Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après apprentissage topographique
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Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après apprentissage topographique

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Une des hypothèses concernant la fonction du sommeil suggère que ce dernier permettrait la plasticité neuronale et l'organisation (ou la réorganisation) synaptique, phénomènes sous-tendant des ...

Une des hypothèses concernant la fonction du sommeil suggère que ce dernier permettrait la plasticité neuronale et l'organisation (ou la réorganisation) synaptique, phénomènes sous-tendant des fonctions cognitives. Des perturbations spécifiques du sommeil faisant suite à un apprentissage ont en effet montré une diminution significative des performances aux niveaux des gènes et du comportement. Notre travail à visé à étudier les conséquences d'une privation de sommeil faisant suite à un apprentissage d'une tâche mnésique au niveau de l'abondance de protéines dans l'hippocampe de rat. Pour ce faire, une première étude protéomique de l'hippocampe de rat en l'absence d'apprentissage spatial spécifique a d'abord été réalisée ; elle montre l'absence de différence quantitative d'abondance protéique entre les hippocampes gauche et droit. Ensuite, une seconde étude protéomique montre qu'une privation de courte durée affecte différents réseaux de protéines, principalement liés au métabolisme cellulaire, aux voies biochimiques de l'énergie, des transports, du trafic vésiculaire, du cytosquelette et du traitement des protéines dans l'hippocampe de rat. Finalement, une troisième étude protéomique montre les effets d'un apprentissage d'une tâche spatiale en début de période d'activité diurne sur le protéome d'hippocampe de rat. Les principales protéines affectées ont ici des fonctions liées au métabolisme cellulaire et au cytosquelette.

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    Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après apprentissage topographique Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après apprentissage topographique Presentation Transcript

    • Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après apprentissage topographique Jean-Etienne Poirrier 24 mars 2010 Centre de Recherches du Cyclotron & Giga-Neurosciences Université de Liège
    • Fonctions du sommeil Conservation Thermorégulation … de l’énergie … Sommeil Plasticité synaptique Restauration Défense tissulaire immunitaire Consolidation Bennington 1999 & 2003, Brown 2004, Walker 2006
    • Consolidation mnésique Induction : requiert synthèse d’ARNm et de protéines   Maintenance : ARNm – synthèse de protéines Mémoire à court terme Mémoire à long terme minutes heures jours Switch Stickgold 2007
    • Hippocampe d’après Ikonen 2002, Cheung 2005
    • Labyrinthe de Morris Quadrants de départ aléatoires : 120 N, E, S, W, E, W, N, S, E, N, W, S Apprentissage t(s) Latence d’échappement 20 Distance parcourue 1 4 8 essai Morris 1984, D’Hooge 2001
    • Fenêtre de sommeil paradoxal Consolidation Smith 1996
    • Fenêtre de sommeil paradoxal  Consolidation Smith 1996
    • Fenêtre de sommeil paradoxal Effet de la privation de sommeil paradoxal sur l’apprentissage spatial Essais apprentissage Tests rétention Latence d’échappement (s) Période de privation de sommeil paradoxal (heures suivant le dernier apprentissage) Smith 1996, 1997
    • Thèses 1. La consolidation de la mémoire est liée au sommeil 2. La consolidation de la mémoire nécessite une néo- synthèse de protéines 3. L’hippocampe est spécifiquement impliqué dans l’induction de la consolidation mnésique
    • Hypothèse L’hippocampe devrait être le siège d’une modification et/ou néo-synthèse de protéines nécessaire à la consolidation mnésique et dépendante de certaines phases du sommeil
    • Questions Modification rapide de l’abondance des protéines hippocampiques de rat suite à un apprentissage ? Modification de l’abondance des protéines hippocampiques et des surrénales de rat après privation de sommeil ? Latéralisation de l’expression des protéines de l’hippocampe de rats ?
    • Le protéome Ensemble complet des protéines exprimées par une cellule, un tissu ou un organisme à un moment donné, et dans des conditions définies
    • Analyse du protéome 1. Préparation échantillon 2. Séparation pI 4 7 (électrophorèse bi-dimensionnelle) Mw 3. Identification (spectrométrie de masse) m/z
    • Gel 2D pH 4 7 Mw
    • 2D-DiGE Echantillon 1 1 échantillon (pooling) + Cy3 Echantillon 2 + Cy5 Meilleure analyse des patrons de distribution Standard interne Focalisation isoélectrique + Cy2 Meilleure quantification des différences SDS-PAGE pH 4 7 2D-DiGE : 1. Cyanines (Cy dyes) comme marqueurs de protéine 2. Co-migration de 2 échantillons différents dans le même gel Lecture Lecture Lecture 3. Co-migration d’un standard Mw à 570nm à 506nm à 670nm interne et normalisation Ünlu 1997, Patton 2000 & 2002
    • Asymétries comportementales Asymétries morphologiques Latéralisation biochimique Protéome Expression différentielle de de l’hippocampe transcrits de rat
    • Résultats : hippocampes gauche et droit Pas de latéralisation de l’abondance de protéines dans l’hippocampe de rat naïf
    • Contrôle positif Différence d’expression des protéines hippocampiques à deux stades du développement : nouveaux nés (3 jours) et adultes (3 mois) Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008
    • Résultat : adultes & nouveaux nés Abondance protéique différente entre l’hippocampe des nouveaux nés et des adultes
    • Résultat : adultes & nouveaux nés • 44 spots adulte > nouveau né • 50 spots nouveau né > adulte • 34 protéines identifiées possibles modifications • 18 protéines uniques post-traductionnelles
    • Fonctions adultes > nouveaux nés abondance
    • Fonctions nouveaux nés > adultes abondance
    • Conclusions – partie 1 G=D Nouveau né ≠ Adulte croissance maturation du cytosquelette synthèse ARNm maturation de voies métaboliques synthèse protéines (glycolyse, respiration, fourniture ATP) Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008
    • Protéome de l’hippocampe hippocampe et des surrénales de rat suite à une privation de sommeil
    • Transcrits du sommeil Rxt1 Arc JNK1 SWI2 Vin-1 Grp94 CHOP CytCOx Vgf NGFI-B Calmodulin NTT4 LMO-4 ERP70 HSP70 aaNAT1b GABA B3 c-fos Neuroglycan N-ras Homer1a IER5 12s rRNA BDNF F3 KIAA0313 TIMP-1 BiP NGFI-A HSP60 GRP75 rlf TrkBr BiP StripeA Stat3 NADH2 Glut1 NFGI-A SNF2 Cirelli 2002, 2005
    • Protocole
    • Poirrier et al. 2006 Journal of Circadian Rhythms 4:10
    • Privation de sommeil – manipulation douce Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Hippocampe : privation - sommeil • 64 spots privation > sommeil • 23 spots sommeil > privation • 16 spots envoyés en MS • 12 protéines identifiées
    • Hippocampes: Privation > Sommeil abondance (NSF) Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14 ; Cirelli 2000 & 2006
    • Confirmations – α-SNAP Anticorps anti-α-SNAP (monoclonal souris, conc. 1µg/ml) Rapport : -1.15 (-1.37) ; n = 3 Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Confirmations – NSF Anticorps anti-NSF (monoclonal souris, dil. 1/2000) Rapport : -1.28 (-1.33) ; n = 3 Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Trafic vésiculaire – plasticité synaptique Ungermann 2005
    • Surrénales : privation - sommeil • 18 spots privation > sommeil • 39 spots sommeil > privation • 13 protéines identifiées • 12 protéines uniques
    • Surrénales : Privation < Sommeil abondance Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Confirmations – G6PD Anticorps anti-G6PD (polyclonal lapin, dil. 1/1000) Rapport : -1.47 (-1.49) ; n = 6 Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Conclusions • Courte privation totale de sommeil :   stress physiologique / comportemental  ensembles de protéines / • Hippocampes en privation : activation de mécanismes impliqués dans transport et trafic vésiculaire – α-SNAP – NSF – Rab GDI α • Glandes surrénales en sommeil : activation de mécanismes impliqués dans le métabolisme Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
    • Où est le stress ? • Aucun indice physiologique classique de stress • Aucun indice comportemental classique de stress G6PD : synthèse NADPH (voie des pentoses phosphates)  NADPH contre le stress oxydatif suivant privation de sommeil CLIC4  maintenance du volume cellulaire et du potentiel de repos membranaire
    • Protéome de l’hippocampe de rat suite à un apprentissage
    • Protocole
    • Groupes Lab. Morris Lab.Morris 4h 20h entraînement test rétention G1 privation G3 privation G2 non-privation Rats 3 mois G4 non-privation G5 G6 privation G7 non-privation Rats 6 mois G1b privation G2b non-privation t0 phase claire sacrifice
    • Latence d’échappement rats 3 mois 120 Apprentissage + Privation (G1) Apprentissage + Non-privation (G2) Durée totale (s) 60 40 20 Tests 1 Tests 2 Tests 3 Rétention Série Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)
    • Distance parcourue rats 3 mois Apprentissage + 4000 Privation (G1) Apprentissage + Non-privation (G2) Distance totale (cm) 1000 Tests 1 Tests 2 Tests 3 Rétention Sans PF Série Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)
    • Et pourtant … Smith 1997
    • Analyse en composantes principales Ensemble des spots de protéines dans l’expérience
    • Apprentissage > Apprentissage + Sommeil abondance
    • Apprentissage + privation ~ Privation abondance
    • Apprentissage + privation > Apprentissage + sommeil abondance
    • Rat, hippocampe & apprentissage Apprentissage tâche spatiale  Rétention tâche spatiale  Apprentissage + privation de sommeil > Apprentissage + sommeil Apprentissage ~ Apprentissage + privation Sommeil suivant apprentissage
    • Conclusions • Etude du protéome d’hippocampe – privation de sommeil – apprentissage tâche mnésique • Importance du protocole expérimental • Privation de sommeil : transport et trafic vésiculaire • Apprentissage = stress, métabolisme
    • Remerciements • Professeurs G. Moonen & A. Luxen • Drs. P. Leprince & P. Maquet • Professeur C. Smith • Professeur PH. Luppi, Dr. R. Goutagny • Professeurs P. De Deyn, R.G. Morris, P. Meerlo, • Drs. A.M. Strijkstra, C. Robert • L. Cambron, JM. Klein • Professeur J. Destiné, Dr. F. Senny, N. Marique, T. Libert • Drs. A. Plenevaux, J. Aerts, A. Silvani, A. Darsaud • D. Lassance, P. Piscicelli, Y. Dohogne, L. Confetti, P. Ernst, A. Brose • Drs. F. Guillonneau, J. Renaut • A. Plenevaux, B. Herbillon, A. Konings