegg M, Sahli R, Wenger A andhuman antibodies. J Clin Microbiol 1979; 9: 397-383. Bille J. Development of a multiplex real-time quantitative PCR assay to detect Chlamydia pneumoniae, Legionella7.4 DETECCIÓN DE ANTÍGENO EN ORINA pneumophila and Mycoplasma pneumoniae in respiratory1. Benson RF, Tang PW, Fields B. Evaluation of the Binax tract secretions. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 45: 85-95.and Biotest urinary antigen kits for detection ofLegionnaires’ disease duet to multiple serogroups and 7.6 DETECCIÓN DE LEGIONELLA EN MUESTRASspecies of Legionella. J Clin Microbiol 2000; 38:2763-2765. DE AGUA CON TÉCNICAS DE PCR2. Domínguez JA, Matas L, Manterola JM, Blavia R, 1. Catalán V, Moreno C, Dasi MA, Muñoz C and Apraiz D.Sopena N, Padilla E, Giménez M, Sabrià M, Morera J, Nested polymerase chain reaction for detection ofAusina V. Comparison of radioimmunoassay and enzyme Legionella pneumophila in water. Res. Microbiol 1994;immunoassay kits for detection of Legionella pneumophila 145:603-610.serogroup 1 antigen in both concentrated and 2. Mahbubani MH, Bej AK, Miller R, Haff L, DiCesare J andnonconcentrated urine samples. J Clin Microbiol Atlas RM. Detection of Legionella with polymerase chain1997;35:1627-1629 reaction and gene probe methods. Mol Cell Probes 1990;3. Domínguez J, Galí N, Blanco S, Pedroso P, Prat C, 4:175-187.Matas L, Ausina V. Assessment of a new test to detect 3. Yañez MA, Carrasco-Serrano C, Barbera VM andLegionella urinary antigen for the diagnosis of Catalán V. Quantitative detection of LegionellaLegionnaires’ Disease. Diag Microbiol Infect Dis 2001; pneumophila in water samples by immunomagnetic41:199-203. purification and real-time PCR amplification of dotA gene.4. Harrison T, Uldum S, Alexiou-Daniel S, Bangsborg J, Appl Environ Microbiol 2005; 71: 3433-41.Bernander S, Drasar V, Etienne J, Helbig J, Lindsay D,Lochman I, Marques T, de Ory F, Tartakovskii I, Wewalka, 7.7 TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE L. pneumophilaFehrenbach F. A multicenter evaluation of the Biotest 1. Fry NK, Alexiou-Daniel S, Bangsborg JM, Bernander S,Legionella urinary antigen EIA. Clin Microbiol Infect 1998; Castellani Pastoris M, Etienne J, Forsblom B, Gaia V,4:359-365. Helbig JH, Lück PC, Lindsay D, Pelaz C, Uldum S, Harrison TG. A multi-center evaluation of genotypic methods for the epidemiological typing of Legionella 14
  17. 17. pneumophila serogroup 1: Results of a pan-European 7.9 PREVENCIÓN Y CONTROL DE LEGIONELOSISstudy. Clin Microbiol Infect 1999, 5: 462-477. EN HOSPITALES2. Gaia V, Fry NK, Afshar B, Lück PC, Meugnier H, Etienne 1. Carratalá J, Gudiol F, Pallarés R, Dorca J, Verdaguer R,J, Peduzzi R, Harrison TG. A consensus sequence-based Ariza J, et al. Risk factors for nosocomial Legionellaepidemiological typing scheme for clinical and pneumophila pneumonia. Am J Respir Crit . Care Medenvironmental isolates of Legionella pneumophila, J Clin 1994; 149: 625-629.Microbiol 2005; 43:2047-2052. 2. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines3. Lück, P.C.; Helbig, J.H.; Gunter, U.; Assmann, M.; Blau, for prevention of nosocomial pneumonia. Morb Mortal WklyR.; Koch, H.; Klepp, M. Epidemiologic investigation by Rep 1997; 46: RR-1: 1-79.macrorestriction analysis and by using monoclonal 3. Freije MR. Legionellae control in health care facilities. Aantibodies of nosocomial pneumonia caused by Legionella guide for minimizing risk. Indianapolis: HC Informationpneumophila serogroup 10. J Clin Microbiol 1994; 32:2692- Resources, Inc., 1996. (http://www.hcinfo.com).2697. 4. Kool JL, Fiore AE, Kioski CM, Brown EW, Benson RF, Pruckler JM et al. More than 10 years of unrecognized7.8 PREVENCIÓN DE LEGIONELOSIS nosocomial transmission of legionnaires´disease among1. ASRHAE Guideline 12-2000. Minimizing the risk of transplant patients. Infect Control Hosp Epidemiol 1998;legionellosis associated with building water systems. 2000. 19:898-904.Atlanta, GA. American Society of Heating, Refrigerating 5. Lepine LA, Jernigan DB, Butler JC, Pruckler JM, Bensonand Air-Conditioning Engineers, pp.1-17. RF, Kim G et al. A recurrent outbreak of nosocomial2. CPNSW. Code of Practice for the control of legionnaires´disease detected by urinary antigen testing:legionnaires´disease. 1991. New South Wales. Sydney. evidence for long-term colonization of a hospital plumbingNSW Health Department, ISBN: 0 7305 3453 7. system. Infect Control Epidemiol 1998; 19: 893-897.3. Guía para la prevención y control de la legionelosis. 6. Sabrià M, Yu VL. Hospital-acquired legionellosis:Departamento de Sanidad y Seguridad Social. 2001. solutions to a presentable infection. The Lancet Infect DisBarcelona. Generalitat de Catalunya. Cuadernos de Salud 2002; 2:368-373.Pública nº16. 7. Yu VL. Nosocomial legionellosis. Curr Opin Infect Dis4. HSE book. Legionnaires´ Disease: The control of 2000; 13:385-388.Legionella bacteria in water systems. Approved Code ofPractice and Guidance (L8). 2000. 3ª Ed. ISBN: 0 71761772 6.5. Vargas F. Ed: Martín-Bourgon C, Boix R y Pelaz C.Recomendaciones para la prevención y control de lalegionelosis. 1999. Ministerio de Sanidad y Consumo.ISBN: 84-7670-507-7. 15
  18. 18. DOCUMENTO TÉCNICO PNT-LP-01 DETECCIÓN DE LEGIONELLA EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE CULTIVO ELABORADO REVISADO Y APROBADO Jefe de Servicio Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES 01 Edición inicialCOPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.
  19. 19. Servicio de Microbiología Detección de Legionella en Fecha: PNT-LP-01 muestras clínicas mediante cultivo Hospital.......................... Edición Nº 01 Página 2 de 71. PROPÓSITO Y ALCANCE 4.1. CONSERVACIÓN Y TRANSPORTEEl objetivo de este documento es describir el Todas las muestras para cultivo deben serprocedimiento de aislamiento de Legionella en conservadas en condiciones de refrigeración (5ºC)cultivo a partir de muestras de origen humano. Se hasta su procesamiento, que debería realizarsedescribe el tipo de muestra y su procesamiento en el antes de las 48 h. Si ello no fuera posible, selaboratorio. conservarán congeladas (-20ºC), evitando en lo posible ciclos de congelación-descongelación, que2. FUNDAMENTO afectan a la viabilidad de la bacteria. Legionella es una bacteria de morfología bacilar. En muestras de pequeño volumen, es preferibleEs aerobia y habitualmente vive en medios diluir utilizando una pequeña cantidad (1 ml) de aguaacuáticos. Es una causa relativamente frecuente de destilada estéril no bacteriostática. No utilizarneumonía y excepcionalmente causa otros tipos de soluciones salinas ni tampones que contenganinfecciones. El cultivo es el único método que fosfato de alta molaridad que pueden inhibir elpermite el diagnóstico etiológico de las infecciones crecimiento de la bacteria.causadas por cualquier especie o serogrupo. Para su Si se requiere transporte, se realizará a 5ºC,aislamiento en cultivo, estos microorganismos excepto cuando las muestras estuvieran congeladas,requieren medios específicos, obteniéndose colonias en cuyo caso deben transportarse en este estado. Elvisibles a partir del 3º-7º día de incubación, aunque transporte se realizará en contenedores estériles,en ocasiones pueden requerir hasta 10-12 días de con cierre fuerte, y de un tamaño lo suficientementeincubación para visualizar su crecimiento. pequeño para evitar la desecación de la muestra, ya Existen 48 especies de Legionella, pero L. que ésta afecta a la viabilidad de Legionella. Sepneumophila es la especie que más frecuentemente utilizarán contenedores y empresas de mensajeríacausa infecciones en humanos. El serogrupo 1 de L. autorizadas para el transporte de material biológicopneumophila es el que más frecuentemente se aísla (ver Procedimiento 1a de SEIMC).de muestras clínicas. Una vez procesadas las muestras es recomendable su conservación a -20ºC hasta tener el resultado3. DOCUMENTOS DE CONSULTA definitivo por si fuera necesario procesarlas de nuevo.- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10. Seguridad en el laboratorio de 4.2. CRITERIOS DE RECHAZO microbiología clínica. 2000. Se debe rechazar cualquier muestra en la que se- Procedimiento en Microbiología Clínica de la observen las siguientes incidencias: SEIMC nº 1ª. Recogida, transporte y procesamiento 1. Defectos en la identificación de la muestra: general de las muestras en el laboratorio de etiquetado inadecuado o erróneo, o microbiología. 2003. cumplimentación incorrecta de la hoja de petición del análisis.4. MUESTRAS 2. Muestras enviadas erróneamente, por ejemplo Las muestras adecuadas para cultivo pueden ser orina con una petición de esputo, o esputos conagrupadas, en función del tipo y nivel de petición de antígeno.contaminación, en: 3. Mal estado de conservación de la muestra: A) Secreciones respiratorias contaminadas: esputo temperatura inadecuada, muestras en medio no expectorado y muestras del tracto respiratorio inferior apropiado, mala conservación (biopsias secas). contaminadas con microbiota del tracto respiratorio 4. Muestras derramadas por envase inadecuado o superior, como aspirados bronquiales o mal cerrado. transtraqueales, y lavados o cepillados bronquiales. No se debe rechazar ninguna muestra sin B) Secreciones respiratorias no contaminadas: contactar primero con el médico responsable del muestras del tracto respiratorio inferior no paciente y se debe realizar cualquier esfuerzo para contaminadas, como las obtenidas mediante cepillo salvar las muestras que se han obtenido con riesgo o telescopado y aspirado pulmonar transparietal. con problemas para el paciente (biopsia pulmonar, C) Tejidos: tejido pulmonar obtenido en biopsia o aspirado transtraqueal, líquido pleural, etc.). necropsia, o tejido de otros órganos. Los tejidos son En general, una muestra es suficiente, ya que el inoculados directamente en los medios de cultivo. aumento del número de muestras no mejora el D) Otras muestras menos frecuentes, como líquido rendimiento en el aislamiento de Legionella en cultivo. pleural, líquido cefalorraquídeo (LCR) o sangre. Las muestras para cultivo es preferible tomarlas antes La sensibilidad del cultivo documentada de de la aplicación de un tratamiento antibiótico, sinmuestras respiratorias oscila entre un 20 y un 80 %, lo embargo su aplicación o duración no son criterios decual refleja cierta dificultad del método, debido a varios rechazo de muestras.factores entre los que se pueden mencionar la El esputo de los pacientes con enfermedad de losprogresiva pérdida de viabilidad de la bacteria tras la legionarios generalmente no es purulento y puede sertoma de la muestra y la experiencia microbiológica sanguinolento o acuoso. De hecho, los esputos muyrequerida. purulentos hacen muy improbable el diagnóstico de legionelosis. Por este motivo, el recuento del número de

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