Your SlideShare is downloading. ×
Mfos skripta   cela
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

Mfos skripta cela

2,135
views

Published on


0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
2,135
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
71
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Molekularna fiziologija organskih sistemaMFOS 2012prof Jelena Đorđevid skripta
  • 2. 2 SadržajĆelijska membrana, uloga proteina, vrste trasporta kroz membranu.......................................................... 5 Transport kroz membranu ........................................................................................................................ 9 Aktivni transport materija posredstvom membranskih proteina ........................................................... 12 Kotransporteri ..................................................................................................................................... 15 Membranski izmenjivači, antiporteri .................................................................................................. 17Jonski kanali ................................................................................................................................................ 17 1) Koneksoni............................................................................................................................................ 20 2) Voltažno zavisni jonski kanali.............................................................................................................. 21 3) kanali za Ca2+ ....................................................................................................................................... 23 4) kanali za K+ .......................................................................................................................................... 25 Grupa kanala koja se aktivira agonistima: .......................................................................................... 29Signalna transdukcija .................................................................................................................................. 30 Mehanizmi komunikacije između delija .................................................................................................. 31 Signalni molekuli ..................................................................................................................................... 31 Klase receptora ....................................................................................................................................... 32 Ligandi za receptore ................................................................................................................................ 32 Signalni događaj ...................................................................................................................................... 33 Membranske guanil ciklaze..................................................................................................................... 38 Membranske Ser/Thr kinaze ................................................................................................................... 39 Membranske tirozin kinaze..................................................................................................................... 39 Receptori spregnuti sa G proteinom ....................................................................................................... 43 Signalizacija preko inozitol-3-fosfata i diacil-glicerola ............................................................................ 53 Signalni put preko eikozanoida ............................................................................................................... 55 Jonotropni receptori ili ligand zavisni jonski kanali ................................................................................ 57Sinaptička transmisija ................................................................................................................................. 58 Holinergička sinapsa ............................................................................................................................... 62 Bolesti vezane za holenergičku sinapsu .................................................................................................. 63 Farmakologija monoaminergičke sinapse .............................................................................................. 64 Receptor za acetilholin............................................................................................................................ 66 Nikotinski receptor.................................................................................................................................. 67
  • 3. 3 Receptori za glutamat ............................................................................................................................. 68 Receptori za GABA .................................................................................................................................. 70Transdukcija senzornih signala ................................................................................................................... 71 Mikrookruženje neurona ........................................................................................................................ 71 Cerebrospinalna tečnost ......................................................................................................................... 72 Transport i stvaranje CST ........................................................................................................................ 73 Transdukcija olfaktornih signala ............................................................................................................. 78 Transdukcija tastatornih signala ............................................................................................................. 80 Detekcija gorkog i slatkog ukusa ......................................................................................................... 81 Detekcija umami, kiselog i slanog ukusa............................................................................................. 81 Periferni hemoreceptori, karotidna telašca ............................................................................................ 82 Nociceptori.............................................................................................................................................. 83 Fotoreceptori .......................................................................................................................................... 84 Vlataste delije .......................................................................................................................................... 88Hormoni koji utiču na ishranu..................................................................................................................... 90 Insulin ...................................................................................................................................................... 90 Glukagon ................................................................................................................................................. 92 LEPTIN – regulator apetita ...................................................................................................................... 93 Adiponektin ............................................................................................................................................. 94 GRELIN..................................................................................................................................................... 94Molekularni mehanizmi lučenja sekreta digestivnog trakta ....................................................................... 96 Sekrecija pankreasnog soka .................................................................................................................... 99 Sekrecija pljuvačnog soka ..................................................................................................................... 105 Sekrecija želudačnog soka .................................................................................................................... 106 Molekularni mehanizmi sekrecije žuči .................................................................................................. 109Molekularni mehanizmi regulacije krvnog pritiska ................................................................................... 114 Vazokonstriktori .................................................................................................................................... 118 Vazodilatatori ........................................................................................................................................ 121 Antihipertenzivi ..................................................................................................................................... 124 Antagonisti kateholaminskih receptora ............................................................................................ 125 Blokatori kanala za Ca2+..................................................................................................................... 126
  • 4. 4 ACE (angiotensin-converting enzyme) inhibitori .............................................................................. 126 Antagonisti receptora za angiotenzine ............................................................................................. 127 Diuretici ............................................................................................................................................. 127 Blokatori receptora za endotelin ...................................................................................................... 128Molekularni mehanizmi transporta u tubulocitama ................................................................................. 129 Transport Na+ ........................................................................................................................................ 130 Transport Cl- .......................................................................................................................................... 131 Transport vode ...................................................................................................................................... 134 Transport uree ...................................................................................................................................... 134 Transport glukoze ................................................................................................................................. 135
  • 5. 5 Ćelijska membrana, uloga proteina, vrste trasporta kroz membranu Sve što se dešava na nivou organizma, organskih sistema i na nivou organa, svi procesipoĉivaju na ćeliji. Na slajdu je primer ţabe koja iskaĉe iz vode da li zato što je voda pretopla ilije hladna, da li zato što beţi od predatora ili je skoĉila u potrazi za plenom. Da bi ona skoĉilapotrebno je da doĊe do savijanja ekstenzora, grĉenja noge i savijanja fleksora. Da bi se mišićzgrĉio potrebno je da doĊe do preklapanja aktinskih i miozinskih filamenata koje se odvijazahvaljujući oslobaĊanju Ca iz intracelularnih depoa. Ca se vezuje za troponin C i kada se to desivezuju se troponin I i troponin T, oni se dakle izmeštaju kao loptice menjaju konformaciju, vukutropomiozin što dovodi do oslobaĊanja mesta za vezivanje na miozinske glavice. Fiziologija je, pre svega, nauka o homeostatskim mehanizmima i sve ovo o ĉemupriĉamo je u cilju odrţanja homeostaze. Fiziološki sistemi su puferi koji omogućavajuodrţavanje fiziološke homeostaze a fiziološka homeostaza poĉiva na samoj ćeliji i ćelija trošiveliku energiju kako bi odrţala homeostazu.Malo podsećanje šta je sekretin – hormon GIT-a koji se sintetiše u duodenumu i vezuje se zasvoje receptore na epitelnim ćelijama npr. u pankreasu, za one kanaliće, i dovodi do luĉenjapankreasnog soka a komponente pankreasnog soka su enzimska i bikarbonantna komponenta.Sekretin se vezuje za svoje receptore na epitelijalnim ćelijama pankreasnog duktusa i dovodi doluĉenja bikarbonata. Sastav unutar ćelije se potpuno razlikuje od vanćelijskog matriksa. I da vidimo šta je to što pravibarijeru i omogućava ćeliji da zadrţi svoj stalni sastav i utiĉe na njenu homeostazu. Ovde vidimo ćelijsku membranu, svi znamo uĉili ste, da ćelijsku membranu ĉinifosfolipidni matriks dakle u pitanju su fosfolipidi koji su specifiĉno orijentisani tako da sepolarne glave se orjentišu ka spoljašjoj sredini, dok su hidrofobni repovi okrenuti ka unutra itakva membrana potpuno onemogućava transport velikih molekula kao što su proteini, NK alionemogućava i transport jona kao što su Na, Ca, K, a omogućava transport O2, CO2. Šta ĉinifosfolipide? Kiĉma svakog fosfolipida je glicerol i serin. Glicerol je sa jedne strane vezan zaslobodne masne kiseline sa druge strane preko fosfatne grupe za razliĉite molekule pa u kolikoje u pitanju etanolamin dakle u pitanju je fosfatidil etanolamin u koliko je u pitanju serin onda jefosfatidilserin itd. Znaĉi u zavisnosti od polarne glave i fosfolipidi se razlikuju. Ono što jeinteresantno je to da je ustanovljeno da je membrana asimetriĉna. Da spoljašnji i unutrašnji listnisu isti. Fosfatidilholin je dominantno zastupljen u spoljašnjem listu membrane dok uunutrašnjem listu fosfatidilserin i fosfatidiletanolamin. Postavlja se pitanje zašto je membranaasimetriĉna? Na to pitanje niko nema pouzdan odgovor ali se pretpostavlja da je ta asimetrijavaţna zbog interakcije sa proteinima koji su uronjeni u ovaj fosfolipidni matriks i komunikacjesa sekundarnim glasnicima. Jer bez obzira što je tako graĊena, fosfolipidni matriks ne dozvoljavaprolazak supstanci, ali one moraju da proĊu jer se na taj naĉin odrţava homeostaza. Dakle u njusu uronjeni proteini koji na razliĉite naĉine uspostavljaju kontakt sa fosfolipidima i samim timimaju razliĉitu ulogu. Ovaj prvi protein koji vidimo je periferni protein znaĉi kao što vidimo postoje dva plavaproteina oni nisu uopšte uronjeni u membranu već su putem jonskih, vodoniĉnih daklenekovalentnim vezama vezani ili za integralne proteine proteine membrane ili za fosfolipidneglave. I kao što vidimo ovi periferni proteini mogu da budu vezani za integralne proteine npr. ispolja, znaĉi vanćelijske teĉnosti, a isto tako unutar ćelije. Primer takvog proteina je ankirin.Ankirin je protein koji odrţava odnosno na neki naĉin vezuje subkortikalne strukture odnosno
  • 6. 6ćelijski citoskelet koji se stastoji od više molekula. Ankirin je taj koji drţi ćelijski citoskelet inpr. daje eritrocitima onaj karkteristiĉan bifokalni oblik. Ostali proteini su integralni proteini - znaĉi da su na razliĉite naĉine uronjeni ufosfolipidni matriks. I ovaj prvi protein je kao što vidimo transmembranski protein koji sadrţijedan α heliks znaĉi samo jedanput prolazi kroz membranu i primer takvog proteina je integrin.Integrini su molekuli koji omogućavaju komunikaciju ćelije sa ekstraćelijkim matriksom npr.laminom, kolagenom; znaĉi sa proteinima ekstraćelijskog matriksa ili drugi molekuliomogućavaju komunikaciju sa drugim ćelijama. Znaĉi integrin je jedan od takvih proteina,adhezivnih molekula koji omogućava ćeliji komunikaciju.Sledeći primer integralnog proteina su proteini koji nekoliko puta prolaze kroz membranu, vrloĉesto ćemo se sretati sa heptaheliĉnim proteinima koji sedam puta prolaze kroz ćelijskumembranu; npr receptori spregnuti sa G proteinom, ABC transporteri. Tipiĉan primer je βreceptor za kateholamine. Broj ponovaka, tj. broj heliksa moţe da bude 12 ili 24 itd. Proteini ne moraju da prolaze kroz membranu, mogu da budu samo uronjeni u dvosloj isada imamo jos jednu interesantnu grupu proteina koja je kovalentno vezana zaglikozilfosfatidilinozitol (GPI) spoljnog lista. To su proteini, adhezivni molekuli; npr. NCAM jeadhezivni molekul nervnih ćelija ili CD59, on je protektin. Druga grupa proteina koja se takoĊevezuju za molekule fosfolipidnog matriksa, dakle to su proteini koji se vezuju za slobodne masnekiseline, npr. meristil grupe ili prenil grupe, to su hidrofobni repovi; primer takvog proteina je Gprotein. Ono što je karakteristiĉno za ove proteine koji prolaze kroz fosfolipidni matriks je da suuglavnom snabdevene nepolarnim AK kao što su Ala, Val, Leu, Pro, Phe, Met. Dakle one kojegrade hidrofilni dţep sa unutrašnje strane i omogućavaju komunikaciju izmeĊu dva susednaheliksa. Svaki heliks odnosno svaki navoj sadrţi 3-6 AK. Druga struktura kada govorimo oproteinima na primeru porina – to je protein membrane bakterija, ne formiraju α heliks vec βbarrel (beta bure). Jasno vam je da se najveći deo komunikacije izmeĊu ćelije i okoline odvijapreko proteina. Zašto kaţem najveći deo? Primer su steroidni hormoni. Steroidni hormoni(mineralokortikoidi, aldosteron) prolaze odnosno aldosteron ne zahteva protein na membrani većprolazi fosfolipidni matriks ulazi u ćeliju i vezuje se za svoje unutarćelijske receptore. I da vidimo koji su to proteini koji pomaţu komunikaciju izmeĊu ćelije i okoline.Prva grupa proteina koja govori o njihovoj ulozi su ligand vezujući proteini, znaĉi to sureceptori za hormone, malo pre pomenuti npr β receptor. Kaĉe se za N-terminus znaĉi navanćelijski domen na kome se nalazi ligand vezujuće mesto, veţe se hormon što dovodi dokonformacionih promena ovih sedam heliksa, jer je u pitanju heptaheliĉni molekul.Konformacione promene dovode do toga da unutarćelijski domen stekne enzimsku aktivnost - toje primer insulinskog receptora. Kada govorimo o proteinu, o ovakvom receptoru koji je kao naslici on dovodi do konformacione promene, a promene dovode do toga da unutarćelijska petljasada aktivira sekundarne glasnike i pošto su najviše u pitanju receptori spregnuti sa G proteinom,dakle u pitanju je protein G. To bi bila prva uloga proteina, da vezuju ligande, i ta veza sareceptorom da dovede do odgovora u ćeliji. Drugi su adhezioni molekuli, spominjali smo integrin. Integrin omogućavakomunikaciju ćelije sa adhezionim molekulima ekstraćelijskog matriksa i u principu ovakvimolekuli omogućavaju razne diferencijacije u ćeliji, regulišu apoptozu itd. Kako izgledaju oviadhezioni molekuli? Dakle u ekstracelularni matriks uronjen je kraj koji ima matriks vezujućidomen on se vezuje za komponente ekstraćelijskog matriksa to je kolagen, laminin, to je spektarrazliĉitih molekula. Veza ekstraćelijskog domena sa komponentama ekstarćelijskog matriksa
  • 7. 7dovodi do konformacionih promena transmembranskog regiona koji sada dovodi do toga da ovimali, kratki citoplazmatski repovi komuniciraju sa unutarćelijskim proteinima. Unutarćelijskiproteini su najĉešće FAK kinaze. Druga vrsta molekula to su molekuli koji omogućavaju komunikaciju izmeĊu dvesusedne ćelije. I tipiĉan primer za takav molekul je kadherin. Kadherina ima do sada 28izolovanih. U pitanju su Ca zavisni molekuli. Zašto Ca zavisni? Zato što ova vanćelijska petljaza sebe vezuje Ca. I oni omogućavaju komunikaciju izmeĊu ćelija, migraciju imunskih ćelija inavoĊenje npr aksona tokom razvoja NS. Druga vrsta adhezionih molekula su Ca nezavisnimolekuli, to je N-CAM adhezioni molekul nervnih ćelija. Adhezioni molekuli mogu da budu imolekuli vezani za GPI. N-CAM je GPI vezani protein. Druga uloga proteina membrane je dasu adhezioni molekuli koji omogućavaju ćeliji da komunicira sa vanćelijskim matriksom i sadrugim ćelijama. Treća vaţna uloga je da proteini formiraju jednu vrstu tunela i da omogućavajuprolazak molekula. Ti tuneli mogu biti razliĉiti, mogu biti pore mogu biti kanali, mogu bitinosaĉi, mogu biti pumpe u zavisnosti od toga na koji se naĉin vrši prenos. Ono što je zajedniĉkoza sve je da stvaraju hidrofilni prolaz u fosfolipidnom dvosloju kroz koji mogu da proĊuhidrofilne supstance, i ono što smo malo pre pomenuli, to je da su ovi α heliksi specifiĉnoorganizovani, rekli smo 3.6 AK po jednom navoju i heliks je organizovan tako da hidrofobne ihidrofilne AK alterniraju-tako da su hidrofilne okrenute ka unutrašnjosti a hidrofobne kafosfolipidnom matriksu. Na taj naĉin specifiĉnom organizacijom AK α heliksa omogućava sehidrofilna sredina samo kanala kroz koji prolaze hidrofilne susptance. Da li će taj tunel biti poraili kanal ili će biti pumpa zavisi od toga na koji naĉin je regulasan pristup tom tunelu. Proteini membrane mogu biti i enzimi. Svaka jonska pumpa koja se nalazi na ćelijskojmembrani je praktiĉno enzim. Sećamo li se neke pumpe? Na/K ATPaza. Kako se zove pumpakoja dovodi do stvaranja ţeludaĉnog soka? Kalijum protonska pumpa. Sve su to enzimi, ATPazekoje razlaţu ATP. Proteini membrane kao enzimi, šta ovo beše? Sećamo li se membranskogvarenja hrane? Sećamo se da pankreasni enzimi razlaţu hranu npr. šećere razlaţu do disaharida igraniĉnih dekstrina. Sećamo se da se varenje proteina pomoću enzima završava do oligopeptida ida oligopeptide, disaharide i najviše dekstrine, najviše razlaţu enzimi membrane. Sećamo seĉetkastog pokrova, one kosice na mikrovilima. Na mikrovilima upravo onaj glikokalikspretstavlja ugljenohidratne komponente upravo ovih enzima koji se nalaze u sastavu membrane ikoji vrše razlaganje oligopeptida, disaharida do monomera i onda ti monomeri ulaze u ćelijuzahvaljujući susednom transporeteru (npr. glukoza). To je primer da proteini membrane mogu dafunkcionišu kao enzimi. Treći primer proteina membrane kao enzima to su da su mnogi GPI-vezani proteini su enzimi i primer takvog enzima je 5’nukleotidaza koja utiĉe na metabolizam istrukturu nekih ?. I ono što je interesantno je da neki enzimi kao npr fosfolipaza C imamogućnost da oslobodi ovaj enzim i da enzim onda samim tim više nije vezan za membranu. Proteini mogu da budu ukljuĉeni u signalizaciju. Integralni protein koji je ukljuĉen usignalizaciju je G protein α subjedinica. Preko miristil i palmitoil grupe ukotvljuje G protein umembranu. Miristoilacija - dodavanje zasićene C14 na N terminalni Gly2 i palmitoilacija, nacisteinskim ostacima. Prvo se iseca terminalna AK, pa se zatim na susednu, praktiĉno terminalnusada dodaje miristoil grupa i ovaj se proces naziva miristoilacija. Zatim sledi sledeći proces to jepalmitoilacija, koja se zasniva na dodavanju palmitoil grupe na cisteinski ostatak. Još uvek se nezna zašto se odvijaju i miristoilacija i palmitoilacija ali se pretpostavlja da je miristoilacija
  • 8. 8neophodna za ukotljavanje samog molekula, a da je moţda palmitoilacija na cisteinskimostacima neophodna za integraciju sa adenil ciklazom. Kada se bilo koji ligand veţe za svoj receptor kada se aktivira G protein tada dolazi dodisocijacije α, β, γ subjedinice tako da sada α subjedinica moţe da aktivira adenil ciklazu sajedne strane a videćemo da β, γ subjedinica takoĊe mogu da uĉestvuju u prenosu signala. γsubjedinica sa druge strane preko prenil grupe ukvotljuje kompleks u membranu. I znaĉi Gprotein je tipiĉni primer integralnog proteina koji je ukljuĉen u ćelijsku signalizaciju. Uklanjanjemiristil i palmitoil grupe α subjedinice dovodi do toga da se α subjedinica otkaĉi od membranešto onemogućava njeno vezivanje sa adenil ciklazom i samim tim onemogućava prenos signalau ćeliju. Ono što je interesantno kada govorimo o integralnim proteinima je da jedna grupaantikancerogenih lekova deluje tako što spreĉava ovo ukotvljavanje onkogenih produkata umembranu i tako ova grupa lekova eliminiše sposobnost ćelije da se transformiše u kancerogenećelije. Jednostavno spreĉavaju ukotvljavanje, spreĉavaju vezu ovih grupa, vezivanje tih grupa zaintegralni protein. Na kraju proteini membrane kao submembranski citoskelet. Pomenuli smo ankirin isada ćemo videti kako on funkcioniše. U pitanju su periferni proteini - proteini koji su slabimnekovalentnim interakcijama vezani za membranu ili neku komponentu ili za integralni protein.Rekli smo da je primer protein ankirin i u principu ovi proteini omogućavaju vezivanjesubmembranskog citoskeleta i malo pre smo pominjali da submembranski citoskelet dajekarakteristiĉan oblik bifokalnih diskova eritrocita. Sad da vidimo šta ĉini taj submembranskicitoskelet. Ĉine ga spektar molekula, jedan od nih je spektrin, zatim molekul aktina, dalje ankirin,Band4.1 i Band3 koji predstavlja integralni protein. Kako funkcioniše ova mreţa? Da krenemo od spektrina. U pitanju je dimer koji se sastojiiz α i β monomera, dva dimera se glavama spajaju u heterotetramer. Repovi ovogheterotetramera su spojeni sa Band4.1 koji je opet sa svoje strane vezan za aktin. Ceo ovajcitoskelet drţi ankirin i drţi ga vezan za integralni protein Band3. Band3 je recimo kanal,odnosno ukljuĉen je u transport hlorida i bikarobonantnih anjona. Ankirin dakle ukotvljuje celuovu mreţu, membranski citoskelet i samim tim omogućava i daje oblik ćeliji. Ukoliko nastanemutacija u genu koji kodira za ankirin, tada eritrociti gube svoj karakteristiĉni oblik. Ankirin nijesamo specifiĉan za eritrocite, nalazi se i u nervnim ćelijama, nalazi se u epitelim ćelijama i nemora uvek biti vezan za Band3, već moţe biti vezan za druge kanale i druge pumpe ili za nekiadhezivni molekul. Imamo još GPI-vezane proteine membrane koji imaju protektivnu ulogu. Pominjali smona poĉetku GPI proteine, oni se sintetišu u ER-u, i nakon sinteze protein se ubacuje u membranuER-a i takav protein sadrţi transmembransku komponentu i komponentu koja štrĉi u lumen ER-a. Proces sinteze GPI proteina obuhvata aktivaciju enzima ER-a koji dovode do isecanjanascentnog proteina izmeĊu transmembranskog regiona i ovog dela koji štrĉi u lumenu ER-a, štodalje dovodi do toga da se na karboksilni kraj ovog dela koji se nalazi u lumenu kaĉi aminogrupa glikozil fosfatidilinozitola i na taj naĉin se gradi protein vezan za GPI. Jedan od enzimakoji uĉestvuje u isecanju ovog nascentnog proteina, koji dovodi do nastanka GPI vezanogprteina, je fosfatidilinozitol glikan A (PIG-A). Zašto kaţemo da imaju protektivnu ulogu? Zatošto je ustanovljeno da npr. u eritrocitima (eritrociti su pogodni za prouĉavanje jer se praktiĉnosastoje samo iz membrane i matriksa koji je ispunjen hemoglobinom) postoje dva GPI proteina.Jedan se naziva protektin (CD59) i drugi je DAF (CD55). I jedan i drugi su GPI vezani proteini i
  • 9. 9imaju protektivnu ulogu. Oni štite eritrocite od sistema komplementa. Sistem komplementa jegrupa proteina koji cirkulišu i koja funkcionišu tako da prepoznaju antitela vezana za bakterije idovode do enzimske hidrolize i do ubacivanja molekula proteina u membranu, što dovodi dostvaranja pore i osmotske lize bakterije. Dolazi do njenog pucanja. Ono što je problem je štosistem komplementa nije savršen kao B i T limfociti i ne moţe da odvoji eritrocit od bakterije.Zato su mnoge ćelije pa i eritrociti snabdeveni ovim molekulima koji praktiĉno štite ćeliju odsistema kompementa i ne dozvoljavaju joj da ono što radi bakterijama radi i samim ćelijama, tj.eritrocitima. Šta se dešava kada nastane mutacija u genu za PIG-A? PIG-A je enzim koji dovodido stvaranja GPI vezanih proteina. Tada nastaje bolest koja se naziva paroksizomalna nokturalnahemoglobinurija. To je retka bolest ali još uvek neistraţena i interesantna. Dolazi do lizeeritrocita samo noću. Iz kog razloga, još uvek se ne zna. PIG-A ne postoji i ĉim ga nema, nemastvaranja CD59 i CD55, što znaĉi da su eritrociti praktiĉno nezaštićeni. Izloţeni su sistemukomplementa. MeĊutim iz nekog razloga ta hemoglobinurija odnosno liza eritrocita se odvijasamo noću odnosno samo u snu. Transport kroz membranu O ovome smo malo priĉali kada smo govorili o osmoregulaciji. Rekli smo da je sastavunutar ćelije potpuno drugaĉiji od sastava vanćelijske teĉnosti. Preteţni intraćelijski katjon je K⁺,kalijuma ima znaĉajno više u ćeliji nego u vanćelijskoj sredini. Na ⁺ je tipiĉni vanćelijski katjon.Proteini se nalaze više u ćeliji nego u vanćelijskoj teĉnosti. Što se tiĉe vode, zanimljiv je podatakda od 42 l vode koliko poseduje odrastao muškarac proseĉne telesne mase od 70 kg, ĉak 25 l senalazi u ćelijama, u vanćelijskoj teĉnosti oko 13 l, plazme imamo oko 3 l itd. Sad da vidimo kojisu to mehanizmi koji omogućavaju ovakvu razliĉitost, kad govorimo najpre o jonima kao što suNa⁺, K⁺, Ca²⁺ i protein. Transport ovih jona se vrši u zavisnosti od elektriĉnog i hemijskoggradijenta, odnosno elektrohemijskog gradijenta. Pasivni transport materija se odvija posredstvom membranskih proteina, u pitanju su jonii hidrofilne matrije. Ovakve materije prolaze kroz jednu vrstu tunela koja se naziva pora ili kakoih nazivamo, neregulisani kanali. Pore su proteini membrane koji su uvek otvoreni. Primerjednog takvog proteina smo imali kada smo govorili o mehanizmu stvaranja mokraće,akvaporini. Danas znamo da ih ima dosta, ali mi smo spominjali akvaporin1 i akvaporin2. Dodanas je izolovano 13 akvaporina i za otkriće akvaporina Peter Agre je 2003.godine dobioNobelovu nagradu. Gde se nalazi akvaporin1? Konstitutivno su eksprimirani, uvek su tu. Ĉemu sluţiHenleova petlja? Da se koncentruje urin.Ako se koncentruje urin, znaĉi da voda mora da prolazi,a voda prolazi kroz silazni deo Henleove petlje zahvaljujući konstitutivno eksprimiranimakvaporinima1. Akvaporin1 je jedan od prvih akvaporina koji je izolovan. U pitanju je tetramer isvaki od tih monomera tetramera ima 6 domena. U pitanju je pora koja je uvek otvorena, nemoţe da se reguliše njeno otvaranje i zatvaranje, samo moţe da se reguliše da li ga ima ili ganema. Zašto kaţemo da moţemo da ga regulišemo da li ga ima ili ga nema? Da li postoje nekiakvaporini koji nisu konstitutivno eksprimirani i moţemo da regulišemo ima li ih ili ih nema? Ko
  • 10. 10odreĊuje to da li će ih biti ili neće? Vazopresin i antidiuretiĉki hormon. Hormon se vezuje zasvoje receptore i dovodi do stvaranja tih pora u membrani i o tome ćemo govoriti na poslednjempredavanju. Dakle, antidiuretiĉki hormon, kada dehidriramo i kada treba da ĉuvamo vodu, ondovodi do eksprimiranja akvaporina 2, koji se ubacuje u membranu i na taj naĉin se vodareapsorbuje iz primarnog filtrata nazad u krvotok. Ovo je primer jedne pore. Drugi primer jeporin. Porin je protein, primer koji se nalazi u zidu gram negativnih bakterija i spoljnojmembrane mitohondrija. Zatim perforin. T limfociti ostvaruju svoje citotoksiĉno dejstvo tako štooslobaĊaju perforin. On je monomer koji se npr.u telu bakterije ili u telu bilo koje ćelije na kojuT limfocit ispoljava svoju citotoksiĉnost, polimerizuje i stvara poru promera 16 nm. Znaĉi to susve primeri na koji naĉin protein formiraju vrstu tunela koja se naziva pora i koja je uvekotvorena. Druga vsta tunela su kanali ili moţemo da je nazovemo regulisanom porom. To su tunelikoji mogu da se otvaraju i da se zatvaraju i u zavisnosti od toga da puštaju jone. To su kanali zaNa⁺, kanali za Cl⁻, kanali za K⁺, kanali za Ca²⁺ itd. Još jednom, razlika izmeĊu pore i kanala je tašto je pora uvek otvorena i moţemo je nazvati neregulisanim kanalom, a kanal moţe da se otvarai zatvara i zato moţemo da ga nazovemo i regulisanom porom. Kanali – u pitanju su tuneli kojiimaj mogućnost otvaranja i zatvaranja i ĉini ih jedna ili više polipeptidnih subjedinica uglavnomorganizovanih u vidu α heliksa i mogu da se otvaraju i zatvaraju u odgovoru na razliĉite faktore.Jedan od tih faktora je promena potencijala membrane. Kakav bi to bio kanal? Voltaţno-zavisnikanal. Da li smo priĉali o HCN kanalima, kanalima koji se otvaraju u odgovoru nahiperpolarizaciju? Oni se nalaze na ćelijama SA ĉvora i ti HCN kanali su odgovorni zagenerisanje spontanih akcionih potencijala. Ćelije SA ĉvora su izmenjene mišićne ćelije kojeimaju mogućnost spontane geneze akcionog potencijala. Kako oni spontano generišu akcionepotencijale? Tako što ih otvara hiperpolarizacija. Hiperpolarizacija dovodi do toga da se kanalotvara, ulazi Na+ i dolazi do depolarizacije i na taj naĉin imamo slanje tih spontanih akcionihpotencijala. Pa tako npr. adrenalin ubrzava srce tako što dovodi do otvaranja tih HCN kanala,ulazi natrijum, natrijum onda aktivira one brze kanale za kalcijum i na taj naĉin srce ubrzava rad.Zatim kanal moţe da se otvori u odgovoru na sekundarni glasnik. Npr postoje kanali koji seotvaraju na Ca, kalcijum indukovano otvaranje kanala za kalcijum. Zatim kad smo priĉali oĉepićima i štapićima…Bez cGMP zatvaraju se kanali zavisni od cGMP-a, ne ulazi Na+, dolazido hiperpolarizacije i smanjuje se oslobaĊanje glutamata. 1 foton stopira ulazak milion jona Na+.Svetlost tj. fotoni dovode do stopiranja ulaska Na+, hiperpolarizacije i smanjenja oslobaĊanjaneurotransmitera- glutamata. I imamo odgovor na ligand, šta bi to bilo? Da li ste ĉuli za kanalekoji su u stvari receptori za hormone, za neurotrasmitere. Receptor za Ach moţe da bude samkanal, receptor za GABA (γ-aminobuternu kiselinu) moţe da bude sam kanal. Moţe da budereceptor spregnut sa proteinom G, kada govorimo o Ach i GABA, ali moţe da bude tzv.jonotropni receptor, da je u stvari sam kanal receptor. Za sam kanal se recimo veţe Ach i dolazido njegovog otvaranja.
  • 11. 11 Zatim kanali mogu biti selektivni. Postoje npr. iskljuĉivo kanali za Na. Ali postoje ineselektivni kanali koji npr. propuštaju sve katjone. Primer tipiĉnog kanala za Na⁺ je voltaţnozavisni kanal za Na⁺, koji je odgovoran za generisanje akcionog potencijala. Ovaj kanal se nalazina tubulocitama i omogućava reapsorbovanje jona Na⁺, a nalazi se takoĊe i u enterocitama.Kanal za K⁺ generiše potencijal mirovanja u svim ćelijama i omogućava završetak akcionogpotencijala u nadraţljivim ćelijama. Kanal za Ca²⁺: kad pomislimo na Ca²⁺ prva asocijacija jekontrakcija, a druga asocijacija je egzocitoza granula. Kalcijum je uvek vezan za jedan od ta dvaprocesa. Tu se nalaze kanali takoĊe za anjone kao što su hloridi ,bikarbonati i karbokatjoni. Celosledeće predavanje će se baviti samo jonskim kanalima. Na koji naĉin se transportuju materije? Transportuju se i dalje u pravcu gradijentakoncentracije, ali zahvaljujući specifiĉnim nosaĉima, opet proteinima membrane i takav processe naziva olakšana difuzija. Sad ćemo da vidimo na koji naĉin funkcionišu ovi nosaĉi. Nosaĉi funkcionišu u ciklusima. Da bi jedan protein, odnosno jedan tunel bio nosaĉ a nekanal, on mora da ima mogućnost da se zatvara i otvara sukcesivno sa jedne i sa druge strane i onse tada naziva nosaĉ. Jedan takav nosaĉ je bio GLUT. Primer GLUT1. GLUT1 je tipiĉan primerjednog proteina koji ima 12 heliksa, svaki od po 3,6 amino-kiselina. 12 puta prolazi kroz ćelijskumembranu. Do sada je izolovano 13 GLUT proteina, nosaĉa za monosaharide. GLUT1 se nalaziu eritrocitima, u endotelnim ćelijama krvno-moţdane barijere i iskljuĉivo prenosi glukozu.GLUT2 se nalazi u tubulocitama, hepatocitama, enterocitama, β ćelijama Langerhansovihostrvaca i on je specifiĉan zato što prenosi osim glukoze i fruktozu i galaktozu. I takoĊe jespecifiĉan po tome što prenosi šećere u oba smera, moţe da prenese šećer iz vanćelijske sredineu ćeliju i obrnuto, iz ćelije u vanćelijsku sredinu. Pominjali smo GLUT2 kada smo priĉali oreapsorbovanju ugljenih hidrata u membranskom varenju. Uz one enzime se nalazio transporter.Pa tako npr. GLUT5 je transporter za fuktozu, on transportuje fruktozu iz lumena digestivnogtrakta u enterocitu, a GLUT2 transportuje na drugu stranu. GLUT3 se nalazi u neuronima iplacenti. GLUT4 u mišićima i masnom tkivu i specifiĉan je za unutarćelijske organele. Znaĉi tosu samo neki transporteri, membranski proteini koji uĉestvuju u procesu olakšane difuzije. Kako se odvija proces olakšane difuzije? Npr .GLUT1 sada treba da transportuje glukozuiz spoljašnje sredine u ćeliju. Prvo se otvara molekul ka spoljašnjoj sredini, glukoza ulazi ivezuje se za svoje vezujuće mesto na transporteru. U sledećoj fazi se GLUT1 zatvara na straniprema vanćelijskoj sredini i sada je glukoza zarobljena unutar molekula, dakle zatvoren jemolekul i sa jedne i sa druge strane i vezana je za svoje vezujuće mesto. Sledeća faza je da seotvara sa unutrašnje strane, glikoza ulazi u ćeliju, zatim se zatvara i sa unutrašnje strane,vezujuće mesto je sada prazno i ciklus se nastavlja. Dakle, da bi neki tunel bio transporter,odnosno nosaĉ a ne kanal, on mora imati mogućnost da se sukcesivno naizmeniĉno otvara i sajedne i sa druge strane. Sa ovog mesta transport moţe da ide i u suprotnom smeru od kazaljke nasatu. Ukoliko transporter prenosi iz ćelije u vanćelijsku sredinu, prvo se otvara strana premacitoplazmi, ulazi glukoza koja se opet vezuje za svoje mesto, zatvara se molekul i glukoza ostaje
  • 12. 12vezana za svoje mesto u zatvorenom molekulu, otvara se ka spoljašnjoj sredini ka vanćelijskommatriksu i ispušta se glukoza. GLUT2 je tipiĉni primer nosaĉa koji moţe da transportujeglukozu, fruktozu i galaktozu u dva smera. Aktivni transport materija posredstvom membranskih proteina Aktivni transport se odvija suprotno od gradijenta koncentracije i tipiĉni transporter jeNa-K ATP-aza. To je protein koji ima izmeĊu ostalog i enzimsku aktivnost. S jedne strane jetransporter, s druge strane je enzim zato što vrši razlaganje ATP-a. Za otkriće Na-K ATP-aze jeJens Skou, 1997, dobio Nobelovu nagradu za hemiju. Ne treba da se znaju imena , ali da se znada je za otkriće neĉega dobijena Nobelova nagrada. Kako izgleda Na-K ATP-aza? Sastoji se iz dve subjedinice, α i β subjedinice. αsubjedinica je ova velika roze, katalitiĉka subjedinica koja se sastoji iz 10 transmembranskihsegmenata. β subjedinica (plavo na slici) poseduje samo jedan transmembranski segment, znaĉisamo jednom prolazi kroz fosfolipidni matriks i ona je odgovorna za pozicioniranje Na-K ATP-aze na membrani. Do sada su izolovane 4α i 2β izoforme i one su eksprimirane u razliĉitimtkivima. Na-K ATP-aza se nalazi na bazolateralnoj membrane većine ćelija, osim horoidnihćelija. Horoidne ćelije su ćelije koje oblaţu komore i koje stvaraju cerebrospinalnu teĉnost.Jedino se na tim ćelijama Na-K ATP-aza nalazi na apikalnom delu. Inaĉe je uvek nabazolateralnom delu. Na-K ATP-aza omogućava jedini vid aktivnog transporta za Na⁺, a glavnije vid transporta za K⁺. Zašto kaţemo glavni vid za K⁺? To znaĉi da postoji još neka vrstatransporta - kalijum protonska pumpa koja stvara HCl, stvara ţeludaĉni sok. Pomenuli smo tupumpu kao jednu vrstu transporta za K⁺. Na-K ATP-aza ispumpava 3 jona Na⁺ iz ćelije iupumpava 2 jona K⁺ u ćeliju. Spada u familiju pumpi koje se nazivaju P ATP-aze ili E1-E2ATP-aze. Šta znaĉi E1-E2 ATP-aze? To znaĉi da se nalaze u dva konformaciona stanja E1 i E2. Toje sliĉna priĉa kao sa nosaĉima, ali malo komplikovanija, zato što se tu umeće i ATP, hidroliza iovaj molekul varira izmeĊu E1 i E2 konformacionog stanja. Krećemo sa fazom ciklusa u kojoj jeispustio K⁺ u ćeliju. Dakle , kada se nalazi u E1 stanju, za α subjedinicu je vezan ATP, ona jeprazna i otvorena ka ćeliji. Zašto je otvorena ka ćeliji? Zato što je malo pre izbacila 2 jona K⁺ ućeliju. Kada je takva, u E1 konformacionom stanju, kad je za nju vezan ATP i kad je prazna,povećan je afinitet tog konformacionog stanja, takve Na-K ATP-aze na Na⁺. I ova 3 jona Na⁺ izcitosola se sada vezuju za svoja vezujuća mesta na subjedinici, što dovodi do hidrolize ATP-a ifosforilacije aspartata na α subjedinici. Znaĉi samim tim što su se vezala 3 jona Na⁺, to dovodido hidrolize ATP-a i fosforilacije aspartate i konformacionih promena koje dovode do toga da seona zatvara prema ćeliji. I sad je taj Na⁺ zatvoren, došlo je do okluzije Na⁺ u okviru molekula.Posle toga, zatvaranje Na-K ATP-aze prema citosolu. Posle toga sledi spontana konformacionapromena, gde se ona transformiše iz E1 stanje u E2 stanje, samim tim se otvara ka vanćelijskoj
  • 13. 13teĉnosti i Na⁺ se izlaţe vanćelijskom prostoru. U takvoj E2 konformaciji je nizak afinitet Na-KATP-aze prema Na⁺ i natrijum se otkaĉi od svojih mesta na α subjedinici, ulazi u vanćelijskuteĉnost i ovakva ATP-aza je sad prazna i nalazi se u E2 stanju. I u takvom stanju se povećavanjen afinitet za K⁺. Sada ulazi K⁺, vezuje se za svoja vezujuća mesta na α subjedinici, što dovodido toga da se defosforiliše aspartate na α subjedinici. Defosforilacija aspartate dovodi dominimalnih konformacionih promena koje dovode do toga da se ona zatvori ka vanćelijskommatriksu i sada se K⁺ nalazi u okviru molekula, ali zatvoren sa obe strane, došlo je do okluzijeK⁺. I na kraju ATP se vezuje za pumpu u E2 stanju i na taj naĉin se ona vraća u E1 stanje, odaklesmo krenuli. U E1 stanju nema visok afinitet prema K⁺ i kalijum se na taj naĉin izbacuje u ćeliju.Sada je ona u E1 stanju, za nju je vezan ATP, otvorena je i prazna i poĉinje dalje, drugi ciklus,povećava se afinitet za Na⁺ i on se vezuje za svoja vezujuća mesta na α subjedinici. Ono što jeinteresantno, kada je pumpa u E2 stanju, tada se za nju mogu vezati kardijaĉni glikozidi, kao štoje npr. digoksin ili uabain. Vezivanje ovih kardijaĉnih glikozida dovodi do blokiranja pumpe,ona se blokira u E2 stanju i ne moţe da funkcioniše. Na taj naĉin deluju ovi blokatori pumpi. Drugi ĉlan iste familije membranskih proteina, odnosno pumpi je kalijum-protonskaATP-aza koja prenosi 2 protona i 2 kalijuma. Zatim u istu familiju ulazi i plazma-membranskapumpa za kalcijum ili Ca²⁺ATP-aza koja prenosi 1 proton i 1 Ca²⁺. I tu se nalazi još SERCApumpa, koja se nalazi na ER-u i ona upumpava jone Ca²⁺ iz citosola u organelu. Kad se aktiviraSERCA? Kada se obavi kontrakcija, kada se kalcijum veţe za troponin C i kad doĊe dopreklapanja, da sad ne bi došlo do stalne kontrakcije, kod tetanus npr. Kalcijum se izmeĊukontrakcije ubacuje u sarkoplazmatiĉni retikulum i tu se deponuje vezan za ona 2 proteina(nismo pominjali koja). Znaĉi SERCA Ca²⁺ ATP-aza je pumpa za kalcijum koja se nalazi namembrani organela (to je dovoljno da se pamti). Sledeća interesantna ATPaza je F tip ATPaze ili F0 F1 ATPaza koja se nalazi naunutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani i ona koristi gradijent protona izmedju spoljašnje iunutrašnje membrane mitohondrija za sintezu ATP-a. ATP sintaza ima dve subjedinice, F0 i F1.F0 je ona koja je zapravo u membrani dok je F1 ka matriksu okrenuta. F0 formira kanal zaprolaz protona i ima a, b i c subjedinice, 10 c subjedinica formira kanal dok a i b regulišupozicioniranje u membrani. F1 ima alfa, beta, gama, delta i epsilon subjedinice i ona jeodgovorna za sintezu ATP-a. Kada protoni prolaze niz gradijent dolazi do rotiranja F0subjedinice, odnosno onih 10 c subjedinica, a one poslediĉno dovode do rotacije gama i epsilon,sto će dovesti do reakcije sinteze ATP-a, i to za 10 protona okrenuće se za 360° F1 subjedinica idovešće do sinteze 3 molekula ATP-a, odnosno za 120° jedan molekul ATP-a. Ove ostalesubjedinice, alfa, beta i delta su isto regulatorne subjedinice i stabilizuju molekul na membrani. csubjedinice bi bile kao ruka koja okreće lilihip. Kako okrećem rukom lilihip okreće se i drška odlilihipa i gore ovaj sam lilihip bi bio ATPaza koja dovodi do sinteze ATP-a i zato kaţemo da imaATPaznu aktivnost. Odakle gradijent protona? Odakle ti protoni izmedju spoljašnje i unutrašnje membrane
  • 14. 14mitohondrija? To su protoni iz elektron transportnog lanca, pre svega kompleksi 1, 3 i 4. SamaATPaza se smatra petim kompleksom, znaĉi to su NAD, NADH, oni upumpavaju protone umatriks. Znaĉi samim tim taj gradijent dovodi do toga da se rotira i da se sintetiše ATP. I za ovuhemiosmotsku hipotezu je takodje dobijena Nobelova nagrada 78, a za ATPazu 20 godinakasnije je takodje dobijena Nobelova nagrada za hemiju. Zašto sad pominjemo ATPazu kao ATP sintazu? Zato što ona ukoliko je protok protonakroz c subjedinice suprotan ona moţe da funkcioniše kao pumpa, odnosno kao protonskaATPaza. Protonske ATPaze se jos nalaze i na organelama i nazivaju se P tip protonskih ATPaza.Nalaze se na vakuolama, lizozomima, endozomima, sekundarnim vezikulima. Potpuno istoizgleda kao ATP sintaza, osim što ima 6 subjedinica koje su nešto veće od c subjedinica na ATPsintazi. Sledeća grupa molekula koja vrši aktivan transport su ABC transporteri. To sutransporteri sa ATP vezujućim motivom (engl. ATP-binding cassette). To je jedna velikasuperfamilija proteina koja sadrţi 48 razliĉitih ABC transportera. Mnogi od njih vrše hidrolizuATP-a da bi obezbedili transport nekih materija. Neki od njih vrše hidrolizu ATPa ali ne da biobezbedili transport, već da bi time regulisali neki jonski kanal ili neki drugi transporter. Prisutnisu kod prokariota i kod eukariota i kod eukariota su uglavnom efluksevi, odnosno eksporteri,znaĉi da transportuje materije iz ćelije. Ovde sam vam dala tabelu da se vidi otprilike kako supodeljeni, znaĉi 48 molekula, transportera koji su podeljeni u nekoliko familija, a, b, c, d, e, f, g,itd.A familija - u pitanju je familija najvećih transportera, neki imaju preko 2100 ak i oni suukljuĉeni u transport holesterola i lipida.B familija - Nalaze se na krvno moţdanoj barijeri, jetri, mitohondrijama, ukljuĉeni su u transportpeptida i ţuĉnih soli. Jedan njen ĉlan koji se naziva ABCB1 ili MDR1 (od multi drug resistance).Znaĉi oni su pronadjeni tako što je ustanovljeno da su odgovorni za rezistenciju na antibiotike.Dovode posle izvesnog vremena do efluksa antibiotika i uzrokuju rezistenciju na antibiotike i tajprvi molekul koji je pronadjen je MDR1. Znaĉi to je B familija ABC transportera i posle jeustanovljeno da su odgovorni za rezistenciju na mnoge druge lekove.C familija - ukljuĉena u transport jona, to su membranski receptori. Tu je CFTR protein, upitanju je kanal za hlor koji je odgovoran za to na koji nacin sekretin omogucava sekrecijubikarbonatnih anjona upravo tako sto regulise delovanje CFTR proteina, odnosno kanala za hlor.Kad budemo govorili o tome kako sekretin funkcioniše pomenućemo i CFTR protein.D familija je karakteristiĉna uglavnom za peroksizome.E i F familije ne moraju da budu transporteri. Mogu da vrše hidrolizu ATP ali da ne trošeenergiju za transport već za regulaciju drugih kanala ili transportera.G familija ukljuĉena u transport lipida, ....ţuĉi, holesterola i drugih steroida. Naroĉito jeinteresantan polutransporter (znaci nije transporter vec regulator), to je G2 transporter ili BCRP
  • 15. 15(breast cancer resistance protein) koji je odgovoran za rezistenciju na hemoterapeutike. Na koji naĉin deluju ABC membranski protein? Kada govorimo o potpunimtransporterima oni se sastoje iz 4 subjedinice, 2 transmembranske i 2 domena koji vezuju ATP.Svaki od njih sadrţi 6 α heliksa koji formiraju jednu vrstu krila i ta krila se otvaraju i zatvaraju iomogućavaju transport materija. Drugi je nukleotid vezujući domen ili ATP vezujući domen kojiima katalitiĉko jezgro koje ĉine 2 β ploĉe i 6 α heliksa i ima taj motiv po kome su dobili ime,ABC motiv ili motiv koji vezuje ATP i u okviru tog motiva je i Q petlja koja spaja karboksilnikraj nukleotid vezujućeg domena sa amino krajem TND - trans membranskog domena, tako dasu oni poredjani transmembranski, nukleotid vezujući, transmembranski, nukleotid vezujući. Kako ABC ostvaruju svoju funckiju? U stanju mirovanja je nukleotid vezujući domen uotvorenoj konfiguraciji i takav molekul ima nizak afinitet za ATP, ali je visok afinitettransmembranskog domena za supstrat koji treba da prenese. Supstrat se u sledećoj fazi vezuje zasvoje mesto na transmembranskom domenu što dovodi do konformacionih promena nukleotidvezujućeg domena, povećava se afinitet za ATP, ATP se vezuje za nukleotid vezujuće mesto štodovodi sam domen u zatvorenu konfiguraciju, znaĉi praktiĉno dolazi do okluzije ATPa. Ovakvasada konfiguracija nukleotid vezujućeg domena menja konfiguraciju trans membranskogdomena, on se otvara kao krilo ka strani membrane suprotnoj onoj u kojoj je bio u stanjumirovanja, tako da u sledećoj fazi je konfiguracija takva da se smanjuje afinitet za molekul kojitransportuje, on se oslobadja, sledi hidroliza ATP-a i transporter se vraća u prvobitnukonfiguraciju gde je NBD u otvorenom a transporter ima povećan afinitet za supstrat kojiprenosi. Gubitak funkcije ABC proteina vezane su za ogroman broj bolesti. Kad smo pominjaliCFTR, to je transmembranski regulator cistiĉne fibroze, znaĉi kanal za to je ukljuĉen upatogenezu bolesti. Zatim bolest adrenoleukodistofija koja nastaje usled nagomilavanja masnihkiselina velikog lanca, oni se nagomilavaju u neuronima i nadbubreţnim ţlezdama i nastaje usledmutacija gena koji vrši transport lipida. Tangierova bolest nastaje usled drastiĉnog smanjenjaHDL. Zatim kornealna distrofija, progresivna familijarna intrahepatiĉka holestaza koja nastajeusled mutacija gena za MRP2. Kotransporteri Transporteri koji prenose 2 ili 3 jona ili molekula na istu stranu. Funkcionišu tako što sejedna materija transportuje u smeru gradijenta koncentracije i na taj naĉin se omogućava, dajeenergija za transport druge materije suprotno gradijentu koncentracije. I to je tzv sekundarniaktivni transport. Primer takvog transportera je natrijum glukozni kotransporter SGLT. Kadasmo govorili o membranskom varenju, one npr disaharidaze, npr maltaza, npr saharaza kojirazlazu disaharide i uz njih se odmah nalazio transporter koji će te nastale monosaharide odmahda ubaci u ćeliju. I takav transporter je SGLT1. Njega ĉini 1 subjedinica, 14 transmembranskihsegmenata i postoji dakle 3 forme SGLT - 1, 2 i 3. Forma 1 prenosi 2 natrijuma i jednu glukozu,
  • 16. 16forma 2 i 3 prenosi jedan natrijum zajedno sa jednom glukozom. U pitanju je elektrogenitransport. Zašto elektrogeni? Zato što prenosi na istu stranu 2 natrijuma i na taj naĉin se menjapotencijal. 10x ima više natrijuma van ćelije nego unutar ćelije i voltaţa od -60mV generišegradijent koncentracije od 100x za glukozu. Znaĉi glukoza se sada transportuje suprotno odgradijenta koncentracije, ali je taj gradijent sada 100x. U sluĉaju SGLT1 taj transport je mnogoefikasniji zato što je gradijent koncentracije za natrijum 100 i voltaţa jos 100, tako da jegradijent koncentracije za glukozu kada je prenosi SGLT1 ĉak 10.000x. Drugi transporter je transporter koji prenosi natrijum i zajedno sa natrijumom i aminokiseline. Gde smo to pominjali, isto digestivni trakt. Enzimi završavaju razlaganje do aminokiselina i sada te ak treba da budu ubaĉene u enterocite. Pominjali smo i u bubrezima, uproksimalnom delu, ĉim je mokraća prešla iz Boumanove kapsule u proksimalni deo bubrega tuse nalaze ova dva transportera i na taj naĉin se reapsorbuje Na zajedno sa glukozom i Na zajednosa ak i na taj naĉin se ĉuva Na, vraća se nazad u krv i vraća se 99% ak i 97% glukoze. Sledeći kotransporter je transporter za natrijum i bikarbonate. Takodje je u pitanjuelektrogeni transport zato što transportuje 3 bikarbonata zajedno sa jednim natrijumom i oni senalaze u pankreasu i holangiocitama.NKCC kotransporter. Pominjali smo NKCC2, deblji uzlazni deo Henleove petlje, znaĉi rekli smotanak uzlazni deo tu je pasivni transport, onda se petlja širi, tu se nalazi NKCC2 koji prenosi 1natrijum, 1 kalijum i 2 hlora. U pitanju je elektroneutralni transport. Nalazi se u neepitelnimćelijama NKCC1, a NKCC2 u Henleovoj petlji. Lek lasiks omogućava diurezu, izbacivanjeteĉnosti, deluje na NKCC2.Na/Cl kotransporter (NCC) – on je tu blizu NKCC2, nastavlja se transport Na i Cl ali se ĉuva K,u prvom delu distalnih tubula se pojavljuje. U pitanju je elektroneutralan transport. Na njegadeluje diuretik tiazid koji je bolji od lasiksa jer ĉuva kalijum.K/Cl kotransporter - transport K i Cl ali suprotno, iz ćelije u ekstraćelijsku teĉnost.Protonski/oligopeptidni kotransporter. Njega smo pominjali, transportovali smo oligopeptide uenterocitama. Sećamo se tripeptidaze i dipeptidaze koje se nalaze na membrani unutar ćelije. Dabi ta tripeptidaza unutar ćelije delovala nešto mora da ubaci tripeptid u ćeliju.Ovaj transporterubacuje proton i 1 oligopeptid.H/monokarboksilni kotransporter (MCT) – elektroneutralni transport; transportuje protonzajedno sa laktatom i piruvatom; laktat izgleda moţe da se trasnportuje u oba smera.H/divalent katjon kotransporter (DCT) – apsorpcija dvovalentnih katjona u duodenumu;transportuje proton zajedno sa dvovalentnim katjonima Fe2+, Cd2+, Pb2+. Omogućavareapsorbovanje gvozdja iz lumena creva u krv. Ima ga i u bubrezima.
  • 17. 17 Membranski izmenjivaĉi, antiporteriNa-Ca izmenjivaĉ (NCX) – u pitanju je elektrogeni transport (ubacuje niz gradijent koncentracije3Na+ a izbacuje suprotno gradijentu 1Ca2+). Gradijent konentracije pravi Na/K ATPaza nabazolateralnoj membrani. 10x gradijent koncentracije za Na+ i -60mV voltaţa generišu 10.000xgradijent konscentracije za Ca2+.Na-H izmenjivaĉ (NHE) – pronaĊeno 10 izoformi; uĉestvuje u regulaciji pH ćelije, ubacuje Na ućeliju u smeru gradijenta koncentracije, a izbacuje iz ćelije protone. Najrasprostranjeniji jeNHE1, nalazi se na neepitelnim ćelijama i bazolateralnoj membrani epitelnih ćelija. NHE3 senalazi na apikalnoj membrani tubulocita i uĉestvuje u sekreciji protona, odnosno reapsorpcijiNa+. TakoĊe se nalazi i u enterocitama. NHE5 se nalazi u neuronima, 10 u osteoklastima…Zatim imamo dva hloridno bikarbonatna izmenjivaĉa. Jedan je zavistan od Na, drugi nije.Na-driven Cl-HCO3 exchanger (NDCBE) – elektroneutralni transport. U pitanju je Na+elektrohemijski gradijent koji takoĊe reguliše pH, budući da ubacuje 2 HCO3-. Ista familija genakodira stvaranje ovog proteina kao i NBC.Cl-HCO3 izmenjivaĉ (AE) – Na-nezavisan, postoji u 3 izoforme, takoĊe reguliše pH. Svakaćelija eksprimira neki AE (spomiljali smo ga kod eritrocita – Hamburgerov šift). I ovajizmenjivaĉ spada u istu familiju gena kao NDCBE i NBC.SO4 exchanger (SAT) – ubacuje sulfate, izbacuje anjone. Nalazi se u tankom crevu iproksimalnim tubulima; trasnport SO42- iz ćelije u krv.Renalni transporter organskih anjona (ROAT) – nalazi se u bubrezima, omogućava preuzimanjeendogenih organskih anjona ali i lekova. OATP omogućava preuzimanje ţuĉnih soli i bilirubinau hepatocite – dovodi do preuzimanja ţuĉnih soli u zamenu za Cl-. PGT – omogućavapreuzimanje prostaglandina i tromboksanaNa apikalnoj membrani tubulocita proksimalnih tubula nalazi se (sekundarni) izmenjivaĉ hloridau zamenu za formate i oksalate. Ista genska familija kao SAT. Jonski kanali Natrijum je predominantni vanćelijski katjon (ima ga 10 puta više van ćelije; 145 mM van ćelije, a 14 mM unutar ćelije). Na -K ATP-aza je odgovorna za odrţavanje gradijenta visoke koncentracije Na van ćelije, K u ćeliji, i ukoliko se ova pumpa blokira ouabainom (koji ima afinitiet vezivanja za pumpu kada je ona u E2 stanju) tada dolazi do poremećaja odnosa ovih jona, koncentracija K se smanjuje u ćeliji, povećava se ulazak Na . Kalijum je predominantni ćelijski katjon, ima ga 120 mM unutar ćelije, van ćelije 4.5 mM, takoĊe ga odrţava Na-K ATP-aza. Osim što generiše gradijent koncentracije, Na -K ATPaza stvara i negativni potencijal membrane. Ova pumpa je elektrogena – izbacuje tri katjona (Na ), a unosi dva (K ). Postavlja
  • 18. 18se pitanje zašto ova ATP-aza troši ovoliko energije da bi odrţavala ovaj gradijent Na i K ?Da je nema, epitelni kanal za Na osetljiv na amiloid ne bi mogao da funkcioniše (nalazi se uepitelnim ćelijama tubulocita). TakoĊe, ne bi mogao da funkcioniše voltaţno-zavisni kanal zaNa koji ubacuje Na u smeru gradijenta koncentracije, niti transporteri koji su prisutni uskoro svakoj ćeliji, npr. kotransporter za glukozu i Na , ili kotransporter za aminokiseline i Na . Ovi kotransporteri su vidovi sekundarnog aktivnog transporta koji koriste energiju koju trošiNa - K ATPaza. Kalcijum - za njega se smatra da ima najveći elektrohemijski gradijent koji iznosi 104.Koncentracija van ćelije je 10-3, a unutar ćelije 10-7 mM. I opet se postavlja pitanje, ko odrţavataj enormni gradijent Ca 2 ? To su pumpe za Ca 2 , pre svega, PMCA (plazma membranskapumpa za kalcijum), SERCA i Na/Ca izmenjivač. SERCA se nalazi na membraniendoplazmatiĉnog i sarkoplazmatiĉnog retikuluma i upumpava Ca 2 koji se nalazi ucitoplazmi. PMCA ispumpava Ca 2 , a ubacuje protone. Ovu pumpu aktivira povišenakoncentracija Ca 2 u ćeliji, ali ne direktno, već preko kalmodulina - kad Ca 2 uĊe u ćeliju, onveţe kalmodulin, a on se veţe za pumpu i aktivira je i to dovodi do izbacivanja Ca kog ima uvisokoj koncentraciji u ćeliji. Kada se smanji koncentracija Ca 2 , on disosuje sa kalmodulina,kalmodulin disosuje sa pumpe i na taj naĉin se odrţavanje jona svodi na normalu. Na /Ca 2izmenjivaĉ – NCX aktivira izuzetno veliki influks Ca 2 u ćeliju i tada omogućava izbacivanjeCa 2 iz ćelije. On se, pre svega, nalazi u neuronima u kardiocitama. Zavisno od gradijentakoncentracije funkcioniše i voltažno-zavisni kanal za Ca 2 koji propušta jone Ca2+ u smerugradijenta. Hlor je predominantno vanćelijski anjon, meĊutim, njegov pasivni transport krozplazma membranu se odvija na osnovu elektrogradijenta, zbog visokog membranskogpotencijala ćelijske membrane i to preko anjon selektivnih kanala. Jedan od takvih kanala je itransmembranski regulator cistiĉne fibroze o kom će biti reĉi kasnije tokom kursa. U nekimćelijama se taj pasivni transport odvija i putem kotransportera u smeru koncentracije Cl . Sadruge strane, ovome se opiru izmenjivaĉi i kotransporteri o kojima smo priĉali, pre svegaanjonski izmenjivaĉ hloridno-bikarbonatni izmenjivaĉ koji izbacuje bikarbonate u zamenu za Cl (primer je kanal NKCC2 karakteristiĉan za debeli uzlazni deo Henleove petlje – ubacuje Na , zajedno sa K i dva Cl ). Kako funkcionišu jonski kanali? Baziraćemo se na morfologiji, patofiziologiji, graĊi ikako funkcionišu. U genomu ĉoveka postoje stotine gena za razliĉite kanale. Razliĉite izoformese eksprimiraju u razliĉitim ćelijama, tkivima i u razliĉitim fazama razvića. Kanali se dele naosnovu njihove elektrofiziologije, odnosno na osnovu toga da li su selektivni ili neselektivni,koje jone propuštaju, na koji naĉin se otvaraju, zatvaraju, inaktiviraju, na osnovu inhibicije istimulacije farmakološkim agensima (danas se mnogi kanali upravo dele po tome kakoodgovaraju na neke toksine. npr. kanali Na na TTX), kako se aktiviraju vanćelijskimagonistima (kao što je acetilholin, GABA, glicin), kako ih modulišu unutarćelijski molekuli(cikliĉni nukleotidi) i kakve su im strukturne karakteristike. Stotine kanala je klonirano i za mnoge kanale je utvrĊeno da imaju zajedniĉkekarakteristike, odnosno da kodiraju jednu vrstu domena koji se (u najvećem broju sluĉajeva)sastoji iz 6 transmembranskih segmenata koji će se ponavljati na razliĉite naĉine kod
  • 19. 19razliĉitih kanala i ono što je karakteristiĉno u ovom domenu je da četvrti segment (S4) imapozitivno naelektisane aminokiseline (lizin i arginin na svakom trećem mestu) i da upravo ovajsegmet predstavlja voltažni senzor, pa je i ovakva graĊa kanala naroĉito karakteristiĉna zavoltaţno-zavisne kanale za Na , Ca2+, K i kanale koje regulišu cikliĉni nukelotidi. IzmeĊusegmenata 5 i 6 (S5 i S6) se nalazi P region koji oiviĉava poru, dakle on je taj koji praktiĉnoformira poru ovog kanala. Diverzitet jonskih kanala kod sisara je veliki i kod razliĉitih kanalaće se ovaj domen na razliĉite naĉine ponavljati.Jonski kanali kod sisara:1) koneksoni To su polukanali koji grade pukotinaste veze. Svaki konekson ĉine 4 transmembranskasegmenta. Kako izgleda jedan domen (na prezentaciji). Dva koneksona grade pukotinastu vezu.2) voltažno zavisni jonski kanali Velika superfamilija kanala koja ima isti strukturni motiv kao što je malopre reĉeno. Ĉetvrtisegment je voltaţni senzor, a P petlja oiviĉava poru. Ono što je interesatno i to ćemo videtikasnije, to je da ovaj domen formira kod kanala za K+ 4 subjedinice (domen predstavlja samjednu subjedinicu), dok kod voltaţno zavisnih kanala za Na+ i Ca2+ domeni su povezani u jednusubjedinicu (subjedinica natrijumskog i kalcijumskog kanala-na prezentaciji).3) kanali zavisni od cikličnih nukleotida (CNG kanali) Oni su srodni voltaţno zavisnim kanalima za Na+, K+ i Ca2+ i imaju isti motiv, jedina razlikaje što imaju specifiĉno graĊen karboksilni kraj (800-850 aminokiselina koje aktiviraju iliinhibiraju cGMP ili cAMP).4) Ca2+ aktivirajući kanali za K+ (kanali za K+ koje aktivira Ca2+) TakoĊe, familija srodna voltaţno zavisnim kanalima za jone. Opet se ponavlja isti domen, stim da ovi kanali imaju specifiĉan N0 segment na N kraju i specifiĉan redosled aminokiselina naC kraju koji je zaduţen za vezivanje Ca2+.5) kanali za K+ sa ulaznom, anormalnom rektifikacijom (IR kanali) Ovi kanali strukturno odudaraju od ostalih, zato što poseduju samo deo kanala (S5, P petlju iS6). Kanal ĉini neki broj subjedinica u zavisnosti koji kanal je u pitanju koju grade samo ovisegmenti koji oiviĉavaju poru.6) kanali koje aktiviraju agonisti U pitanju su tri velike i razliĉite superfamilije kanala koje aktiviraju ili acetilholin iliserotonin ili GABA, glicin i glutamin. Za njih je karakteristiĉno da su domeni sastoje iz ĉetiritransmembranska segmenta. Domeni formiraju pentamer.7) drugi kanali: kanal za Cl- (CFTR) koji je transmembranski regulator cistiĉne fibroze, domenne poseduje voltaţni senzor ni P petlju i na specifiĉan naĉin se vezuje za drugi isti takav domen;CIC kanali (kanali za Cl-) koji imaju specifiĉnu strukturu; kanal za Na+ osetljiv na amilorid-epitelni kanal za Na+; IP3 kanal za Ca2+-spominjali smo ga kod suţavanja krvnih sudova poddejstvom noradrenalina, receptor za IP3 na sarkoplazmatiĉnom retikulumu je kanal za Ca2+ krozkoji on izlazi i ulazi u citoplazmu.
  • 20. 20 Domen moţe da ĉini 4 ili 6 transmembranskih segmenata ili kod IP kanala koji imajuanormalnu rektifikaciju samo 2 transmemb.segmenta. Kada su u pitanju voltaţno zavisni jonskikanali 4 domena (tetrameri) formiraju kanal. Kod Na+ su psudotetrameri, jer su ta 4 domenavezana u jednu subjedinicu, a kod kanala za K+ to su pravi tetrameri gde je jedan domen jednasubjedinica. Sledeći su agonistima aktivirajući kanali gde agonisti (Acth, GABA) direktnoaktiviraju svoje receptore, a oni su u stvari sami kanali. Kod njih jedan domen ĉine 4transmembranska segmenta i oni formiraju pentamere (kanal formira 5 takvih domena). Kodkoneksona tetramerni domeni se udruţuju i formiraju heksamere.Jonski kanali se razlikuju od pora zbog mogućnosti otvaranja i zatvaranja i moţemo ih nazvatiregulisanim porama. Na njihovo otvaranja i zatvaranje mogu da utiĉu: promena potencijalamembrane koja je naroĉito karakteristiĉna za voltaţno zavisne kanale; sekundarni glasnicinpr. Ca2+, cikliĉni nukleotidi; mogu da ih otvaraju ligandi; mogu da ih blokiraju ili aktivirajutoksini-postoje razliĉiti toksini paukova, morskih puţeva, biljaka, zmija ... ; velika grupalekova-fenilalkilamini (lekovi za pritisak) blokiraju kanal za Ca2+, anestetici...Što se tiĉe njihove elektrofiziologije mogu biti selektivni. Neki su selektivniji za svoje jone, aneki su manje selektivni npr. kanal za Na+ je izuzetno selektivan. Postoje kanali koji propuštajuneselektivno razliĉite katjone. 1) Koneksoni To su polukanali koji su eksprimirani u svim tkivima, nema ih samo u eritrocitima iskeletnim mišićima. Naroĉito su karakteristiĉni za hepatocite, kardiomiocite, roţnjaĉu, betaćelije pankreasa itd. Ĉine ih 6 koneksina. Polukanal jedne ćelije i polukanal susedne ćelijegrade pukotinastu vezu. One propuštaju akcione potencijale, jone, cikliĉne nukleotide i svemolekule ispod 1200 Da. Na otvaranje i zatvaranje ovih kanala utiĉe, pre svega, Ca2+, pH,potencijal membrane i cikliĉni nukleotidi. Kada je u ćeliji niska koncentracija Ca2+ ovi kanali suotvoreni. Otvoreni su na specifiĉan naĉin, tako što je svaka subjedinica (koneksin) nagnuta poduglom od 7,8o i formiraju strukuturu cveta (rozetu). Povećanje konc. Ca2+ dovodi do toga da seoni ispravljaju, zaravne se i to dovodi do zatvaranja koneksona, odnosno, pukotinastih veza. Naisti naĉin deluje smanjenje pH. Povećanje kiselosti na isti naĉin deluje na zatvaranjapukotinastih veza. Šta se dešava kada nastane mutacija u genu za neki od koneksona? Npr.mutacija u genu za koneksin 32 dovodi do bolesti koja se naziva CHARCOT-MARIE-TOOTH-ova bolest. Šta je uzrok nastanke Šarkot-Mari-Tut (Charcot-Marie-Tooth) bolesti? U pitanju jeneuropatija koja nastaje usled mutacije u genu za koneksin 32 koji formira pukotinaste vezeizmeĊu Švanovih ćelija što dovodi do poremećaja u stvaranju mijelina i u prenosu akcionihpotencijala, što opet dovodi do degeneracija perifernih nerava. Klaustonov sindrom nastajeusled mutacije u genu za koneksin 30 i manifestuje se na drugaĉiji naĉin, menja kvalitet kose,dovodi do opadanja kose – alopecije.
  • 21. 21 2) Voltaţno zavisni jonski kanali Prvi voltaţni kanal je za Na , preĉišćen je ’78. godine i izolovan je iz elektrocita jegulje(lat. Electrophorus electricus). Tada je ustanovljeno da se kod jegulje KANAL ZA Na sastojiiskljuĉivo iz alfa-subjedinice koju grade 4 puta ponovljeni motivi, odnosno domeni 1, 2, 3, 4.Alfa-subjedinca je glikozilovana i gradi taj tzv. pseudotetramer, znaĉi ne dolazi dotetramerizacije ovih domena već se oni vezuju u jednu subjedinicu. Kasnije kod sisara jeustanovljeno da postoje druge subjedinice, npr. u mišiću sisara (raĊeno na pacovima) postojibeta1-subjedinica a u mozgu sisara postoji još i beta2. Znaĉi, nervne ćelije poseduju alfa, beta1i beta2 subjedinice. Još uvek se ne zna koja je uloga beta sujedinica ali se pretpostavlja da imaulogu u eksprimiranju ovih kanala na membrani i da na neki naĉin regulišu otvaranje izatvaranju kanala. (Ponavlja da jegulja ima samo alfa subjedinicu). Zašto su bitni ovi kanali zaNa ? Bitni su za inicijalnu depolarizacionu fazu krive akcionog potencijala, izuzetno suselektivni kanali – iskljuĉivo propuštaju Na . MeĊutim, bez obzira na selektivnost, njihovootvaranje i zatvaranje zavisi od koncentracije Ca2+ van ćelije. Ustanovljeno je da ukoliko sepoveća koncentracije Ca2+ u vanćelijskim teĉnostima, tj. intersticijumu, to dovodi do pomeranjavoltaţne aktivacije ovih kanla ka pozitivnijim vrednostima (crvena kriva sa slike) što semanifestuje sa slabošću mišića. I suprotno, ukoliko se smanji koncentacija Ca2+ u intesticijumu,ako je 0.5 mM, tada se voltaţna aktivacija pomera ka negativnim vrednostima, kriva se pomerau levo što dovodi do hiperekcitabilnosti miocite.Kod sisara je ustanovljeno da najmanje 8 gena kodira alfa-subjedinicu koja formira kanal i da seove izoforme eksprimiraju u razliĉitim tkivima. Osetljivost na ovaj toksin dovela je da se genikoji kodiraju za ove kanale podele na 4 grupe izdvojene na osnovu osetljivosti na tetrodoksin(TTX) i na osnovu toga što se eksprimiraju u razliĉitim tkivima:1. U mozgu to je grupa kanala B-I, B-II, B-III, B-VI2. Sledeća je izoforma SkM1 prisutna samo u skeletnim mišićima, takoĊe osetljiva na TTXkoja je prisutna iskljuĉivo u skeletnim mišićima.3. SkM2 je prisutna iskljuĉivo u kardiocitama (srcu) ali je interesantno da je ovasubjedinica pronaĊena i u denervisanom skeletnom mišiću i ova forma nije osetljiva na TTX.4. Još dve izoforme PN1, PN3, PN-od Periferni Nervni sistem, eksprimiraja se naneuronima spinalne ganglije (PNS) i ova PN3 izoforma takoĊe nije osetljiva na TTX. * I skorije je otkrivena još jedna podfamilija koja se eksprimira u materici i u mozgu. Kad smo već kod selektivnosti i osetljivosti na razliĉite otrove, TTX je otrov kogastvaraju morske bakterije i vrlo ĉesto se akumulira u tkivima beskiĉmenjaka, riba, vodeozemacai dovodi do blokade kanala za Na (sem SkM2 i PN3). Sigurno ste ĉuli fenomen trovanjasušijem u Japanu, naroĉito je karakteristiĉna ova Fugu, puffer fish, riba koja moţe da se naduje,ona iz nekog razloga specifiĉno akumulira ove toksine i moţe da izazove ozbiljan problem.Drugi toksin koji moduliše otvaranje kanala za Na je saksitoksin (STX) koga stvaraju nekevrste morskih dinoflagelata i koje su odgovorne za stavranje crvene plime. Kada se namnoţeove bakterije dovode do pomene boje mora i stvaranje tzv. crvene plime. Saksitoksin stvaraju i
  • 22. 22slatkovodne cijanobakterije i takoĊe dovodi do paralize usled trovanja „morskim plodovima“.I jedan i drugi toksin se vezuju za P region alfa-subjedinice, deo koji formira poru i deluju takošto drţe kanal otvorenim i najštetniji efekat koji izazivaju ova dva toksina je što dovode dorespiratorne paralize. Jedini naĉin da se u tom trenutku spase ţivot je stavljanje na aparate zaveštaĉko disanje. Sledeći toksin koji utiĉe na specifiĉnu izoformu je izoforma koja se nalazi uskeletnim mišićima i zato se naziva mikro izoforma (SkM1) zato što na nju deluje mikro-konotoksin otrov morskog puţa lat. Conus geographus. Ova vrsta grabljivog puţa ima posebnoizuzetno otrovan otrov koji ima poseban zub iz kojeg se izliva (priĉala o njemu prošle godine udelu varenja i razliĉitog naĉina dobavljanja hrane). Mikro - konotoksin blokira SkM1 izoformukanala za Na. Sledi zatim plejada razliĉitih toksina, batrakotoksin kog stvara lat. Dendrobatesazureus slatka plava ţaba koja stvara izuzetno jak otrov. Sliĉan otrov stvara ptica sa NoveGvineje, ptica Pitohuji, isto otrov koji utiĉe na zatvaranje i otvaranje kanala za Na. Brevetoksinkoga stvaraju takoĊe dinoflagelate, neki biljni alkaloidi - veratridin, akonicin. Za akonicinkaţu da je Kraljica otrova da je jedan od najjaĉih otrova. Neki insekticidi regulišu otvaranje izatvaranje kanala za Na . Škorpija lat. Androctonus centuroideus (nećete pamtiti latinskenazive, naravno) stvara toksine. Ova škorpija stvara alfa i beta toksine koji se vezuju zaodereĊene delove odreĊenih segmenata Na-kanala i dovodi do njihove aktivacije/inaktivacije.Još jedna grupa farmakoloških agenasa, to su anestetici. Karl Koler je 1884. godine otkrioispitujući efekat kokain biljaka i ustanovio je da kokain ima efeka anelgetika, ali naţalost ima idejstva na CNS- dovodi do omamljivanja. U meĊuvremenu je razvijena grupa lekova koja imasliĉan efekat kao kokain, ali ne deluje na CNS npr. prokain koji je praktiĉno kokain saanalgetskim dejstvom, koristi se u ginekologiji, i kao lokalni anestetik u stomatologiji itd. Svioni deluju (anestetici) tako što se vezuju za već otvorene kanale za Na i onemogućavajurepetitivno ispaljivanje AP. Šta se dešava kada doĊe do mutacija gena koji kodiraju ove kanale? Gen za SkM1izoformu je lociran na 17. hromozomu, gen za kardiocitnu izoformu lociran je na 3.hromozomu. Ta bolest koja nastaje usled mutacije i to zamene samo dve amino kiseline u alfa lancudovodi do hiperkalemične periodične paralize. Periodiĉna je jer dovodi do slabosti mišićakoje se periodiĉno javljaju. Nekad se javljaju i kada je normalna koncentracija K . Najĉešće sejavljaju napadi slabosti kada se poveća koncentarcija K u serumu (nakon vezbanja, nakonfiziĉke aktivnosti ili nakon uzimanja hrane bogate K ). Primećeno je da se epizode rigidnogkoĉenja i slabosti mišića javljaju kada se poveća koncentracija K u serumu. Druga bolest jeparamiotonija kongenita koja nastaje usled nekoliko mutacija, odnosno zamenom jedne, dve,tri ili ĉetiri amino kiseline koja takoĊe dovodi do peridoiĉne paralize, meĊutim, ovu periodiĉnuparalizu „okida“ hladnoća tj. izlaganje hladnoći, niska tameperatura, zbog neĉega dovodi do„okidanja“ ovog fenomena i do periodiĉne paralize. Sindrom dugog QT nastaje zbog delecijejedne amino kiseline, izmeĊu trećeg i ĉetvrtog domena u izoformi koja se eksprimira ukardiocitama koja dovodi do defektnog rada srca i moţe dovesti i do zastoja. Jedna vrsta
  • 23. 23sindroma koja je pronaĊena i karakteristiĉna samo za stanovnike Dalekog istoka naroĉito jezastupljena na Tajlandu i Laosu, naziva se brugada sindrom vrlo je ĉest uzroĉnik smrti usledventrikularnih fibrilacija (ispaljivanje repetitivnih akcionih potencijala i nemogućnost da sekomora opusti). Brugada sindrom je dobio naziv po dvojici španskih kardiologa, iako jekarakteristiĉan za stanovnike Dalekog istoka. Lev-Lenegre sindrom koji se manifestuje tokomsprovoĊenja Na kroz kanale i naziva se još i sindrom vezan za kanal za Na . 3) kanali za Ca 2 + Kanali za Ca 2 izuzetno su bitni za depolarizacionu fazu nekih AP, za neke APdovoljan je samo Na . Kod mirisni receptora, na primer, da bi se uspostavio generatorskipotencijal potrebno je da se otvore kanali za Ca 2 i tek kada Ca 2 uĊe u ćeliju tada se formirajuAP. Kanali za Ca 2 neophodni su za signalnu transdukciju, proces kontrakcije, za egzocitozu,naroĉito je vaţan za egzocitozu neurotransmitera, za egzocitozu granula sa pankreasnimhormonima (bez Ca 2 ne bi uopšte došlo do izluĉivanja hormona pankreasa). Kada jekoncentracija Ca 2 u fiziološkim granicama tada je ovaj kanal 1000 puta propustljiviji za Ca 2nego za Na . Kanali za Ca 2 poseduju visoku selektivnost, mada ne takvu kao kanal za Najer je ustanovljeno da sa smanjenjem koncentracije Ca 2 ovaj kanal poĉinje da sprovodi i K iNa . Jonsku selektivnost kanala za Ca 2 determiniše to da je neophodno da se najmanje 2 Ca 2 ubace u jonski kanal i da se simultano veţu i to dovodi do njihovog provoĊenja kroz ovajkanal (tzv. jon-jon interakcija unutar samog kanala). Kanal za Ca 2 (izgleda sliĉno kao za Na ) ĉini alfa subjedinica, pseudotetramer tj.ĉetiri domena povezana meĊusobno u alafa1 subjedinicu, meĊutim, kanal za Ca 2 poseduje joši gama, alfa 2, delta i beta subjedinicu. Delta i alfa 2 su kodirane jednim genom i nakontranslacije dobija se jedan protein koji se iseca na dve subjedinice koje utiĉu na voltaţnuselektivnost ovog kanala, kinetiku i pik AP. Diverzitet kanala za Ca 2 (slajd 14) – postoji pet grupa kanala za Ca 2 (T, L, N, P/Q iR). T kanali za Ca 2 su pominjani prošle godine kada se uĉilo na koji naĉin noradrenalinubrzava rad srca – noradrenalin otvara HCN kanale i ulazi Na koji dovodi do otvaranja Tkanala. T kanali su brzo aktivirajući i brzo inaktivirajući kanali, imaju nizak voltaţni pragpotreban za aktivaciju, manji od -30 mV i karakteristiĉni su za SA ĉvor. L kanali za Ca 2nalaze se na kardiomiocitama i kroz njih ulazi ekstraćelijski Ca 2 . L kanali za Ca 2 suspregnuti sa kanalima za Ca 2 na sarkoplazmatiĉnom retikulumu i na taj naĉin dolazi dokalcijumom indukovanog oslobaĊanja kalcijuma. L kanali za razliku od T kanala se sporijeinaktiviraju zato se i nazivaju L kanali (L od long lived) imaju visok voltaţni prag za aktivacijuiznad -30 mV i karakteristiĉni su pre svega za kardiomiocite, zatim za miocite skeltnih i glatkihmišića, neurone i neuroendokrine ćelije. Ostale tri grupe kanala (N, P/Q i R), imaju visok
  • 24. 24voltaţni prag, veći od -30 mV, srednje se inaktiviraju i dovode do oslobaĊanjaneurotransmitera. N kanali se nalaze u dendritima i telima neurona. P/Q kanali se nalaze ućelijama kore cerebeluma naroĉito u Purkinjeovim ćelijama i granularnim ćelijama. R kanali seuvek nalaze na membrani granularnih ćelija cerebeluma. P/Q kanali su presinaptiĉki kanali zaCa 2 . Ovi kanali za Ca 2 su razliĉito osetiljivi na lekove, blokatore. T kanal je manje osetljivna blokator dihydropyridin (DHP). DHP je grupa lekova koja utiĉe na kanale za Ca 2 . Lkanale, za razliku od T kanala, dihydropyridini blokiraju. Najpoznatiji dihydropyridin jeamlodipin ili Norvasc. Sledeća grupa lekova koja blokira L kanale su phenylalkylamini gdespada verapamil ili Ispotin. Treća grupa su benzothiazepini (dilitiazem). Pomenuti lekovi sekoriste za smanjenje udarnog volumena i na taj naĉin dovode do smanjenja krvnog pritiska.Krvni pritisak zavisi od stanja kontrakcije. Stanje kontrakcije regulišu kardiocite komore, natim kardiocitama se nalazi L kanali za Ca 2 kroz koje ulazi Ca 2 koji dovodi do osobaĊanjaunutarćelijskog Ca 2 i taj Ca 2 se vezuje za troponin C, dovodi do premeštanja vlakana idolazi do kontrakcije, meĊutim kada su ovi kanali blokirani i zatvoreni lekovima nema Ca 2 ,dolazi do samnjenja udarnog volumena i to dovodi do smanjenja krvnog pritiska.Dihydropyridini mogu da budi i blokatori i aktivatori oni se vezuju za linker izmeĊu S5 i S6 idovode do konformacionih promena i na taj naĉin utiĉu ili na otvaranje ili na zatvaranje i zatose kaţe da mogu biti i aktivatori i blokatori. N kanal ne reaguje na grupu lekovadihydropyridine ali reaguje na omega – conotoksin, otrov morskog puţa Conus geographicuskoji stvara i mikro -konotoksin zato što je conus ime roda conotoksin otrov ovog puţa kojisadrţi mikro 1 i blokira kanale za Na u skeletnim mišićima a poseduje i omega conotoksinkoji utiĉe na N kanale za Ca 2 . ω- agatoksin pauka Agelenopsis aperta ω- Agatoksin blokiraP/Q kanale na njih takoĊe ne deluju DTH ali deluje ova komponenta otrova ovog pauka.Na R kanale ne reaguju DTH, blokira ga ω- Agatoksin komponenta IIIA.Dve razliĉite komponente toksina ovog pauka utiĉu na otvaranje i zatvaranje ove 2 vrste kanalaza Ca. Šta se dešava ukoliko doĊe do mutacija u genu za kanal za kalcijum? Jedna neobiĉna,retka bolest - muskularna disgeneza koja nastaje usled mutacija u genu za kanal za kalcijum-(skeletno mišićni) i kanal koji je vezan za srce. Kod ovih miševa (ispitivanih) skeletni mišići sene razvijaju i oni po roĊenju umiru. Miocite ovih miševa intenzivno korišćene u kulturi zaispitivanje Ca kanala-upravo je na ovim ćelijama ustanovljeno da 2 razliĉita gena kodiraju 2razliĉita kanala-alfa1S gen kodira L kanal za Ca na skeletnim mišićima a alfa1C kodira kaokanal za Ca u kardiomiocitama. Ustanovljeno je da unutarćelijski linker izmeĊu drugog i trećegdomena – dugaĉki linker koji ulazi u citoplazmu - on determiniše naĉin kuplovanja izmeĊukanala za Ca2+ na membrani i SR (sarkoplazmin retikulum) u kardiocitama i miocitama štoznaĉi da je ovaj linker izmeĊu drugog i trećeg domena odgovoran za kalcijum indukovanooslobaĊanje kalcijuma. Kada kalcijum uĊe kroz L kanale dovodi do kalcijum indukovanogoslobaĊanja kalcijuma iz SR, kada su u pitanju mišićne ćelije - (determiniše naĉin kuplovanja
  • 25. 25izmeĊu ova 2 kanala) - od tog linkera zavisi ta veza i uopšte mehanizam kuplovanja -spregnutost ova dva kanala. Ovo je sve ustanovljeno zahvaljujući ovom naslednom defektugena kada kanal za kalcijum dovodi do muskularne disgeneze. Sledeće oboljenje nije genetskooboljenje već oboljenje koje nastaje usled stvaranja alfa antitela za kanale kalcijuma-presinaptiĉke kanale za kalcijum - LAMBERT-EATON-OV SINDROM. Ukoliko se stvarajuantitela na presinaptiĉkom kanalu za Ca-( posledica-nema oslobaĊanja neurotransmitera kojidovodi do ostvarivanja ovog sindroma).HIPOKALEMIĈNA PERIODIĈNA PARALIZA - u pitanju je nasledni defekt kanala zakalcijum koji nastaje usled taĉkastih mutacija u genu za L kanal za kalcijum u skeletnimmišićima i koje se odraţavaju na voltaţni senzor.FAMILIJARNA HEMIPLEGIĈNA MIGRENA - taĉkaste mutacije na P/Q kanalu koje dovodedo familijarne migrene ili EPIZODIĈNA ATAKSIJA TIP 2-mutacije na genu za P/Q kanal uneuronima cerebeluma.Poremećaj funkcije malog mozga-Ataksija-nemogućnosti ostvarivanja koordinisanih pokreta,nemogućnosti odrţavanja ravnoteţe. Dolazi do mutacije gena za alfa 1A gen koji kodira upravoP/Q kanal-prisutan na ćelijama kore malog mozga. 4) kanali za K +(Inicijalni podaci o molekularnoj biologiji kanala za K+ dobijeni na Shaker mutantu Drosophile,koje imaju defektan gen za kanal za K+, i zato drhte u etarskoj anesteziji.) Prvi podaci su dobijeni na drozofili na mutantu koji ima defektan gen za kalijum, mutantdrhti u etarskoj anesteziji i zato su nazvani šejker mutanti-to je jedna grupa kanala za K koja sedanas naziva šejker kanali. 1987 je kloniran gen za kanal za kalijum kod sisara i ustanovljeno je da takoĊe sadrţidomen koji kodira subjedinice (tetramerne, pseudotetramerne) sa kojima su spregnuti kanali zakalcijum i kanali za natrijum. Na N kraju poseduju domen koji ima ulogu u tetramerizaciji,takoĊe osim ova 4 domena tu se nalazi i jedna beta subjedinica-to bi bila struktura kanala zakalijum. U pitanju je divergentna i velika familija kanala za kalijum-kaţemo da najmanje 17razliĉitih gena kodira razliĉite kanale za kalijum sa kompletnim motivom.U fiziološkim uslovima je ovaj kana je 100x propustljiviji za kalijum nego za natrijum-ukolikose poremeti odnos ovih jona ovaj kanal moţe da propušta i natrijum. Natrijum moţe ĉak i dablokira kanale za kalijum. Uloga kanala za kalijum: Ovi kanali imaju suprotnu ulogu u kanalima za natrijum ikanalima za kalcijum, dakle imaju ulogu u inicijalnoj fazi akcionog potencijala, kanali zakalcijum –odrţavanje depolarizacione faze, dok kanali za kalijum imaju ulogu u stabilizacijipotencijala mirovanja odnosno u fazi završetka akcionog potencijala. Regulišu snagu ifrekvenciju svih tipova mišićnih kontrakcija, omogućavaju terminaciju oslobaĊanjaneurotransmitera iz nervnih završetaka, a u epitelnim ćelijama kroz ovaj kanal se kalijum iapsorbuje. Da li se sećate nekog kanala koga smo spominjali na primeru tubulocita? Ti kanali
  • 26. 26deluju kao transkripcioni faktori za kanal za natrijum i to je epitelni kanal za natrijum i upravojedan od tih kanala je kanal za kalijum kroz koji se vrši sekrecija jona kalijuma. U pitanju je vrlo divergentna raznolika familija kanala mnogo razliĉitijih kanala negošto su u pitanju kanali za natrijum I kanali za kalcijum. Pre molekularna biološka studija: ovi kanali su bili svrstani u 4 grupe, prva grupa sukanali sa zakasnelom izlaznom rektifikacijom, to su kanali kroz koje kalijum izlazi i oni sezakasnelo inaktiviraju. Kanali sa brzom izlaznom rektifikacijom koji se brzo inaktiviraju, zatim Ca2+-aktivirajući kanali za K+ . Danas se kanali za kalijum svrstavaju u 3 familije, prvi su voltaţno zavisni kanali za K ioni su upravo srodni šejker familiji -zašto njima-prvi podaci o ovom kanalu dobijeni su našejker mutantu drozofile koja ima mutiran gen za ovaj kanal i kod sisara su pronaĊeni srodnikanali i to su zapravo voltaţni kanali za kalijum koji su svrstani u ovu prvu grupu. Druga grupasu kalcijum aktivirajući kanali za kalijum. Treća grupa su kanali sa anomalnom i ulaznom retifikacijom. Prvi su voltaţno zavisni kanali za K+ i oni su upravo srodni shaker familiji. Prvi podacio ovoj familiji dobijeni su na shaker mutantu Drosophile koja drhti u anesteziji jer ima mutirangen za ovaj kanal. I kod sisara su pronaĊeni sliĉni kanali srodni kanali i to su zapravo voltaţnikanali za K+. Druga grupa su Ca2+ aktivirajući kanali za K+, i treća grupa su kanali saanomalnom ulaznom rektifikacijom (rektifikacija je da li je ulazak ili izlazak, u principu svikanali za K+ imaju izlaznu rektifikaciju, ali ovaj anomalni ima ulaznu). Prva grupa su voltaţno zavisni kanali za K+ (upozoravam dokone da je greškom reklaza Ca+), kanali srodni kanalima Drosophile iz shaker familije, koji imaju konzerviran ovaj S1-S6 motiv ali u zavisnosti od duţine N odnosno C kraja dele se na razliĉite podgrupe odnosnoĉlanove podfamilija ove velike familije. Na Drozofili a posle i kod sisara je ustanovljeno dadepolarizacija dovodi do izmeštanja S4 segmenta – voltaţno zavisnog segmenta – voltaţnisenzor koji omogućava specifiĉnost ovog kanala, omogućava mu da reaguje na promene voltaţeu ćeliji. Kv familija je podeljena na 12 klasa. Prva klasa su homologi shaker kalanima kodDrozofile, Kv2 klasa su Shab kanali Drozofile, Kv3 Shaw kanali Drozofile itd. Ono što nasinteresuje to je da moţemo da ih podelimo na dve velike grupe. Jedna grupa su kanalitakozvanog A tipa koji se brzo inaktiviraju i druga grupa su kanali koji se zakasnelo aktiviraju uodgovoru na depolarizaciju. Ako poredimo recimo kanale Kv1.1, Kv1.2, 1.3, 1.4, kada bigledali njihove krive, kako izgledaju akcioni potencijali, videli bi da se oni sve brţe i brţeinaktiviraju. Kv1.1 ima dugaĉak plato 1.2 je već nešto kraći a Kv1.4 je već brzo inaktivirajućikanal. Ovo ne moramo da pamtimo, na šta se dele i ove silne brojke, ali treba da znamo dapostoji grupa kanala koji se brzo inaktiviraju i grupa koji se sporije inaktiviraju u odgovoru nadepolarizaciju. Na koji naĉin se vrši inaktivacija? Postoje dva mehanizma. Jedna vrstamehanizma je tzv. ˝ball and chain˝, 20-ak amino kiselina na amino kraju imaju ulogu loptevezane sa lancem i ta lopta moţe da zatvori kanal za kalijum i na taj naĉin da ga inaktivira.Umetne se u usta kanala i na taj naĉin ga zatvori. Kanali koji nemaju ovakav N kraj i nemaju Ntip inaktivacije (N tip zato što je amino kraj taj koji zatvara kanal) kod njih β subjedinica delujekao lopta koja zatvara usta kanala.
  • 27. 27 Druga grupa su kanali za K+ koje aktivira Ca2+ i oni su kalcijumom aktivirajući kanaliza kalijum, nazivaju se još i MAXI kanali i BK (big channel) i oni na primer omogućavajurepetitivnu ekscitaciju odnosno repetitivno ispaljivanje akcionih potencijala u SA ĉvoru. Da sepodsetimo da je Ca2+ neophodan za bilo kakvu vrstu kontrakcije i izmeĊu dva akcionapotencijala SERCA pumpe upumpavaju Ca2+ u organele. Dok se SERCA pumpe ne aktivirajuaktiviraju se ovi kanali za K+, Ca2+ aktivira ove kanale za K+ i omogućavaju hiperpolarizacijudok SERCA pumpe ne ubace Ca2+ u unutarćelijske depoe. Pre nego što će SERCA da ukloniCa2+ on za to vreme aktivira kanale za K+, tada K+ ulazi i dovodi do hiperpolarizacije. Drugauloga ovih kanala je relaksacija glatkih mišićnih ćelija. Treća uloga je regulacija volumenanenadraţljivih ćelija procesom bubrenja ćelija. Rekli smo da ovi kanali imaju sliĉan domen,ovaj karakteristiĉni S1-S6 domen, jedina razlika je što ima i ovaj S0 domen na N kraju i imakarakteristiĉan COOH kraj od nekih 850 AK za koji se vezuje Ca2+ i aktivira ovaj kanal.Osim BK kanala postoje i SK kanali (small channel), oni su voltaţno nezavisni i reguliše ihkalcijum koji je vezan za kalmodulin. Kalmodulin je taj koji reguliše otvaranje ovih kanala. I onje recimo karakteristiĉan i neophodan za ekscitacju neurona i sekreciju hormona. Treća grupa su kanali sa anomalnom ulaznom rektifikacijom. Sadrţi 7 podfamilija Kir1-Kir7 i njihova uloga je da se spreĉi gubitak K+ tokom repetitivne aktivacije i tokom akcionihpotencijala koji dugo traju. Ne sadrţe kompletan domen, sadrţe samo S5 i S6 za koje je vezanaP petlja koja praktiĉno oblaţe poru i budući da ne poseduje S4 voltaţni senzor oni se ne moguvoltaţno aktivirati. Na koji naĉin se uspostavlja anomalna rektifikacija – anomalni ulazak K+?Uspostavlja se tako što unutarćelijski Mg2+ blokira kanal tako da ne dozvoljava K+ iz ćelije daizlazi napolje kroz ovaj kanal. Osim Mg2+, spermin i spermidin, molekuli poliamini koji senalaze unutar ćelije takoĊe ostvaruju ovu rektifikaciju tj. ne dozvoljavaju da unutarćelijski K+izlazi kroz ove kanale. S druge strane, negativna voltaţa a i K+ koji ulazi ima tendenciju daizmesti Mg2+ i na taj naĉin K+ ulazi suprotno – anomalno tj. ulazi umesto da izlazi kao što je tosluĉaj sa drugim kanalima za K+. Rektifikaciju omogućavaju joni Mg2+ i molekuli poliaminikoji mogu blokirati usta kanala. Spreĉavanje blokade, odnosno ponovno uspostavljanjefunkcionisanja kanala u suprotnom smeru omogućava K+ koji ulazi i izmešta jon Mg2+ iomogućava ulazak jona u suprotnom smeru. Jedna podfamilija kanala sa anomalnomrektifikacijom su GIRK kanali koje aktivira βγ subjedinica u SA ĉvoru i to je naĉin na kojiacetilholin (Ach) ostvaruje negativno hronotropno dejstvo na rad srca. Još jedna podfamilijakanala sa anomalnom rektifikacijom koji su regulisani sa adeninskim nukleotidima i za njih jekarakteristiĉno da ih ATP inhibira a ADP aktivira, nalaze se u kardiocitima, tubulocitima inaroĉito su karakteristiĉne u β ćelijama pankreasa. Za njih se kaţe da ta sprega metabolizma,odnosno stvaranja ATP-a reguliše njihovo otvaranje i zatvaranje. Interesantan je primer kakodolazi do sekrecije insulina. Ostvaruje se upravo posredstvom ovih kanala i to kako? Povećanjeprometa glukoze utiĉe na β ćelije pankreasa koje stvaraju insulin dovodi do remećenja odnosaATP/ADP u korist ATP-a. ATP blokira ove kanale što dovodi do male depolarizacije i do togada se aktiviraju kanali za Ca2+, Ca2+ ulazi u β ćeliju i dolazi do egzocitoze granula sa insulinom.Voltaţno zavisni zakasnelo aktivirajući kanali za K+ se blokiraju sa tetraetilamonijumom – TAkoji se vezuje za isto mesto za koje se vezuje K+ i na taj naĉin se onemogućava vezivanje K+ nakoji naĉin se spreĉava propuštanje K+.S druge strane voltaţno zavisni kanali koji se brzo inaktiviraju, A kanali, njih blokiraaminopiridon.
  • 28. 28 Kir kanali, koji uĉestvuju u sekreciji insulina zahvaljujući ATP-u, oni se blokirajutolbutamidom i glibenklamidom, glibenklamid se ĉesto dovodi u vezu sa dijabetesom tipa 2.Zatim, toksini se vezuju za ove kanale. Charybdotoxin, neurotoksin otrova izraeslkog škorpiona Leirusa quinquestriatusa, jerima 5 strafte na leĊima i koji blokira iskljuĉivo kanale za kalijum koji se aktiviraju kalcijumom. Dendrotoksin, Neurotoskisin otrova crne mambe, Dendroaspsis, blokira voltaţnozavisne kanale za kalijum I to iskljuĉivo na Ranvierovim suţenjima motoneurona i povećavaoslobaĊanje acetilholina. Dendrotokin K je striktno selektivan za kalijumove voltaţno zavisnekanale familije jedan ĉlana jedan. Kaliotoksin, škorpije Androctonus mauretanicus, koji blokira voltaţno zavisne kanaleza kalijum familije 1 ĉlana 3.To su svi toksini koji deluju na ovaj kanal.Nasledni defekti, bolesti koji nastaju usled mutacija gena ili autoantitela za proteine kanala zakalijum.o Kongenitalni hiperinsulinizam - mutacija u genu za kanal koji je regulisan adeninskimnukleotidima i omogućava oslobaĊanje insulina iz ćelija pankreasa.o Sindrom dugog QT - mutacija u genu za kanal Kv 7.1, prisutan u SA ĉvoru, uzrokujedefektan srĉani ritam. Samo ime govori, QT, znaĉi da se prolongira period, raspon izmeĊuQRS zubca i T talasa perioda izmeĊu, depolarizacije komora i repolarizacije komora. Mutacijaje u genu koji kodira za ovaj kanal - za kalijum, a kalijum dovodi do hiperpolarizacije.o Sa druge strane, Sindrom kratkog QT, mutacija u genu za Kv 11.1 ili hER kanala zakalijum dovodi do suprotnog efekta od prethdonog, jer smanjuje se rastojanje izmeĊu QRSzubca i T talasa.o Adersen- Tawilov sindrom, opet uzrokuje defektan ritam srca, usled mutacija u genuza Kir 2.1. koji osim defektnog rada srca uzrokuje i fiziĉke anomalije kao što su mala donjavilica, nisko postavljene uši i karakteristiĉna zakrivljenost prstiju. Na osnovu fenotipa moţe selako zakljuĉiti da pacijent ima defektan gen za kalijum.o Mutacija u genu za ROMK, koji je opet kanal za kalijuma, on je karakteristiĉan zatubulocite, i to uzlaznog dela Henlejeve petlje i kortikalnih cevcica, on uzrokuje Barterovsindrom, koga karakteriše hipokalemija i acidoza. U ovim ćelijama se jasno odrţava acido-bazna ravnoteţa, ako se sećate, sto opet dovodi do njenog poremećajao Mutacija u genu za Kv 1.5 dovodi do atrijalne fibrilacijeo ISAACov sindrom, autoimuski fenomen, dolazi do stvaranja autoantitela na Kv1.1, štodovodi do hiper osetljivosti perifernih nerava i spontane mišićne atrofije.1998. prvi put na Streptomyces-u je otkrivena 3D struktura kanala za kaliljum, KscA. Ovajkanal je homolog IR kanalu za kalijum kiĉmenjaka, u pitanju je tetramer kao što je i Shaker tipkanal, ali svaku subjedinice ne sadrţe (NEKI NISAM DOBRO RAZUMELA KOJI) motiv većsamo S5-P-S6 domen. Upravo na Streptomyces–u je ustanovljeno da S5 ĉini periferni deo kanala, dok su svispoljni, sva ĉetiri tetramera spoljni deo kanala, S6 ĉini kicmu kanala, dok P jon je odgovoran zaosetljivost na blokatore kanala i odgovoran je takoĊe za osetljivost.
  • 29. 29TakoĊe je utvrĊeno da ovaj kanal vezuje kooperativno 3 jona kalijuma, da vezivanje kalijumapotiĉe od S6 segmenta, a ne boĉnih aminokisleinskih lanaca.Na koji naĉin su evoluirali kanali? Dakle smatra se da su voltaţno zavisni kanali, smatra su da su svi geni evoluirali odprimordijalnog gena, koji se tokom evolucije duplirao, I naši…geni nastali su i tako su nastaligeni za tetramerne kanale kao što su kanali za kalijum, s’druge strane pseudotetramerni kao štosu kanali za natrijum I kalcijum. Grupa kanala koja se aktivira agonistima:Agonisti su razliciti trasmiteri ili hormoni kao što su na primer: ATP, GABA, ACETILHOLIN,SEROTONIN, GLICIN, GLUTAMAT. Na osnovu toga su formirane 4 vrste kanala:1) Prvi su oni koje aktivira ATP, kod kojih, domen formiraju 2 transmembranska segmenta ijedna velka petlja van ćelije. Oni su najjednostavniji jonotropni receptori.2) Malo sloţeniji su kanali koje aktivira serotonin, acetiholin, glicin, GABA i glutamin.Domen je-pentamer, sastoji se iz M1, M2, M3 i M4 transmembranskih segmenata, ono što jekarakteristiĉno jeste da poru formira M2 transmembranski segment.3) Kanali koje aktivira glutamat, AMPA, NMDA i jonotropni kanali za glutamat. Imaju tritransmembranska segmenta i poru koja nije okrenuta kao što je okrenuta pora odnosno petljakod kanala za kalijum, kalcijum i natrijum, već se ta petlja nalazi izmeĊu prva dva i saunutrašnje strane .4) Skoro definisani kanal kod Cyanobacteria, receptor za glutamate koji se satoji iz dvatransmembranska segmenta kanala za kalijum i petlje locirane izmeĊu njih.5) Ligandi se vezuju za ekstracelijske domene.I kako oni izgledaju: Na primer Acetilholinski receptor - jonotropni kanali, koji je pentamer. Sastoji se izdve alfa subjedinice, beta, gama i delta subjedinice . Svaka subjedinica formira domen I svakasubjedinica sadrzi M1,M2, M3 i M4 domen. Alfa subjedinica vezuje ligand. Dva Acetilholinase vezuju za receptor da bi se on otvorio, na takav naĉin receptor sada zahvaljujući M2 domenu,koji predstavlja poru, propusta katjone i to natrijum i kalijum. Druga vrsta receptora je na primer GABA koji je takoĊe jonotropni receptor, alireceptor za anjone. Sastoji se iz 5 subjedinica, jedna subjedinica vezuje ligand, GABA-u, drugasubjedinica vezuje benzodiazepine, treća barbiturate, a ĉetvrta poseduje mesta za vezivanjestereodigena. Primer kanala za natrijum, kalijum i kalcijum su AMPA i NMDA - jonotropnireceptori za glutamat, pri ĉemu AMPA iskljuĉivo vezan za Na i K. NMDA propušta i kalcijum.
  • 30. 30 Signalna transdukcija Kada priĉamo o signalnoj transdukciji logiĉno je da, ĉim su se pojavili u evolucijivišećelijski organizmi, da se pojavila potreba za nekom vrstom komunikacije izmeĊu ćelija; ikako su evoluirali višećelijski organizmi, tako su evoluirali i signalni putevi, odnosno mehanizmisignalne transdukcije. Svesni smo toga da bilo koji biološki proces ne bi mogao da se odvija bez signalnetransdukcije, poĉevši od embriogeneze do kompleksnih integracionih procesa, npr. odgovor nastres, pri ĉemu se ukljuĉuju svi fiziološki sistemi i omogućavaju odrţavanje homeostaze. Pre svega, da vidimo šta su to signali. Hemijski signali su hemijski molekuli hrane,hemijski molekuli odoranti, joni, materije koje reflektuju metaboliĉki status (npr. glukoza,slobodne masne kiseline), neurotransmiteri, hormoni. Neurotransmiteri, hormoni i materije kojereflektuju metaboliĉki status omogućavaju ćelijama da medjusobno komuniciraju, i to dakomuniciraju susedne ćelije ili udaljene ćelije.
  • 31. 31 Osim tih hemijskih signala, reagujemo i na ne-hemijske signale. U pitanju su toplotni signali, mehaniĉki signali (npr. aktiviraju Paĉinijeva telašca ili Merkelove diskove ili aktiviraju vlataste ćelije unutrašnjeg uha i omogućavaju nam da ĉujemo) i svetlosni signali. Ovi ne- hemijski signali se pretvaraju u hemijski signal, odnosno u akcioni potencijal. Šta god da je signalni molekul, on dolazi do membrane, na membrani aktivira neki svoj receptor, to pokreće kaskadu signalnih dešavanja u ćeliji i dovodi do odgovora te ćelije. Znamo da signalni molekuli ne moraju da se zaustave na membrani, već ako su lipofilni mogu da uĊu u ćeliju i da pokrenu odgovor ćelije vezujući se za svoje unutarćelijske receptore. Mehanizmi komunikacije izmeĊu ćelija1. Pukotinaste veze, veze preko kojih susedne ćelije direktno komuniciraju. Koneksoni, polukanali izmeĊu dve susedne ćelije, formiraju pukotinu koja propušta molekule ispod 1200 Da, akcione potencijale.2. Endokrini vid komunikacije. Bilo da je reĉ o ćeliji nekog endokrinog organa, bilo da je u pitanju ćelija nekog ne-endokrinog organa (sada pita koji to ne-endokrini organi mogu da stvaraju hormone. Odgovori: masno tkivo – leptin, srce – ANP, BNP, crevo – sekretin).3. Parakrini vid. Primer: parijetalne ćelije koje stvaraju HCl. Susedna ćelija luĉi signal (u ovom sluĉaju histamin) koji deluje na susednu ćeliju (oksintiĉnu ćeliju) i preko signalne kaskade dolazi do aktivacije K/H pumpe.4. Nervni način. Acetilholin luĉi postganglijsko vlakno parasimpatiĉkog nervnog sistema koji se takoĊe vezuje za oksintiĉne ćelije. * I Gastrin se vezuje za svoj receptor na oksintiĉnoj ćeliji. Gastrin ne stvara klasiĉna endokrina ţlezda , stvara ga G ćelija antruma (tu za gastrin opet daje primer da se luĉi signal od strane ćelija koje ne ulaze u sastav endokrinog organa).5. Autokrini pristup. Pr. NA koji sam sebe reguliše. Ĉim se izluĉi iz ćelije on se vezuje sa svoje receptore α2 na istoj celiji i inhibira sopstveno izluĉivanje. Signalni molekuli1. Amini – kateholamini (adrenalin, noradrenalin);2. Peptidni hormoni – insulin;
  • 32. 323. Steroidni hormoni (gluko-, mineralokortikoidi…);4. Mali molekuli (nukleotidi, AK, adenozin, ATP, gasovi – NO, CO, joni). Svi ovi signalni molekuli se vezuju za svoje receptore. Neki receptori ne traţe ćelijsku mašineriju -ukoliko je u pitanju jonotropni receptor koji je istovremeno kanal. On momentalno menja svoja svojstva i poĉinje da propušta neki jon. Svi ostali receptori zahtevaju angaţovanje ćelijske mašinerije, odnosno razliĉitih enzima, transkripcionih faktora, jonskih kanala itd. Klase receptora1. Jonski kanali;2. Receptori spregnuti sa proteinom G;3. Receptori koji imaju enzimsku aktivnost (njihovi citoplazmatski domeni imaju enzimsku aktivnost) ili receptori koji su spregnuti sa enzimima (sami nemaju enzimsku aktivnost);4. Unutarćelijski receptori;5. Transmembranski proteini koji oslobaĊaju transkripcione faktore.1. Jonski kanali su homomeri, heteromeri, oligomeri;2. Receptori spregnuti sa proteinom G su jednolanĉani koji 7 puta prolaze kroz ćelijsku membranu;3. Uglavnom jednolanĉani sa jednim transmembranskim domenom, pa onda mogu da dimerizuju;4. Homodimeri ili heterodimeri sa razliĉitim funkcionalnim domenima;5. Proteini membrane. Ligandi za receptore1. Jonski kanali: Vanćelijski: GABA, glicin, acetilholin, serotonin, glutamat, ATP; Unutarćelijski: cGMP, cAMP, cGTP, ATP, IP3, Ca2+, Ryanodin.2. Receptori spregnuti sa G proteinom: Kateholamini, holecistokinin, odoranti, oksicotin, neki tastanti, parathormon, citokinini;
  • 33. 333. Receptori sa enz.aktivnošću: ANP, NGF (faktor rasta nerava), EGF (epidermalni faktor rasta), PDGF (faktor rasta poreklo iz trombocita), FGF (faktor rasta fibroblasta), INSULIN, IL-3,-5,-6, EPO (eritropoetin), LIF (faktor inhibicije leukemije), CNTF (cilijarni neutrofiĉki faktor), GH (growth factor), IFN, CD45;4. Unutarćel.: Mineralokortikoidi, glukokortikoidi, androgeni, estrogeni, vitamin D, prostaglandini, tireoidni hormoni, retinoinska kiselina; 5. Transmembranski: JAGGED, DELTA-LIKED Acetilholin je primer liganda koji moţe da se veţe za dve razliĉite grupe receptora (za muskarinske receptore spregnute sa proteinom G i za jonske kanale). Signalni dogaĊaj Podrazumeva da 1. receptor prepozna odreĊeni signal, odnosno ligand. Vezuju se slabim jonskim vezama, van der Waalsovim ili hidrofobnim interakcijama. To dovodi do konformacionih promena receptora; ta konformaciona promena moţe dovesti do toga da receptor reaguje sa unutarćelijskim ili membranskim proteinima ili da stekne enzimsku aktivnost. 2. Sledeći korak je transdukcija signala, odnosno stvaranje sekundarnih glasnika koji ćeliji dalje prenose poruku i 3. aktiviraju efektore koji mogu biti jonski kanali, enzimi i transkripcioni faktori. Sekundarni glasnici mogu i da 4. modulišu efektore; mogu da aktiviraju protein kinaze, fosfataze. 5. Na kraju, ćelija odgovara na razliĉite signalne puteve (jedna ćelija u sebi ima gomilu signalnih puteva i bilo koji odgovor ćelije podrazumeva interakciju svih tih signalnih puteva). 6. Kraj odgovora ćelije vrlo ĉesto zahteva povratne sprege; mora biti precizno regulisan i to se reguliše preko sekundarnog glasnika. Njegovo stvaranje, aktivacija, inaktivacija (NAROCITO INAKTIVACIJA) moraju biti precizno regulisani da bi se završio odgovor i da ćelija ne bi bila prekomerno aktivirana. Sekundarni glasnici omogućavaju amplifikaciju signala pa najĉešće jedan ligand dovodi do stvaranja nekoliko stotina molekula sekundarnih glasnika što aktivira nekoliko hiljada narednih molekula u kaskadi. Primer: cAMP-a, odnosno adenilat-ciklaza. Koncentracija cAMP-a
  • 34. 34povećava se 5x za samo 5 s. Izuzetno brza aktivacija, ali i inaktivacija, zahvaljujući cAMP-fosfodiesterazi. Signalni dogaĊaj odlikuju i specifičnost i diverzitet. Primer: adrenalin i glukagon sevezuju za dva potpuno razliĉita receptora, a putem cAMP-a aktiviraju istu signalnu kaskadu,dovodeći do glikogenolize u ćeliji. S druge strane, adrenalin ostvaruje razliĉite efekte u razliĉitimćelijama i tkivima. Ubrzava rad srca, širi krvne sudove mišića, a suţava one u digestivnomtraktu, širi bronhije i zenice. Zahvaljujući ovim raznolikim funkcijama, omogućava organizmuintegrisan odgovor, ĉuvajući homeostazu. S druge strane, kada govorimo o kompleksnimprocesima poput proliferacije i diferencijeacije, oni zahtevaju interakciju velikog broja signalnihputeva u ćeliji. Signalna transdukcija moţe imati genomske i negenomske efekte. Negenomski su onikada se ceo proces završava u citoplazmi, dok genomski podrazumevaju izmenjenu ekspresijugena, kao krajnji rezultat signalne kaskade. Receptori koji oslobađaju transkripcione faktore su integralni membranski proteini,koji odstupaju od klasiĉne definicije receptora zbog specifiĉnosti interakcije koju ostvaruju saligandom. Ovu klasu receptora aktiviraju ligandi koji se nalaze na drugim ćelijama. Kljuĉni su zamnoge procese: metabolizam masti, ćelijsku diferencijaciju i podleţu procesu koji se nazivaregulisana intramembranska proteoliza (RIP). Dakle, signalni put podrazumeva proteolitiĉkoisecanje proteina membrane, oslobaĊanja fragmenta u citosol i njegov prelazak u nukleus, gde ćeostvariti genomske efekte. U ovu grupu transmembranskih proteina spadaju: SREBP, Notch,Irel, ATF6, APP. SREBP (protein koji se vezuje za sterol-regulatorne elemente) nalazi se na membraniendoplazmatiĉnog retikuluma, kroz koju prolazi dva puta, pri ĉemu su NH2 i COOH krajokrenuti ka citosol. Ima i malu petlju koja se nalazi u lumenu endoplazmatiĉnog retikuluma. NaNH2 kraju smešten je transkripcioni faktor, koji prolazi kroz membranu i vezan je petljom od 30AK za regulatorni kraj molekula, koji je na membrani vezan za drugi signalni molekul, SCAP(protein koj aktivira isecanje SREBP-a). SCAP nekoliko puta prolazi kroz ćelijsku membranu,karboksilnim krajem vezan je za SREBP, a amino krajem za INSIG.
  • 35. 35 Vezu ostverenu preko amino krajeva izmeĊu SCAP-a i INSIG-a uĉvršćuje holesterol.Kada holesterola ima dovoljno u ćeliji, tada je ceo proteinski kompleks vezan u membraniendoplazmatiĉnog retikuluma. U suprotnom sluĉaju, dešavaju se konformacione promene SCAP-a, koje rezultiraju njegovim odvajanjem od INSIG-a i, poslediĉno, ceo kompleks završava uGoldţi aparatu. Tu podleţu isecanju, na prvom mestu proteazom S1P, koja kida petlju od 30 AKsa luminalne strane, a zatim S2P proteaza iseca transmembranski segment transkripcionogfaktora. Time on biva osloboĊen, a dalje se upućuje u jedro gde se vezuje za SRE elemente, kojise nalaze na promotorima gena za enzime ukljuĉene u biosintezu holesterola. To je put kojimholesterol reguliše sopstvenu sintezu. Notch transmembranski protein prvi put je opisan kod mutanta D. melanogaster saiskrzanim krilima ( notch eng. recka), po ĉemu je i dobio naziv. Do danas su pronaĊena ĉetiri:Notch1, Notch2, Notch3, Notch4. Najveće su razlike meĊu njima u ekstraćelijskom delu. Upitanju su, dakle, transmembranski proteini koji jednom prolaze kroz membranu i ĉiji je NH2 krajokrenut ekstraćelijski. Poseduju veliki broj domena, od kojih je najbitnije zapamtiti ekstraćelijskiNECD i intraćelijski NICD, koji se sastoji od kratkog ekstraćelijskog dela, transmembranskog iunutarćelijskog segmenta. Razlike meĊu ĉetiri forme Notch proteina odnose se na broj EGF-likeponovaka, koji se nalaze na ekstraćelijskom domenu. Ponovci se sastoje od oko 40 AK i 3disulfidna mosta, modifikovana dodavanjem O-glukoze ili O-fukoze na Cys. Signalni put proteina Notch naroĉito je vaţan tokom procesa, koji se odigravaju za vremeembrionalnog razvića pa tako utiĉe na: razvoj i funkciju neurona, angiogenezu, formiranjezalistaka ĉime utiĉe na komunikaciju ćelija endokardijuma i kardiocita, kod adulta na funkcijusrĉanih zalistaka, determiniše razvoj ćelija endokrinog i egzokrinog pankreasa, kao i sekretornihi apsorptivnih ćelija creva, formiranje kostiju, stvaranje T-limfocita, diferencijaciju ćelijamleĉnih ţlezda. Ligandi ovog receptora pripadaju DSL familiji: DELTA-like (DELTA Dros.),JAGGED (SERRATE Dros.), F3/contactin. Notch se aktivira kontaktom dve ćelije, jedne kojaeksprimira sam Notch, i druge koja eksprimira njegov ligand, pri ĉemu dolazi do aktivacijemetaloproteinaze iz familije ADAM – TACE ( TNFα converting enzyme), koja dovodi doisecanja NECD zajedno sa JAGGED. Iseĉeni deo se endocitotski internalizuje od strane ćelijekoja je eksprimirala ligand. Zašto se to dešava, još uvek nije ustanovljeno. Na scenu potom stupaenzimski kompleks – γ-sekretaza, koja seĉenjem u transmembranskom segmentu oslobaĊa
  • 36. 36unutarćelijski deo. OsloboĊeni NICD odlazi u jedro gde se vezuje za proteine CSL, koji sevezuju za DNK i pokreću ekspresiju ciljnih gena. Notch se eksprimira i na nervnim ćelijamauĉestvujući u procesima njihovog razvoja i plastiĉnosti nervnog sistema. MeĊutim, kompleks γ–sekretaze dovodi do isecanja još jednog transmembranskog proteina na neuronima, APP-a.Ovaj enzimski kompleks sastoji se od ĉetiri proteina: PS-1 (presenilin-1), Nct (nicastrin),APH-1 (anterior pharynx-defective-1), PEN-2 (presenilin enhancer-2). APP jetransmembranski protein koji takoĊe oslobaĊa transkripcione faktore i na njega prvo delujeenzim β-sekretaza, isecajući ekstraćelijski domen. Potom se aktivira γ-sekretaza, koja oslobaĊacitoplazmatiĉni fragment APP-a i amiloida β. Citoplazmatiĉni APP fragment utiĉe na ekspresijugena, dok amiloid β ostaje u membrani. MeĊutim, u sluĉaju mutacije u genu koji kodira zapresenilin-1, ceo enzimski kompleks ĉiji je PS-1 sastavni deo povećava aktivnost, što dovodi donagomilavanja amiloidnih plakova i fibrila u membranama neurona, a to je proces ukljuĉen upatogenezu Alchajmerove bolesti. Sem toga, γ-sekretaza je ukljuĉena i u funkcionisanje kanalaza Ca2+ na endoplazmatiĉnom retikulumu, pa njena mutirana forma i na taj naĉin doprinosipatogenezi prethodno pomenute bolesti. Unutarćelijski receptori locirani su u citoplazmi i kada veţu ligand, postajutranskripcioni faktori. Njihovi ligandi su mali, lipofilni molekuli poput steroidnih hormona, kojimogu da proĊu ćelijsku membranu, te stoga ne zahtevaju prisustvo receptora na njoj. U pitanjusu, dakle, receptori za: glukokortikoide, mineralokortikoide, polne hormone, tiroidnehormone, vitamin D, prostaglandine, retinoinsku kiselinu, ali i grupa receptora siroĉića ĉijiligandi još uvek nisu okarakterisani ( eng. orphan receptors). Ligandi ovih receptora ulaze ućeliju putem difuzije ili, kao što je to sluĉaj sa tiroidnim hormonima, pomoću specifiĉnih nosaĉa,i vezuju se za receptore koje kodira velika familija gena sa preko 32 ĉlana. Receptori suorganizovani u vidu homodimera ( npr. receptori za glukokortikoide i mineralokortikoide) iliheterodimera ( npr. receptor za tiroidni hormon dimerizuje sa retinoidom X) i mogu se naći ucitoplazmi (glukokortikoidni receptor) ili jedru (estrogenski receptor), pri ĉemu je receptor zaretinoinsku kiselinu stalno vezan za DNK. Receptori se nalaze u citoplazmi kao što je sluĉaj sa glukokortikoidnim receptorima,nalaze se u jedru kao što je sluĉaj sa estrogenima ili su vezani za DNK kao što je sluĉaj sa“retinoaminskom kiselinom” (ako sam dobro ĉuo). Svi se sastoje od 6 razliĉitih domena. Ovde je
  • 37. 37data homologija izmeĊu nekih domena, ovaj u sredini je glukokortikoidni receptor i sve ovo jehomologija razliĉitih domena u poreĊenju sa glukokortikoidnim receptorom. Pa da krenemo odamino kraja, tu se nalaze prva dva AB domena koji su najrazliĉitiji medju receptorima,homologija je uvek manja od 7% izmedju razliĉitih receptora i u okviru ovog AB domena nalazise prvi transaktivacioni domen receptora. Sledeći, zeleni je C domen, najsliĉniji meĊu razliĉitimreceptorima. To je DNK vezujući domen, domen koji poseduje cinkane prste i koji je ukljuĉen udimerizaciju receptora. Sledeći svetlo roze je domen koji je neophodan da receptor uĊe u jedro,tzv. nuklearni lokalizacioni domen. Ĉetvrti je hormon vezujući domen E domen, takoĊe je vaţanza dimerizaciju i on poseduje drugi transaktivacioni domen. Šesti domen je mali domen koji senalazi na karboksilnom kraju i ĉija je uloga nepoznata, on se nalazi na ? (nekom receptoru). Kako funkcionišu unutraćelijski receptori, da ponovimo… u pitanju su mali hormoni,male molekulske mase, lipofilni koji mogu da proĊu ćelijsku membranu i koji se vezuju za svojeunutarćelijske receptore. Inatktivni receptor za koga nije vezan formon je vezan sa kompleksomproteina citoplazme. Proteini tog kompleksa se menjaju, zna se da ucestvuju hit šok (hsp90) ihsp70, p23, fhpp51 (?) itd. Hit šok 90 povećava afinitet receptora prema hormonu, kad sehormon veţe za ovaj kompleks receptor disosuje od proteinskog kompleksa, meĊutim pre 2godine je pronaĊeno da hsp nalazi i u jedru, pa se postavlja pitanje da li dolazi do njegovogizdvajanja, da li moţda dolazi u jedru do njihovog ponovnog spajanja ili je to neki drugi hsp90protein. Šta se dešava kad se glukokortikoidni receptor ubaci u jedro? Dolazi do njihovedimerizacije, a da bi do toga došlo neophodno je da hormon i dalje bude vezan za receptor štonije sluĉaj sa recimo tiroidnim hormonom. I ovakav dimer, znaĉi dva receptora sa vezanimhormonima se vezuje za specifiĉne sekvence na promotoru gena koji se nazivaju gre (nestoglucocortioid responsive element). Znaĉi elementi koji odgovaraju na glukokortikoide. UnutarDNK vezujućeg domena nalaze se cinkani prsti o tome siguno znate – cinkane prste formira cinkkoji vezuje za 4 cisteina, dva alfa heliksa i dve beta ploĉe, i ovi cinkani prsti uspostavljajukontekt sa DNK molekulom i interaguju sa bazama preko specifiĉne sekvence koja se naziva Pboks, u pitanju su 6 amino kiselina koje se nalaze na karboksilnom kraju cinkanih prstiju. P bokssada vezuje za malopre pomenute GRE sekvence, dakle dve sekvence, dva polumesta vezivanjaod 6 baznih parova koji su meĊusobno odvojeni sa 3 bazna para. Šta je jos neophodno da bi se
  • 38. 38aktivirala transkripcija? Neophodnu su transaktivacioni domeni A, B i D takoĊe regrutuju iproteine koaktivatore (nerazumljivo koje) koji sada praktiĉno aktiviraju preinicijacionutranslacionu mašineriju. Za nas je bitno da znamo da postoje unutraćelijski receptori atranskripcija je posle druga priĉa. Koja je razlika izmeĊu mehanizma delovanja tiroidnih hormona i glukokortikoidnihhormona? Tiroidni hormoni ulaze ili putem difuzije ili putem transportera i oni se vezuju zareceptor pre ili posle dimerizacije i to je razlika u odnosu na glukokortikoide i takoĊe razlika dase ne formiraju homodimeri nego heterodimeri zajedno sa … ne ĉuje se kojom kiselinom… i tajheterodimes se vezuje za TRE (tiroid responsive element) sekvence , elementi koji odgovaraju natiroidne hormone. TRE – u pitanju su 6 bazna para odvojena sa 4 bazna para, i ono što jedrugaĉije to je da N kraj receptora aktivira proteine iz preinicijalne transkripcione mašinerije kaošto je na primer Tr2F, Tr2D. Ti proteini mogu biti i aktvatori i represori, najĉešće su represorikad za sebe nemaju vezane hormone, a dešava se da tiroidni hormon moţe biti u kompeticiji sadrugim translationim faktorima, na primer sa estrogenim hormonima. Sledeća kategorija su receptori sa enzimskom aktivnošću U pitanju je 5 grupa receptora, prva grupa su membranske guanil ciklaze koje katalizujestvaranje cGMPa, zatim membranske serin-treonin kinaze koje fosforilišu serin odnosno treoninostatke proteina ćelije ili sopstvene. Zatim membranske tirozin kinaze koje fosforilišu sopstveneodnosno tirozinske ostatke proteina citosola. Receptori koji interaguju sa tirozin kinazamacitosola i na kraju membranske tirozin fosfataze koje vrse isecanje fosfatnih grupa sa proteinacelije. Membranske guanil ciklaze Amp i bmp su proteini koji se vezuju za membranske guanil ciklaze, u pitanju su svi oviproteini, svi ovi proteini su samo jedan transmembranski segmen u pitanju je protein koji samojedan put prolazi kroz celijsku membranu, dakle kada se amp ili bmp veţe sa svoj vanćelijskidomen, vezivanje ovag peptida dovodi do dimerizacije receptora i ovakav receptor sada stiĉeguanil ciklaznu aktivnost odnosno mogućnost konverzije, pretvaranje ? tela u sekundaraniglasnik cGMP.
  • 39. 39 Osim membraske guanil ciklaze, da napravimo malu digresiju, guanil ciklaza moţe senalaziti i u citosolu i predstavlja receptor za azot monoksid. Kako nastaje azot monoksid ukratko,objasnićemo na primeru kako acetil holin i bradikinin ostvarjuju vazodilataciju. Acetil holin ibradikinin se vezuju za endotelne ćelije krvnih sudova i veza hormon receptor dovodi dooslobadjanja kalcijuma, on se vezuje za kalmodulin, i kalmodulin sa kalcijumom aktiviraendotelnu azot oksid sintetazu, ona dovodi do stvaranja azot oksida koji prelazi u susednu ćeliju,i ovaj azot okid se vezuje za solubilnu guanil ciklazu. To dovodi do pretvaranja GTPa u cGMP,aktivacije protein kinaze G na primer aktivira SERCA i SERCA ubacuje kalcijum što dovodi dovazodilatacije, i tako azot oksid uspostavlja vazodiletaciju. Drugi molekul na koji deluje proteinkinaza G je kinaza lakog lanca miozina, ona fosforiliše i na taj naĉin je inaktivira, dakle ne moţeda fosforiliše laki lanac miozina i ne moţe da dovede do preklapanja aktina i miozina. Membranske Ser/Thr kinaze Primer za ovaj recetor je faktor transformacije rasta beta (TGFbeta). Dakle, ovaj receptorĉine 2 tipa receptora, Tip1 i Tip2. Tip2 receptor vezuje ligand, a ligand moţe biti TGFbeta, moţebiti Antimilerov hormon (AMH)-ovaj hormon omogućava stvaranje muških reproduktivnihorgana tokom razvića, ne dozvoljavaju razvoj Milerovih tuba, zato se zove antimilerov hormon,ne dozvoljavaju nastanak ţenskih polnih organa, zatim tu se nalaze I receptori za inhibin Iaktivin, dakle svi ovi ligandi se vezuju za Tip2 membranski segment treonin kinaze , što dovodido toga da Tip1 pepoznaje da se ligand vezao za Tip2 membranski segment treonin kinaze, štoaktivira enzimsku aktivnost Tip2 i ona fosforiliše Ser/Thr ostatke Tip1. Znaĉi, ligand se veţe zaTip2, to prepoznaje Tip1, prepoznavanje od strane Tip1 dovodi do toga da Tip2 stekne enzimskuaktivnost, fosforiliše serinske I treoninske ostatke Tip1, što dovodi do toga da ova ovakofosforilisana serin treonin kinaza Tip1 moţe da fosforiliše Ser/Thr ostatke na proteinima citosola. Membranske tirozin kinaze Tipiĉne membranske tirozin kinaze su receptori za faktor rasta nerava(NGF). Dakle, ovdeje u pitanju jedan proten koji samo jedanput prolazi kroz ćelijsku membranu. Vezivanjem dvaNGF-a za dve membranske tirozin kinaze dovodi do dimerizacije, a dimerizacija je signal zamedjusobnu fosforilaciju tirozinskih ostataka ( receptori jedan drugom fosforilišu tirozinskeostatke), jedan monomer fosforiliše tirozinske ostatke drugog monomera i obrnuto.
  • 40. 40 Druga membranska tirozin kinaza je receptor za insulin. Ona kao što vidite izgledadrugaĉije, u pitanju je heterotetramer, koji sadrţi dve alfa I dve beta subjedinice. Dve alfasubjedinice su vezane disulfidnim mostovima I alfa i beta subjedinice su takodje vezanedisulfidnim mostovima. U pitanju je dakle heterotetramer koji je sam po sebi tetramer, netetramerizuje kada se za njega veţe ligand. Vezivanje liganda, odnosno insulina, ili faktor rastasliĉan insulinu 1 (IGF1), dovodi do toga da citoplazmatski delovi beta subjedinice steknu tirozinkinaznu aktivnost i mogu dalje da fosforilišu kako sami sebe, tako i tirozinske ostatke proteinacitoplazme koji se nazivaju IRS1. Znaĉi, IRS1 predstavlja supstrat za insulinski receptor. Dakle,evo iste slike, insulinski receptor, insulin se vezao, doveo je do toga da je citoplazmatski deostekao tirozin kinaznu aktivnost i da moţe sam sebe da fosforiliše, ali i fosforiliše supstrate zainsulinski receptor koji se nazivaju IRS1, 2, 3 I 4. Šta su IRS1,2,3 i 4? Dakle, u pitanju suefektorni proteini citosola. Kada ovi proteini postanu fosforilisani, oni postaju proteini zapristajanje. Šta znaĉi pristajanje? To znaĉi da se za njih sada vezuju proteini koji imaju SH2,odnosno SH3 motive. Šta su SH2, odnosno SH3 motivi? To su dţepovi, od 50-100aminokiselina, koji predstavljaju dţepove za fosforilisane tirozine. Znaĉi, molekul koji posedujeSH2 motiv predstavlja dţep u koji se sad ubacuje ovaj fosforilisani tirozin na IRS1. I zatokaţemo da su oni proteini za pristajanje. U ovom sluĉaju, odnosno na ovoj slici za njega pristajeGRB2 koji sad pokreće RAS signalni put, o tome ćemo sledeći put. Koji još proteini mogu daposeduju ovaj SH2, SH3 motiv? To moţe na primer da bude fosfolipaza C gama ili tirozinkinaze iz Src familije. Sledeća grupa receptora su oni koji nemaju sami po sebi enzimsku aktivnost, znaĉinjihovi citoplazmatski domeni nemaju enzimsku aktivnost, ali su spregnuti sa proteinimacitoplazme koji imaju tirozin kinaznu aktivnost. I u pitanju su receptori za veliki brojinterleukina, dakle IL-2,3,4,5,6.., receptori za leukemija inhibirajuće faktore, receptori zaeritropoetin, receptor za faktor stimulacije kolonije makrofaga, receptori za epidermalni fatorrasta, za interferone beta, gama, za hormon rasta...itd. Dakle u pitanju su receptori koji mogu bitihomodimeri (koje ĉine dva alfa lanca) heterodimeri ( koga ĉine alfa i beta lanac, primer:receptor za interleukin3) ili mogu biti ĉak i heterotrimeri, da trimerizuju, odnosno da formirajualfa, beta i gama trimere. Ovi receptori dakle ne poseduju enzimsku aktivnost, već su svojimcitoplazmatskim domenom nekovalentno vezani sa dve grupe enzima. Jedna frupa su tirozin
  • 41. 41kinaze iz janus familije, takozvane JAK kinaze. I druge su tirozin kinaze iz sark (Src) familije.Kada se veţe ligand, na primer neki interleukin, dolazi do homodimerizacije, heterodimerizacijeili trimerizacije što dovodi do autofosforilacije spregnutih proteina, ali i foforilacije nizvodnihputeva. Da vidimo na koji naĉin funkcionišu janus kinaze , a na koji naĉin Src kinaze. Dakle,janus kinaze su JAK1, JAK2 i Tyk2. Za JAK kinaze je karakteristiĉno da nizvodno fosforilišuproteine iz STAT(signal transducers and activators of transcription) familije, koji dakledimerizuju, ulaze u jedro i postaju transkripcioni faktori. Takav tipiĉni ligand je interferon alfakoji se vezuje za ovakav receptor sa enzimskom aktivnošću i koji sad aktivira enzime citosola izjanus familije tuk2 (Tyk2) i JAK1. Tyk2 i JAK1 fosforilišu STAT1 i STAT2 proteine koji saddimerizuju. Osim toga za sebe vezuju IRF9 (faktor koji je regulisan interferonima). FosforilisaniSTAT1, STAT2 i IRF9 ulaze u jedro i vezuju se za svoje sekvence koje se nazivaju ISRE (IFN-αresponse element ). Interferon gama aktivira JAK1 i JAK2 proteine citosola, što dovodi dofosforilacije STAT1, znaĉI STAT1 sad formira stabilne homodimere. Ovakav stabilanhomodimer ulazi u jedro i vezuje se za svoju sekvencu koja se naziva GAS (γ activation site) .JAK kinaze su spregnute i sa receptorom za leptin. Znaĉi leptin se vezuje za svoje OB-Rbreceptore i kada nema leptina, ovaj receptor ne dimerizuje. Kada ima leptina, kada se on veţe zasvoje receptore, receptor formira tetramer. Ovakav tetramer dovodi do autofosforilacije JAK2 iove fosforilisane JAK2 sada fosforilišu tirozine na receptoru za leptin. Na taj naĉin se receptorza leptin aktivira što omogućava fosforilaciju STAT3. STAT3 dimerizuje i odlazi u jedro, štodovodi do transkripcije specifiĉnog gena. Druga familija kinaza su sark kinaze ili Srk( skraćenica od sarkoma) i u pitanju je prviopisani protoonko protein i za njegovo otriće su Bishop i Varmus 1989. dobili Nobelovunagradu. U pitanju je familija Srk kinaza koja se sastoji iz 3 podfamilije, odnosno 9 kinaza. Src,Yes, Fyn, Fgr, to su tirozin kinaze koje ulaze u podfamiliju Srk kinaze tipa A. Lyn, Hck, Lck,Blk kinaze subfamilije tipa B i Frk kinaza koja je srodna tirozin kinazama invertebrata. Neke Srkkinaze su prisutne u svim tkivima, a neke su specifiĉne za odreĊena tkiva. Kako izgledaju Srkkinaze? Dakle, ove tirozin kinaze imaju nekoliko domena. Ovaj domen na amino kraju jetakozvani SH4 domen koji je zaduţen za ukotljavanje u membranu (ukotljavanje se vrši prekomeristil grupe, sećamo se prvog predavanja). Sledeći (beli) je univerzalni domen ĉija je uloganepoznata. Zatim idu SH3 i SH2, malopre pomenuti, rekli smo da su u pitanju sekvence od 50-
  • 42. 42100ak koji formiraju dţepove za fosforilisane tirozine. I rekli smo, takodje da osim ovog GRB2,I Srk kinaze poseduju te domene u koje se sad pakuju fosforilisani tirozini. Sledeći domen(crveni), linker koji ima mogućnost da se veţe za SH3. Zatim sledi (plavi) veliki katalitiĉkidomen koji je podeljen na dva poddomena i koji u stvari ima tirozin kinaznu aktivnost. IzmeĊuova dva poddomena nalazi se aktivaciona petlja (narandţasta) koja poseduje tirozinski ostatakna, negde piše 416. mestu, negde piše na 418. mestu, ali to ne pamtimo. Ova aktivaciona petljaima regulatornu ulogu i takoĊe se naziva i SH1 petlja. I na C kraju ove Srk kinaze posedujujednu malu sekvencu na kojem se opet nalazi vaţan tirozin na 527. ili 529. mestu koji je vrlovaţan za aktivaciju Srk kinaze. Pa da vidimo na koji naĉin se aktiviraju ove tirozin kinaze.Samim tim što im naziv potiĉe od sarkoma, ukljuĉene su u onkogenezu i mnoge bolesti, apogotovo bolesti posredovane T limfocitima. Kada je fosforilisan tirozin na C kraju ( na 527. Ili529. mestu), tada je tirozin kinaza inhibirana zato što je C kraj vezan za SH2 domen. Dakle SH2domen postaje mesto u koje se uklapa fosfotirozin samog molekula. Samim tim što se sad C krajupakovao u ovaj SH2 domen, dovodi do toga da se linker vezuje za SH3 domen. Dakle linker,koji takoĊe poseduje fosforilisani tirozin se uklapa u dţep SH3 domena. I na taj naĉin katalitiĉkomesto je neurĊeeno i tirozin kinaza je inhibirana. Na koji naĉin se aktivira Srk kinaza? Aktivirase pre svega defosforilacijom ovog tirozina na C kraju koju vrše enzimi koji se zovu tirozinfosfataze. Tipiĉna tirozin fosfataza je npr CD45 koja vrši defosforilaciju ovog tirozina na 529.mestu što omogućava molekulu da se otvori i samim tim da se za SH2 mesto veţu FAK kinazeili PTK2. Istovremeno aktivacija podrazumeva i autofosforilaciju Tyr unutar katalitiĉkogdomena na 416. mestu, ĉto dovodi do aktivacije ove Srk kinaze. I da vidimo na koji naĉin Srkkinaze uĉestvuju u procesu nastanka tumora dojke. Dakle, kada je reĉ o genezi tumora dojke, tusu Srk kinaze spregnute sa receptorima za epidermalni faktor rasta (EGFR). Ovi receptori senazivaju još i HER1 receptori i u izmenjenim ćelijama dojke dolazi do povećane ekspresije kakoHER1 , tako i Srk kinaza. Ĉim je povećana ekspresija Srk i HER1 , to dovodi do toga da Srkkinaze fosforilišu tirozine na STAT3 molekulu nizvodno. A takoĊe pojaĉano eksprimirane Srkkinaze fosforilišu tirozin na 699. mestu STAT5b. Treće mesto fosforilacije prekomernoeksprimiranih Srk kinaza je 845. mesto tirozina samog receptora. Sad ovako fosforilisanireceptor takoĊe fosforiliše STAT3, fosforiliše i STAT5b ali na drugim mestima tirozina, štodovodi do toga da STAT5b dimerizuje, ulazi u jedro i vezuje se za sekvencu STAT5RE (STAT-
  • 43. 43response elements). TakoĊe dimerizuje i STAT3 i vezuje se za STAT3RE (STAT-responseelements) što dovodi do transkripcije gena koji regulišu proliferaciju, odnosno nastanak tumoradojke. Ovo je samo jedan od predloţenih modela u kojima su Srk kinaze ukljuĉene u pojavutumora. Naravno nećete pamtiti mesta tirozinskih ostataka, samo trebate da shvatite da su upitanju razliĉita mesta. I na kraju nam ostaju membranke tirozin fosfataze. Malopre pomenuti CD45 koji jeupravo doveo do aktivacije Srk kinaze jer je defosforilisao tirozin na 529. mestu, dakle u pitanjuje protein koji se nalazi na T limfocitima i B limfocitima i koji predstavlja primer enzima kojiima tirozin fosfatnu aktivnost. Receptori spregnuti sa G proteinom Kada govorimo o receptorima spregnutim sa G proteinom u pitanju su receptori koji senalaze u membrane, najveća familija receptora (1000) i za njih se vezuju razliĉiti ligandi:hormoni, neurotransmiteri, protektanti, odoranti, tastanti, vazoaktivni peptidi... Dakle, veliki jediverzitet liganda: hormoni kao što su glukagon, kateholamini,neurotransmiteri, neki tastanti nesvi,.. svi oni se vezuju za proteine spregnute sa proteinom G. Ako govorimo o hemijskomdiverzitetu, već moţemo da vidimo da su u pitanju amini, oligopeptidi, mali hemijski molekulikao što su odoranti ili tastanti itd. Receptor koji 7 puta prolazi kroz membranu, ima sedamtransmembranskih segmenata. U vanćelijskom prostoru štĉi N, amino kraj koji je glikozilovan iza male ligande kao što je adrenalin oni se vezuju za transmembranske segmente dok većiligandi preferiraju za svoje vezivanje i ovaj glikozilovani amino kraj. Kada govorimo o petljamau citosolu naroĉito je vaţna ova petlja izmeĊu 5. i 6. Transmembranskog segmenta jer je tomesto vezivanja G proteina, mada G protein poseduje i neka mesta za vezivanje u petlji izmeĊu3. i 4. Segmenta i glikozilovanog karbokscilnog kraja koji štrĉi u citosolu. Dakle ova pretlja jenajbitnija za vezu sa G proteinom (izmeĊu 5. i 6.) a pojedine ak ove petlje (3. i 4.) i karboksilnogkraja takoĊe su vaţna kao mesta za vezivanje G proteina. U pitanju je velika superfamilijamembranskih proteina koja ukljuĉuje ove klasiĉne membranske heterotrimere alfa,beta,gama aukljuĉuje i male proteine kao što je Ras. I za sve njih je karakteristiĉno da kada je spregnut saGTP oni su u aktivnoj formi, a kada je vezan GDP onda su nekativni. Nešto o klasiĉnim membranskim heterotrimerima. Heterotrimer je saĉinjen od alfa, beta,gama subjedinice. Alfa sujedinica je ta koja vezuje za sebe GTP koji ima GTPaznu aktivnost-
  • 44. 44hidrolizuje i ona je ta koja reaguje sa efektorima npr. Kao što je adenil ciklaza. Alfa sujedinica jepomoćni ? linker uz pomoću kojeg se ? ukotvljuje u ćelijsku membranu, s druge strane ceokomplek se ukotvljen u membranu preko prenil grupe gama sujedinice i na taj naĉin je sa dvamesta kompleks ukotvljen u membranu. TakoĊe, betagama sujedinica mogu reagovati saefektorom. Imajući u vidu da su tri subjedinice, postoji veliki diverzitet proteina, samo ako govorimoo alfa sujedinici u ptanju je do sada otkriveno 16 razliĉitih izoformi, 5 izoformi beta subjedinice i11 razliĉitih izoformi gama subjedinica. Svi oni su razliĉito distribuirani u razliĉitim tkivima iinteraguju sa razliĉitim efektorima i sa razliĉitim receptorima. Npr. videćemo to i kasnije alfa Ssubjedinicu aktivira glukagon, adrenalin i ona posle interaguje sa proteinima kao što je adenilciklaza. Alfa O sujedinica, aktiviraju je odoranti i efektor je adenil ciklaza, kasnije adenil ciklazaaktivira kanale zavisne od cikliĉnog nukleotida i do otvaranja kanala za Na i Ca. Alfa Qsubjedinica ona aktivira noradrenalin koji na taj naĉin izaziva vazokonstrikciju vezjujući se sasvoje alfa1 receptore i efektro je fosfolipaza C. Za otkriće G proteina ’94 Gilman i Rodbel sudobili Nobelov nagradu za medicinu. Kako funkcioniše G protein? Rekli smo da kada za sebe ima vezan GTP onda je aktivan,kada je vezan GDP neaktivan je. Ovde imamo nekativnan komplek za koji je vezan GDP, dolazizatim do vezivanja liganda za receptor, to vodi konformacionoj promeni i receptor interaguje saG proteinom što dovodi do otpuštanja GDP-a i vezivanja GTP. Vezivanje GTP dovodi do togada trimer disosuje od receptora, vezje se za svoj efektor preko alfa ili betagama subjedinice. Onedisosuju, vezuje svaka svoj efektor. Alfa subjedinica npr adenil ciklazu, fosfolipazu C,fosfodiestarazu, a betagama subjedinica npr. bruton tirozin kinazu (Btk), moţe da aktivira jonskikanal itd. Na kraju imamo terminaciju procesa: alfa subjedinica hidrolizuje GTP (dakle ponovoje inaktivirana) i promoviše spajanje sa betagama subjedinicom i na taj naĉin je kompleksstabilizovan. Još jedan faktor proteina za terminaciju odgovora - RGS odnosno regulatorsignalizacije G rpoteina koji pojaĉava njegovu GTPaznu aktivnost i time promoviše terminacijuodgovora. Iako su vaţne grupe kojim je alfa subjedinica ukotvljena u membranu, otklanjanjemovih grupa alfa se otkaĉi od membrane i ne moţe više da interaguje sa RC i efektorom. Preko G proteina kolera toksin ispoljava toksiĉno dejstvo koje se naziva simptomomkolere. To je toksin koji je sekretorni produkt bakterije Vibrio cholerae i u pitanju je oligoprotein
  • 45. 45koji se sastoji iz jedna A subjedinice (zeleno) i 5/pentamer B subjedinica (ljubiĉasto na slici).Kolera toksin se vezuje za enterocite i vezuju se za receptor koji se naziva GM1 ganglozoidnireceptor preko pentamera B subjedinica, to dovodi do endocitoze- ulaska kompleksa u ćeliju. Ućeliju kada dospe A subjedinica dolazi do isecanja na dva domena, odvajeni A1 domena sadastiĉe enzimsku aktivnost, odnosno dovodi do transfera ADP riboze na alfa B1 subjedinicu.Samim tiim ova alfa S subjedinica je inhibirana, blokirana je njena GTPazna aktivnost i ona jepraktiĉno u membrani blokirana sa GTPom (blokirana je sa vezanim GTPom) a to znaĉi daimamo konstantu produkciju cAMP, ĉim se povećava koliĉina cAMP on dovodi do aktiviranjakanala za Cl na enterociti koji se naziva transmembranski regulator cistiĉne fibroze TRCF.Samim tim je konstantno aktivirani iz njega izlaze hloridi dovodi do paracelularnog transportavode i Na i na taj naĉin izaziva klasiĉne simptome kolere a pre svega dijareju. Kao jedan odterapeutika se koriste i enkefalini koji se vezuje za svoje opioidne receptore na istoj ćeliji(enterociti) i aktiviraju Gi protein što znaĉi da će Gi protein sada inhibirati adenil ciklazu i na tajnaĉin enkefalini mogu da imaju terapeutski efekat kada je u pitanju dijarea. Na sliĉan naĉin infekciju, odnosno velik kašalj izaziva pertusis toksin koji je sekretorniprodukt bkterije Bordetella pertussis . TakoĊe se sastoji od 6 subjedinica, jedne S1 koja je analogA subjedinici kod kolera toksina S2-S5 je oligomer koji je homolog ovom pentameru 5 Bsubjedinica. Mehanizam delovanja je nešto drugaĉiji: vrši se ADP ribolizacija alfa i subjedinice,ona vrši tranfer ADP riboze na alfa i subjedinicu, znaĉi ona ne moţe da menja GDP za GTP i onasada ostaje blokirana sa vezanim GDPom što znaĉi da nema mogućnost da inhibira adenilciklazu i opet se povećava cAMP i opet dolazi do akitvacije TRCF-a. Mali GTP- vezujući proteini. Mali proteini, takoĊe na membrani koji imaju mogućnost davezuju GTP odnosno GMP i u pitanju su familije malih proteina od oko 100 ĉlanova koji suklasifikovani u 5 familija Ras, Rho, Rab, Sar1/Arf, Ran i oni funkcionišu kao biotajmeri ćelijaodnosno omogućavaju spektar ćelijskih funkcija i to pre svega poĉetak trajanje i kraj nekefunkcije. Ovo su neke opšte funkcije: Ras familija reguliše eksperiju gena. Rho- reorganizacijucitoskeleta, Rab, Sar1/Arf – transprt vezikula, Ran – mikrotubularnu reorganizaciju. Sliĉnoheterotrimeru i kada je mali GTP vezujući protein kao što je Ras ima za sebe vezan GDP i tadaje inaktivan, suprotno kada ima vezan GTP onda je aktivan. Šta je to sada što prevodi inaktivnuformu u aktivnu? Kada su u pitanju mali GTP vezujući proteini to su proteini kao što je GEF
  • 46. 46(guanine nucleotide exchange factors) faktor izmene gunaniskinh nukleotida ili SOS (son orsevenless). Ne zna se zašto se ovako zove...ima veze sa nekim proteinom kod Drozofile.GEF iSOS vrše izmenu nukletodi i samim tim aktiviraju Ras. A sa druge strane, GAP- protein kojiaktivira GTPaznu aktivnost Ras proteina ili neurofibromin, oni omogućavaju hidrolizu GTPa iinaktiviraju ovaj mali protein. Na koji naĉin deluju mali GTP vezujući proteini? Tipiĉna aktivacija MAP kinaznog puta.Ovaj poĉetak liĉi na receptor za insulin. IzmeĊu ostalog i receptro za insulin aktivira male GTPvezujuće proteine, bilo koji ligand kada se veţe za svoj receptor, menja njegovu aktivnost, dolazido dimerizacije receptora i dimerizovani receptori se sad aktiviraju i fosforilišu tirozinskeostatke samih receptora – autofosforilacija i aktiviranja u našem sluĉaju insulinskih receptora istiĉu osobinu proteina za ukotvljavanje, uz koje „pristaju“ proteini koji imaju SH2 i SH3domene- Ċepovi od 50 do 100 ak koji imaju mogućnost da u sebe ubace fosfotirozine. Kada su upitanju faktori rasta, odnosno GRB-protein koji vezuje receptore za faktore rasta preko svojihSH2 domena se ukotvljuje za fosfotirozine samog receptora?. A zašto se ovaj GRB2 zove tako kako se zove? To je zato što se aktivira u odgovoru narazliĉite faktore rasta kao što su EGF - epidermalni faktor rasta, faktor rasta nerava - NGF,fibroblast faktori rasta - FGF, faktor rasta poreklom iz trombocita - PDGF itd. Dakle, zbog toganaziv GRB (growth factor receptor bound protein) - protein koji se vezuje za receptore za faktorerasta. I kao što sam rekla, svojim SH2 domenima kojim formiraju jednu vrstu dţepova u kojei sesad ubacuju fosforilisani tirozini samog receptora. S druge strane, preko SH3 domena aktiviraSOS - protein koji ima ulogu izmjenjivaĉa guaninskih nukleotida. Samim tim SH2-? (valjdaSH3) aktivira Ras, jer vrši izmjenu nukleotida i sad aktivirani Ras regrutuje Ser/Thr kinazu izcitosloa tzv. Raf-1 kinazu ili kinazu kinaze MAP kinaze i ubacuje je u membranu. Znaĉi, ulogamalog GTP vezujućeg proteina Ras-a je da regrutuje kinazu kinaze MAP kinaze u membranu.Kada se ona regrutuje i ubaci u membranu, tako aktivirana fosforiliše sledeću kinazu. To jeMEK ili kinaza MAP kinaze, koja opet fosforiliše sledeću kinazu, a to je ERK, kinaza koja jeregulisana ekstraćelijskim signalima ili MAP kinaza koja sada kada se fosforiliše ima mogućnostda fosforiliše druge proteine citoslola i samim tim da ispoljava negenomske efekte, ali ima imogućnost da uĊe u nukleus i da fosforiliše brojne proteine jedra, odnosno transkripcione faktorei tako stiĉe genomski efekat.
  • 47. 47 E sad, pre nego krenemo opet na onu klasiĉnu alfa signalizaciju koja vam je najpoznatijada vidimo sta je sa βγ o kojoj se do skoro nije mnogo znali. Dakle, šta su sve u stanju da urade βγsubjedninice kada se odvoje od kompleksa, odnosno od alfa subjedninice? Idemo jednu po jednu,sve ćemo ove puteve da obradimo, nije toliko komplikovano kao što izgleda na prvi pogled. Dakle, prvo što radi βγ subjedinica to je da omogućava endocitozu i transport npr.albumina posredovanog caveolinom. Znaĉi endocitoza i transcitoza albumina posredovanicaveolinom. Šta se tu dešava? βγ subjedinica sada aktivira Src kinazu o kojoj smo priĉali prošliput. Src kinaza aktivira dynamin2, fosforiliše dynamin2 i kaveolin i on omogućava ovutranscitozu albumina. Evo kako to izgleda izbliza pa ćemo da se vratimo na onu komlikovanušemu. Dakle, kaveole predstavljaju jame u membrani koje omogućavaju transcitozu velikihmolekula, u ovom sluĉaju albumina. Da bi se kaveola odvojila od membrabne potreban je jedanprotein koji se naziva dynamin2, koji ima GTP-aznu aktivnost i omogućava fisiju, odnosnoodvajanje kaveola sa membrane tako što omogućava konstrikciju vrata kaveole nakon što jehidrolizovao GTP. Kakve to veze ima sad sa βγ subjedinicom? Kad se albumin veţe za svojreceptor gp60 na membrani ili unutar kaveole to dovodi do odvajanje βγ subjednice od αsubjedninice. βγ subjedinica sada aktivira Src, Src omogućava fosforilaciju dynamina na 231mestu unutar GTP-aznog domena i omogućava fosforilaciju dynamina2 na 597 mestu.Fosforilacija na 597 mestu je izuzetno vaţna jer omogućava da se on izmesti u plazma membranisa jednog mesta na drugi i da se veţe za caveoline, odnosni caveolin1 koji se nalazi unutarkaveole. Samim tim, kao što sam rekla, stiĉe GTP-aznu aktivnost i omogućava fisiju kaveole. Nataj naĉin omogućava endocitozu odnosno transcitozu albumina sa jedne strane ćelije na drugustranu ćelije. Završili smo endocitozu, idemo sad drugu ulogu βγ subjedinice, a to je aktivacija MAPkinaznog puta preko fosforilacije jednog adapternog proteina koji se naziva SHC transformišućiprotein-1. βγ subjedinica fosforiliše SHC. SHC aktivira GRB-2, malopre pomenuti, koji sadaaktivira SOS. SOS opet aktivira Ras, odnosno doovodi do izmjene nukleotida, Ras sada stiĉeGTP-aznu aktivnost, omogućava translokaciju Raf-1 u membranu. Raf-1 aktivira MEK, MEKaktivira ERK i dakle na taj naĉin βγ subjedinica moţe da aktivira MAP kinazni put. Šta radi još βγ subjedinica? Ovaj srednji deo, to je metabolizam fosfoinozitida.Metabolizam fosfoinizitida... Dakle ovo sve što se dešava u citosolu to je samo šema, sve su to
  • 48. 48proteini membrane. Fosfoinozitidi su proteini membrane, jednostavno ne bi moglo da stane naovu sliku... Mi smo sve vreme u membrani... dakle βγ subjedinica je zakaĉena za membranu ifosfoinozitidi na koje djeluje su takoĊe u membrani. Dakle βγ subjedinica sada aktivira Bruton-ovu tirozin kinazu-Btk koja sada fosforiliše fosfolipazu c gama (PLCγ). PLCγ sada razlaţefosfatidil inozitol difosfat koji, ponavljam se nalazi u membrani, na dva sekundarna glasnika,inozitol-3-fosfat-IP3 i diacilglicerol-DAG. Videćemo kasnije IP3 odlazi u citosol, a DAG ostajeu membrani. Osim toga βγ subjedinica direktno aktivira fosfolipacu c beta2 i ta fosfolipaza c beta2 takoĊe deluje na fosfatidil inozitol bifosfat i dovodi do stvaranja IP3-a i DAG-a. Zatim, βγsubjedinica aktivira jednu kinazu koja se naziva PI3K (fosfoinozitid-3-kinaza) koja konvertujefosfatidil inozitol difosfat u fosfatidil inozitol 3 fosfat. PIP3 omogućava regrutovanje proteinkinaze B - PKB ili tzv. Akt-a u membranu i omogućava sada dakle da na njega deluje novi enzimkoji se naziva 3 fosfatidil inozitol zavisna protein kinaza 1-PDPK1. Kada je translocirana umembranu protein kinaza B ili Akt, na nju sada moţe da deluje ovaj enzim i da pokrene novisignalni put koji se naziva Akt signalni put koji recimo ima ulogu u blokadi apoptoze iproloferaciji ćelija. Dalje, βγ subjedinica moţe da aktivira i adenil ciklazu 2 (ACII) i adenilciklazu 5 (ACV). Znaĉi, ove dve adenil cikalze kao i ona adenil ciklaza na koju smo naviklitakoĊe dovode do stvaranja cAMP-a i aktivira protein kinazu A.I na kraju, βγ subjedinica dovodi ovaj sluĉaj pominjali smo ĉini mi se kad smo priĉali onegativnom hronotropnom dejstvu acetilholina. Dakle, βγ subjedinica otvara kanale za kalijum ikanale za kalijum kroz koje kalijum izlazi što dovodi do hiperpolarizacije ćelije i usporavanjarada srca. Idemo sada na α signalizaciju, na receptore spregnute s proteinom G ali preko αsubjedinice. Dakle, ona je kuplovana sa razliĉitim enzimima i moţe da ih inhibira ili stimuliše.Tako, αs subjedinica stmuliše adenil ciklazu, a αi inhibira adenil ciklazu te tako dovodi dopovećanja sekundarnog glasnika cAMP-a ili do njegovog smanjenja. Koji su to razliĉitisekundarni glasnici koje moţe da aktiviraju razliĉite α subjedinice? Dakle, cAMP i adenilciklaza. Zatim, ovde nemamo sluĉaj klasiĉnog liganda već je svetlost ta koja aktivira protein kojije spregnut s G proteinom i naziva se rodopsin. On se sastoji iz proteinske komponente-opsina iretinola. Cis-retinal apsorbuje foton svetlosti i dovodi do konformacionih promena samog
  • 49. 49proteina i dovodi do disocijacije u ovom sluĉaju αt subjedinice. T zato što se ovaj kompleks kojise vezuje za rodopsin naziva transducin. αt subjedinica ne aktivira adenil cikazu kao αs većaktivira fosfodiesterazu koja razgraĊuje cGMP što dovodi do smanjenja cGMP-a i dohiperpolarizacije ćelije u odgovoru na svetlost. Sledeća subjedinica je αq subjedinica. Ona aktivira fosfolipazu C - PLC i to PLC β-2 kojadovodi do stvaranja IP3-a i DAG-a. Odoranti dovode do stvaranja αo subjedinice koja takoĊe aktivira adenil ciklazu. Kadagovorimo o klasiĉnom putu na A, znaĉi adenil ciklaza, cAMP, protein kinaza A... da navedemoprimere sa kojima smo se do sada susretali... na taj naĉin recimo, adrenokortikotropni hormon -ACTH iz hipofize se vezuje za svoje receptore na kori nadbubrega i preko AC i cAMP-a dovodido stvaranja glukokortikoida iz holesterola. Pominjala je prošli put koleginica kada je drţalaseminar da se na taj naĉin vazopresin vezuje za svoje receptore na tubulocitama i da takoomogućava eksprimiranje akvaporina. Pominjali smo da na ovaj naĉin, preko AC i cAMP-anoradrenalin ostvaruje pozitivno inotropno dejstvo. Znaĉi, pozitivno inotropno dejstvo ostvarujekad se vezuje za svoje receptore na kojim ćelijama? Pozitivni efekat na snagu kontrakcijeostvaruje vezujući se za svoje receptore na kardiocitama. A šta se dešava kad se NA veţe zaćelije SA ĉvora? Ostvaruje pozitivno hronotropno dejstvo, ubrzava rad srca. Preko kog signalnogputa to ostvaruje? Istog ovog. Opet se vezuje za β1 receptore i preko AC i cAMP-a ostvarujepozitivno hronotropno dejstvo. Malopre smo priĉali da kolera toksin i nemetuzis toksin opet preko α subjediniceostvaruje simptome holere. Zatim, postoji niz sindroma vezanih za defekte, odnosno mutacije ugenu za αs subjedinicu. Jedan od takvih sindroma je McCune-Albright sindrom, koji nastajeusled mutacije u gnas1 genu, a gnas1 gen je taj koji kodira αs subjedinicu, znaĉi mutacija u ovomgenu dovodi do ovog sindroma koji se manifestuje preranim pubertetom, deformisanim kostima,hiperpigmentacijom i hiperfunkcijom mnogih endokrinih ţlezda. TakoĊe, sledeći poremećaj,takoĊe nasledan, Albrightova hereditarna osteodistrofija ili pseudoparatiroidizam,nefunkcionalna αs subjedinica, dovodi do rezistencije na parathormon (zato se i nazivapseudoparatireoidizam). Znaĉi nije u pitanju defekt tireoidne ţlezde, parathormona ima dosta,ĉak ga ima i više, meĊutim ćelije su rezistentne na ovaj hormon, što dovodi do hipokalcemije, dokarakteristiĉno niskog rasta, 4. i 5. prst su kraći i dovodi do mentalne retardacije. Dakle dve
  • 50. 50karakteristiĉne bolesti vezane za mutaciju u genu za αs subjedinicu. αs subjedinica aktiviraadenilat ciklazu, ona sad dovodi do povećanja cAMP-a, cAMP aktivira PKA, zašto je A? zato štoje od cAMP zavisna protein kinaza, koja se sastoji iz 2 katalitiĉke I 2 regulatorne subjedinice.Regulatorne praktiĉno inhibiraju protein kinazu, kada se veţe cAMP dovodi do odvajanjaregulatornih od katalitiĉkih subjedinica, katalitiĉke subjedinice stiĉu serin treonin kinaznodejstvo, odnosno omogućava fosforilaciju serina I treonina na efektornom proteinu. Ĉemu jošsluţi regulatorna subjedinica? Ona obavja ukotvljavanje celog ovog kompleksa jer se vezuje zaAKAP. AKAP je protein koji ukotvljava A kinazu I povezuje protein kinazu za citoskelet ili zaorganelu. U neuronima npr. AKAP79 ukotvljava PKA i kalcineurin, odnosno protein fosfatazu 3(PP3). Za otkriće o postojanja i funkcionisanja G proteina, cAMP-a kao sekundarnog glasnikaEarl Sutherland je 1971. dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu, a za otkrićesignalnog puta, odnosno fosforilaciju u signalnoj transdukciji Edmond Fischer i Edwin Krebs1992. dobili Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu. Otkriće funkcionisanja cAMP-a je ustanovljeno na katabolizmu glikogena u skeletnimmišićima, o tome nećemo priĉati jer sam sigurna da ste o tome slušali veliki broj puta tokomstudiranja. Znaĉi koja je poenta delovanja npr. adrenalina ili glukagona na glikogenolizu? To jeda se aktivaira glikogen fosforilaza sa jedne strane i omogućava se glikogenoliza, i da seistovremeno aktivira glikogen sintetaza, odnosno da se inhibira glikogeneza. Dakle cAMPaktivira PKA koja fosforiliše subjedinice neaktivne kinaze glikogen fosforilaze sa jedne strane, asa druge strane aktivnu glikogen sintazu inaktivira i na taj naĉin onemogućava istovremenoglikoneogenezu. Treća stvar koju obavlja PKA u mišićnim ćelijama i npr. hepatocitima ukolikoje potrebno da deluje na nivo glukagona, to je da fosforiliše i aktivira inhibitor fosfoproteinfosfataze (PP1). Zašto inhibira PP1? Zato što ova fosfataza uklanja fosfate koje ova PKA dodaje.Znaĉi ukoliko ona nije inhibirana ovaj ceo posao će biti besmislen jer PKA fosforiliše serintreonin ostatke, a PP1 ih defosforiliše. Da se to ne bi dešavalo treći efektorni protein PKA jePP1, odnosno fosfoprotein fosfataza. Priĉali smo već da na ovaj naĉin se u velikoj meriamplifikuje signal, da jedan adrenalin dovodi do stvaranja 10 000 glukoze i da sam cAMPostvaruje veliki spektar enzimskih funkcija. Dakle jasno nam je da je vaţan balans izmeĊuaktivnosti kinaze sa jedne strane i fosfataze, jer da fosfataza nije blokirana ne bi se odvijala
  • 51. 51glikogenoliza. Osim protein fosfataze 1 koja vrši uklanjanje fosfata na serinu i treoninu kojefosforiliše PKA postoje još PP2, PP3 i PP2C. PP2 takoĊe defosforiliše, odnosno uklanja fosfatneostatke koje su dodale druge kinaze npr. malopre pomenuta MAP kinaza ili ERK, ili proteinkinaza B ili A, i na taj naĉin deluje na MAP kinazni put i na ARK kinazni put. PP3 ili PP2B sedrugaĉije naziva kalcineurin, uĉestvuje u aktivaciji T limfocita, i upravo je kalicneurin odnosnoova fosfataza glavni ??, lekovi se baziraju na kalcineurinu. Osim negenomskih efekata o kojima smo priĉali, odnosno na koje sam vas podsetila,PKA moţe da ostvaruje i genomske efekte, to smo malo dotakli kada smo priĉali oakvaporinima, da kada se katalitiĉka subjedinica odvoji od regulatornih subjedinica imamogućnost da uĊe u jedro, i za samo pola sata moţe da fosforiliše CREB, odnosno protein kojise vezuje za CRE elemente. CRE elementi su elementi na promotoru gena, npr. gen za porin, kojise naziva CRE. Zašto? Zato što je cAMP responsivni element. Osim toga, fosforilacija CREB-aomogućava da se ovaj protein veţe za drugi protein koji se naziva CBP. CBP je CREB vezujućiprotein. I ovaj CBP kad se sad veţe za CREB formira neku vrstu mosta, odnosno spojniceizmeĊu CREB-a i proteina transkripcione mašinerije i pomaţe transkripciju. Znaĉi sa jednestrane CREB se vezuje za CRE elemente na promotoru gena, a sa druge strane njegovafosforilacija mu omogućava da se veţe za CBP koji predstavlja spoj izmeĊu CREB-a i proteinainiciacione transkripcione mašinerije. I ovo je sliĉno kao u citosolu, omogućena terminacijasignala tako što PKA kada je ušla u jedro i izvršila fosforilaciju CREB-a, sa druge stranefosforilisala je PP1 koja onemogućava defosforilaciju CREB-a sa jedne strane i ĉim se spusticAMP ona se ukljuĉuje, defosforiliše je i na taj naĉin omogućava terminaciju signala. Šta još radi cAMP? Ovo je nešto što već znate. cAMP i PKA ukljuĉeni su u mehanizamdesenzitizacije B adrenergiĉkih receptora. Na koji naĉin? Noradrenalin se veţe za svoje Badrenergiĉke receptore, što smo, priĉali smo o tome da na taj naĉin moţe da ubrza rad srca. Znaĉiklasiĉan put, preko αs adenil ciklaze cAMP i PKA koja kao što smo rekli fosforiliše specifiĉneciljne proteine, sa druge strane PKA fosforiliše kinazu β adrenergiĉkog receptora ili BARK,znaĉi BAR kinazu. Ova kinaza sada kada je fosforilisana ima mogućnost da se translocira umembranu, znaĉi dolazi do B adrenergiĉkog receptora i na taj naĉin omogućava kontrolu ispreĉava prekomernu aktivaciju ovog receptora. Znaĉi na neki naĉin omogućava desenzitizacijureceptora. Znaĉi ovo što smo rekli, da BAR kinaza omogućava fosforilaciju receptora i na taj
  • 52. 52naĉin onemogućava prekomernu aktivaciju, što je vaţno jer ako bi ćelija bila izloţena, ako binpr. adrenalin prekomerno aktivirao ćeliju to bi bilo pogubno za hepatocite itd. Drugimehanizam kojim se vrši desentizacija je vezivanje arestina2. Arestin 2 se takoĊe vezuje za Badrenergiĉki receptor, i to za mesto za koje se vezuje G protein. Znaĉi to je ona petlja izmeĊu S5i S6 transmembranskih segmenata, dakle omogućava na taj naĉin da se B adrenergiĉki receptorpoveţe sa proteinom i sa klatrinskim adapterom, koji promovišu internalizaciju receptora i na tajnaĉin omogućavaju receptorsku desenzitizaciju internalizacijom receptora, odnosno ulaskomreceptora u unutarćelijske depoe. Dakle jedan mehanizam koji obavlja PKA je fosforilacijaBARK-a koji sad vrši fosforilaciju receptora, a drugi mehanizam je vezivanje arestina 2 iinternalizacija B adrenergiĉkog receptora. Šta još radi cAMP? Ovo smo pominjali, znaĉi samo da se podsetimo. Dakle rekli smo dase cAMP stvara u odgovoru na odorante, to su mali molekuli koji se rastvarauj u odorantvezujućim proteinima mukusa sluzokoţe nosa, i na taj naĉin mogu da se vezuju za svojereceptore koji takoĊe predstavljaju receptore spregnute sa proteinom G. αolf subjedinica dovodido stvaranja cAMP-a, a cAMP sada otvara kanale spregnute sa cikliĉnim proteinima, CNGkanale, to su kanali kroz koje ulaze Ca i Na. Dakle cAMP dovodi do otvaranja kanala zavisnihod cikliĉnih nukleotida, u ovom sluĉaju cAMP, i kroz te kanale sada ulazi Ca odnosno Na, štodovodi do inicijalne depolarizacije. Inicijalna depolarizacija, odnosno povećanje koncentracijeCa u ćeliji dovodi do otvaranja kanala za Cl zavisnih od kalcijuma. Znaĉi to su Ca aktivirajućikanali za Cl, kroz koje sada Cl izlazi što dovodi do dalje depolarizacije, što dovodi do stvaranjareceptorskog ? potencijala koji kada preĊe prag dovodi do stvaranja akcionih potencijala. Sećatese ove slike, rekli smo da je ovde neobiĉno što od dendrita dolazi akcioni potencijal ka telućelije, zatim od tela ćelije odlazi u olfaktorni bulbus. Sledeći receptor spregnut sa proteinom G ali signalna kaskada koja se odvija prekocAMP-a je situacija koju imamo u ĉepićima i štapićima. Sećate se na koji naĉin su graĊeništapići i ĉepići. Rekli smo da imaju spoljni segment koji ima jednu vrstu diskova, koji serazlikuju morfološki kada su u pitanju ĉepići i štapići i po tome su dobili naziv, i na timmembranama se nalazi fotopigment. U pitanju je rodopsin, ĉlan familije spregnut sa proteinom Gkoga ne aktiviraju klasiĉni ligandi već svetlost. Svetlost dovodi do prevoĊenja cis- retinala utrans-retinal. Stvaranje trans retinala utiĉe na G protein koji se naziva transducin. Sada αG
  • 53. 53subjedinica aktivira sledeći enzim – u pitanju je fosfodiesteraza. Ona hidrolizuje cikliĉni GMP uGMP, samim tim se smanjuje koncentracija cGMP-a u ćeliji i dolazi do toga da on disosuje sasvog CMG kanala (kanali zavisni od cikliĉnih nukleotida), u ovom sluĉaju zavisni od cikliĉnogGMP-a što dovodi do zatvaranja kanala i hiperpolarizacije. Veoma je neobiĉno da svetlostdovodi do hiperpolarizacije, a mrak je depolarišući. Signalizacija preko inozitol -3-fosfata i diacil-glicerola Odakle ćeliji IP3 i DAG? Oni se stvaraju iz fosfatidilinozitola koji su veoma malozastupljeni u ćel.membrani. Njihovi produkti imaju vaţnu ulogu u signalnoj transdukciji. Kadase hormon ili npr.neurotransmiter (noradrenalin) veţe za svoj npr. α1 receptor u ćelijama glatkihmišića i krvnih sudova dolazi do disocijacije alfaQ subjedinice G proteina koji sada aktivirafosfolipazu Cβ. Postoje tri familije ovih lipaza: PLCβ, PLCγ i PLCδ. One se razlikuju pokatalitiĉkim svojstvima, eksprimiraju se u razliĉitim tipovima ćelija i aktiviraju se na razliĉitenaĉine. PLCβ hidrolizuje fosfatidilinozitol-3 fosfate (PIP2) na IP3 I DAG. Fosfatidilinozitoli sujedan izvor ova dva sekundarna glasnika,tj. DAG-a. Drugi izvor DAG-a su fosfatidilholini kojihima mnogo, dosta su zastupljeni u membranama. DAG nastaje delovanjem dve fosfolipaze: PLCI PLD. PLC iseca fosfatidilholine na odreĊenom mestu I nastaje sa jedne strane DAG,a sa drugefosfoholin. PLD iseca fosfatidilholin na drugom mestu,tj. fosfodiestarsku vezu sa druge stranetako da su produkti fosfo-DAG i holin. Interesantno je da se razlikuju tipovi u ćeliji u pogledutoga da li DAG nastaje delovanjem PLCβ ili PLD. Kada nastaje delovanjem PLCβ nastajeizuzetno brzo, ima nešto veći pik koji se brzo smanjuje. Delovanjem PLD,tj. DAG koji nastajehidrolizom fosfatidilholina nastaje znaĉajno kasnije, duţe perzistira u ćeliji i ima kasni pik. Naovaj naĉin,preko PLD, DAG nastaje pod uticajem TNF-α, IFN-γ i razliĉitih interleukina. IP3 je sekundarni glasnik koji se odvaja od membranaskog PIP2 i ulazi u citosol gde sevezuje za svoje receptore koji su ustvari kanali za Ca2+ koji se nalaze na ER i koji su srodniryanodinskom receptoru koji se nalazi na membrane sarkoplazmatiĉnog retikuluma. Receptor jetetramer i svaku jedinicu kodira bar 3 gena što ukazuje na veliki diverzitet. Receptori mogu dafosforilišu protein-kinaza A, PKC i Ca-zavisne protein kinaze. Ca2+ izlazi iz unutarćelijskihdepoa, povećava se konc. Ca2+ u citosolu. To povećanje moţe biti tranzitorno (povećava se konc.i odmah se smanjuje) i perzistentno. Perzistentno se odvija u talasima (povećava se, smanjuje se,povećava se) što je regulisano povratnom spregom, tj. Ca2+ sam sebe reguliše: kada je visoka
  • 54. 54konc.Ca2+ dolazi do smanjenja (ubacivanja u unutarćelijske depoe) i obrnuto. Osim IP3 napovećanje konc. Ca moţe da utiĉe i cikliĉna- ADP- riboza. Ona moţe na neki naĉin da se veţe ida otvori ove kanale i da dovede do povećanja konc. Ca u ćeliji. Rekli smo kada smo govorili ojonskim kanalima, da je Ca preteţno ekstraćel.katjon i da je vaţno da ga ima malo u ćeliji jernjegovo povećanje dovodi do brojnih procesa kao što su egzocitoze – granula sa enzimimapankreasa, egzocitoze granula sa hormonima, neurotransmiterima, na taj naĉin se vrši sekrecijainsulina; bilo kakve kontrakcije mišića, oslobaĊanje histamina, agregacije trombocita… Ca neostvaruje te efekte direktno već se uglavnom vezuje za protein koji se zove kalmodulin. Za ovajprotein se vezuju 4 Ca, dolazi do konformacionih promena i takav protein moţe da se veţe zainaktivne proteine citosola ĉime ih aktivira. Tako se aktivira fosfodiesteraza koja vrši razgradnjucGMP-a. Najĉešće se kalmodulin vezan sa Ca vezuje za sledeću grupu kinaza koje se nazivajukalmodulin zavisne protein kinaze. To su protein kinaze sa serin-treonin aktivnošću koje vršefosforilaciju nizvodnih protein na serinskim i treoninskim ostacima. Primer jedne takve kinaze jeMLCK (kinaza lakog lanca miozina). Na nju deluje kalmodulin za koji je vezan Ca i dovodi doaktivacije ove kinaze. Primer kalmodulin zavisne protein kinaze je i β subjedinica kinazaglikogen fosforilaze (od koje kreće ceo put…u kojim se odvija glikoliza)CAM kinaza II (kalmodulin zavisna kinaza II) je vaţna jer aktivira tirozin-hidroksilazu (TH) kojiuĉestvuje u sintezi kateholamina (limitirajući enzim u sintezi svih kateholamina) i reguliše njihovnivo. Terminacija procesa : Ca ne moţe da egzistira u citosolu već se uklanja SERCA pumpom(višak Ca upumpava u ER ili sarkoplazmatiĉni retikulum), PMCA (plazmomembranska pumpaza Ca-ispumpava Ca, upumpava protone), NCX ( izmenjivaĉ Na I Ca -izbacuje Ca, ubacuje Na usmeru gradijenta koncentracije zahvaljujući Na/K/ATPazi). Zašto je bitan još Ca? Jako je vaţno da kada se Ca oslobodi aktivira drugi enzim- proteinkinazu C. PKC je inaktivna i nalazi se u citosolu, da bi se aktivirala mora da se translocira umembranu. U pitanju je Ca-zavisna kinaza jer je Ca taj koji omogućava njenu translokaciju. Onase sad translocira, to se odvija posle jednog minuta, translocira se u membranu gde je sad aktiviraDAG (koji ostaje u membrane kao sekundarni glasnik).
  • 55. 55 PKC je serin-treonin kinaza. Postoje 3 familije koje su razvrstane u ove famile na osnovu membranskog fosfatidilserina sa jedne strane i zahteva protein kinaza za Ca,tj.DAG. Forbol estri mogu da aktiviraju PKC, odnosno da je drţe translociranu u membrane I aktiviranu ĉak I u odsustvu DAG-a. Forbol estri su biiljnog porekla i predstavljaju promotore tumora koji mogu da aktiviraju PKC. Glavni supstrat PKC je MARCKS (miryistoylated alanine rich C kinase supstrat). To je kiseli protein koji sa jedne strane ima mesto za fosforilaciju od strane PKC a sa druge mesto kojim se vezuje za kalmodulin i za aktin. Kada je vezan za membranu, ona predstavlja most izmeĊu aktina i ćel.membrane i na neki naĉin uĉestvuje u regulaciji oblika ćelije. Kada je MARCKS defosforilisana, ona je vezana za membranu i vezana za aktin; njena fosforilacija dovodi do toga da se ona translocira u citosol. Vazna je jer obezbeĊuje oblik ćelije. PKC osim što ima negenomske efekte, moţe da moduliše transkripciju i na taj naĉin moduliše transkripciju dena za involukrin- to je protein koji se nalazi u keratinocitama. PKC najĉešće fosforilišu P-CAF factor koji je vezan za P300/CBP transkripcioni koaktivator. Zbog toga forbol estri predstavljaju tumor promotore. Forbol estri mogu da aktiviraju PKC I bez DAG-a I na taj naĉin, budući da PKC ima genomske efekte (posebno deluju na P-CAF faktor ), ostvaruju dejstvo promotora tumora. Signalni put preko eikozanoida Eikozanoidi nastaju delovanjem serije enzima na arahidonsku kiselinu. Arahidonska kiselina je prekursor ovih sekundarnih glasnika i ona je u stvari produkt hidrolize fosfolipida membrane. Arahidonska kis. nastaje delovanjem fosfolipaze A2 koja iseca fosfolipide na odreĊenom mestu. Na arahidonsku kis.deluje serija enzima I nastaju eikozanoidi. Oni se tako zovu jer imaju 20 karboksilinh atoma (eikos je 20 na grĉkom). Ukljuĉeni su u spektar fizioloških funkcija: utiĉu na alergijse reakcije, imaju vazomotorno dejstvo (neki su vazodilatatori, neki vazokonstriktori), utiĉu na sekreciju ţeludaĉnog soka, na agregaciju trombocita… Enzimi koji prevode arahidonsku kis u signalne molekule su:1. Ciklooksigenaze – dovode do stvaranja tromboksana, prostaglandina i prostociklina2. 5-Llipooksigenaze – dovode do stvaranja leukotriena i HETE3. Epoksigenaze (citohrom P-450 0ksidaze) koje stvaraju druge HETE
  • 56. 56 Leukotrieni su medijatori alergijskih reakcija (odgovorni su za ostvarivanje simptomaastme, psoriaze, rinitisa). Druge HETE koje stvaraju epoksigenaze uĉestvuju u formiranju plaka,oslobaĊanju Ca i vazoaktivni su agensi. Ligandi koji omogućavaju oslobaĊanje arahidonske kis. iz membranskih fosfolipida:1. Kada se govori o direktnom putu radi se o serotoninu preko serotoninskih receptora 2,glutamin preko metalotropnog GLUT1 receptora, faktora rasta, faktora rasta fibroblasta, IFN-γ,α.Aktiviraju receptore spregnute sa G proteinom, aktiviraju protein Gi/G0 ĉija verovatno βγsubjedinica direktno stimuliše fosfolipazu A2, ali je verovatnije da se ipak indirektno fosfolipazaA2 aktivira preko MAP kinaze koja fosforiliše serinske ostatke PLA.2. Indirektni put: preko DAG-a; dopamin se vezuje za svoje D2 receptore, adenozin za A1receptore, noradrenalin preko α2 receptora i serotonin preko serotoninskih receptora tipa 1.Oniaktiviraju fosfolipazu Cβ koja deluje na DAG i dovodi do stvaranja arahidonske kis. DAGaktivira DAG-lipazu koja dovodi do stvaranja monoacil-glicerola koji ostaje u membrani iarahidonske kis.Svi faktori koji povećavaju konc. Ca, a koji stimulišu fosfolipazuA i svi signalni putevi kojiaktiviraju MAP kinazu- svi oni dovode do stvaranja arahidonske kis. Ciklooksigenaza je bifuncionalni enzim. Ima ciklooksigenaznu aktivnost i mogućnostperoksidacije i na taj naĉin stvara tromboksane, prostaglandine i prostacikline. Preko svojecikloogsigenazne aktivnosti ona prevodi arahidonsku kis. U prostaglandin G2 koji zatimperoksidaznom aktivnošću prevodi u prostaglandin H2. Postoje dve izoforme ovog enzima:ciklooksigenaza 1 i ciklooksigenaza 2. Obe imaju karakteristiĉno katalitiĉko mesto koje imaoblik dugog hidrofobnog tunela. COX-1 je konstitutivno eksprimirana izoforma (stalno jeeksprimirana) i kada na nju deluje aspirin on je ireverzibilno inhibira tako što acetiluje serin navrhu tunela (tj.katalitiĉkog mesta) i upravo na ovaj naĉin aspirin ispoljava nepovoljno dejstvo naţeludac (stare generacije aspirina dovodile do nastanka ţeludaĉne kiseline i ĉira). Novageneracija aspirina je usmerena na COX-2 koja se indukuje inflamacijom i svojaantiimflamatorna dejstva aspirin i diklofen ostvaruju na COX-2 izoformu. Kako podiţemo ispuštamo temperaturu ako popijemo aspirin? Prostaglandin E2 baţdari taĉku u hipotalamusu (na370 C). Inflamacija dovodi do eksprimiranja COX-2 koji dovodi do nastanka prostaglandina E2,raste njegova konc.u ćeliji i povećava se baţdarna taĉka. Mi tada produkujemo toplotu, drhtimo i
  • 57. 57podiţemo temperaturu na 39,40. Aspirin deluje na COX-2 izoformu, smanjuje se konc. E2 kao ibaţdarna taĉka. Mi bivamo obavešteni o tome i oslobaĊamo se toplote znojenjem. Male dozeaspirina se koriste kao prevencija od infarkta miokarda. Srĉani bolesnici svaki dan piju male doze aspirina jer one inhibiraju stvaranje trombocitaod strane tromboksana A2. Tromboksan A2 je vazokonstriktor,on omogućava agregacijutrombocita i njihovo oslobaĊanje. Prostaglandini takoĊe utiĉu na oslobaĊanje trombocita,vazokonstriktori su, utiĉu na oslobaĊanje renina, imaju ulogu u inflamaciji, vazoaktivni suagensi. Vazoaktivnu aktivnost ostvaruju kod fetalnog krvotoka: neki krvni sud je otvoren samokod fetusa i omogućava da krv ne odlazi u pluća koja su zatvorena već direktno iz desne komoreprebacuje u aortu zahvaljujući ductus-u arteriosus-u koji je raširen zahvaljujući prostaglandinuE2 kojeg kod fetusa ima 5 puta više. Ĉim se beba rodi, koncentracija se spušta na normalu.Prostaglandin E2 ima ulogu u inhibiranju Na/K ATPaze u bubrezima. Prostociklini su inhibitori agregacije trombocita i vazodilatatori. Jonotropni receptori ili ligand zavisni jonski kanali Ligand zavisni jonski kanali, dakle transmembranski proteini koji se sastoje iz nekolikosubjedinica. Najĉešće su pentameri. Svaki pentamer je graĊen od 4 transmembranska segmenta.U pitanju su receptori za serotonin, acetilholin. GABA-u, glicin.... Primer je nikotinski receptor za acetilholin koji u stvari predstavlja kanale za Na, tj. K.Sastoji se iz 2α,β,γ i δ subjedinice. Svaka subjedinica ima 4 transmembranska segmenta. M2transmembranski segment formira poru kroz koju prolaze Na i K. Α alfa subjedinica vezujeligand (on se vezuje za ekstraćelijski amino kraj). 2 acetilholina se veţu za 2 α subjedinice i nataj naĉin se otvara kanal. Pr. Receptor za IP3 je u stvari kanal za Ca koji se nalazi na ER-u isrodan je kanalu za Ca koji je na sarkoplazmatiĉnom retikulumu, dakle to je onaj guanozinskireceptor.
  • 58. 58 Sinaptička transmisijaSLIDE 2:ISTORIJAT FIZIOLOGIJE SINAPSEKada je prvi put poĉela uopšte da se izuĉava sinapsa? 1900. god. zaĉinje se fiziologijasinapse kada je ustanovljeno da ekstrakt nadbubreţnih ţlezda ostvaruje isti efekat nafrekvenciju srca kao stimulacija SNS. Posle par godina (1904) Eliot je ustanovio da se nakrajevima SNS otpušta supstanca koja je sliĉna adrenalinu.1921. god. Otto Loewi je ustanovio da stimulacija n.vagusa dovodi do usporavanja rada srcaţabe u kupatilu. Isti efekat postiţe se perfundovanjem srca fiziološkim rastvorom izstimulisanih komora, a supstancu koja postiţe taj efekat nazvao je vagusstoff.Zatim, Henry Dale je ustanovila da isti neurotransmiter (Ach) ima inhibitorni efekat u sinapsisrca, a stimulatorni u sinapsi izmeĊu motornog nerva i skeletnog mišića (u nervno-mišićnojsinapsi).Za otkrića Otto Loewi i Sir Henry Dale dodeljena je Nobelova nagrada za medicinu 1936.god.
  • 59. 591959. god. Furshpan i Potter su prvi dali direktne dokaze o postojanju elektriĉne sinapse.Radili su eksperimente na nervu jastoga i ustanovili su da depolarizacija presinaptiĉkogabdominalnog nerva jastoga dovodi do ekscitacije motornog nerva, koji inerviše rep.Već 1960. godine postoje prvi dokazi da ćelije koriste i elektriĉni i hemijski modalitet umedjusobnom komuniciranju.Danas, znamo da postoje elektriĉne i hemijske sinapse. Direktna elektriĉna veza uspostavljase preko koneksona, a hemijska sinapsa preko neurotransmitera.SLIDE 3:ELEKTRIĈNA SINAPSARazlike izmedju elektriĉne i hemijske sinapse: prvo, elektriĉna sinapsa momentalno deluje, aza hemijsku sinapsu je karakteristiĉna zakasnela propagacija signala (za oko 1 ms). Ono štojoš karakteriše elektriĉnu sinapsu je da je pukotina uska, dok je kod hemijske sinapsepukotina znaĉajno veća. Dakle, elektriĉna sinapsa se uspostavlja zahvaljujući sistemukoneksona i bidirekcionalna je (u zavisnosti od potencijala membrane moţe da se sprovodi ujednom ili drugom smeru). Postoje i polarizovane elektriĉne sinapse (uniderekcionalna) kojezavise od gradje koneksona.SLIDE 4:HEMIJSKA SINAPSAHemijsku sinapsu karakeriše oslobadjanje neurotransmitera. U hem. sinapsi uĉestvuju dvećelije. Ona je polarizovana (unidirekcionalna, jednosmerna) u smislu propagacije signala(presinaptiĉki ka postsinaptiĉkom završetku), ali se moţe modulisati dvosmerno (kasnijeobjašnjenje).Dakle, da bi hem. sinapsa funkcionisala treba prvo da se sintetišu neurotransmiteri i da sespakuju u sinaptiĉke vezikule. Nakon stvaranja AP dolazi do depolarizacije koja dovodi dootvaranja voltaţno zavisnih kanala za Ca2+. Sada Ca2+ ulazi u presinaptiĉki završetak štoomogućava fuziju vezikule sa membranom. Neurotransmiter se oslobadja u sinapsu,difunduje, vezuje se za svoje receptore na postsinaptiĉkoj ćeliji i aktivira se postsinaptiĉkaćelija. Naravno, mora da dodje do terminacije odgovora. Neurotransmiter se uklanja izsinapse enzimskom razgradnjom, preuzimanjem u presinaptiĉki završetak ili difunduje izsinapse. Postoji veliki diverzitet u funkcionalnoj specijalizaciji i regulaciji. Prvo, kadagovorimo o prirodi neurotransmitera. Onda kada govorimo o naĉinu pakovanja vezikule.Diverzitet postoji i u pogledu receptora na postsinaptiĉkoj ćeliji, a mogu i razliĉitimsignalima da se pokrenu odgovori ćelije.SLIDE 5:NEUROTRANSMITERI
  • 60. 60Koji su to neurotransmiteri?1. Amino kiseline (glutaminska kiselina - vaţan inhibitorni neurotransmiter, γ aminobuterna kiselina - vaţan inhibitorni neurotransmiter i glicin - inhibitorni neurotransmiter).2. Monoamini (acetilholin, serotonin i histamini)3. Kateholamini (dopamin, adrenalin, noradrenalin)4. Peptidi (tu se nalaze i endogeni opioidi, enkefalin itd.)5. Derivati purina (npr. ATP)6. NO se takodje smatra neurotransmiterom. Na specifiĉan naĉin se sintetiše i otpušta (ućeliju i iz ćelije). Kao kandidat za neurotransmitera se pojavljuje i CO. Medjutim, još uvek jepod znakom pitannja da li moţemo da ga svrstamo u neurotransmiter.SLIDE 6:SINAPTIĈKA VEZIKULAKako se sintetišu neurotransmiteri? Kako dolazi do egzocitoze sadrţaja vezikula?Vezikularni peptidi, enzimi i prekursori neurotransmitera sintetišu se na granuliranomendoplazmatiĉnom retikulumu tela neurona i usmeravaju se u Goldţijev aparat. Nastalanascentana sinaptiĉka vezikula se transportuje brzim aksonskim transportom u nervnizavršetak, preko sistema mikrotubula. Razlikuje se sudbina neurotransmitera tj. da li suneurotransmiteri peptidni ili ne-peptidni. Sinaptiĉke vezikule sa peptidnimneurotransmiterima se, po dolasku u nervni završetak, kaĉe za aktinski citoskelet. Nepeptidnineurotransmiteri se sintetišu po dolasku u nervni završetak i kaĉe za aktinski citoskelet.Znaĉi, kada je sinaptiĉka vezikula zakaĉena za aktinski citosleket ona je zrela sinaptiĉkavezikula i spremna je za ukotljavanje i Ca2+ zavisnu egzocitozu.SLAJD 7.Za sintezu neuropeptidnih neurotransmitera koji se sintetišu u nervnom završetku neophodnisu vakuolarna protonska pumpa (vodoniĉna ATPaza) koja se nalazi u vezikuli i predstavljajedan sloj proteina vezikule koji se sintetiše na granuliranom ER i transporterneurotransmitera koji izmenjuje neurotransmitere i protone.Vakuolarna ATPaza ubacuje protone u vezikulu i na osnovu gradijenta koncentracije ali i pHkoji se stvara u vezikuli, aktivira se transporter neurotransmitera koji izmenjujeneurotransmitere za protone. I u principu ovi transmiteri za neurotransmitere su specifiĉni zarazliĉite neurotransmitere, npr. za Ach, monoamine, kateholamine, glutamat, GABA.Koji su to još proteini vezikule koji se nalaze i koji su sintetisani na granuliranom ER? To sutakozvani membranski proteini vezani za vezikulu (VAMPs) i prvi VAMP je SV2 (proteinsinaptiĉke vezikule 2). Što se tiĉe graĊe, vrlo liĉi na transportni protein, ima 12
  • 61. 61transmembranskih domena, ali to nije njegova uloga. On utiĉe na sinaptiĉku transmisiju i naprvom i sedmom transmembranskom domenu ima ATP-vezujuća mesta, što ukazuje na to dapovezuje da povezuje ćelijski metabolizam i egzocitozu.Sledeći VAMP je sinaptobrevin ili v-SNARE (v jer se nalazi na vezikuli, SNARE jer sureceptori za SNAP). Gap3 je GTPazni molekul, sinaptotagmin je senzor, odnosno receptor zakalcijum, koji registruje povećanje kalcijuma i okida egzocitozu neurotransmitera, a zasinaptofizin se smatra da formira poru tokom egzocitoze. Sinapsine fosforilišu cAMP-zavisne i CaM zavisne kinaze i time ih inhibiraju, pa se oni otkaĉinju od aktinskogcitoskeleta i takoĊe doprinose egzocitozi.SLAJD 8.Kada imamo sintetisane neurotransmitere i vezikulu koja sadrţi sve pomenute proteine (naslajdu 7), ukljuĉujući i sinaptobrevin i sinaptotagmin, ona se pribliţava membrani gde će seizvršiti fuzija sa membranom. Tu se nalaze dva proteina, SNAP25 i sintaksin. Sintaksin je t-SNARE, jer je t od target, odnosi se na ciljnu membranu, a što se tiĉe SNAP25, to je proteinod 25 kD Synaptosome-associated protein koji se vezuje za membranu pomoću palmitoilgrupe. U ovom trenutku je sintaksin vezan za n-Sec-1.n-Sec-1 na sledećoj slici disosuje od sintaksina i omogućuje da se formira komplekssintaksina i SNAP25 koji stiĉe mogućnost da se veţe za sinaptobrevin na vezikuli. Slobodnikrajevi ovih molekula se uvrću jedni oko drugih.Na sledećoj slici, izuzetno stabilan kompleks sintaksina, SNAP25 i sinaptobrevina se zateţe,vuĉe i pribliţava vezikulu membrani gde će doći do stvaranja pore i njene sa ciljnommembranom.Otvaraju se kanali za kalcijum, povećava se koncentracija kalcijuma koja regrutujesinaptotagmin (funkcioniše kao senzor za kalcijum). MeĊutim, fuzija se ne odigrava bezuĉešća GTP-vezujućeg proteina Rab3, koji se ukljuĉuje u komunikaciju izmeĊu SNAREproteina.Sledeći korak je vezivanje solubilne α-SNAP i ATPaze NSF koja hidrolizuje ATP i koristiovu energiju za rasturanje kompleksa, tako da opet imamo poĉetni ciklus. SNAP25 isintaksin su slobodni za narednu vezikulu, a sinaptobrevin i sinaptotagmin recikliraju tunovu vezikulu.SLAJD 9. Uklanjanje neurotransmitera iz sinapse je takoĊe vaţan proces jer ne sme da se dozvoli daneurotransmiter stoji u sinapsi i aktivira, bilo koji proces da je u pitanju. Neurotransmiteri sesintešu, preko specifiĉnih transportera se unose u vezikulu. Ovde je u pitanju vezikularniacetilholinski transporter koji ubacuje sintetisani acetilholin u nervnom završetku usinaptiĉku vezikulu. Zatim dolazi do egzocitoze zahvaljujući proteinima koje smo pominjali i
  • 62. 62neurotransmiter se vezuje za svoje receptore na postsinaptiĉkoj membrani, a moţe da se veţei za svoje receptore na presinaptiĉkoj membrani.Acetilholin uklanja Ach-esteraza koja ga razlaţe na holin i acetil i holin se opet preuzima upresinaptiĉki završetak pomoću Na-zavisnog transportera holina koji pripada familijitranspotera specifiĉnih za kateholamine, serotonin, GABA, glicin, a koji vrši kotransport saNa+ ili Cl- jonima. Druga grupa transpotera obavlja transport glutamata i aspartata zajednosa jonima Na+ i H+, a ponekad i K+.Što se tiĉe Ach-esteraze, postoji više podela, ali je ona podelila na dve forme: globularnu Gformu i asimetriĉnu A formu. Globularna forma je solubilna ili vezana preko GPI zamembranu i javlja se u vidu monomera, dimera ili tetramera, dok asimetriĉnu formu ĉini 1-3tetramera G forme i najpoznatija je najveća forma sa 3 tetramera koja se sastoji od 12subjedinica i nalazi se na neuro-mišićnoj sinapsi.SLAJD 10 I 11 Holinergiĉka sinapsaŠto se tiĉe farmakoliogije holinergiĉne sinapse, ĉućemo neke nove stvari, i podsetiti se nekihkoje smo već ĉuli. Na slajdu sa leve strane vidimo blikatore Na kanala, tetrodotoxin isaxitoxin, koji blokiraju depolarizacionu fazu AP i spreĉavaju oslobaĊanje Ach. Sa desnestrane vidimo Dendrotoxin, otrov crne mambe, koji blokira voltazno zavisne kanale za K, ipovećava oslobaĊanje Ach. Zatim, ω-konotoxin-to je otrov morskog puţa Conusgeographus, koji blokira N kanal za Ca. Šta je to beše N kanal? To je intermedijarni Cakanal, koji nema ni brzu ni sporu dinamiku otvaranja i zatvaranja. Sledeće ćemo pomenutineurotoxine bakterija Clostridium tetani i C. Botulinum. Neurotoxini B, D, F i G suneuropetidaze koje isecaju sinptobrevin. Peptidaze botulinskog toxina A i E seku SNAP-25,dok C1 seĉe syntaxin, ĉime spreĉavaju oslobaĊanje Ach. To su bili toxini koji utiĉu napresinaptiĉki završetak, i na neki naĉin spreĉavaju oslobaĊanje Ach. Sledeća meta našihlekova je Ach esteraza, enzim koji razlaţe Ach. Ireverzibilni inhibitori AchE su nervni gasDFP (diizopropilfluorofosfat) i insekticid malation. Oni reaguju sa Ser ostatkom enzima inepovratno ga menjaju povećavajući koliĉinu Ach u sinapsi. Na ovaj enzim utiĉu i nekiprirodni inhibitori, kao što je anatoxin, poreklom iz cijanobakterija Anabene, koji jeodgovoran za trovanje ţivotinja koje piju zagaĊenu vodu. Prirodni inhibitor je i fascikulinotrova mambe. Zatim imamo mikro konotoxin, takoĊe smo ga pominjali, to je otrov morskogpuţa koji blokira kanal za Na na skeleletno-mišićnim ćelijama, a ne deluje na kanale unervima. On deluje na nivou postsinaptiĉke strane. Stigli smo dakle do receptora. Blokatornikotinskog receptora je α-Tubocurarin, sasatojak je kurare otrova iz biljke Strychnos, kojimsu pripadnici plemena Amazona mazali strele. Vezuje se za 2 aktivaciona mesta α-subjedinice N1 AchR. Efekat kurare otrova poništava Ach, i biljni alkaloid Physostigmininhibira AchE i povećava koliĉinu Ach u sinapsi. To je znaĉi prirodni agonist AchR koji je u
  • 63. 63kompeticiji za vezivanje. Postoje još 2 toxina, α-bungarotoxin, otrov zmija Bungarusmulticinctus, koji obstuira mesto vezivanja Ach za AchR. Drugi je k-bungarotoxin, koji naisti naĉin deluje, samo na AchR u mozgu, a ne u mišićima. Šta je još interesantno, maloprepomenuti fizostigmin, razvijen je lek neostigmin, sintetiĉki blokator AchE. Koristi se kaoterapija kod miastenije gravis. Koji je mehanizam delovanja neostigmina-AchE dok razlaţeAch, javlja se uvek jedno intermedijerno jedinjenje, acetilovana AchE, meĊutim, kada seneostigmin veţe za AchE, on je blokira jer nastaje karbamil AchE, ona ostaje neka 4 h, takoda je inhibicija neostigminom reverzibilna, i kratko traje. MeĊutim, ovaj enzim moţe bitiireverzibilno blokiran, što se postiţe delovanjem DFP, koji u stvari predstavlja sarin bojniotrov, koji je pronaĊen u Nemaĉkoj 38, i dobio je naziv prema prvim slovima imenanauĉnika koji su ga otkrili. Dosta je korišćen u Drugom svetskom ratu, on je odgovaoran zaonu katastrofu u metrou u Tokiu kada je umrlo 15-ak ljudi. Znaĉi on je vrlo opasan jerireverzibilno blokira AchE. Što se tiĉe AchR, njegov prirodni agonist je Ach koji se vezujeza nikotin. Nikotinski receptori su odgovorni za zavisnost od duvana. Za ovaj receptor sevezuju još 2 jedinjenja, suicinilholin i karbamilholin, vrlo sliĉne strukture, 2 holina vezana zasukcinil grupom, odnosno za holin vezana karbamil grupa. Pošto su sliĉni Ach, na isti naĉinga aktiviraju, deluju na AchR, otvaraju ih. Ova 2 jedinjenja ne mogu da se uklanjaju pomoćuAchE. Ovaj sukcinilholin se dosta koristi u operacijama kao relaksant, dodaje se anestezijikao agens koji dovodi do relaxacije mišića, kod operacija kod kojih je potrebno da mišićibudu relaxirani.SLAJD 12 Bolesti vezane za holenergiĉku sinapsuVeć smo pominjali Lambert Eatonov sindrom, to je autoimunsko oboljenje, koje nastajeusled stvaranja antitela na presinaptiĉke kanale za Ca2+. Uglavnom pogaĊa mišićeekstremiteta.Myasthenia gravis (grĉ.mys - mišić, asthenia - slabost mišića) nastaje usled stvaranjaautoantitela na receptore za Ach, ali se ova autoantitijela stvaraju na AchR koji se nalazi natimusu. Najĉešće se javlja kod mlaĊih ţena zbog hiperplazije timusa, a kod starijihmuškaraca nastaje usled kancera timusa. Dakle, sve to što podstiĉe hiperplaziju timusa utiĉe ina stvaranje autoantitijela na AchR na timusu, kasnije se ova antitijela sele i na mišiće, ipostoje dvije forme ove bolesti u zavisnosti od tipa ciljnih mišića: jedna ciljna grupa suekstraokularni mišići, druga ciljna grupa su skeletni mišići.Antitela najĉešće na MIR region α subjedinice. Sad je jasno zbog ĉega se neostigmin koristiu terapiji ove bolesti. Sledeće oboljenje vezano za holinergiĉku sinapsu je Kongenitalni miasteničnisindrom - nasledna bolest koju karakteriše poremećaj zatvaranja AChR zbog taĉkaste
  • 64. 64mutacije koja dovodi do zamene Thr sa Pro na 264. mjestu ε subjedinice (u M2 domenu kojiformira poru).Maligna hipertermija nasledni poremećaj 1/10.000-50.000 kod kojih udisanje anestetika,kao što je halotan dovodi do otvaranja, a zatim potpune blokade nikotinskog AChR što semanifestuje mišićnom rigidnošću, hipertermijom i tahimetabolizmom. Simptomi proistiĉu izprekomerne ATP hidrolize. Bolest je rezultat mutacije u genu za receptor za Ca2+ na SR(RYR1- rijanodinski receptor).SLAJD 13 Farmakologija monoaminergiĉ ke sinapseKada govorimo o ovim sinapsama najprije govorimo o dopaminu, noradrenalinu iserotoninu. Dopamin i noradrenalin su kateholamini, nastaju iz piridina pod dejstvom enzimatirozin-hidroksilaze. Prošli put sam pominjala Tyr-hidoksilazu kao limitirajući enzim zasintezu kateholamina, u kom kontekstu? CaM zavisna kinaza II aktivira limitirajući enzimTyr-hidoksilazu koja pretvara tirozin u L-DOPU. DOPA dekarboksilaza dovodi do stvaranjadopamina, a enzim dopamin β-hidroksilaza (DBH) dopamin pretvara u noradrenalin. Oni sepakuju u vezikule, a s druge strane preko triptofana pod dejstvom triptofan hidroksilazenastaje 5-hidroksitriptofan koji se prevodi u serotonin takoĊe vaţan neurotransmiter.Poremećaji nivoa ova tri transmitera naroĉito u limbiĉkom sistemu, prefrontalnom korteksu igornjem dijelu moţdanog stabla dovode do poremećaja. Limbiĉki sistem utiĉe na ponašanje,naroĉito na ponašanje u smislu agresivnosti, straha, utiĉe na seksualne f-je i procesememorisanja. Ĉine ga hipokampus, bademasta jedra koja su preko fornixa povezana sahipotalamusom (SLAJD 14). Smanjenje pomenutih transmitera u sinapsi dovodi dodepresije.Depresija je bolest koja je danas veoma raširena u svijetu. Statistika pokazuje da 15-17miliona Amerikanaca pati od ove bolesti. Ĉešća je kod ţena nego kod muškaraca, starosti od25-45 godina, i što je najgore ta granica je pomjerena, dešava se da se javlja i kod djece od5te godine. Simptomi depresije su potpuno odsustvo ţelje za ţivotom, odsustvo ţelje za bilokakvim aktivnostima, hiperfagija ili afagija (prekomjereno uzimanje hrane ili odsustvo ţeljeza hranom), prekomjereno spavanje ili odsustvo potrebe za snom (SLAJD 15). Kakosmanjenje pomenutih transmitera u sinapsi dovodi do pojave depresije veoma je razvijenaindustrija ljekova koji se koriste u terapiji ove bolesti. 50-ih godina prošlog vijeka prvakombinacija ljekova zasnivala se na inhibiciji MAO (monoamonoksidaza). MAO je enzimkoji vrši oksidativnu dezaminaciju kateholamina, razlaţe ih, a pošto je cilj da saĉuvamokateholamine u sinapsi vidjećemo kasnije zašto je promjenjena generacija ovih ljekova kaošto je npr. selagilin. Poslije nekih 10-ak godina razvija se nova grupa ljekova – tricikliĉniantidepresivi (TCAs). Oni su selektivni inhibitori preuzimanja noradrenalina, koji djeluju naNET (transporter za noradrenalin). Prosto blokiraju transporter, spreĉavaju preuzimanje
  • 65. 65noradrenalina i tako noradrenalin ostaje u sinapsi. Najnovija generacija ljekova - selektivniinhibitori preuzimanja serotonina (SSRI). Dva lijeka na kojima Amerikanci šive su Prozak iZoloft koji djeluju na transporter za serotonin, spreĉavaju njegovo preuzimanje, i Ser ostaje unormalnoj koliĉini u sinapsi (SLAJD 16 i 17).SLAJD 18: Da vidimo sada zašto su se inhibitori monoaminooksidaze pokazali kao neefikasni lekovi.Monoaminooksidaza postoji u dve forme: A i B. MAO-A vrši oksidativnu deaminacijuserotonina, noradrenalina i adrenalina, dok oksidativnu deaminaciju dopamina podjednakoefikasno vrše obe forme, i MAO-A i B. O ovom enzimu priĉamo jer je niz poremećaja ibolesti vezano za njega. 1993. Bruner je opisao sindrom koji je po njenu I nazvanBRUNNEROV SINDROM. To je retko nasledno oboljenje koje nastaje usled mutacije genaza MAO-A, i manifestuje se blagom mentalnom retardacijom (i poznate su u svetu ĉitaveporodice koje nose ovaj fenotip), problematiĉnim agresivnim ponašanjem, hiperseksualnošćui sve je to uslovljeno povećanjem dopamina, serotonina i adrenalina u mozgu-naruĉito ulimbiĉkom sistemu koji je odgovoran I za seksualnost, agresivno ponašanje… Zatim su2002.god raĊene velike studije na zlostavljanoj deci, i ustanovljeno je da deca koja imajunisku MAO aktivnost razvijaju antisocijalno ponašanje za razliku od dece kod kojih je ovajenzim normalno aktivniji. Dalje se ustanovilo da je niska aktivnost MAO u mogućoj je vezisa shizofrenijom (grĉ. skhizein - podeliti; phrēn - pamet), jer ta niska aktivnost podrazumevapovećanje dopamina i time se povećava njegovo delovanje na D2 receptore i dovodi dosimptoma ove bolesti: halucinacija, paranoja, bizarnih deluzija, dezorganizovanih misli igovora, znaĉajne socijalne i poslovne disfunkcije. Zatim, visoka aktivnost MAO moţe dadovede do simptoma MDD depresije jer se na taj naĉin uklanjaju kateholamini. MeĊutim,MAO inhibitori su napušteni jer oni mogu dovesti do serotoninskog sindroma: donagomilavanja serotonina koji dovodi do hipertenzije, hipertermije, drhtanja, znojenja.TakoĊe je dokazano i da pušenje dovodi do deplecije MAO- još jedan razlog da se ostavecigare. Particular attention has been paid to the function of dopamine in the mesolimbicpathway of the brain. This focus largely resulted from the accidental finding thatphenothiazine drugs, which block dopamine function, could reduce psychotic symptoms. It isalso supported by the fact that amphetamines, which trigger the release of dopamine, mayexacerbate the psychotic symptoms in schizophrenia.[48] The influential dopaminehypothesis of schizophrenia proposed that excessive activation of D2 receptors was the causeof (the positive symptoms of) schizophrenia. Although postulated for about 20 years basedon the D2 blockade effect common to all antipsychotics, it was not until the mid-1990s thatPET and SPET imaging studies provided supporting evidence. The dopamine hypothesis isnow thought to be simplistic, partly because newer antipsychotic medication (atypical
  • 66. 66antipsychotic medication) can be just as effective as older medication (typical antipsychoticmedication), but also affects serotonin function and may have slightly less of a dopamineblocking effect.[49] Interest has also focused on the neurotransmitter glutamate and thereduced function of the NMDA glutamate receptor in schizophrenia, largely because of theabnormally low levels of glutamate receptors found in the postmortem brains of thosediagnosed with schizophrenia,[50] and the discovery that glutamate-blocking drugs such asphencyclidine and ketamine can mimic the symptoms and cognitive problems associatedwith the condition.[51] Reduced glutamate function is linked to poor performance on testsrequiring frontal lobe and hippocampal function, and glutamate can affect dopaminefunction, both of which have been implicated in schizophrenia, have suggested an importantmediating (and possibly causal) role of glutamate pathways in the condition.[52] But positivesymptoms fail to respond to glutamatergic medication.[53] A common side effect associatedwith schizo-affective patients, known as akathisia (mistaken for schizophrenic symptoms),was found to be associated with increased levels of norepinephrine.[54] Serotoninski sindrom Symptom onset is usually rapid, often occurring within minutes.Serotonin syndrome encompasses a wide range of clinical findings. Mild symptoms mayonly consist of increased heart rate, shivering, sweating, dilated pupils, myoclonus(intermittent tremor or twitching), as well as overresponsive reflexes.[1] Moderateintoxication includes additional abnormalities such as hyperactive bowel sounds, high bloodpressure and hyperthermia; a temperature as high as 40 °C (104 °F) is common in moderateintoxication. The overactive reflexes and clonus in moderate cases may be greater in thelower limbs than in the upper limbs. Mental status changes include hypervigilance andagitation.[1] Severe symptoms include severe increases in heart rate and blood pressure thatmay lead to shock. Temperature may rise to above 41.1 °C (106.0 °F) in life-threateningcases. Other abnormalities include metabolic acidosis, rhabdomyolysis, seizures, renalfailure, and disseminated intravascular coagulation; these effects usually arise as aconsequence of hyperthermia.[1][3] The symptoms are often described as a clinical triad ofabnormalities:[1][5] ReceptoriSLAJD 20: Receptor za acetilholinKrećemo od receptora za acetilholin. Postoje dve vrste: nikotinski i muskarinski,pri ĉemujedni jonotropni a drugi metabotropni, tj. jedni su jonski kanali a drugi spregnuti sa Gproteinom. U mozgu ima 10 do 100 puta više muskarinskih nego nikotinskih receptora. Toje neurotransmiter nervno mišićne sinapse i autonomnog nervnog sistema. Ustanovljeno jeda postoje dva velika holinergiĉka sistema mozga, i to su bazalni kompleks prednjeg mozga(koji inerviše hipokampus i koru-neokorteks) i pontomesencephalotegmentalni kompleks
  • 67. 67(koji inerviše dorzalni talamus i deo prednjeg mozga i ukljuĉen je u smenu budnog stanja isna i u procese uĉenja). Što se tiĉe jonotropnih-u pitanju su jonski kanali od 5 subjedinica:2α, β,γ,δ. Ove subjedinice su visoko konzervirane, i ĉak je 90% njihova sliĉnost kodelektriĉnog organa Torpedo i fetusa sisara, dok kod adultnog receptora dolazi do zamene γsubjedinice sa ε subjedinicom i njihov receptor se sastoji od 2α, β,ε,δ subjedinica. Svaku odovih 5 subjedinica ĉine 4 razliĉita transmembranska segmenta M1, M2, M3, M4.Ekstracelularni amino kraj M1 domena je odgovoran za vezivanje acetilholina i svaka αsubjedinica veţe po jedan acetilholin. M2 domen formira poru i utiĉe na promet Na+,odnosno K+. α subjedinica je kodirana sa 8 gena- AChRC skeletnog mišića kodirana je α1genom, dok geni α2-α8 kodiraju α subjedinice eksprimirane u nervnom tkivu. Samo produktigena α1, α7 i α8 vezuju α-bungarotoksin. β subjedinicu kodiraju 4 gena- AChRC skeletnogmišića kodira β1 gen, dok β2, β3 i β4 geni kodiraju tri izoforme neurona.SLAJD21: Nikotinski receptor Nikotinski receptori su karakteristiĉni i za autonomni nervni sistem. Nikotinski receptoripostganglijskih neuronai simpatiĉkog NS i parasimpatiĉkog nervnog sistema su N2 tipa, zarazliku od N1 receptora nervno-mišićne sinapse. I jedan I drugi nikotinski receptor seaktiviraju nikotinom I ACh, ali se samo N1 blokira kurare, na koji je N2 tip otporan. DvaAch se vezuju za po jednuα subjedinicu nikotinskih N2 receptora, što dovodi do otvaranjakanala, ulaze Na+ i K+( s tim što je dominantan ulazak Na+) I dolazi do depolarizacije Igeneze akcionog potencijala. Na krajevima postganglijskih neurona PSNS oslobaĊa se ACh, koji se vezuje za M2muskarinske receptore ne efektornim ćelijama I dolazi do odvajanja α od βγ subjedinice, a βγsubjedinica otvara GIRK K+ kanale što dovodi do hiperpolarizacije i BRADIKARDIJE.Muskarinski receptori se aktiviraju muskarinom, alkaloidom otrovnih gljiva I po njemu sudobili ime. Prvi put je izolovan još 1869. god. iz gljive Amanita muscaria. Pet razliĉitih genakodira pet subtipova muskarinskih receptora M1 – M5 sve ih podjenako aktiviraju muskarin iACh, a blokira atropin, pa su klasifikovani u odnosu na graĊu: treća citosolna pelja je sliĉnakod M1, M3 i M5 koji su spregnuti sa Gαq/11 subjedinicom, dok su M2 i M4 imaju sliĉnucitosolnu pelju i spregnuti su sa Gαi/0 subjedinicom.SLIDE 22:Tako isto ova priĉa, dve vrste muskarinskih receptora, spregnuti sa G proteinom, imaju 7transmembranskih domena i sada M1,M3, M5 muskarinski receptori aktiviraju fosfolipazu Cšto znaĉi IP3 i DAG, aktiviraju fosfolipazu A2, kanale za kalijum i kalcijum, fosfolipazu d,protein kinaze sa tirozin kinaznom aktivnošću. M2, M4, kuplovani su sa Gαi/0 aktiviraju GIRKkanale, inhibiraju AC i voltaţno zavisne kanale za Ca 2+. Sada da vidimo kako to rade M2 iM4. Dakle preko Gαi/0 subjedinice inaktiviraju katalitiĉku subjedinicu adenilat ciklaze što
  • 68. 68znaĉi da dolazi do smanjenja cAMP, ali i s druge strane se podstiĉe razgradnja cAMP gdjefosfodiesteraza, PDE2, preko cGMP-a, dakle cGMP podstiĉe PDE2, a koja s druge stranepovecava razgradnju cAMP. Što se tiĉe M1,M3, M5 receptora, oni svoju aktivnost ostavrujupreko Gq11, aktivira se fosfolipaza C koja razlaţe fosfatidin inozitol bifosfat, PIP 2, koji bitrebao da je u membrani i da ostaje u njoj, ovo je samo šema. IP3 sada dovodi do oslobaĊanjakalcijuma, do aktiviranja kalmodulina i sada kalmodulin zavisne kinaze aktiviraju azot oksidsintazu koja daje azot oksid koji pomaţe drugim receptorima i stvara PDE2. DAG aktiviraprotein kinazu C, PKC, a kalcijum takoĊe aktivira kalmodulin zavisnu kinazu i dovodi doprocesa egzocitoze. Koji bi to bili procesi? Egzocitoza na krajevima parasimpatiĉkihvlakana, Ach se oslobaĊa, koja prvenstveno regulišu varenje, egzocitoza granula sapankreasnim enzimima. Zatim Ca2+ takoĊe dovodi preko kalmodulina do aktivacije kinazelakog lanca miozina koja omogućava izaziva kontrakciju, a ova kinaza lakog lanca miozinapreko RhoA, mali GTP- vezujući protein, aktivira Rho kinazu koja takoĊe aktivira MLCK,kinazu lakog lanca miozina koja dovodi do kontrakcije glatke muskulature, a rekli smo da jeparasimpatiĉki sistem odgovoran i za to, uopste podstiĉe varenje.SLIDE 23: Receptori za glutamatGlutamat je izuzetno vaţan neurotransmiter u mozgu i izmeĊu ostalog uĉestvuje u prenosuosećaja bola, stvaranju memorije, neurotoksiĉnosti, umami ukusa, koji potiĉe odaminokiselina. Sliĉno Ach djeluje preko dve vrste receptora: metabotropnog i jonotropnogreceptora. Ovi metabotropni su takoĊe spregnuti sa proteinom G, saĉinjeni od 7transmembranskih domena i postoji 8 razliĉitih metabotropnih receptora koji se oznaĉavajum kao metabotropni, glu-glutamat i od 1 do 8. Grupisani su u zavisnosti od graĊe, odmorfologije, mehanizma transdukcije signala, ali druga i treća grupa su u principupresinaptiĉki receptori, uglavnom autoreceptori koji blokiraju oslobaĊanje glutamata, a prvagrupa gdje spadaju 1 i 5 su postsinaptiĉki receptori preko kojih glutamat ostvaruje svojreceptorni efekat.SLIDE 24:Drugi moţda vaţniji receptori su jonotropni receptori, predstavljaju kanale i u zavisnosti odagonista koji se vezuju za ove receptore dele se na: NMDA, AMPA i receptore za kainat.NMDA- N-metil-D-aspartat, AMPA- α-amino-3-hidroksi-5-metil 4-izoksazol propionat,receptor za kainat- kainska kiselina i domoiĉna kiselina se vezuju za njega. Razliĉiti su iblokatori, pa se za AMPA vezuje grupa jednih benzodiazepina, za AMPA i receptore zakainat se vezuje grupa cyano-7-nitroquinoxaline-2,3dione, dok se za NMDA vezuje APV -2-amino-5-fosfovaleriat. Prikaz znaĉaja evolucije jonotropnih receptora za glutamat. Svi sutetrameri, dakle svaka subjedinica se sastoji iz 3 transmembranska domena, imaju velikiamino završetak, ekstraćelijski, koji je odgovoran za vezivanje liganda odnosno glutamata,
  • 69. 69zatim sledi prvi transmembranski domen, izmeĊu prvog i drugog transmembranskog domenanalazi se velika petlja koja u stvari predstavlja kanal pore koja oiviĉava poru i tako uĉestvujeu transportu jona i na kraju treći transmembranski domen.Da bi se NMDA receptori aktivirali neophodan je ligand glutamat, glicin, postoji alosteriĉnomjesto za vezivanje drugog neurotransmitera dakle glicina i neophodno je depolarizacija. Nakoji naĉin funkcionišu receptori za glutamat?SLIDE 25:U većini sinapsi mozga ova dva receptora koegzistiraju, AMPA i NMDA receptori. NMDAreceptori su voltaţno zavisni i ligand zavisni. Voltaţno su zavisni zato što na potencijalumembrane od -70mV su receptori blokirani Mg2+, dakle glutamat na ovom potencijalu nemoţe da se veţe za NMDA receptore već se vezuje za AMPA receptore, koji su voltaţnonezavisni. Vezivanje glutamata za AMPA receptore dovodi otvaranja kanala kroz koje ulaziNa+ i izlazi K+ i dolazi do depolarizacije. Tada nastala depolarizacija dovodi do toga da seMg2+ odvaja od NMDA receptora i sada ovi kanali se otvaraju i ulazi Ca2+. Tako da se sadapovećava koncentracija u postsinaptiĉkoj ćeliji. Dakle, AMPA su odgovorni za brzudepolarizaciju dok su NMDA odgovorni za sporu depolarizaciju i uglavnom sukarakteristiĉni za hipokampus i koru prednjeg mozga. Što se tiĉe receptora za kainat, onimogu biti presinaptiĉki i postsinaptiĉki, eksprimirani svuda po CNS-u, naroĉitohipokampusu i cerebelumu. Verovatno imaju ulogu u transmisiji osećaja bola.SLIDE 26 i SLIDE 27 – Profesorka je preskoĉila.U pitanju su dugotrajna sinaptiĉka potencijacija i NO.SLIDE 28 Sinapse mogu biti ekscitatorne, inhibitorne i modulatorne. Dat je primer sinapse koju gradepiramidalni neuroni uĉestvuju u formiranju kortiko-spinalnog trakta. Piramidalni neuron koreostvaruje ekscitatornu sinapsu sa aksonom neurona lateralnog kolenastog jedra talamusa,inhibitornu sa interneuronom i modulatornu sa aksonom neurona locus coeruleusa (jedrokoje sadrţi najveću koliĉinu noradrenergiĉkih neurona u mozgu). Ekscitatorne sinapse seostvaruju posredstvom glutamata i aspartata. Inhibitorne sinapse delovanjem GABA iglicina, a modulatorne sinapse u modulaciji odgovora, odnosno u regulaciji sinapse odgovarana noradrenalin.Ekscitatorne sinapse→glutamat, aspartat→EPSP (ekscitatorni postsinaptiĉki potencijal) -kanal za Na+Inhibitorne sinapse prisutne samo u mozgu→ GABA, Gly→IPSP - kanal za Cl-Modulatorne sinapse→noradrenalin, koji deluje na nadraţenu nervnu ćeliju i moduliše njenodgovor na dati nadraţaj - kanal za K+
  • 70. 70SLIDE 29: Receptori za GABAGABA je najzastupljeniji inhibitorni neurotransmiter, dakle odgovoran za sve inhibitorneprocese u mozgu, a osim njega tu je i kao drugi inhibitorni receptor i Gly. I ovde se javljajujonotropni i metabotropni receptori. GABAa i GABAC i receptori za drugi inhibitornineurotransmiter - Gly su jonotropni tj. kanali za Cl- , a GABAB je metabotropni, receptorspregnut sa proteinom G, koji dovodi do otvaranja kanala za K+ i zatvaranja kanala za Ca2+.Jonotropni receptori su heteropentameri, dakle sastoje se od 5 razliĉitih subjedinica, a svakasubjedinica se sastoji iz 4 transmembranska domena, što znaĉi da spada u familiju receptorakao i nikotinski. Ovaj receptor je specifiĉan jer ova subjedinica vezuje razliĉite supstance.Sinaptiĉka inhibicija mora biti precizno regulisana, jer ukoliko se ne ostvaruje uodgovarajućem nivou, ukoliko je prekomerna, moţe da dovede do gubitka svesti i kome, a ukoliko je premala inhibicija moţe da dovede npr. do epileptiĉnih napada. Inhibicija je dakleprecizno regulisana graĊom samog receptora.Prva subjedinica vezuje GABA, a druga subjedinica vezuje benzodiazepine kao što su nprsredstva za smirenje i valijum. Vezivanje materija kao što su benzodiazepini samo po sebi neutiĉe na receptor, ali kada je GABA vezana za receptor ova grupa jedinjenja povećavafrekvencu otvaranja kanala za hlor. Treća subjedinica vezuje barbiturate, kao što je sedativ fenobarbitol, koji sliĉnobenzodiazepinima ne deluju na ovaj receptor sami po sebi , ali kada je GABA vezana zareceptor povećavaju duţinu otvaranja kanala za hlor. Još uvek nisu pronaĊeni prirodniligandi, ali na osnovu ĉinjenice da se supstance kao benzodiazepini i barbiturati vezuju zaodreĊena mesta na receptoru, pretpostavlja se da u organizmu postoje prirodne endogenesupstance koje imaju sliĉno dejstvo i koje upravo rade na preciznoj regulaciji otvaranja izatvaranja jonskog kanala za hlor.Ĉetvrta subjedinica odgovara na prirodne modulatore ovog receptora, a to su steroidi. Dakleto je steroid vezujuće mesto za koje se vezuju metaboliti i hormoni kao što su progesteron,kortikosteron i testosteron. TakoĊe utiĉe na frekvencu i duţinu otvaranja kanala za hlor. Petasubjedinica ima mesto za fosforilaciju.
  • 71. 71 Transdukcija senzornih signala Mikrookruţenje neurona Mikrookruţenje neurona je pre svega ekstraćelijska teĉnost mozga (BECF, brainextracelllular fluid, EĆT), ali i kapilari, glija ćelije i susedni neuroni. Najveći uticaj na neuroneima EĆT, ali i neuroni utiĉu na sastav EĆT. Mozak zauzima samo 2% telesne mase, ali ĉak 15% minutnog volumena odlazi u mozak,jer je to vrlo metabolićki aktivno tkivo koje troši ĉak 20% O2 i ĉak 50% glukoze. Interesantno jeda 50% energije odlazi na rad Na-K-ATPaze i prekid protoka krvi dovodi do deplecije ATP-a, ikako neuroni ne mogu da obavljaju svoju funkciju u takvim uslovima, dolazi do gubitka svestiposle 10 sekundi, a posle 5 minuta dolazi do oštećenja na neuronima.
  • 72. 72Krvno-moţdana barijera (KMB) štiti EĆT od uticaja sastojaka krvi, a cerebrospinalna teĉnost(CSF, CST) utiĉe na sastav EĆT. Gljia ćelije takoĊe utiĉu na funkcionisanje neurona. Cerebrospinalna teĉnost Oko 500 ml CSF dnevno stvaraju horoidni pleksusi, prisutni u sve 4 komore. CST imaoko 150ml u svakom trenutku, od toga 30ml u komorama, 120ml u subarahnoidnom prostoru– on se nalazi se izmedju arahnoidee i pie mater. CST cirkuliše komorama, i preko tri otvora IVkomore prelazi u subarahnoidni prostor, odakle se apsorbuje u venski sistem u gornjemsagitalnom sinusu. Dakle, moţete videti da ceo mozak zapravo pliva u CST (odnosno njome jeobavijen) i na taj naĉin smanjuje se subjektivni osećaj teţine mozga (da nosimo 1.5 kg u glavi), asa druge strane graĊa subarahnoidni prostor uslovljava da on zapravo ima ulogu ? (onemogućavapotrese, eliminiše smetnje koje bi mogle da izazovu promene poloţaja glave u protoru). //RaĊeno je istraţivanje gde je dokazano da ljudi kojima je smanjena koliĉina CST, osećaju bol prisvakom pokretu glave // Kako se vrši apsorpcija? Arahnoidea formira evaginacije koje se nazivaju arahnoidnegranulacije (ukoliko su visoke oko 1 cm) ili arahnoidne resice/vili (ukoliko je njihov promer umikrometrima). Dakle, na ovom mestu se vrši apsorpcija i to procesom transcitoze – formiraju sevakuole sa CST i ona se apsorbuje iz subarahnoidnog prostora u venozni sinus. Sila koja ovoomogućava je povećanje pritiska CST. Kada se on poveća (iznad 70mm vodenog stuba) dolazido aktiviranja transcitoze. Apsorpcija je proporcionalna cerebrospinalnom pritisku, a taj pritisakje jednak intrakranijalnom pritisku. Ako doĊe do zapaljenja arahnoidee, remeti se proces apsorpcije CST, povećava sepritisak CST. Ovo rezultira hidrocefalijom (nagomilavanje teĉnosti u mozgu) koja se manifestujedemencijom, poremećenim hodom i nevoljnim mokrenjem. CST i EĆT imaju sliĉan sastav (u većem delu mozga), jer komuniciraju preko pia mater iependimalnih ćelija (ćelije koje oblaţu zidove komora). Komunikacija se odvija prekopukotinastih veza – omogućen je transport jona i makromolekula paracelularno. Ependimalnećelije apsorbuju metabolite, signalne molekule, produkte razlaganje neurotransmitera (serotonina,dopamina) koje CST odnosi. Ĉesto se nazivaju „bubrezima mozga“.Kako se stvara CST?
  • 73. 73 Stvaraju je ćelije horoidnih pleksusa – specijalizovane horoidne ćelije (zapravo izmenjeneependimalne ĉelije) koje imaju cilije koje se projektuju u komore. Horoidni kapilar se snabdevakrvlju preko horoidne arterije i protok krvi kroz horoidne pleksuse je 10 puta veći nego u ostalimdelovima mozga. Horoidne ćelije u potpunosti izoluju CST od kapilara, koji nisu deo krvnomoţdane barijere. Sastav cerebrospinalne teĉnosti se razlikuje od sastava krvne plazme. CST nijeultrafiltrat krvi. Sadrţi manje K+, AK i ne sadrţi proteine. Homeostaza K+, H+, HCO3-, Mg2+,Ca2+ je strogo kontrolisana. Transport i stvaranje CST Prvi korak je ultrafiltracija plazme kojom nastaje EĆT. Drugi korak podrazumeva dahoroidne ćelije stvaraju i aktivno sekretuju CST u komore. Ovaj proces je potpuno atipičan u poreĊenju sa svim drugim epitelnim ćelijama, zašto?Na-K-ATPaza na ovim ćelijama je smeštena na apikalnoj strani, a ne na bazolateralnoj. Njenimradom dolazi do aktivnog izbacivanja Na+ van horoidne ćelije i da je to tako dokazuje ĉinjenicada blokator Na-K-ATPaze (ouabain) dovodi do poremećaja stvaranja CST. Budući da izbacujeNa+, stvara se gradijent i ostavlja nisku koncentraciju u ćeliji - na bazolateralnom delu se nalazeNKCC2 transporter (ubacuje Na, K i 2 Cl) i on vraća Na+ u ćeliju. Blokiranjem NKCC2furosemidom se inhibira stvaranje CST, što dokazuje da i ovaj transporter ima znaĉajnu ulogu uastvaranju CST. Osim toga, ukljuĉen je Na-H izmenjivaĉ, i na taj se takoĊe ubacuje Na+ u ćeliju.Limitirajući faktor za ovaj izmenjivaĉ su protoni koji će snabdeti ovaj izmenjivaĉ. Izvor je enzimkarbo-anhidraza koja moţe biti blokirana acetazolamidom, što dovodi do inhibicije stvaranjeCST. Hlor se transportuje u ćeliju zahvaljujući NKCC2, kao i zahvaljujući hloridnom-bikarbonatnom izmenjivaĉu koji se takoĊe nalazi na bazolateratlnoj strain membrane. Sa drugestrane, izbacivanje hlora iz ćelije se vrši uz pomoć K-Cl kontransportera i putem specifiĉnogkanala za Cl- koji sprovodi i bikarbonate. Bikarbonati su neophodni za neutralizaciju kiselinakoje stvaraju neuroni, pa se bikarbonati koje stvara karbo-anhidraza se izbacuju putem ovogkanala. Dakle, treba da zapamtimo da je raspored transportera, kao i redosled događajadrugaĉiji u odnosu na druge epitelne ćelije. Na ovaj naĉin je opisano kako horoidne ćelijesekretuju CST, a već je spomenuto da one apsorbuju razliĉite metabolite, pre svega produktemetabolizma neurotransmitera.
  • 74. 74 Posredstvom EĆT mozga neuroni dobijaju O2, glukozu, AK, vitamini, a produktimetabolizma neurotramsmitera napuštaju mozak. Putem ekstraćelijske teĉnosti mozga neuronima se dopremaju kiseonik, glukoza,aminokiseline, vitamini, a produkti metabolizma (razgradnje neurotransmitera) napuštaju mozak.Osim toga, vanćelijska teĉnost mozga je jedno vaţno sredstvo komunikacije izmeĊu ćelija, jerĉesto se dešava da neurotransmiter utekne iz sinapse i dospe u vanćelijsku teĉnost mozga i na tajnaĉin moţe da deluje i na druge sinapse tj. postsinaptiĉke neurone drugih neurotransmitera.Zatim, u ekstraćelijsku teĉnost mozga se oslobaĊaju i neki neurotrofini, kao što je neurotrofiĉnifaktor poreklom iz mozga (BDNF), cilijarni neurotrofiĉni faktor (CNTF), neurotrofin-3 itd. I još jednom da ponovim, sastav vanćelijske teĉnosti mozga i cerebrospinalne teĉnosti jeisti. Krvno-moţdana barijera odvaja ove dve teĉnosti od uticaja bilo kakvih supstanci poreklomiz krvi, što je jako vaţno. Navela je samo tri primera zbog ĉega je vaţno da CSF i BECF budupotpuno izolovane od krvi. Da to nije tako, bilo bi dovoljno da posle proteinskog obroka (jednogdobrog bifteka ) aminokisleine triptofan i tirozin postanu odmah supstrat za stvaranjeneurotransmitera, koji bi se nekontrolisano oslobodili u mozgu i doveli do haosa ufunkcionisanju nervnih i glija ćelija. S druge strane, posle fiziĉke aktivnosti (npr. posle trkemaratonaca) nagomilavanje H+ i K+ bi u tom trenutku znaĉajno snizilo IQ sportiste, naravno, tobi bilo tranzitorno. Zatim, razliĉiti hormoni, joni, citokini koji cirkulišu putem krvi itekako biremetili funkciju neurona i glija ćelija. Ništa od toga ne sme da se dozvoli i zbog toga postojikrvno-moţdana barijera. Njeno postojanje je utvrĊeno još 1885.godine. Erlih je ubrizgavaorazliĉite boje i shvatio da sva meka tkiva upijaju te boje, osim mozga što ga je navelo na pomisaoda u mozgu postoji nešto što ne dozvoljava propuštanje materija iz krvi. Danas se zna da svikiĉmenjaci, pa ĉak i neki beskiĉmenjaci poseduju k-m barijeru. Ona ima, s jedne strane,pozitivnu ulogu, a sa druge strane omogućava selektivni transport. Na slici je prikazana klasiĉna ćelija i klasiĉni kapilar i moţdani kapilar (da bi se videlarazlika). Da bi k-m barijera predstavljala fiziĉku barijeru kod ovog kapilara ne postoje pore(neuroklasiĉni kapilar). Šta beše ima ako je u pitanju kontinurani kapilar? MeĊućelijske pukotine.A ukoliko je u pitanju fenestrirani? Fenestre, odnosno otvorĉiće. Kao što vidimo, kapilari nemajunikakve otvore, štaviše imaju specifiĉne tesne veze, koje su postavljene ukoso i nazivaju sezonula occludens. Ona je potpuno drugaĉije graĊe od bilo kakve druge tesne veze na koju smo
  • 75. 75navikli. Nema paracelularnog transporta, znaĉi ne postoji transport kroz tesne veze. S drugestrane, ne postoji transcitoza, nemoguć je protok materija putem transcitoze i formiranjavezikula. Ono što je drugaĉije, to je da su endotelne ćelije kapilara mozga izuzetno bogatemitohondrijama u poreĊenju sa drugim endotelnim ćelijama. Zatim, tu se nalaze i pericite. Imajudeblju bazalnu laminu u poreĊenju sa drugim kapilarima. I astrocitni završeci (stopalca)predstavljaju, s jedne strane, fiziĉku barijeru, ali sa druge strane bez njih ne bi bilo mogućeformiranje tesnih veza. Zahvaljujući astrocitama formiraju se ove specifiĉne tesne veze, odnosno,zonula occludens i, takoĊe, omogućavaju razmenu materija sa krvlju. Šta je to što prolazi k-m barijeru? To su lipofilne supstance (CO2,O2, alkohol, neki lekovi,heroin, kofein, nikotin). K-m barijera propušta vodu zahvaljujući akvaporinima 4 i 8, ĉija seekspresija znaĉajno povećava kada se promeni osmolarnost plazme. Ne propuštaju se K+ i Mg+.K+ ima jako malo u CSF-u. Ne propušta se ni bilirubin. Ono što je karakteristiĉno je da endotelne ćelije sadrţe neke enzime, kao što su enzimikoji razgraĊuju neurotransmitere (npr. monoamino oksidaza -MAO), enkefaline, supstanciju Pitd. Upravo zbog toga što postoje ti enzimi dopamin ne moţe da se koristi kao sredstvo terapijeParkinsonove bolesti, jer u trenutku kada pokuša da proĊe endotel MAO ga razgraĊuje. Zbogtoga se L-DOPA, prekursor dopamina, koristi kao terapetuk za minimalizovanje simptomaParkinsonove bolesti. Na slici je endotelna ćelija sa specifiĉnim tesnim vezama (zonula occludens). Rekli smoda se kroz endotel ovakvih kapilara odvija transport lipofilnih supstanci (gore pomenutih).Transport glukoze, aminokiselina, organskih anjona, prekursora nukleinskih kiselina se odvijapomoću dvosmernih transportera koji imaju mogućnost da transportuju pobrojane nutrijente, a sdruge strane imaju mogućnost da transportuju produkte metabolizma. Šta se nalazi na membraniendotelnih ćelija koje ulaze u sastav k-m barijere? Neizbeţna Na+/K+ ATPaza, NHE (Na+/H+izmenjivaĉ) na bazolateralnoj membrani, a na apikalnoj membrani se nalazi epitelni kanal za Na+osetljiv na amilorid i NKCC2. S tim da je jako vaţno da ovi transporteri uĉestvuju u strogojregulaciji pH, naroĉito NHE i Na+/K+ ATPaza koja reguliše i odrţava nizak nivo K+ uvanćelijskoj teĉnosti mozga. Sledeća sliĉna slika- tesna veza, bazalna lamina, završetak astrocita.Ovde su navedeni transporteri koji omogućavaju transport: glukoze (GLUT1), velikih neutralnihaminokiselina (LAT1), ekscitatornih aminokiselina (EAAT1-3, E-ekscitatorne AA-aminoacid).
  • 76. 76Na endotelnim ćelijama se nalaze i receptori za neurotransmitere npr.serotonin, receptori zapurine, rec. za endotelin1 i neki faktori iz glija ćelija, kao što je neurotrofiĉni faktor poreklom izglija ćelija (GDNF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), TGF- β faktor rasta fibroblasta (bFGF),angiopoetin (ANG1) itd. Sve su to faktori koji mogu da utiĉu na funkcionisanje endotela kapilarau sastavu k-m barijere. K-m barijera nije uniformna u svim delovima mozga. U nekim delovima mozga ona jeprekinuta i ti delovi mozga se nazivaju cirkumventrikularni organi. Pomenuli smo area postremai, moţda, organum vasculosum laminae terminalis. Koji su delovi gde je k-m barijera prekinuta?To su epifiza, subfornikalni organ (fornix je struktura koja spaja hipotalamus sa limbiĉkimsistemom), organum vasculosum laminae terminalis, neurohipofiza, eminentia mediana i areapostrema koja se nalazi u moţdanom stablu. Na tom mestu su ependimalne ćelije drugaĉije(specijalizovane, imaju specifiĉne nastavke) i prekrivaju propustljivije kapilare u sastavucirkumvent. organa. Na taj naĉin je u ovom delu mozga sastav vanćelijske teĉnosti mozga sliĉansastavu krvi, a potpuno odvojen od sastava CSF-a. Znaĉi, CSF i dalje zadrţava isti sastav. Zatosam i rekla da u najvećem delu mozga BECF ima isti sastav kao CSF, osim u delovima gde je k-m barijera raskinuta. Da k-m barijera nije narušena hipotalamus ne bi mogao da otpušta svojehormone u cirkulaciju, oksitocin i vazopresin takoĊe ne bi mogli da proĊu, zatim svi hormoniadenohipofize ne bi mogli da se otpuštaju u portalni krvotok, citokini ne bi mogli da utiĉu nahipotalamus (centralni termostat- da moţe da povećava i sniţava svoju bazalnu temperaturu),osmoreceptori u hipotalamusu ne bi znali da smo dehidrirali i da treba da pokrenu sintezu isekreciju antidiuretiĉkog hormona itd. Krećemo sada na mehanizme senzorne transdukcije, priĉali smo već o tome, vi ste se većsusretali sa molekularnim mehanizmima, mislim da ste nešto već radili kod profesora AnĊusa...Znaĉi još pre 150 godina Miler je pretpostavio da su neuroni specijalizovani za detekcijuodreĊenog tipa stimulusa i da će izazvati uvek istu senzaciju bez obzira na to kako su aktivirani.Ovo se naziva univarijansa: senzorni receptor i sve što sledi iza tog senzornog receptora, daklesenzorni put će se uvek na isti naĉin aktivirati bez obzira na to šta ga je aktiviralo. Pa sam ja, ĉinimi se, dala jedan primer, na šta mislim, na oko, znaĉi bez obzira što nije u pitanju svetlosnistimulus nego mehaniĉki, dakle oko će da izazove senzaciju svetlosti. Pošto se dosta radilo namehanizmima senzorne transdukcije na molekularnom nivou mi danas znamo da mnogi procesi
  • 77. 77poĉinju od forme proteina, odnosno receptora spregnutog sa proteinom G, pa ćemo videti na kojinaĉin se vrši primanje svetlosnog signala, olfaktornog signala, mirisnog signala, odnosnoodoranata, neki tastatorni i hemijski stimulusi... S druge strane ti prijemnici mogu da budumodifikovani membranski kanali kao što su ? preklopne veze na vlatastim ćelijama, isto takoprijemnici mogu da budu neuroni, specijalizovani neuroni i mogu da budu efektorne ćelije. Kad govorimo o koracima signalne transdukcije, i ovo je samo ponavljanje onoga što smoveć priĉali, dakle svaki receptor treba da bude osposobljen da detektuje specifiĉnu energijustimulusa, dakle toplotnu, svetlosnu, mehaniĉku i tako dalje, da to rade selektivno, da to radebrzo i da je u stanju da odredi koji je tip, i da lokalizuje stimulus. Zatim sledi amplifikacijasignala. Posle ćemo govoriti u ciframa šta je sve jedan jedini foton u stanju da uradi kadagovorimo o amplifikaciji signala. Zatim se konvertuje amplifikovan signal u promenu potencijalamembrane odnosno dolazi do stvaranja receptorskog potencijala, ukoliko je u pitanju epitelnaćelija ili generatorskog potencijala, ako je receptor nervna ćelija, taj receptorski potencijal jošuvek nije akcioni potencijal već prosta promena potencijala membrane koja sad moţe damoduliše aktivnost kanala, moţe da okine akcioni potencijal, videćemo na slajdu gde je tipiĉnoolfaktorni neuron da receptorski odnosno generatorski potencijal dovodi do okidanja akcionogpotencijala u delu iste ćelije i moţe da dovede do toga da se oslobodi neurotransmiter, ĉak moţeda determiniše obrazac po kome se akcioni potencijali šalju dalje senzornim neuronom. Kada govorimo o transdukciji hemijskog signala moţemo reći da je hemijska transdukcijamoţda najstarija forma senzorne transdukcije, jer sećate se ove slike, priĉali smo o paramecijumukoji je u stanju da prepozna hemijske signale, odnosno da atraktantni molekuli hiperpolarišumembranu dok je odbijajući depolarišu i samim tim to ima veze sa proteinima petlje, on se na tajnaĉin ponaša, znaĉi pliva u pravcu atraktantnih molekula ili od odbijajućih molekula. I ono štosmo takoĊe rekli, da je praktiĉno svaka naša ćelija hemosenzitivna, jer je to proces kojim našećelije komuniciraju, znaĉi svaka naša ćelija odgovara na hemijski signal, odgovara na hormon iliodgovara na neurotransmiter. Hemijski signali, znaĉi nutrijenti, otrovi, atraktanti, signalnimolekuli praktiĉno uĉestvuju u procesu ishrane, ukazuju na opasnost, procesu reprodukcije,navigacije...
  • 78. 78 Transdukcija olfaktornih signala Signalnim molekulima dakle regulišemo sve fiziološke procese u organizmu. Evo slike,transdukcija olfaktornih signala, u pitanju je bipolarni neuron ĉiji jedan kraj ĉine nepokretnecilije uronjene u mukus, u mukusu odorant-vezujući proteini vezuju odorante omogućavajući imda proĊu kroz mukusni sloj i da se veţu za svoj receptor spregnut sa proteinom G koji dovodi doaktivacije Gon subjedinice i adenil ciklaza i cAMP i kada se poveća cAMP to dovodi do otvaranjakanala za katjone spregnutih sa cikliĉnim proteinima (CNG kanale) i sad kroz te kanale ulaze Naodnosno Ca, što dovodi do stvaranja generatorskog potencijala, o kome sam malopre govorila,odnosno poĉetnu depolarizaciju ćelije, sad ovaj Ca koji je ušao kroz CNG kanale (kanali zakatjone spregnuti sa cAMP) omogućava otvaranje kanala za Cl koji se aktiviraju kalcijumom i Clizlazi što dovodi do dalje depolarizacije i okidanja akcionog potencijala u okidaĉkoj zoni koja senalazi blizu ? neurona, zatim se dalje putem aksona akcioni potencijal, znaĉi akson prolazi ?ploĉu i šalje se u olfaktorni bulbus. Što se tiĉe ovog receptora spregnutog sa proteinom G, dakletreći, ĉetvrti i peti segment su izgleda zaduţeni za prepoznavanje odoranta, a kao što je sluĉaj sasvim ostalim G proteinima, dakle Gon subjedinica prepoznaje ova treća petlja i karboksilni krajkoji se nalazi u citosolu. I ovo je opet malo podsećanje, veoma je neobiĉno da je ovako veliki deo genoma zauzetnašim mirisnim receptorima, jer podsećam da svaka ova olfaktorna ćelija sadrţi samo jedanjedini receptor, jednu jedinu vrstu receptora, dakle kod miša se zna, to je Linda Bah ustanovilapre 10-ak godina, 2004. godine dobila sa ? Nobelovu nagradu za svoje delo radeći na olfaktornojkori i na mirisnim receptorima, dakle oni su ustanovili da miš recimo poseduje hiljadu gena zarazliĉite receptore za odorante, i 260 pseudogena, kod nas je priĉa nešto manja 339, po nekima350, zavisi kako gde u literaturi, 297 pseudogena, znaĉi svaka ova olfaktorna ćelija ispoljavasamo jednu jedinu vrstu receptora za odorante. Ovo se ne sećam da li sam već rekla, pre nekih desetak godina ustanovljeno u našem tomepitelu u mozgu se nalaze ĉak i receptori za feromone i oni se nazivaju vomeronazalni receptorikoji liĉe na vomeronazalne organe, pošto su vomeronazalno organi organi kod kiĉmenjaka npr.zmije, apopsonov organ, jedna vrsta vomeronazalnog organa koji je zaduţen za detekcijuferomona i budući da je pronaĊen ovaj receptor sad se radi na tome i traţi se da li smo mi ustanju da detektujemo feromone.
  • 79. 79 Pa da vidimo šta se dalje dešava sa tim signalom, ovo smo sve ispriĉali, dakle generisalismo akcioni potencijal, evo ga telo olfaktornog receptora, rekli smo da akson prolazi ? ploĉu idolazi do olfaktornog bulbusa, ovo je jedan olfaktorni bulbus koga ĉini veliki broj, oko 2000 ihima, po bulbusu kod npr. zeca, a toliko je mislim i kod ĉoveka, to su glomerulusi, dakle u komsvaka olfaktorno-receptorna ćelija koja eksprimira jedan odorantni receptor uspostavlja sinapsusa nekih 25 apikalnih dendrita mitralne ćelije. Znaĉi ovo ovde su mitralne ćelije, ima ih oko 50000 kod ĉoveka po jednom bulbusu, kod pacova 45 000, dakle to su glavne ćelije olfaktornogbulbusa i njihovi aksoni u stvari grade olfaktorni traktus u sastavu prvog kranijalnog nerva.Znaĉi bulbus ĉini oko 2 000 glomerulusa, a u svakom glomerulusu jedna olfaktorna receptornaćelija formira sinapsu sa 25 apikalnih dendrita mitralne ćelije. Ovaj olfaktorni traktus koga ĉineaksoni mitralne ćelije dakle sada ulazi u piriformnu odnosno primarnu olfaktornu koru, a iz njeprolazi kroz talamus kod sisara, i završava se u neokorteksu, da se podsetimo priĉe da se utalamusu prekopĉavaju sva senzorna vlakna osim mirisnih. Završili smo sa primarnom korom,preko talamusa i limbiĉkog sistema dalje do neokorteksa da bi jednostavno prošle informacije uasocijativnu zonu, da se podsetimo da li je to miris nekog jela, parfema ili tako nešto. Znaĉi pretalamusa se put završava u primarnoj zoni zaduţenoj za ?. TakoĊe interesantno, to je isto skoro Linda Bah objavila rad da neuroni u sastavuprimarnog olfaktornog korteksa primaju informacije sa razliĉitih glomerulusa, što je logiĉno,dakle na taj naĉin postaviće se pitanje, dobro, imamo tih 350, 339 razliĉitih receptora, sigurnomoţemo da prepoznamo 500 000 razliĉitih mirisa, na koji naĉin se dakle vrši obrada signala,obrada signala se vrši tako što sada sa razliĉitih glomerulusa informacije stiţu u ćelije primarnogolfaktornog korteksa i to je ona ustanovila da ĉak neke ćelije primarnog olfaktornog korteksamogu da primaju informacije samo ako dobiju signal sa razliĉitih odorantnih receptora, sa dve, trićelije, uopšte neće da reaguju ako se pojedinaĉno aktivira jedna ćelija ili druga, već prima signalsamo ako doĊe iz dve tri razliĉite ćelije, na taj naĉin se odvija kombinatorika i omogućava sedetekcija velikog broj mirisa, mnogo većeg nego što je u pitanju broj receptora za odorante. Da se vratimo na bulbus, to smo sad ispriĉali, šta se dešava sa prenosom signala. Ubulbusu se još nalaze i jukstaglomerularne ili periokologlomerularne ćelije, znaĉi one se nalazeoko glomerulusa i one su zaduţene za proces lateralne inhibicije, dakle one npr. namomogućavaju da ne reagujemo na miris hrane kada smo gladni, kada nismo gladni, lateralna
  • 80. 80inhibicija se iskljuĉuje kada smo gladni. Tu se još nalaze granularne ćelije koje takoĊe posedujuinhibitorne interneurone. Evo kako izgleda jedan glomerulus, evo ga sad akson ovog olfaktornogreceptora koji je stigao u glomerulus i koji odmah uspostavlja sinapsu sa jednim od 25 apikalnihdendrita mitralne ćelije. U principu ove olfaktorno-receptorne ćelije su, sad sam htela da kaţem, glutamatergiĉke,znaĉi one otpuštaju glutamat i to je utvrĊeno kod kornjaĉa, kod pacova, kod ţabe. MeĊutim kodpacova, sad da ne davim o onim receptorima o kojima je bilo reĉi prošli put (AMPA i NMDA),ustanovljeno je kod pacova da ove ćelije ĉak luĉe i noradrenalin i zato mi je ĉudno da sve bolestikod ljudi koje su praćene poremećenim metabolizmom, odnosno poremećenom transmisijom kadje u pitanju ovaj kateholamin, dakle te bolesti su praćene ozbiljnim gubitkom mogućnostipercepcije mirisa. Takve bolesti su Korsakoff-ova bolest, jedna vrsta demencije, kodAlchajmerove bolesti jedan od tipiĉnih simptoma je gubitak ĉula mirisa, takoĊe starenjem,gubitkom, odnosno promenom funkcionisanja transmisije kateholamina gubi se i mogućnostregistrovanja mirisa. Parkinsonova bolest je takoĊe praćena poremećenom olfaktornomdiskriminacijom, što znaĉi da je dopamin ukljuĉen u ovu diskriminaciju, on je ukljuĉen tako štosu ove jukstaglomerularne, odnosno periglomerularne ćelije koje su ukljuĉene u lateralnuinhibiciju dopaminske, ali i stvaraju GABA, pa se ovaj dopamin sada vezuje za presinaptiĉke D2receptore na aksonima olfaktorne-receptorne ćelije, dakle na taj naĉin modulišu oslobaĊanjeglutamata i noradrenalina. Osim toga, periglomerularne ćelije oslobaĊaju GABA, inhibitornineurotransmiter koji se vezuje za GABAA receptore na apikalnim dendritima mitralnih ćelija, alii za presinapticke GABAB receptore i tako vrši apikalnu inhibiciju i moduliše oslobaĊanjeglutamata, a najverovatnije i noradrenalina. Transdukcija tastatornih signala Kada su tastatorni signali u pitanju, vrši se detekcija 5 osnovnih ukusa: slatko, slano,gorko, kiselo i umami, pri ĉemu su slatko, slano i umami nutritivni ukusi poreklom od proteina isoli, dok se za gorko i kiselo moţe reći da su ukusi upozorenja. Receptori za tastante lokalizovanisu u okviru kvrţica koje su rasprostranjene na jeziku, mekom nepcu i ţdrelu. Na kvrţicama senalaze pupoljci u ĉijem sklopu su receptori, epitelne ćelije. One oslobaĊanjem neurotransmiteraaktiviraju aferentne senzorne neurone, sa kojima uspostavljaju sinapsu i na taj naĉin prenosesignal. Detekcija signala poreklom iz hrane vrši se na razliĉite naĉine, u zavisnosti od ukusa.
  • 81. 81Slano, kiselo i umami detektuju se posredstvom receptora jonskih kanala. Kada se detektujeslan ukus, Na+ ulazi kroz svoje kanale, u sluĉaju kiselog, vrši se po istom principu transportprotona, dok je za detekciju umami ukusa odgovoran jonotropni receptorski kanal za glutamat.Blokadu jonskog kanala vrše komponente iz kisele i gorke hrane, dok su klasiĉni membranskireceptori spregnuti sa proteinom G zaduţeni za detekciju: slatkog, gorkog i umami ukusa. Detekcija gorkog i slatkog ukusa Za detekciju gorkog i slatkog ukusa odgovorni su receptori spregnuti sa proteinom G. Usluĉaju gorkog ukusa receptor T2R/TRB kupluje se sa proteinom G ĉija se α-subjedinica nazivagustducin (po analogiji sa transducinom ĉepića i štapića mreţnjaĉe). U toku prenosa signalaprethodno pomenuti gustducin aktivira PDE1A (fosfodiesteraza 1A), koja razgraĊuje cAMP uAMP, što dalje vodi ka dezinhibiciji kanala za Ca+ zavisnih od cikliĉnih nukleotida i ulaska Ca+jona u ćeliju. Drugi put kojim moţe da se ostvari prenos signala posredovan je βγ-subjedinicomproteina G, koja aktivira PLCβ2, koja dalje dovodi do aktivacije signalnog puta preko IP3 iDAG, što opet vodi povećanju koncentracije Ca+ u ćeliji. Treći naĉin prenosa signala je putemzatvaranja kanala za K+ osetljivog na kinin (gorkog ukusa). Posledica sva tri signalna puta jedepolarizacija membrane ćelije, koja uzrokuje otvaranje kanala za Ca+ zavisnih od voltaţe iegzocitoze granula sa neurotransmiterima. Pretpostavlja se da je navedeni neurotransmiterserotonin, ali to još uvek nije sa sigurnošću utvrĊeno. Receptor za slatko (T1R3 ili T1r3/T1r2 –ne moraju da se pamte nazivi receptora) takoĊe je spregnut sa proteinom G, deluje preko njegoveαs-subjedinice, cAMPa i PKA, koja fosforiliše i zatvara kanal za K+. Posledica je depolarizacijamembrane, otvaranje kanala za Ca+ zavisnih od voltaţe i egzocitoze granula saneurotransmiterima, verovatno serotoninom. Interesantno je da veštaĉki zaslaĊivaĉi deluju prekoGαq subjedinice ili βγ-gustducina, koji aktivira PLCβ2, tj povećavaju oslobaĊanjeneurotransmitera, ali preko IP3 i DAG (najjaĉi zaslaĊivaĉ - lugdunam, biljnog je porekla, slaĊi odsaharoze 225000 puta). Još jedan zanimljiv podatak je da samo mala promena u strukturi moţeda dovode do percepcije drugaĉijeg ukusa, pa je tako L-Phe gorak, a D-Phe sladak. Detekcija umami, kiselog i slanog ukusa Umami ukus deluje preko jonotropnog NMDA receptora za glutamat, kroz koji ulaze Ca+i Na+, što dovodi do depolarizacije i otvaranja kanala za Ca+ zavisnih od voltaţe, koji
  • 82. 82omogućavaju egzocitozu. Umami, tj. glutamat moţe da se veţe i za metabotropni receptormGluR4 i prenese signal preko cAMP i PKA, koja fosforiliše i zatvara kanal za K+ (zato jeprethodno navedeno da umami moţe da se detektuje i preko blokade jonskog kanala) , ali i zareceptor spregnut sa proteinom G - T1r3/T1r1. Slano i kiselo aktiviraju ćelije preko jonskogkanala. U sluĉaju slanog ukusa, Na+ će ulaskom kroz epitelne kanale osetljive na amilorid –ENaC da izazove depolarizaciju, otvaranje kanala za Ca+ zavisnih od voltaţe i egzocitozegranula sa neurotransmiterima. Protoni ulaze kroz sliĉan kanal – ASIC (kanali osetljivi na kiselo;eng. Acid Sensing Ion Channels; potfamilija ENaC), a nishodni sled dogaĊaja je isti kaoprilikom ulaska Na+. Interesantno je da anjoni mogu da modulišu i neutrališu ukus slane hrane,naroĉito kada su u pitanju veliki anjoni. Kako se vrši dalja detekcija ukusa? N. glossopharyngeus (IX) i n. facialis (VII) prenosesignale sa gustatornih kvrţica prednjeg, srednjeg i zadnjeg dela jezika u nc. gustatoriusproduţene moţdine, a odatle dalje u ventralno posteromedijalno jedro talamusa i, na kraju,gustatorno polje senzorne zone neokorteksa (36. Brodmanovo polje). Ageusia – gubitak ĉulaukusa, za koji su odgovorna kako oštećenja VPM jedra, tako i 36. Brodmanovog polja. Nc.gustatorius šalje signale i u okolna jedra zaduţena za gutanje, ţvakanje, salivaciju. Periferni hemoreceptori, karotidna telašca Glomusne ćelije tipa I istog su porekla kao nervne ćelije i imaju sposobnost stvaranjaneurotransmitera, aktiviranja jonskih kanala zavisnih od voltaţe itd. Stimuliše ih hipoksija,hiperkapnija, ali i acidoza. Detektovanje hipoksije u glomusnim ćelijama vrši se pomoću jednevrste membranskog proteina, koji sadrţi hem. Kada se smanji koncentracija O2 u krvi, ondifunduje sa prethodno pomenutog proteina, koji, kad se naĊe u toj formi, na neki naĉin remetiotvaranje kanala za K+, tj. stimuliše zatvaranje. Drugi mehanizam odigrava se putem cAMP, kojipreko PKA izaziva iste efekte. Treći naĉin je remećenjem rada NADPH-oksidaze, enzimamitohondrija, ĉime dolazi do povećanja odnosa redukovanog i oksidovanog glutationa, što opetdovodi do zatvaranja kanala za K+. Posledica je depolarizacija (jer K+ koji je pozitivan jon ostajeu ćeliji), koja aktivira kanale za Ca+ zavisne od voltaţe i dovodi do egzocitoze granula saneurotransmiterima, najverovatnije dopaminom. On se vezuje za receptore na postsinaptiĉkojmembrani n. glossopharyngeus-a, koji prenosi signal u centar za disanje u produţenoj moţdini,dorzalna respiratorna grupa neurona.
  • 83. 83 Kao što smo rekli, ćelije sliĉne nervnoj ćeliji poseduju razliĉite neurotransmitere,najverovatnije je u pitanju dopamin koji se vezuje sa svoje dopaminske receptore napostsinaptiĉkoj membrani glossopharyngeus-a koji šalje informacije u centar za disanje. Takohipoksija deluje na glomusnu ćeliju. Hiperkapnija - povećanje koncentracije CO2. CO2 ulazi u glomusnu ćeliju, reaguje savodom, nastaje ugljena kiselina koja disosuje na protone i bikarbonate. Protoni nekako izmeštajujone Ca sa K+ kanala zavisnih od Ca2+, što opet dovodi do zatvaranja kanala za K, dodepolarizacije, otvaranja voltaţno-zavisnih kanala za Ca2+. Acidoza – smanjenje pH, odnosno povećanje koncentracije protona, dovodi do inhibicijeNa+/H+ izmenjivaĉa sa jedne strane i dovodi do ubacivanja protona u glomusnu ćeliju. Proton,bez obzira što nije poreklom od K/H ATPaze, na isti naĉin izmešta Ca2+ sa mesta na koje se Ca2+vezuje na kanalu za K+, kanal za K+ se zatvara, dolazi do depolarizacije, otvaranja voltaţno-zavisnih kanala za Ca2+, oslobaĊanja neurotransmitera i ekscitacija postsinaptiĉkog receptora naglossopharyngeus-u koji aktivira centar za disanje. Nociceptori Transdukcija signala na primeru oštećenja pankreasa (hroniĉni pankreatitis, inflamacijaitd.). Zašto pankreas? Zato što je dobro inervisan organ, zato što je podloţan uticajima hemijskihmedijatora, pre svega proinflamatornih molekula, kao uticajima toplotnih i mehaniĉkihstimulusa. Kad nastane zapaljenje pankreasa dolazi do nagomilavanja perineuralnih inflamatornihćelija (eozinofili, CD4+, CD8+ limfociti, makrofagi, mast ćelije) koje oslobaĊaju proinflamatornemedijatore i neurotrofine. Koji su to inflamatorni medijatori? Joni K, protoni, histamin,serotonin, bradikinin, PGE2 (postanglandin E2), CGRP (calcitonin gene-related protein),TNFα, IL-1, IL-6. OslobaĊaju se i neutrofini; jedan od neurotrofina je NGF (faktor rasta nerava)koji je medijator perzistentnog bola, a odgovoran je i za termalnu hiperalgeziju (povećanaosetljivost na termalne stimuluse – nešto što bi se inaĉe registrovalo kao blago povećanatemperatura se registruje kao izuzetno povećana temperatura) i mehaniĉku alodiniju (pojava da sestimilusi koji inaĉe nisu bolni registruju kao bolni).NGF deluje preko Tyr kinaze A koja pokreće ERK (MAPK) kaskadni put.
  • 84. 84Artemin – neurotrofin glijalnih ćelija (GDNF) se vezuje za svoje GFRα3 receptore i medijator jeintenziteta bola i frekvencije bola.Kljuĉni neurotrofin za medijaciju bola, odnosno koji nas obaveštava o nastalom bolu, je BDNF –faktor rasta nerava poreklom iz mozga; kod pankreasa je u korelaciji sa intezitetom bola.Gap-43, marker neoplastiĉnosti tokom razvića, ali i tokom povrede i pojaĉano se eksprimira unervnim vlaknima pacijenata koji boluju od pankreatitisa. Dakle, supstancija P se vezuje za svoje receptore (receptori za neurokine). U ovomsluĉaju supstancija P se vezuje za neurikin 1. TakoĊe, pojaĉano eksprimiran receptor je i TRP(Transient Receptor Potential) koga smo pominjali kad smo priĉali o ĉulima, to su kanali koji suodgovorni za registrovanje toplotnog stimulusa. Za njega se vezuje mentol, pa mi imamo osećajda nas hladi. Mentol, dakle, ne aktivira receptore za ukus, već ovaj TRP. Jedan od ovih receptoraje TRPV1, vaniloidni tip, pojaĉano eksprimiran u neuronima koji prenose senzaciju bola izzapaljenog pankreasa. Šta se dešava kad doĊe do povrede na periferiji? Nagomilavaju se mast ćelije, makrofagi;oni oslobaĊaju serotonin, serotonin se vezuje za svoje serotoninske receptore. OslobaĊa se ihistamin, on se vezuje za svoje H1 receptore; PGE2 se vezuje za receptore za prostanglandine.I oni svi deluju preko PKA. Trombociti koji ulaze oslobaĊaju bradikinine koji se vezuju zabradikininske receptore 1 i 2; NGF i bradikini preko Tyr kinaze A aktiviraju MAPK (ERK)signalni put. TakoĊe, bradikinin i NGF mogu da deluju i preko PKC.Eozinofili, keratinociti itrombociti oslobaĊaju purine, npr. adenozin koji se vezuje za svoje A2 receptore, ili protone kojise vezuju za ASIC kanale (kanali za Na koji reaguju na ekstraćelijkse protone). Šte se dešava na nivou kiĉmene moţdine kada je senzorni neuron doneo informaciju doleĊnih rogova sive mase? Ovo su glutamatski završeci, oslobaĊaju glutamat i aspartat. I posletoga, aktivirane glija ćelije koje se nalaze u dorzalnim rogovima sive mase takoĊe oslobaĊajufaktore koji modulišu osećaj bola (TNF, ATP, ROS, NO, glutamat, PG, IL-1, IL-6). Fotoreceptori Mreţnjaĉa pored fotoreceptora sadrţi i amakrine, bipolarne, horizontalne i na krajuganglijske ćelije ĉiji aksoni grade II kranijalni nerv koji prenosi signale u mozak.
  • 85. 85 Ĉepići i štapići, graĊa: imaju kratak akson koji se završava sinaptiĉkim završecima; teloneurona ĉini takozvani unutrašnji segment gde se nalaze jedro i mitohondrije i tu se vrši sintezafotopigmenta (rodopsin). Ovaj unutrašnji segment, formirajući jednu vrstu tunela, ima ulogu i uusmeravanju fotona kroz cilijarnu dršku u spoljašnji segment. Spoljni segment ĉini izuvijenamembrana na razliĉite naĉine i u zavisnosti od toga kako je membrana izuvijana, ovi receptori semorfološki dele na ĉepiće i štapiće. (ĉepić levo, štapić desno na drugoj slici) Diskovi sapigmentom omogućavaju apsorpciju svetlosti. Drugaĉiji je vid komunikacije ćelija u zavisnosti od toga da li se receptori nalaze u ţutojmrlji ili na periferiji. Ĉepić koji se nalazi u samoj fovei uspostavlja sinapsu na sledeći naĉin:jedan ĉepić uspostavlja sinapsu sa jednim bipolarnim neuronom, jedan bipolarni neuronuspostavlja jednu sinapsu sa jednom ganglijskom ćelijom. I za ovu receptorsku ćeliju moţemo dalaţemo da ima malo receptorsko polje zato što prima signale samo od jednog receptora.MeĊutim, ovaj vid prenosa signala pravi sliku visoke rezolucije. Zato je vaţno da soĉivo usmerizrak taĉno na foveu gde su najzastupljeniji ĉepići. Kada ima dovoljno svetla i kad pada taĉno naţutu mrlju mi smo u stanju da stvorimo jasnu sliku visoke rezolucije. Na periferiji retine situacija je drugaĉija. Imamo ĉepiće i štapiće. I jedna ganglijska ćelijaprima informacije sa više bipolarnih neurona, a svaki bipolarni neuron uspostavlja sinapsu sajednim ĉepićem ili jednim štapićem. Receptorsko polje ove ganglijske ćelije je veliko, ali slika koja se stvara posredstvom oveganglijske ćelije je manje rezolucije, ali je i osetljivija jer ova ganglijska ćelija sakupljainformacije sa više receptora. Zanimljivost: 1942. Hertz sa saradnicima je ustanovio da je potrebno samo 5 do 7 fotonapo jednom štapiću da se izazove senzacija svetlosti. Na diskovima spoljnog segmenta nalazi se rodopsin, vizuelni pigment (ne pamtiti ovo:30000 molekula/μm2 diska, 109 u po štapiću). Rodopsin koristi samo 10% svetlosti koja dospe uţutu mrlju. Apsorpcija protona deluje na aldehid vitamina A (retinal) koji je u cis-retinal formi idovodi do njegove izomerizacije i stvaranja trans-retinala. Trans-retinal je stabilnija forma kojadovodi do konformacionih promena opsina (receptor spregnut sa proteinom G) i do stvaranja
  • 86. 86metarodopsina II. Metarodopsin II, promenjeni opsin, spregnut je sa specifiĉnim proteinom Gkoji se naziva transducin. Ovaj protein vrši transdukciju signala. α subjedinica se aktivira kad seza nju veţe GTP, aktivira fosfodiestarazu (PDE) koja prevodi cGMP u GMP i time dovodi dopromene u ćelij 1985. Fesenko je sa saradnicima ustanovio da je receptorni molekul cGMP-a neselektivnikanal za katjone koji je zavistan od cGMP. Samim tim, kad se smanji koncentracija cGMP-a,ovi kanali se zatvaraju, a zatvaranje kanala dovodi do hiperpolarizacije. Receptor mora da prepozna tip energije i da amplifikuje signal. Sad više jednazanimljivost nego stvar za pamćenje: 1 foton aktivira preko metarodopsina 700 transducina uroku od 100ms, to dovodi do hidrolize 1400 cGMP, što dovodi do zatvaranja kanala što blokiraulazak 106 jona Na. Šta se dešava sa trans-retinalom i opsinom? Oni se odvoje nakon završenog procesa inakon odvajanja dolazi do tzv. bleeching-a, odnosno izbeljivanja; roze rodopsin prelazi u blediopsin. Retinal se prevodi u retinol (vitamin A) koji se sprovodi u pigmentni epitel u koji suĉepići i štapići praktiĉno uronjeni. Tu se retinol transformiše u 11-cis retinal koji se vraća uĉepiće. Na taj naĉin se omogućava njegovo.... Terminacija signala predstavlja smanjenje koncentracije Ca. Aktivacija fosfodistaraze ismanjenje cGMP-a dovodi do zatvranja kanala, ĉim se zatvori ovaj neselektivni kanal, ne ulazejoni Na i Ca. Smanjenje Ca dovodi do toga da se aktivira guanil ciklaza koja dovodi do stvaranjacGMP i u milisekundi prvi cGMP dovodi do otvaranja ovih kanala. I na taj naĉin se vršiterminacija signala. Pad Ca- to je jedna fina klackalica koja ne dozvoljava da receptor budeprekomerno ukljuĉen. MeĊutim, ovakva terminacija nije bas tako jednostavna, nije samo Caukljucen u terminaciju odgovora već su ukljuĉeni i drugi molekuli. Osim Ca, rodopsin kinaza fosforiliše rodopsin. Za ovako fosforilisan rodopsin vezuje searestin. (Arestin je još ukljuĉen u internalizaciju receptora za kateholamine.) Arestin se vezuje zamesto vezivanja transducina i onemogućava njegovu vezu sa transducinom. To je prvi korakterminacije. Drugi korak je hidroliza GTP-a koji vrši GAP protein koji se naziva RGS9-1 onaktivira GTPaznu aktivnost, meĊutim ne zna se zbog ĉega ovaj GAP protein zahteva za aktivnostprisustvo β5L subjedinice G protein. Kao produkt nastaje inaktivirana alfa-GDP transducina
  • 87. 87koja sada disosuje od fosfodiestaraze (3.korak). Ĉetvrti korak je aktiviranje još jednog proteinGCAP (engl. guanylate cyclase activating protein) koji aktivira GC (guanil ciklazu) i obnavljacGMP i time promoviše ponovno otvaranje neselektivnih kanala za katjone zavisnih od cGMP. Ono što je ĉudno to je fotoreceptorski potencijal- odgovor na svetlost hiperpolarizacijoma ono što je neoĉekivano je da se sinapsa normalno ponaša. To znaĉi da na svetlostihiperpolarizacija dovodi do smanjenja oslobaĊanja glutamate, kao i u svakoj drugoj sinapsi, a umraku depolarizacija dovodi do povećanog oslobaĊanja glutamata. Glutamate se oslobaĊa usinapsi sa bipolarnim neuronima. Ti bipolarni neuroni ostvaru sinapsu sa 10 vrsta ĉepića ili sajednom vrstom štapića i sa druge strane tu se umeću horizontalne, amakrine ćelije koje ovu većkomplikovanu priĉu dodatno komplikuju jer uĉestvuju i u lateralnoj inhibiciji (ali zanemarićemoove horizontalne, amkrine ćelije za sada). Glutamate koji se sada oslobaĊa aktivira bipolarneneurone koji se dele na dve vrste neurona. Jedna vrsta bipolarnih neurona tzv. “ON” neuronidepolarišu na svetlosti, druga vrsta su “OFF” koji depolarišu u mraku. Npr. U mraku, osloboĊeniglutamate će da hiperpolariše ovaj beli bipolarni neuron- vezuje se za metabotropne receptore zaglutamate i preko Go subjedinice i PDE dovode do smanjenja cGMP-a. S druge strane, glutamatese na „OFF“ bipolarnim neuronima vezuje za AMPA receptore (za Kainat) i dovode dodepolarizacije. U mraku se depolarišu „OFF“ neuroni, a hiperpolarišu „ON“ bipolarni neuroni. Osim toga, bipolarni neuroni ostvaruju sinapsu i sa jednom vrstom štapića. I ova vrstaštapića ne deluje direktno već ovi bipolarni neuroni ostvaruju sinapsu sa štapićima, aktivirajuamakrine A2 ćeije i preko njih aktiviraju „ON“ neurone a inaktiviraju „OFF“. I na taj naĉin seumeću u proces sprovoĊenja signala. Horizontalne, amakrine ćelije su ukljuĉne u lateralnu inhibiciju, šta se dalje dešava? Ovebipolarne ćelije uspostavljau sinapsu sa ganglijskim ćelijama. Postoje dve vrste M (midget) i P(parasol) ganglijske ćelije. Aksoni ovih gangliskih ćelija grade II kranijalni nerv koji sprovodisignale u vidnu zonu kore velikog mozga. Prva struktura kroz koju prolazi II .kranijalni nerv iz ...ukršta se u nivou optiĉke hijazme i odlazi u lateralno kolenasto telo koje je graĊeno iz 6 slojevaneurona- ono je jedro talamusa. (Ne odlazi u folikule kore -oni nisu deo vidnog puta, kontrolišusamo pokrete oĉiju u odnosu na svetlosni stimulus.). U VI, IV i I sloj stiţe informacija izsuprotnog oka, a u V, III i II sloj iz istog oka. Prva dva neurona ovog lateralnog kolenastog telasu magnocelularni i dobijaju informacije iz P ganglijskih ćelija (tu se završavaju aksoni), od M
  • 88. 88ganglijskih ćelija tu su parvocelularni neuroni koji uspostavljau sinapsu sa III, IV, V i VI. DosprovoĊenja dalje do prednje kore velikog mozga vidne zone moţemo reći da su ove M gangliskećelije zaduţene za detekciju pokreta, pravca, orjentacije (obuhvataju malo receptivno polje) dokP ganglijske ćelije (izgledaju kao padobrani) imaju veliko receptivno polje i odgovore su zadetekciju forme i boje. Vlataste ćelije Vlataste ćelije su zaduţene za odrţavanje ravnoteţe i za registrovanje zvuĉnih vibracija.Nalaze se u okviru sakulusa i utrikusa ili polukruţnih kanala u unutrašnjem uhu ali nalaze se i uokviru Kortijevog organa. Na apikalnom kraju nalaze se kinocilije (ukoliko ih ima) i snopstereocilija 50-150. Na njima se nalaze „tip“ preklopne veze na kojima se nalaze nespecifiĉnikanali za K. Kada se stereocilije pomere ka kinociliju za samo 0.5nm dovode do depolarizacije iaktivacije ovih K kanala, dok odvajanje stereocilija od kinoclije dovodi do hiperpolarizacije izatvaranje kanala. Vlataste ćelije su deo epitela koji razdvaja endolimfu od prelimfe. Koncentracija K uendolimfi je sliĉna koncentraciji K kao u cerebrospinalnoj teĉnosti (izuzetno niska), 145mV jegradijent izmeĊu koncentracije K u perilimfi i u endolimfi. Taj visok gradijent upravo odrţavajuvlataste ćelije. Depolarizacija dovodi do otvaranja voltaţno-zavisnih kanala za Ca, dolazi doegzocitoze granula sa neurotransmiterom (verovatno je to glutamat) i on sad aktivira okidanje APna senzornom neuronu. Tu se još nalaze voltaţno-zavsini kanali za K i Ca zavisni kanali za Kkoji omogućavaju procese recirkulacije jona K. Izuzetno je vaţno odrţavanje koncentracije K uendolimfi na niskom nivou. Kako se to odvija? Scala vestibuli gde se nalazi perilimfa i gde je koncentracija K 5mM,a koncentracija K u endolimfi je 150mM (veliki gradijent od 145mM), taj K je neophodan zafunkcionisanje vlatastih ćelija i on recirkuliše na ovaj naĉin: Spoljašnje vlataste ćelije koje su zaduţene za amplifikaciju signala, u njih ulazi K preko“tip” preklopne veze, a zatim prelaze (joni k) preko aktivnog transporta u Deiterove ćelije(tamnoroze na slici) i to posredstvom K kotransporetra Kcc3, Kcc4, i kanala za K sa inverznom(anormalnom) rektifikacijom Kir 4.1 . Zatim se K prenosi u sistem ćelija bazalne membrane,Kortijevog organa u koje spadaju Hensenove ćelije i ćelije spoljašnjeg sulkusa. U pitanju se
  • 89. 89ćelije koje su meĊusobno vezane mreţom pukotinastih veza i K putuje njima. Iz spoljašnjegsulkusa K prelazi u mreţu pukotinastih veza vezivnog tkiva koga ĉine fibrocite spiralnogligamenta- one takoĊe ĉine sistem ćelija koje su povezane meĊusobno pukotinastim vezama. Izćelija spiralnog ligamenta K su prebacuje u Stria Vascularis i preko marginalnih ćeija dospeva uScala media odnosno u endolimfu. Ono što je karakteristiĉno to je da su pukotinaste veze bazalne mebrane i vezivnog tkivaobiluju koneksinima- polukanali koji formiraju pukotinaste veze. I naroĉito je vaţan koneksin 26jer je ustanovljeno da mutacija koneksina 26 prouzrokuje vrlo ĉest oblik uroĊenje gluvoće. Na koji naĉin se sada vrši transport, odnosno repetiranje kanala? Evo ga spoljni sulkuskroz koji u sistem fibrocita spiralnog ligamenta ( koji je takoĊe sistem ćelija povezanihpukotinastim vezama) K ulazi preko Na/K- ATPaze i preko NKCC1 kotransporetar.Znaĉi, ĉimdospe u fibrocite spiralnog ligamenta K se pukotinastim vezama sprovodi koz ove ćelije i zatimse preko kanala za K sa inverznom rektifikacijom 4.1 tako da ulazi u stria vasculais. Iz strievascularis u marginalne ćelije ubacuje se Na/K-ATPazom i NKCC1 kotransportera. Na suprotnustrane recirkularizaciju vrši voltaţno-zavisan kanal za K Kv 7.1 i KCNE1 takoĊe voltaţno-zavisan kanal za K.Na ovaj naĉin preko sistema ovih transportera i Na/K-ATPaze vrši se recikliranje K. Transmisija signala se vrši pomeranjem stereocilija, aktiviralo se ovo recikliranje K iendocitoza granula sa glutamatom koji sada aktivira vestibularni nerv (u sastavu VIII nerva) kojidolazi do vestibularnih jedara produţene moţdine i zatim odlazi u mali mozak (arhicerebelum),talamus pa u kiĉmenu moţdinu i omogućava nam odrţavanje ravnoteţe. S druge strane, spoljašnje i unutrašnje vlataste ćelije grade auditorijalni nerv (u sastavuvestibularnokohlearnog VIII nerva) kojim se informacije prenose u donje folikule, pa umedijalno kolenasto telo i na kraju u temporalni deo slušne koru, oko slepooĉnog dela nalazi seprimarna zona a centralne zone se nalaze okolo i one nam omogućavaju da zvuk interpretiramo ine shavtimo ih kao proste vibracije i da shavtimo o kakvoj vrsti zvuka se radi.
  • 90. 90 Hormoni koji utiču na ishranuAcCoa – produkt razgradnje AK, masnih kiselina, piruvata. Prekursor za sintezu ATPa Insulin Insulin se sintetiše u beta ostrvcima endokrinog pankreasa. Gen za insulin, posedujepromotorski region i TATA box, mesto poĉetka transkripcije. Nakon transkripcije kojufavorizuje povišena cc glukoze i cAMP-a, iRNK za inslulin se transportuje u citoplazmu, gde sevezuje za SRP – signal recognition particle. Sve ovo favorizuje povišena cc glukoze. Nakontranslacije, dobija se preproinsulin, koji poseduje A lanac, B lanac i C lanac koji spaja A i B. Uendoplazmatiĉnom retikulum vrši se obrada, savijanje i formiranje disulfidnih veza, a zatim uGoldţiju dolazi do dodatne obrade – isecanja C lanca, ĉime nastaje zreo insulin. U beta ćelijama pankreasa, nakon vezivanja i ulaska glukoze kroz GLUT2 transporter,pokreću se metaboliĉki procesi koji dovode do porasta ATP-a u odnosu na ADP, dolazi doinhibicije otvaranja kanala za K, koji ne moţe da napušta ćeliju. Rezultat je depolarizacija, kojadovodi do otvaranja VZK za Ca i egzocitoze granula sa insulinom. Galektin u membraniinteraguje sa GLUT2. Miševi sa mutacijom u genu za enzim koji modifikuje galektin, suhiperglikemiĉni. Galektin stabilizuje GLU2 u membrani beta ćelija pankreasa, pa kada nema togenzima, galektin se udaljava od transportera. Favorizuje se tada njegova internalizacija uendozom i spajanje s lizozomom, npr.
  • 91. 91 OslobaĊanje insulina je bifaziĉno. Prva faza – oslobaĊanje već sintetisanog insulina. Polasata posle stimulacije oslobaĊa se i odreĊena koliĉina novosintetisanog insulina. Insulin je najpotentniji anaboliĉki hormon, on stimuliše sintezu ugljenih hidrata, proteinai lipida. Utiĉe na vezikularni transport, aktivaciju i inaktivaciju kinaza i fosfataza, ćelijski rast idiferencijaciju i regulaciju transkripcije. Dejstvo insulina na jetru ogleda se u preuzimanjuglukoze iz krvi (hipoglikemijski efekat), sinteze glikogena, stimulacija glikolize i produkcijeATP-a, sinteza SMK i triglicerida. Jetra je metaboliĉki zonirana, u prefrontalnim hepatocitimavrši se glukoneogeneza, a u perivenoznim glikoliza, zato što se oni nalaze pored vena, produktise isporuĉuju u krvotok a i visoka je zastupljenost kiseonika. U mišićima se takoĊe promovišepreuzimanje glukoze iz krvi a dalje i povećanje rezervi glikogena. U masnom tkivu se takoĊepovećava preuzimanje glukoze iz krvi, koja ulazi u proces glikolize. Nastaje glicerol fosfat kojise koristi za sintezu triglicerida. Insulin u adipocitipa inhibira lipazu. Na mišićnim ćelijama i adipocitima, nakon vezivanja insulina za insulinski receptor,stimuliše se ugradnja GLUT4 transportera u membranu! Insulinski receptor poseduje Tyr kinaznu aktivnost. Sastoji se iz dve α i dve βsubjedinice. α su vezane jednim disulfidnim mostom, a svaka od α je vezana disulfidnom vezomsa „njenom“ β subjedinicom. Brojni adapterski proteini se vezuju za receptor kada je u aktivnom fosforilisanom stanju.Gab-1 nakon vezivanja za receptor biva aktiviran, interaguje sa Shp2, koji aktivira MAPKsignalni put. Do istog ishoda dovodi i interakcije Shc proteina sa Grb2 adapterskim proteinom.IRS1-4, supstrat insulinskog receptora, aktivira PI3K što pokreće aktinski put, koji moţe bitipovezan sa ćelijskom proliferaijom (Akt). Naime, nakon vezivanja dva molekula insulina za alfa lance insulinskog receptora, dolazido aktivacije beta lanaca, i fosforilacije tirozinskih ostataka na intracelularnom domenu betalanaca. IRS se vezuje za te tirozine i sam se aktivira fosforilacijom. On zatim aktivira PI3K, kojas jedne strane aktivira PIP3, koji aktivira Akt, a s druge GRP1/ARNO, koji aktivira ARF,kojiaktivira fosfolipazu D. Ona fosforiliše vezikule sa GLUT4, vezikula se pomera ka membrani itransporter se ugraĊuje u istu. PIP3 moţe da deluje i indirektno, tako što aktivira PDK1-fosfoinozitol zavisna kinaza, koja moţe da aktivira bilo PKC biloAkt, dovede do pomeranjavezikule sa Glut4 ka membrani. Insulin moţe i na naĉin nezavisan od PI3K, koji je povezan sa lipidnim ostrvcima. Kadase veţe insulin, aktivira se receptor, a zatim i APS, koji se veţe sa Cbl. Cbl se dalje vezuje zaCAP. Dalje dolazi do aktivacije brojnih proteina, dok se na kraju ne aktivira TC10, koji da bibio aktivan, mora biti posttranslaciono modifikovan farnelizacijom i palmitoilacijom. TC10stimuliše ugradnju GLUT4 u regionu lipidnih ostrvaca/kaveola, preko interakcije sa kaveolinom.
  • 92. 92 U bazalnom stanju, kada nema insulina, i receptor nije stimulisan, GLUT4 se mahomnalazi u citoplazmi, privezan za aktinske filamente. Nakon nadolaska stimulusa, vezikula saGLUT4 poĉinje da se kreće ka membrani, prvo dolazi do polu ugradnje a zatim se potpunougraĊuje u membranu.Kako dolazi do terminacije ovog procesa? Lipidna fosfataza deluje na PIP3. TakoĊe postoji još jedna kinaza serin/treonin, kojafosforiliše receotor pre no što se za njega veţe insulin, što moţe dovesti do insulinskerezistencije. PTP1B svojom fosfataynom ativnošću otklanja fosfatne grupe sa IRS, PI3K, samogreceptora, Cbl, i tako dovodi do terminacije signalnog puta pokrenutog od strane insulina Glukagon Ima antagonistiĉki efekat u odnosu na insulin. On povećava konccentraciju AK; glukozuizbacuje u krvotok...JETRA- INAKTIVIRA GLIKOGEN SINTETAZU- AKTIVIRA FOSFORILAZU α → GLIKOGENOLIZU- GLUKONEOGENEZU (laktat, piruvat, arginin, alanin)MASNO TKIVO – LIPOLIZAU hepatocitima: kada doĊe do smanjena konc glukoze u krvi, aktivira se AC, povećava sekoliĉina cAMPa, on aktivira fosforilazu B, koja poveććava cc glukozo1fosfata, koji se prevodi uglukozu.Sinteza glikogena: Glukoza se preuzima iz krvi, aktivira se glikogen sintetaza D i nastajeglikogen.Normalno bazalno stanje: raznoteţa izmeĊu glukagona i insulina. Gukagon – 10 g/h. U mozakide 60% glukoze.Prilikom veţbanja: raste cc glukagona, opada insulina, glukagon deluje na jetru, da oslobodiglukozu, koja se prvenstveno šalje u mišiće.Nakon ugljenihidratnog obroka : ravnoteţa se pomera ka insulinu, koji deluje na jetru, mišiće imasno tkivo da preuzimaju glukozu i skladište je u vidu glikogena!
  • 93. 93 LEPTIN – regulator apetita Uĉestvuje u brojnim procesima. Regulacija telesne mase i apetita, zarastanje rana,reprodukcija, imunitet... angiogeneza, remodeliranje kosti... kardiovaskularne fje,antikonvulzivno dejstvo. Odusutvo leptina, ili njegovog receptora, dovodi do nekontrolisanogunosa hrane, i rezultuje gojaznošću. Iako je leptin cirkulišuće molekul koji redukuje apetit,gojazni ljudi generalno imaju veoma visoku cc leptina u cirkulaciji, ali je on nefunkcionalan. Ljudi koji su gojazni, kod njih je povećana cc leptina u krvi. Oni sintetišu nefunkcionalanleptin, koji ne moţe da ispolji svoju fju. Leptin koji se luĉi u hipotalamus zaduţen je za dugoroĉnu regulaciju apetita. Postoje tri forme receptora za leptin : kratka forma ObrS, duga forma Obrl, SLR –solubna forma, za nju se leptin vezuje u cirkulaciji, ona nastaje dejstvom matriksnihmetaloproteinaza. Duga forma receptora ObrL ima najveći signalni kapacitet. Poseduje dva Box-a u intracelularnom domenu, za koje se vezuje JAK2, kao i mesta vezivanja za STAT3 i SHP2. Kratke forme nastaju alternativnom obradom primarnog transkripta. Kada se leptin veţe za ekstracelularni domen receptora, dolazi do njegove aktivacije idimerizacije. Za aktivirani receptor se vezuje JAK2 kinaza, koja fosforiliše samu sebe ali i samreceptor. To omogućava vezivanje STAT3. On moţe direktno da ode u nukleus i regulišetranskripciju brojnih gena.32. Terminacija preko PTP1B, koja otklanja fosfate sa JAK2, samog receptora...(33.)Moţe takoĊe da aktivira SOCS3, što je naĉin da se ovaj signalni put zaustavi. Hroniĉnaaktivacija SOCS3 dovodi do leptinske rezistencije!34. slajd mi se ĉini da je pedja preskoĉio35. Insulin preko IRS moţe da uĉestvuje u aktivaciji JAK2 ali i STAT3 Kada se veţe za svojreceptor, receptor se aktivira, i za njega se veţe IRS. IRS dalje, stimuliše aktivnost JAK2 iSTAT3, koji su vezani za intracel domen reeceptora za leptin. Dalje, leptin, moţe da aktivira puta PLC...PIP2 se razgraĊuje na IP3 i DAG. PKCaktivirana, dalje aktivira JNK kinazu, koja fosforiliše c-Jun, koji stimuliše transkripcijuodreĊenih gena – ćel proliferacija i diferencijacija. SHP2 koji ima vezivano mesto na intracelularnom domenu leptinskog receptora, moţe dase aktivira fosforilacijom, i da aktivira Grb2. Grb2 aktivira Ras, koji pokreće tri puta: MAPKsignalni put, koji vodi ka aktivaciji c-Fos, p38, koji dovodi do ekspresije TNFalfa i p4244, kojidovodi do ekspresije NOS – lipolize i vazokonstrikcije.
  • 94. 94 Kros tok izmeĊu insulinskog i leptinskog puta: JAK kinaza moţe da aktivira IRS (aznamo da se on aktivira vezivanjem za fosforilisane tirozine intracelularnog domena beta lanacainsulinskog receptora).CNS, JETRA, ADIPOZNO TKIVO... Leptin se veţe za receptor, dimerizacija. JAK kinaza se veţe za receptor, autofosforiliše ifisforiliše sam receptor. IRS1/2 se vezuje za fosforilisane tirozine, aktivira se i aktivira PI3K.Dalje PI3K aktivira Akt, smanjuje se koncentracija cAMP i NPY, što vodi sprečavanju unosahrane. TakoĊe Akt dovodi do ekspresije POMC gena, nastaje alfa-MSH koji spreĉava unoshrane takoĊe (videti u delu o grelinu, slika efekata leptina i grelina).Antikonvulzivni efekti leptina u hipotalamusu, on inhibira AMPA receptore za glutamat, prekoJAK2/PI3K i onemogućava da doĊe do ekscitatacije, mogao bi da se koristi kao antiepleptiĉnilek. Adiponektin Sintetiše se u belom masnom tkivu (najveća cc adiponektina), jetri, hipofizi, slezini,meĊumozgu, skel mišićima i bubrezima. On reguliše ekspresiju insulina (UP), a glukokortikoidai TNFalfa (DOWN). Ima antitinflamatorno dejstvo. U cirkulaciji se moţe naći u razl formana – globularni, intaktni monomer, hexamer,oligomeri velikih mol masa. U gladovanju dolazi do povećanja cc adiponektina. Vezuje se za receptor AdipoR1, kojije spregnut sa G proteinom... aktivira se AMPK, koji dalje aktivira CAMKK2. Favorizuje seaktivacije NPY, koji vodi ka unosu hrane. Adipotenktin iz masnog tkiva izlazi u cirkulaciju. Inhibira glukoneogenezu, AMPKzavisno smanjenje ekspresije G6P Aktivira oksidaciju masnih kiselina, AMPK zavisna fosforilacija acetilCoa karboxilaze,smanjuje cc malonil Coa, povećava Beta oksidaciju masnih kiselina u mitohondrijama , utiĉe natranslokaciju GLUT4 i stimuliše preuzimanje glukoze. GRELIN Grelin stimuliše unos hrane. Ţeludac, pankreas, glomerulus bubrega i hipotalamus,blizina nc.arquatusa mesta su luĉenja grelina. Pre nego što je otkriven grelin, otkriven je receptor za grelin GHSR. Efekt moţe da bude direktno na nivou CNSa... povećanje cc grelina u cirkulaciji kadasmo gladni i kod ljudi koji su obolelui od anorexia nervosa. Da bi mogao da bude aktivanbiološki, neophodno je da dodje do posttranslacione modifikacije oktanoil grupom, što radi
  • 95. 95grelin o acetil transferaza.Ne zna se koji je grelin aktivniji, oni koji se sintetiše u hipotalamusu,ili onaj u stomaku. To je zato što se ne zna koliko je sposoban da proĊe kroz KMB. Zna se dagrelin aktivira neurone u kojima se sintetiše Neuropeptid Y, koji stimuliše unos hrane.Molekularni mehanizam dejstva grelina Grelin se vezuje za svoj receptor, GHSR, aktivira se G protein q, odnosno Gαqsubjedinica, koja aktivira PLCβ. Dalje, poznati put, PIP2, IP3, DAG. Ca se oslobaĊa iz ER-a, Ca2+ vezuje kalmodulin (CaM) → aktivacija CaMKK →aktivacija AMPK – AMPom aktivirana protein kinaza. Zatim doazi do fosforilacije TSC1/TSC2,koji stimulišu GTPazu Rheb, što spreĉava aktivaciju mTOR i doprinosi porastu apetita. Još jedan target grelina postoji: Acetyl-CoA karboksilaza (ACC) je supstrat grelinomaktivirane AMPK. U apsorptivnom stanju (GLU ) ACC posredovana sinteza malonil-CoA, štorezultira inhibicijom β-oksidacije. Grelinom posredovana aktivacija AMPK dovodi do fosforilacije i inaktivacije acetil-CoAkarboksilaze. Sledstveno smanjenje sinteze masnih kiselina i povećanje stope b-oksidacijedoprinosi formiranju osećaja gladi.Suprotno dejstvo grelina i leptina na unos hrane, leptin sprečava, grelin stimuliše PONAVLJANJEReceptor za insulin prvo aktivira IRS-1. On dalje aktivira kinazu odgovornu za sintezu PIP3(PI3-K), PIP3 dalje aktivira fosfoinozitol zavisnu kinazu 1 (PDK1), a ona zatim aktivira proteinkinazu C i protein kinazu 1. Na drugom delu slike, predstavljen je naĉin ulaska glukoze u mišićdok veţbamo, naime, do njenog ulaska dolazi na onaj drugi naĉin, posredstvom CBLprotoonkogena koji aktivira niz proteina dok ne dodje do aktivacije kljuĉnog enima - TC 10GTP-aza.
  • 96. 96Sledeća šema pokazuje naĉin na koji udruţeno deluju insulin i leptin. Leptin aktivira Janus kinazu i ona moţe da aktivira IRS koji dalje deluje na p85 (koji jeinaĉe katalitiĉka jedinica malopre spomenutog enzima PI3-K). To je naĉin na koji, na nivoućelije, oni dovode do razliĉitih bioloških posledica. Insulin i leptin su vrlo spregnuti, dakle nemoţemo ih posmatrati odvojeno. Molekularni mehanizmi lučenja sekreta digestivnog trakta Sekretorni put je otkrio i opisao George Palade 1975. godine i za to je dobio Nobelovunagradu za fiziologiju i medicinu. Danas se zna da nije u pitanju jednostavan, gladak,kontinuiran put već da je u pitanju serija skokovitih translokacija sintetisanog produkta iz jednogćelijskog odeljka u drugi. Dakle, nije u pitanju gladak put već je u pitanju niz skokovitihtranslokacija, odnosno, stvaranja sekretornih granula koje prolaze kroz faze pupljenja (fisije),zatim fuzije sa sledećim odeljkom ćelije i svaka od ovih faza je paţljivo orkestrirana i regulisana.U sekretornom putu u pitanju su proteini kao što su pankreasni enzimi, enzimi pljuvaĉnog sokaitd. Ovi enzimi se stvaraju na ribozomima gER-a. U gER-u se dodaje tipiĉna signalna sekvencakoja se nalazi na N-kraju ili oko N-kraja proteina. Signalna sekvenca determiniše put sekretornevezikule tj. sudbinu tog proteinskog produkta. Zatim, proteiniski produkt dolazi dotranslokacionog aparata koji se nalazi izmeĊu gER-a i Goldţijevog kompleksa. Translokcioniaparat ukljuĉuje formiranje ,,pokrivajućih“ vezikula (COP-coated vezikule), u pitanju suvezikule koje su prekrivene specifiĉnim proteinima i ti proteini omogućavaju da se vezikulaoformi, da se otkaĉi od ER-a i da doĊe do sledećeg odeljka ćelije a to je cis-Goldţi mreţa gdedolazi do njene fuzije, zatim se tu stvara sledeća COP vezikula koja se prebacuje na trans-Goldţimreţu, COP vezikula u trans-Goldţi mreţi se pretvara u regulatornu sekretornu vezikulu.Regulatorne sekretorne vezikule imaju poĉevši od trans-Goldţi mreţe dve sudbine. Prva je damogu da poĊu duţ regulisanog sekretornog puta kao što je sluĉaj sa endokrinim i egzokrinimćelijama i neuronima, neurotransmiteri i hormoni determinišu sudbinu vezikula i odluĉujumomenat njihove egzocitoze. S druge strane, imamo neregulisani (konstitutivni) sekretorni putgde kada nastane konstitutivna sekretorna vezikula momentalno se izluĉuje, dakle, ne ĉeka nekistimulus.
  • 97. 97 Kada govorimo o pokrivajućim proteinima danas se zna da postoje, najmanje, tri vrste,,pokrivajućih“ (coat) proteina. Jedan od njih su klatrini, omogućavaju pokrivanje vezikula kojese transportuju od ćelijske membrane do endozoma (proces endocitoze) i transportuju proteineod endozoma do trans-Goldţi mreţe. Sledeća grupa proteina su COPII proteini vezikule kojiomogućavaju transport novosintetisanih proteina iz ER-a. Treća grupa su COPI proteinivezikula, dakle vezikula pokrivena kompleksom I, koji omogućava transport izmeĊu odeljakaGoldţi mreţe izmeĊu cis i trans i obrnuto, izmeĊu trans i cis, odnosno, izmeĊu cis i ER-a tj.omogućava povratni transport vezikula. Za sva tri pokrivajuća proteina karakteristiĉno je daposeduju 2 strukture: α solenoide i β propelere. α solenoidi su specifiĉno uvijeni α heliksi kojiimaju ĉvršću graĊu u poreĊenju sa obiĉnim α heliksom. β propeleri su predstavljeni cilindrimakoji se nalaze ili na C-kraju α solenoida ili na N-kraju α solenoida. Klatrini formiraju triskelion,to su u stvari tronsošci koji imaju tri noţice od α solenoida i na kraju se nalaze β propeleri.Triskelioni kada pokriju vezikulu formiraju tzv. ikosaedralnu strukturu. COPII kompleks se,takoĊe, sastoji od α solenoida i β propelera i COP II ĉini heterotetramer, odnosno, dimer kogaĉine Sec13 i Sec31. Sec31 je α solenoid koji se udruţuje na N-kraju sa Sec13 koji predstavlja βpropeler, a sa C-kraja Sec31 regrutuje još jedan dimer koji se naziva Sec23/Sec24 i ovaj dimerpredstavlja adaptin. U principu, ovi pokrivajući molekuli se uvek udruţuju sa još jednim setomproteina koji se nazivaju adaptorni proteini, adaptini ili adaptori, svejedno je kako ih imenujemo.COPII ima neku štapićastu strukturu i udruţuju se tako da kada pokriju vezikulu gradesuboktaedralnu strukturu. Ono što je interesantno je da su ovi α solenoidi graĊeni tako da imajumogućnost ,,uvrtanja” i tako mogu da pokriju vezikulu razliĉite veliĉine, dakle, više se skupekada je vezikula mala i mogu više da se rašire kada je vezikula veća. Treća vrsta molekula jeCOPI koji formira triskelione (tronošce). COPI predstavlja kompleks saĉinjen od 8 razliĉitihproteina. Triskelione grade α, β′ i ε-COP proteini, u pitanju je heterotrimer, na C-krajuheterotrimera nalazi se ε subjedinica koja regrutuje adaptin koga formiraju β, γ, δ i δ-COPproteini.4. SLIDE: E sad da vidimo kako se ovi proteini organizuju. Sintetisali smo pankreasni enzim u ER.Sad taj sadrţaj mora da predje iz ER-a i da se spoji sa cis-golgi-vezikulom. Dakle, sad se namembrani ER-a polimerizuju ovi COP-II molekuli. Oni su vezani za Sec23/Sec24 adaptine i oni
  • 98. 98sada uspostavljaju vez usa membranskim CARGO proteinima (to su oni proteini zbog kojih seformira vezikula, oni treba da se prenosu iz jednog odeljka u drugi). Npr. CARGO protein jepankreasni enzim. Dakle, sad ovi COP molekuli uspostavljaju vezu sa membranskim CARGOproteinom i sa receptorima koji vezuju solubilne CARGO proteine. Tipiĉan receptor za solubilneCARGO je ovaj ERGIC-53, koji omogućava formiranje vezikule koja će da predje iz ER-a (zatoje ER-GIC) u prostor izmedju ER-a i kompleksa Golgi. Da bi se formirala vezikula, neophodnisu mali GTP-vezujući proteini. Ovo je mali GTP-vezujući protein koji se spaja sa COPproteinima. Oni su neophodni da bi doslo do fisije vezikule, da se ona odvoji, u ovom sluĉaju, odER-a, i ono što ćemo videti kasnije je da ovi COP proteini moraju da se sklone da bi kasnijedošlo do fuzije vezikule sa cis-membranom. Znaĉi, hidroliza GTP-a omogućava fisiju vezikule iodvajanje COP proteine pre fuzije. Ono što je zanimljivo je da kada su u pitanju COP I ili IIvezikule, ovaj mali GTP-vezujući protein je dovoljan da bi došlo do fisije vezikule, a kad je upitanju klatrinska vezikula, ovaj mali GTP-v-p kada izvrši hidrolizu daje energiju samo zavezivanje dinamina, a dinamin je taj koji omogućava da se vezikula otkaĉi. Dakle, sad smoformirali vezikulu zahvaljujući svim ovim proteinima, sada se ova vezikula fuzioniše sa cis-Golgi mreţom. Pre fuzije je neophodno da se ovi proteini sklone, jer oni ne dozvoljavaju fuzijuvezikula sa cis-Golgi. Znaĉi, dolazi do separacije CARGO proteina za dalji transport. Svi oviproteini koji se odvajaju, dalje nemaju nikakvu funkciju, jedan takav protein je ERGIC-53.5. SLIDE: Sadrţaj iz vezikule prelazi u cis-Golgi, a zatim i u trans-Golgi, i kada se taj sadrţajizruĉi, neophodno je da se formira nova vezikula- COP I. Sada COP I molekuli polimerizuju duţ membrane cis-Golgi, oni su vezani za svojeadaptine (β, γ, δ, i δ-COP adaptine). Opet se uspostavlja kontakt sa membranskim CARGOproteinima, sa membranskim receptorima za solubilne CARGO proteine i sa malim GTPvezujućim proteinima, koji je u sluĉaju COP I vezikule Arf-1 (u COP II je Sar 1). HidrolizaGTP-a neophodna da dodje do fisije od cis kompleksa, i ona se, dakle, dalje usmerava ka trans-Golgi mreţi gde se sada vrši sortiranje i pakovanje u sekretorne vezikule. Sada ova sekretornavezikula moţe krenuti razliĉitim putevima. Ili ulazi u regulisani put, gde vezikula ĉeka signal dabude izluĉena, ili ulazi u neregulisani put gde se odmah izluĉuje.
  • 99. 996 SLIDE: Na koji naĉin sada vezikula fuzioniše sa target-membranom? Ne moţe svaka vezikula dafuzioniše sa svakom membranom, već je ovaj proces taĉno determinisan. Fuzija se ne odvijaspontano zbog odbijanja negativnih fosfolipida membrana u kontaktu, zatim sami COP proteinine dozvoljavaju fuziju, znaĉi pre samog ukotvljavanja mora doći do gubljenja COP proteina.Znaĉi, kada vezikula mikrotubulama stigne do membrane, ona gubi COP proteine i eksprimiraproteine za premošćavanje. Pominjali smo već SNARE molekule- Soluble NSF AttachmentProtein Receptor. Vezikula eksprimira v-SNARE protein, a ciljna membrane t (target)-SNAREproteine. U pitanju je omĉica na vezikuli koja treba da se zakaĉi za istu takvu omĉicu na target-membrani. Da bi došlo do fuzije neophodan je SNAP (solubilni protein koji za sebe kaĉi NSF), aNSF je NEM-senzitivni faktor. Za fuziju je takoĊe neophodan mali GTP protein koji dovodi dohidrolize GTP-a i daje energiju za fuziju vezikule sa membranom i pomaţe sticanje ovogOMEGA profila. NSF faktor je neophodan da bi kompleks disosovao, odnosno da se v-SNAREotkaĉi od t-SNARE.7 SLIDE: Na ovoj slici imate sve što smo da sada priĉali, od ER-a, COP II, COP I vezikule, domomenta fuzije. Na taj naĉin se vrši fuzija i zato se kaţe da je sekretorni put izuzetno preciznoorkestriran i organizovan. Sekrecija pankreasnog soka Šta se sada dalje dešava sa sekretom digestivnog trakta? Enzimi se sintetišu u acinusnimćelijama pankreasa, a od tih acinusnih lobusa kreću kanalići obloţeni niskim epitelom kojidodaje još jednu komponentu pankreasnom soku, a to su bikarbonati, dakle bazna komponenta.*Objašanjava sl: visoke acinusne ćelije sa bogate mitohondrijama sa mnoštvom zimogenihgranula (regulisana sekrecija) i niske epitelne ćelije kanalića. Dakle, enzimi se sintetišu na gERodakle putem COPII i COPI vezikula dospevaju do cis, a zatim i trans Goldţi cisterni. Nakonodvajanja vezikula od trans Goldţi cisterni sledi kondenzacija njihovog sadrţaja, ĉime dolazi dostvaranja kondenzacione vezikule koja se odlikuje niţim pH. Dalja kondenzacija rezultirastvaranjem zimogene granule, koja je u odnosu na kondenzacionu još gušćeg sadrţaja i manja30%. Upravo zimogena granula je ta koja je spakovana, spremna i ĉeka stimulus. Ona dalje
  • 100. 100putuje od trans Goldţi kompleksa do apikalne membrane gde će se izvršiti egzocitoza, tokomkoje (naravno, nakon obroka) dolazi do uvećanja apikalne membrane od ĉak 30x. Zimogenegranule se dovode u kontakt zahvaljujući jednoj vrsti aktinske mreţe, dok druga aktinska mreţastoji uz samu apikalnu membranu i spreĉava fuziju. CCK (stimulus za luĉenje pankreasnihenzima) omogućava reorganizaciju te druge aktinske mreţe ĉime je omogućena fuzija zimogenegranule sa apikalnom membranom. Dakle, ćelija stimulisana posredstvom Ach ili CCK koristiregulisani sekretorni put, meĊutim, meĊu acinusnim ćelijama prisutan je i konstitutivni, dodušeminimalan, neregulisani sekretorni put. To znaĉi da acinusna ćelija konstantno izbacuje malesadrţaje zimogenih granula. Taj sadrţaj predstavlja mešavinu od oko 20 proteina (neaktivneforme tripsina i himotripsina-tripsinogen i himotripsinogen; prokarboksipeptidaza A i B;proelastaza; proproteaza E; amilaza; lipaze; RNAza; DNAza; kolipaza; inhibitor tripsina;lithostatin; glikoprotein 2). Da bi došlo do luĉenja pankreasnog soka neophodan je Ach (nervnakontrola) i CCK, koji luĉe ćelije duodenuma stimulisane produktima razlaganja hrane (peptidi,SMK dugih lanaca, AK). Još jedna interesantan povratna sprega koja govori o tome kako jedigestivni sistem organizovan da sam sebe kontroliše je da se CCK sekretuje i u odgovoru naCCK-oslobađajuće faktore, sintetisane od strane mukoznih ćelija duodenuma. To su peptidikoje pod bazalnim uslovima razgraĊuju oni konstitutivno sekretovani enzimi, te CCK-oslobaĊajući faktori neće biti u mogućnosti da isprovociraju luĉenje CCK onda kad to nijepotrebno. MeĊutim nakon obroka enzimi se usmeravaju na razlaganje komponenata hrane,njihov nivo se povećava, a sledstveno i CCK. Ono što je interesantno je da pankreas ima najvećikapacitet za sintezu proteina u odnosu na sve druge organe (5-15 g/dan). Ta sinteza se odvija uacinusnim ćelijama pod dejstvom razliĉitih faktora, pre svega CCK, koji se vezuje za receptoreCCKA. To predstavlja direktan mehanizam delovanja. Indirektno, CCK moţe delovati istimulacijom parasimpatiĉkog nervnog sistema, na ĉijim krajevima se luĉi Ach, koji će sesledstveno na površini acinusne ćelije vezati za M3 receptore i preko dobro poznatog puta, kojiukljuĉuje Gαq subjedinicu, PLC, IP3 i DAG dovesti do nagomilavanja Ca2+ (IP3 ga oslobaĊaiz intraćelijskih depoa, a DAG preko PKC ubacuje iz ekstraćelijske sredine). Povećanje nivoaCa2+ dovodi do njegovog vezivanja za CaM, koji dalje aktivira CaM-zavisne protein-kinaze.Sem CCK i Ach, na egzocitozu zimogenih granula acisnusnih ćelija u znaĉajnoj meri utiĉe i VIP(sintetiše se u neuronima, izolovan prvobitno iz onih koji inervišu digestivni trakt, ima
  • 101. 101vazodilatatorno dejstvo), što je jasno ilustrovano na grafikonu koji se tiĉe kinetike sekrecijeamilaze (slika 1). VIP se vezuje za VPAC2 receptore i delije preko Gαs subjedinice, AC, cAMP i PKA.Preko istog signalnog puta i sekretin u manjoj meri utiĉe na egzocitozu pankreasnih enzima.Sumarno, PKC, PKA i CaM-zavisne protein-kinaze fosforilišu strukturne i regulatorneproteine, ĉime dolazi do egzocitoze sadržaja zimogenih granula. Na acisnusnim ćelijamaokarakterisani su i receptori za: GRP, CGRP, insulin, somatostatin, ali još uvek nije poznatopreko kog signalnog puta i na koji naĉin deluju na acinusnu ćeliju.Sem što luĉe pankreasne enzime, acinusne ćelije imaju mogućnost i luĉenja izotoniĉnog rastvoraNaCl. Za njegovo luĉenje odgovorni su, pre svega, kanal za Cl-, pozicioniran na apikalnoj stranimembrane acinusne ćelije, i NKCC transporter na bazolateralnoj strani. Ovaj transport seodigrava zahvaljujući Na+/K+-ATPazi na bazolateralnoj membrani, koja odrţava nizak nivo Na+u ćeliji, na osnovu kog operiše NKCC transporter, koji treba da ubaci Cl- . Cl- se sada nagomilava u ćeliji i kroz ovaj kanal za Cl- koji se nalazi na apikalnojmembrani izlazi. Na taj naĉin doprinosi stvaranju izotoniĉnog rastvora NaCl u lumenuduodenuma. Na+ prati Cl- pasivno tj. paracelularno, preko “tesnih” pora zajedno sa H2O, a H2Oprolazi još i kroz akvaporine koji se nalaze na acinarnim ćelijama. K+ koji se ubacuje u ćeliju,zahvaljujući radu Na-K ATPaze, se izbacuje preko kanala za K+ koji se nalazi na bazolateralnojmembrani. Na proces stvaranja ovog izotoniĉnog rastvora NaCl utiĉu acetilholin, holecistokinin igastrin oslobaĊajući peptid (GRP). Zna se da utiĉu preko Ca-signalnog puta, ali se ne zna krajnjiefekat tih signalnih puteva. Predpostavlja se da se fosforilišu kanali za K+ i Cl-. Epitelne ćelije duktusa dodaju baznu komponentu. Zašto se uopšte dodaje baznakomponenta? Za neutralizaciju kiselosti hrane koja dolazi iz ţeluca. Zbog toga je jako vaţnodelovanje ovih epitelnih ćelija kanalića pankreasa koje dodaju bikarbonate sadrţaju pankreasnogsoka. Cl-/HCO3- izmenjivaĉ ubacuje HCO3- u lumen duktusa. Sada da vidimo odakle Cl- i HCO3-u ćeliji. Izvor HCO3- je Na+-HCO3- kotransporter (NBC) i on ubacuje ova dva u ćeliju. Drugiizvor HCO3- je karboanhidraza koja katalizuje reakciju izmeĊu H2O i CO2, stvara se slabaugljena kiselina, koja disosuje na HCO3- i H+. Sad imamo problem nagomilavanja H+ u ćelijiduktusa. Njih izbacuje Na+/H+ izmenjivaĉ (NHE), koji funkcioniše zahvaljujući Na-K ATPazi, i
  • 102. 102H+ pumpa, koja troši ATP direktno i izbacuje H+ u intersticijum. Dakle, Na-K ATPazaomogućava funkcionisanje NHE i NBC-a. Sad se postavlja pitanje šta tu sad radi sekretin. Uĉili smo da sekretin utiĉe na stvaranjebikarbonatne faze pankreasnog soka. Sekretin se vezuje za svoje sekretinske receptore (SCTR) ipreko signalnog puta cAMP i PKA fosforiliše kanal za Cl- koji se nalazi na membrani na kojojse nalazi i Cl-/HCO3- izmenjivaĉ. Ovaj kanal za Cl- je, u stvari, transmembranski regulatorcistiĉne fibroze (CFTR). Dakle, njegovom fosforilacijom omogućen je izlazak Cl- i, praktiĉno,ovaj Cl- sada snabdeva Cl-/HCO3- izmenjivaĉ. S druge strane, sekretin utiĉe i na NBC (aktiviraga). Osim sekretina, na fosforilaciju CFTR kanala utiĉe i acetilholin. Acetilholin se vezuje zasvoje muskarinske receptore (M3) i preko DAG-a i IP3, Ca2+ i CaM zavisne protein kinazeaktivira PKC, koja sama po sebi ne moţe da fosofriliše CFTR, meĊutim moţe da podstaknefosforilaciju CFTR PKA. Znaĉi, ona samo ima mogućnost da pomogne fosforilaciju koju vršiPKA. Zna se da GRP stimuliše sekreciju bikarbonatne faze pankreasnog soka. Ne zna se kako.Zna se i da supstancija P inhibira stvaranje bikarbonatne faze pankreasnog soka. Isto se ne znakako i kojim signalnim putevima. Još je interesantno da neke epitelne ćelije pankreasnih kanalaposeduju još jedan kanal za Cl- koji se naziva ORCC (kanal za Cl- sa izlaznom rektifikacijom).On operiše na jedan specifiĉan naĉin. Kada se aktivira CFTR, on na nepoznat naĉin aktivira iomogućava izlazak ATP-a iz epitelne ćelije u lumen kanalića. U lumenu kanalića ATP se vezujeza svoje purinske receptore za ATP i ovako aktivirani receptori autokrino deluju na ORCC iomogućavaju izlazak Cl-. Znaĉi, on dodatno potpomaţe izlazak Cl-, ali je neophodna inicijalnaaktivacija CFTR. Na sliĉan naĉin se dodaje bikarbonatna faza i pljuvaĉnom soku i ţuĉnom soku. Kada smo priĉali o ABC proteinima rekla sam da ćemo lepo objasniti kako funkcionišuovi proteini kad budemo radili CFTR. CFTR je jedan kompleksan protein koji se sastoji iz dvadomena koji prolaze kroz membranu (MSD 1 i 2). Oni imaju po 6 transmembranskih domena.MeĊusobno su povezani preko NBD1 (nucleotid binding domen-domen koji vezuje nukleotide),a sa druge strane se nalazi NBD2 (iza MSD2). Cela jedna polovina (MSD1 i NBD1) je povezanasa drugom (MSD2 i NBD2) regulatornim (R) domenom. CFTR predstavlja glikoprotein od170kDa i ulazi u veliku grupu proteina koji se nazivaju ABC transporteri (transporteri koji imajuATP vezujući motiv). Ovaj motiv se kod CFTR-a nalazi u okviru NBD 1 i 2. Ovaj dugaĉki
  • 103. 103regulatorni domen citosola je izuzetno vaţan i ukoliko doĊe do delecije samo jedneaminokiseline i to fenilalanina na 508.mestu nastaje bolest cistiĉna fibroza. Da vidimo na koji naĉin funkcionišu ABC proteini, CFTR. Na slajdu se vidi kako izgledaCFTR kada je zatvoren. Kanal za Cl- je zatvoren, zato što je R domen defosforilisan. Da bi došlodo otvaranja kanala neophodna je fosforilacija koju vrši PKA kojoj moţe da pomogne PKC.PKA ima mogućnost da fosforiliše u okviru R domena nekoliko mesta. Od stepena fosforilacijezavisi otvorenost ovog molekula. Poĉetna, umerena fosforilacija dovodi do konformacionihpromena (odvaja se NBD1 i postaje dostupan za vezivanje prvog ATP-a). Dalja fosforilacijedovodi do toga da i NBD2 moţe da veţe sledeći ATP. ATP se vezuje za NBD1 što dovodi dotrenutnog otvaranja kanala za Cl- (flickery znaĉi treperavo), ali ĉim ATP hidrolizuje i odvoje seADP i Pi, on se ponovo zatvara. Da bi kanal ostao u stabilnom otvorenom stanju, neophodno jeda se veţe i drugi ATP. Kada se veţe drugi ATP, on se posebno stabilizuje u otvorenom stanju istoji otvoren dok god su za njega vezani ADP i Pi. Kada se odvoje ADP i Pi sa NBD2 mesta,molekul se zatvara i protein fosfataza vrši defosforilaciju R domena i vraća ga u stanjemirovanja. Još jednom da podsetim da ovu inicijalnu fosforilaciju vrši PKA, dok PKC sama posebi ne moţe da fosforiliše CFTR, meĊutim moţe da podstakne fosforilaciju koju vrši PKA. I dapodsetim, osim CFTR na nekim epitelnim ćelijama nalaze se i ORCC kanali, koji mogu da seaktiviraju kada se aktivira CFTR. Kako i zašto nastaje cistiĉna fibroza? Delecija samo jedneamino kiseline, u pitanju je fenilalanin na 508. mestu, dovodi do toga da ovaj kanal postajenefunkcionalan. Njega odmah prepoznaju unutarćelijski ćelijski odeljci (ER) i uništavaju ga.Posledica toga je da na membrani epitelne ćelije postoji manjak kanala za hlor. Ĉim ima manjibroj kanala za hlor, on ne moţe da izaĊe iz ćelije i ne moţe da snadbe Cl/HCO3 izmenjivaĉ kojije u stvari odgovoran za dodavanje bikarbonatne komponente. Osnovni simptomi su stradanjedva tkiva: pluća i pankreasa. Pankreas: normalno se stvaraju enzimi i vrši se njihova sekrecija. MeĊutim, ne dodaje imse bikarbonatna komponenta pa ovaj gust sekret moţe da se zaglavi u epitelnim kanalićima,dovodi do njihove opstrukcije, do širenja, dilatacije pankreasnih kanala i njihove zamenefibroznim tkivom. Otud i naziv cistiĉna fibroza. Takve osobe imaju probleme sa ishranom, zbogopsturkcije kanala digestivni enzimi ne mogu da dospeju u duodenum i ne mogu da razloţehranu.
  • 104. 104 Plućno tkivo: isti problem... Ne funkcioniše kanal, ne snabdeva izmenjivaĉ, izmenjivaĉne dodaje bikarbonatnu komponentu u disajne puteve, što znaĉi da se stvara izuzetno gust sekret.To dovodi do uĉestalih infekcija, do opsturkcije disajnih puteva i zamene plućnog parenhimafibroznim tkivom, što ovde dovodi do problema u disanju. Ljudi koji umiru od cistiĉne fibrozeumiru upravo zbog problema sa disanjem /disajnim putevima.Malopre smo pominjali akutni pankreatitis – rekli smo da akutni pankreatitis nastaje usledakutnog trovanja alkoholom, trovanja insekticidima i otrova škorpije Tityus trinitatis. Trovanje alkoholom Dve komponente koje se nalaze u alkoholu: holesterol estri i etil estri slobodnih masnihkiselina, dovode do oksidativnog stresa u acinusnoj ćeliji. Dolazi do destabilizacije lizozoma idestabilizacije zimogenih granula. Pojaĉana je sinteza pankreasnih enzima u zimogenimgranulama, ali se smanjuje njihova sekrecija. Pomenuli smo da se u zimogenim granulama stvarainhibitor pepsina. On nije dovoljan u sluĉaju kada se javlja abnormalnost zimogene granule(kada je došlo do prekomerne sinteze enzima). Tada dolazi do aktivacije proenzima unutarzimogenih granula (jedan molekul pepsina je dovoljan da autokatalitiĉki aktivira drugemoleklue) i to dovodi do nekroze acinusne ćelije. Nekroza dovodi do oslobaĊanja citokina, kojidalje aktiviraju pankreasne stelatne ćelije. Pankreasne stelatne ćelije oslobaĊaju Trail molekule(ligandi koji indukuju apoptozu, vezani su sa TNFom). Trail ligandi se vezuju za svoje receptore(Trail R1 i Trail R2) koje eksprimiraju oštećene acinusne ćelije (eksprimiraju i CD95). Na tajnaĉin se indukuje apoptoza acinusnih ćelija. S druge strane, dolazi do opstrukcije pankreasnogkanala, što aktivira NOTCH i Hedgehog put, što dovodi do metaplazije, neoplazije kanala i moţedoći do nastanka tumora. Regulacija luĉenja pankreasnog soka Poĉinje da se luĉi kada vidimo, okusimo ili osetimo miris hrane. To se dešava da bipankreasni enzimi već bili tu kada dospe hrana. Gastriĉna faza je zanemarljiva, a najvaţnija jeintestinalna faza (kada je hrana dospela u duodenum) i kada su se izluĉili: acetilholin,holecistokinin i sekretin.
  • 105. 105 Sekrecija pljuvaĉnog soka Postoje tri vrste pljuvaĉnih ţlezdi: 1) zaušne pljuvaĉne ţlezde - stvaraju iskljuĉivoamilazu, 2) podjeziĉne stvaraju i mukus i amilazu (više mukusa), i 3) podviliĉne - stvaraju imukus i amilazu (više amilaze, a manje mukusa). U regulaciji sekrecije pljuvaĉnog sokadominira nervna kontrola. Za egzocitozu zimogenih granula neophodan je Ca2+. Do povećanjakalcijuma dolazi kada se acetilholin veţe za M3 receptore, ali i noradrenalin ako se veţe zasvoje α1 receptore. Osim toga, supstanca P se veţe za svoje NK1 receptore. Svi oni deluju prekoαq subjedinice, fosfolipaze C, IP3 i DAG-a. Na taj naĉin dovode do povećanja koncentracije Ca2+i egzocitoze granula sa amilazom ili mucinom (u zavisnosti od toga da li je to serozna ilimukozna ćelija). Noradrenalin koji se veţe za β1 receptore, dovodi do povećanja cAMP-a, a štose tiĉe ATP-a, on se kolokalizuje u granulama sa noradrenalinom i sa njim se zajedno oslobaĊa.ATP se vezuje za svoje purinske P2Z receptore i takoĊe utiĉe na egzocitozu granula.Acetilholin moţe da dovede do povećanja cGMP-a, preko azot oksida i guanilat ciklaze, i timepoveća sekreciju zimogenih granula preko ovog signalnog puta. Kao što je sluĉaj sa pankreasnim ćelijama, i ćelije pljuvaĉnih ţlezda mogu da dobijuizotoniĉni rastvor NaCl . Isti mehanizam samo malo drugaĉija slika na slajdu. Kanal za hlor senalazi na bl membrani acinusne ćelije. NKCC2 snadbeva hlor i ubacuje ga zahvaljujući Na/KATP-azi, a kalijum koji se ubacuje ovim putem, se izbacuje zahvaljujući kanalu za kalijum kojise nalazi na bazolateralnoj membrani. Neurotransmiteri koji utiĉu na dodavanje NaClpljuvaĉnom soku takoĊe utiĉu preko kalcijuma. Smatra se da je u ovaj signalni put ukljuĉenafosforilacija kanala za hlor i fosforilacija kanala za kalijum. Epitelne ćelije kanalića pljuvaĉnih ţlezda modifikuju izotoniĉni sekret acinusnih ćelija nadrugaĉiji naĉin. Ćelije duktusa apsorbuju NaCl, a vrše sekreciju kalijuma i bikarbonata. Natrijumse apsorbuje iz lumena pljuvaĉne ţlezde u ćeliju duktusa preko epitelnog kanala za natrijum (nizgradijent koncentracije zahvaljujući Na+/K+ATP-azi koja se nalazi na bazolateralnoj membrani iodrţava nizak nivo Na+ u epitelnoj ćeliji). Drugi mehanizam apsorpcije Na+ je Na+/H+izmenjivaĉ (NHE) koji u zavisnosti od gradijenta koji stvara Na+/K+ATP-aza, ubacuje Na+ aizbacuje protone.
  • 106. 106 Hlor se reapsorbuje, iz pljuvaĉke u duktus, zahvaljujući Cl-/HCO3 izmenjivaĉu, sa jednestrane, a sa druge strane i kanal za hlor, kroz koji Cl- izlazi u intersticijum, i u manjoj meri tu senalazi CFTR kroz koji hlor moţe da se vrati. Sekrecija bikarbonata se vrši istovremeno - Cl-/HCO3 izmenjivaĉ koji ubacuje hlor ućeliju, a izbacuje bikarbonate. Poreklo bikrbonata - pretpostavlja se da je ukljuĉenakarboanhidraza. Sekrecija kalijuma se vrši pomoću K+/H+ izmenjivaĉa (izbacuju K+, a ubacujeprotone). Na taj naĉin se vrši apsorbovanje NaCl, a sekrecija kalijuma i bikarbonata. Ko utiĉe na sve ove procese? Ach koji se vezuje za muskarinske M3 receptore.Verovatno je da ceo ovaj proces ide preko Ca 2 signalnog puta, ali to još nije do kraja utvrĊeno.Ono što se zna to je da aldosteron omogućava apsorpciju Na , tako što povećava ekspresijuepitelnog kanala za Na i Na /K ATPaze. Interesantno je da ćelije duktusa pljuvaĉnih ţlezda mogu da sintetišu neke proteine poputkalikreina, α amilaze, ribonukleaze, faktora rasta (EGF, NGF) i da ih luĉe u lumen ili u krv. To jejedan nespecifiĉan proces koji je vezan za ćelije parijetalnog duktusa (osim što vrše procesereapsorpcije i sekrecije, vrše sintezu proteina).SJÖGRENOV sindrom – autoimunska bolest koja nastaje usled stvaranja antitela na ćelijepljuvaĉnih i suznih ţlezda. MeĊutim, nisu još detektovani proteini na koje se ustremljuju ovaantitela. Sekrecija ţeludaĉnog soka Fokusiraćemo se sad na dva tipa ćelija: parijetalne (oksintiĉne) ćelije koje stvaraju HCl ina endokrine ć. koje se nalaze u jamicama tela zeluca - histaminocite, D i G ćelije. Faktori kojiutiĉu na stvaranje HCl su pre svega Ach, histamin i gastrin. Sva tri deluju direktno - vezuju se zasvoje receptore na oksintiĉnim ćelijama (Ach za muskarinske M3 receptore, histamin za svojeH2 receptore i gastrin za holecistokininske receptore tipa B). Mogu da deluju i indirektno: Ach igastrin se vezuju za receptore na LCL ćelijama (histaminocitama) i dovode do oslobaĊanjahistamina koji deluje sada parakrino. Mi ćemo se fokusirati na gastrin, kojeg stavaraju G ćelije ţeludca i duodenuma. Gastrinse stvara u formi progastrina, velikog polipeptida koji podleţe posttranslacionim modifikacijama
  • 107. 107- procesu isecanja i C-terminalnoj amidaciji (dodavanje amino grupe na C-terminus). Postojedva tipa gastrina, takozvani mali (17 a.k.) i veliki (34 a.k). Mali je aktivniji i prvenstveno gastvaraju G ćelije antruma, dok se veliki sporije degradira i luĉe ga, prevashodno, D ćelijeduodenuma. Interesantno je da je za maksimalnu aktivnost gastrina neophodna sekvenca na Cterminusu od 5 aminokiselina, koja je identiĉna sekvenci koju poseduje holecistokinin na svomC-terminusu. Zato nije ni ĉudo što se vezuju za iste receptore. Dakle, ovi faktori koji modulišu oslobaĊanje HCl mogu delovati direktno i indirektno.Direktno dejstvo faktora. da poĉnemo sa Ach: oslobaĊa se na krajevima postganglijskih vlakanaparasmpatiĉkog nervnog sistema, vezuje se za M3 receptore na oksintiĉnim ćelijama i preko αqsubjedinice, PLC, IP3 i DAG-a i PKC, dovodi do aktivacije PKD na naĉin na koji deluje igastrin. Dakle, gastrin deluje preko istog signalnog puta i krajnji efekat su aktivacija PKC ikalmodulin zavisne protein kinaza. Zbog prisustva istih sekvenci na C-terminusu vezuju se zaiste receptore. Pri tom, CCKb ima isti afinitet za vezivanje gastrina i holecistokinina, dok se zaCCKa vezuje holecistokinin većim afinitetom. TakoĊe, Ach moţe i direktno da deluje na kanaleza Ca 2 koji se nalaze na bazolateralnoj membrani i tako dodatno podstiĉe ulazak Ca 2 uoksintiĉne ćelije. Treći parakrini faktor, histamin koji se vezuje za H2 receptore i deluje preko signalnogputa na A: αs subjedinice, adenil ciklaze, i krajnjeg efektora PKA. PKA, PKC i kalmodulinzavisna kinaza imaju ulogu u fosforilaciji K-H pumpe (ispumpava protone i upumpava K uzutrošak ATPa). Sve ovo moţe da moduliše somatostatin. On se sintetiše i oslobaĊa iz D ćelijaantruma i D ćelija tela ţeludca. TakoĊe, prostaglandin E2 se vezuje za svoje prostaglandinskereceptore tipa 3 i zajedno sa somatostatinom, preko αi subjedinice inhibiraju ovaj put i dovodedo smanjenja luĉenja HCl. Na taj naĉin antagonizuju dejstvo histamina. Sa druge strane, mogudelovati indirektno - na histaminocite i da inhibiraju luĉenje histamina sa jedne strane, ali i dadeluju na G ćelije i inhibiraju luĉenje gastrina. Dakle, preko ovog signalnog puta somatostatin iprostaglandin poništavaju delovanje histamina, a sa druge strane deluju direktno tako štosmanjuju oslobaĊanje i histamina i gastrina. To smo pominjali kada smo priĉali o Helicobacterpilory, koja inhibira oslobaĊanje somatostatina i na taj naĉin dodatno podstiĉe sekreciju HCl-a.
  • 108. 108 Na koji naĉin je regulisana sinteza HCl? U principu, izmeĊu obroka pumpa koja vršisekreciju HCl-a se nalazi u obliku tubulovezikula koja sadrţi pumpe i kanale za K i Cl .Nakon obroka dolazi do citoskeletnog rearenţmana i ove tubulovezikule postaju sastavni deomembrane kanalikula oksintiĉnih ćelija. Na taj naĉin se membrana povećeve 50-100 puta i kanalii pumpa se eksprimiraju. Pumpa je P tip ATPaze ili E1-E2 koja se sastoje iz 2 subjedinice: α-katalitiĉka funkcija i β-omogućava pozicioniranje na membrani. Ona ispumpava protone iupumpava K . K se odmah preko kanala reciklira i vraća u lumen kanalikula dok Cl prolazikroz karbo. Izvor H+ je karboanhidraza koja katalizuje reakciju izmeĊu CO2 i H2O stvara se slabaugljena kiselina koja disosuje na protone i bikarbonate. H+ snabdevaju pumpu, a HCO3bikarbonatno-hloridni izmenjivaĉ. Dakle, bikarbonati se izbacuju iz ćelije, a hloridi se ubacuju ućeliju i upravo taj Cl napušta oksintiĉnu ćeliju kroz kanal za hlor. I na taj naĉin se stvarahlorovodoniĉna kiselina. Kako funkcionišu lekovi koji se primenjuju u terapiji gastritisa ili u terapiji ĉira naţelucu? Najviše primenjivan lek je omeprazol koji inhibira ovu protonsku pumpu. On sekovalentno vezuje za cistein koji je u ekstraćelijskom domenu α subjedinice. I postoji još jedaneksperimentalni lek (još uvek se ne zna kako se zove), ali on je inhibitor K+, odnosno vezuje seza mesto za K+ na ovoj pumpi. Regulacija sekrecije ţeludaĉnog soka Da krenemo od acetilholina koji se luĉi na krajevima postganglijskih vlakana. On sedirektno vezuje za oksintiĉne ćelije i na malopre pomenut naĉin dolazi do sekrecije HCl. Vezujese i za ECL ćelije i dovodi do oslobaĊanja histamina. Postoje i postganglijska vlaknaparasimpatiĉkog nervnog sistema koji stvaraju peptide umesto acetilholina. Jedna takva vrstapostganglijskih vlakana su vlakna koja oslobaĊaju GRP (gastrin releasing peptide). Kad seoslobodi sa ovih vlakana on se vezuje za G ćelije antruma i dovodi do oslobaĊanja maloggastrina koji ulazi u cirkulaciju, deluje na oksintiĉnu ćeliju ili na ECL ćeliju. Acetilholin inhibira D ćelije. To je jedna fina vrsta povratne sprege; podstiĉe luĉenje HCli inhibira, s druge strane, stvaranje inhibitora. Vezuje se za svoje receptore na D ćelijama iinhibira luĉenje somatostatina koji deluje parakrino (jer se izluĉuje iz D ćelija koje se nalaze ujamicama), a vezuje se i za svoje receptore na D ćelijama antruma i inhibira delovanje
  • 109. 109somatostatina koji bi delovao endokrino, odnosno koji bi se izluĉio u cirkulaciju i prekocirkulacije bi došao i vezao se za svoje receptore na oksintiĉnoj ćeliji i inhibirao luĉenje HCl. Kada gastrin isprovocira stvaranje HCl i kada se on nagomila, taj HCl sada aktivira Dćelije antruma, što znaĉi da dolazi do oslobaĊanja somatostatina, somatostatin se luĉi ucirkulaciju i inhibira stvaranje HCl. Fina povratna sprega preko gastrina i somatostatina kojureguliše nivo HCl. Kada ga je malo, gastrin se neometano izluĉuje, a Ach inhibira sekrecijusomatostatina, a kada se nagomila HCl, on direktno deluje na D ćelije, oslobaĊa se somatostatinkoji spušta nivo sekrecije HCl. Na sekreciju HCl utiĉu još sekretin i GIP (gastrin-inhibitorni polipeptid). GIP inhibiraoslobaĊanje gastrina. Sekretin stimuliše sekreciju somatostatina. A sekretin i GIP mogu nadirektan naĉin da inhibiraju sekreciju protona.Zollinger-Ellison-ov sindrom – posledica ovog sindroma je povećana sekrecija HCl, a uzrok jeneobiĉan. Nastaje usled gastrinoma, tumora ćelija duodenuma, al ii usled tumora pankreasnihostrvaca (ne zna na koji naĉin tumor pankreasnih ostrvaca utiĉe na povećanje koncentracijegastrina). Koncentracija gastrina se enormno povećava kod ovog sindroma, što dovodi dopovećanje koncentracije HCl i do gastritisa. Kako se leĉi ovaj sindrom? Inhibitorom protonskepumpe (omeprol ili omeprazol) i blokatorima receptora za histamin. Molekularni mehanizmi sekrecije ţuĉi Ţuĉ stvaraju hepatocite koje luĉe ţuĉ u ţuĉne kanaliće i kako sekret prolazi kroz ţuĉnekanaliće menja se njegov sadrţaj. U periportalnom kanalu se dodaje bikarbonatna i vodena faza itako nastala ţuĉ ulazi u velike ţuĉne puteve – ductus hepaticus, zatim u ţuĉnu kesu gde sekoncentruje i koncentrovana ţuĉ se izbacuje izmeĊu obroka na isto mesto gde se izluĉuje ipankreasni sok. Ţuĉi se dodaje bikarbonatna faza u holangiocitama (epitelni kanalići izmeĊu hepatocita).Bikarbonate dodaje hloridno-bikarbonatni izmenjivaĉ, upumpava Cl-, ispumpava HCO3-, poentaje da se ţuĉnom soku dodaju bikarbonati. Odakle bikarbonati? Zahvaljujući natrijum-bikarbonatnom kotransporteru i karbon hidrazi. Karbon hidraza stvara bikarbonate, ali stvara iprotone. Protone prihvata natrijum-protonski izmenjivaĉ i pumpa za protone.
  • 110. 110 Natrijum-protonski izmenjivaĉ i natrijum-bikarbonatni kotransporter funkcionišuzahvaljujući gradijentu Na+ koji stvara Na+/ K+ATPaza. Nizak nivo Na omogućava rad NHE(Na/H izmenjivaĉ) i NBC (Na/HCO3 kotransporter). Na dodavanje bikarbonata utiĉe sekretin. Pitanje: šta sve radi sekretin? Dodajebikarbonatnu fazu pankreasnom soku, dodaje bikarbonatnu fazu ţuĉnom soku, stimulišestvaranje crevnog soka, odnosno delovanje na Liberkinove kripte i Brunerove ţlezde. Na koji naĉin sekretin dodaje bikarbonatnu fazu ţuĉnom soku? Kao i kod pankreasa,preko cAMP i PKA, fosforiliše CFTR, odnosno kanal za Cl, kroz taj kanal izlazi Cl kojisnadbeva Cl/HCO3 izmenjivaĉ. Na isti naĉin deluju i glukagon i VIP. Znaĉi, sekretin, glukagoni VIP podstiĉu dodavanje bikarbonata ţuĉnom soku, a somatostatin inhibira. Ono što je interesantno je da holangiocite imaju mogućnost reapsorbovanja vode ielektrolita, tj.imaju mogućnosnost da zgušnjavaju sekret u sluĉaju kada je hirurški odstranjenaţuĉna kesa. Kada je odstranjena ţuĉna kesa, holangiocite na neki naĉin preuzimaju njenu ulogu.U ţuĉnoj kesi se ţuĉ koncentruje 10-20 puta tako što se reapsorbuje voda, Na, Cl.Na+ se reasporbuje delovanjem Na/H izmenjivaĉa iz lumena ţuĉne kese u ćelije zida ţuĉne kese;a na drugu stranu, u intersticijum, dejstvom Na/K ATPaze.Što se tiĉe Cl-, on se reapsorbuje dejstvom Cl/HCO3 izmenjivaĉa u ćelije zida ţuĉne kese, aposredstvom kanala za Cl u intersticijum.Voda i bikarbonati prolaze paracelularno, a voda takoĊe prolazi i transcelularno.VIP i serotonin inhibiraju ovaj proces zgušnjavanja ţuĉi. Ţuĉ u ţuĉnoj kesi nakon zgušnjavanja sadrţi koncentrovani rastvor ţuĉnih soli,holesterol, bilirubin i zbog delovanja N/H izmenjivaĉa ostaje velika koncentracija protona. Zaštovelika konc. H? Zbog spreĉavanja stvaranja kamena u ţuĉi, tzv.pigmentnog kamena. Kamen uţuĉi nastaje precipitacijom Ca, CaCO3, Ca-bilirubinata, SMK. A povećana konc. H spreĉavapojavu pigmentnog kamena povećavanjem restvorljivosti kalcijumovih soli i onemogućavajućiprecipitaciju Ca. MeĊutim, najveća koliĉina kamena u ţuĉi, tzv. Cholelithiaza nastaje usledprecipitacije holesterola na mukozi zapaljene ţuĉne kese. Holesterol, kojeg ostaje 3-9 puta višekoncentrovanjem sadrţaja ţuĉne kese, ne moţe da precipitira na ţuĉnoj kesi jer se tu nalaze i
  • 111. 111fosfolipidi i ţuĉne soli koji grade micele. Kada se zapali epitel ţucne kese, tada se dodatnopovećava apsorpcija vode, uklanjaju se ţuĉne soli i pojaĉava se sekrecija holesterola, što znaĉi datada u ţuĉnoj kesi ima znaĉajno više holesterola, ali fali ono što ce da ga rastvori, što će danapravi te micele, odnosno, nedostaju ţuĉne soli. Zbog toga u sluĉaju zapaljenja epitela ţuĉnekese dolazi do precipitacije holesterola i nastanka najĉešće vrste kamena u ţuĉnoj kesi, kojanastaje zbog nagomilavanja holesterola. Poznata slika, ţuĉne soli su komponente ţuĉnog soka i one su neophodne za emulgacijumasti. U duodenumu se masti prevode u veliki broj sitnih masnih kapi na koje moţe da delujehidrofilna lipaza sa jedne strane i sa druge strane opet omogućavaju stvaranje micela i praktiĉnoreapsorbovanje masti u enterociti. Organizam ne troši veliku energiju za stvaranje ţuĉnih soli, od0,5g dnevno koliko stvori toliko i izbaci, a tokom celog dana te ţuĉne soli recirkulišu iz creva ukrvotok i nazad u hepatocite i tako, u zavisnosti od toga koliko jedemo i kakvu vrstu hranejedemo (ako jedemo masnu hranu, one recirkulišu i do 12 puta dnevno). One se izbacuju iz ţuĉnekese u vidu konjugovanih ţuĉnih soli i do terminalnog ileuma je manji procenat apsorpcije.Zašto je to tako? Do terminalnog ileuma apsorpija ţuĉnih soli je minimalna. Zašto? Zato što seone na tom putu emulguju. Minimalno se apsorbuju do terminalnog ileuma i ako se apsorbuju,apsorbuju se pasivno. Najveći deo apsorpcije se odvija u nivou terminalnog ileuma i u pitanju jeaktivna apsorpcija, deluje ASBT-a. U pitanju je transporter koji transportuje … nalazi se naapikalnom delu ćelije i to je transporter Na i ţuĉnih soli. To je transporter koji transportujeaktivno natrijum zajedno sa konjugovanim ţuĉnim solima u samu ćeliju, meĊutim, sa drugestrane se nalazi izmenjivaĉ koji izmenjuje anjone, ne zna se taĉno koje. Ono što se zna jeste da jeon Na-nezavisan, nije vezan za transport Na. Ono malo što pobegne ţuĉnih soli izmenjivaĉu i štose pasivno ne reapsorbuje doĉekaju bakterije zadnjeg dela kolona koje vrše dekonjugovanjeţuĉnih soli, pa se one mogu pasivno reapsorbovati, ali oslobaĊaju se 7α dehidroksilaze koje vršeprevoĊenje primarnih ţuĉnih soli u sekundarne, to su dezoksiholna i litoholna. Sada imamo situaciju da su se pasivno reapsorbovale nekonjugovane ţuĉne soli i aktivnosmo reapsorbovali u najvećem procentku konjugovane ţuĉne soli i sada one treba da se vratenazad u hepatocitu. U hepatociti će da se modifikuju i da se ponovo izluĉe u ţuĉne kanaliće. Davidimo na koji naĉin se to dešava. Nekonjugovane ţuĉne soli su uglavnom vezane za albumin.Ono što je interesantno je da albumin na neki naĉin povećava afinitet transportera za
  • 112. 112konjugovane i nekonjugovane ţuĉne soli, a taj transporter se naziva Na-tauoholatkotransportni polipeptid (NTCP) – on kontransportuje Na zajedno sa konjugovanom ţuĉnomkiselinom – tauroholnom kiselinom. Sam naslov kaţe da on transportuje konjugovane ţuĉne soli,ali on ima mogućnost i da transportuje nekih 50% nekonjugovanih ţuĉnih soli. Drugi transporterje transporter transportni protein organskih anjona – to je stari naziv. Sada se nazivaSLCO1A2 ili OATP-A. Transportni protein koji ima mogućnost da transportuje nekonjugovaneţuĉne soli. Ostalih 50% nekonjugovanih ţuĉnih soli se transportuje pasivno, znaĉi one sepretvaraju u ţuĉne kiiseline, pasivno ulaze u hepatocitu gde disosuju i tu se u ćeliji konjuguju,dodaju im se sulfati i glukuronati ili im se dodaju glicin i taurin. Tada u ćeliji imamo novekonjugovane ţuĉne soli, a one konjugovane ţuĉne soli koje su bile transportovane aktivno uterminalnom ileumu, one se takoĊe transportuju zahvaljujuci NTCP-u. U ćeliji se vezuju zavezujuce proteine, to su dihidrodiol dehidrogenaza, glutation-S-transferaza, FFA-BP(vezujući protein slobodih masnih kiselina). Oni proteini ih drţe do momenta izluĉivanja, a kadadoĊe vreme za izluĉivanje bilo ovih konjugovanih bilo ovih koje su se konjugovale u ćeliji, onese izluĉuju u lumen kanalića preko 2 pumpe, jedna je BSEP, to pumpa za ţuĉne soli koja trošienergiju i ona vrši transport iskljuĉivo ţuĉnih soli konjugovanih sa glicinom i taurinom. Drugitransporter je ABC protein koji smo spominjali na prvom predavanju, to je MRP2 (multidrugresistance-associated protein – protein povezan sa rezistencijom na više lekova). On transportujeiskljuĉivo ţuĉne soli koje su konjugovane sa sulfatima i glukuronatima. To je protein koji imaATP vezujuće mesto. Ono što se zna je da mutacija MRP2 dovodi do progresivne familijarneintrahepatičke cholestaze tip3 , znaĉi dolazi do potpunog zastoja sekrecije ţuĉi, uslednedostatka ove pumpe, a ista takva bolest zove se progresivna familijarna intrahepatičkacholestaza tip2. Ona nastaje usled mutacije gena za BSEP. Osim što ima mogućnost transportaţuĉnih soli, hepatocite imaju uobiĉajene transportere, dakle zahvaljujući Na/K ATPaziodrţavaju nizak nivo Na, zahvaljujući PMCA odrţavaju nizak nivo Ca. Zašto se odrţava nizaknivo Na? Da bi mogao da radi Na/H izmenjivaĉ, da bi funkcionisao Na/HCO3 kontransporter, dabi funkcionisao kontransporter za Na/AA I da bi funkcionisao NTCP. Šta je NTCP? Maloprepomenuti Na-tauroholat kotransportni polipeptid, Na/K ATPaza koja odrţava nizak gradijent iomogućava funkcionisanje svih ovih transportera. Glukoza se u hepatocite ubacuje prekoGLUK2, u pitanju je transporter koji je neosetljiv na insulin.
  • 113. 113 Što se tiĉe sekrecije organskih anjona, malopre pomenuti OATP-A – transporterorganskih anjona osim što transportuje nekonjugovane ţuĉne soli, moţe da transportuje u manjojmeri i ţuĉne boje, bilirubin i steroide i neke anjone kao što je npr sulfobromoftalein. Ovajtransportni polipeptid moţe da transportuje i 90% glutationa koji se sintetiše u jetri i kojiizbacuje u krv preko ovog transportera. To je jedan veoma vaţan molekul koji imaantioksidativnu funkciju. Ţuĉne boje – Odakle potiĉu ţuĉne boje? Odakle bilirubin? Nastaje raspadanjemhemoglobina. Bilirubin je vaţan sastojak zuĉi i daje boju ţuĉi. Na koji naĉin se sada bilirubinkoji se nalazi u krvi transportuje u hepatocite, a zatim u kanaliće? Opet malopre pomenutiOATP-2, samo se naziva po starom. Sliĉan transporter koji je malopre transportovao ţuĉne soliovde transportuje ţuĉne boje. Drugi naĉin transporta je bilitranslokaza, sama reĉ kaţe,transportuje bilirubin i treći je elektroneutralni mehanizam. Kada dospeju ţuĉne soli uhepatocite, tu se konjuguju i to se konjuguju iskljuĉivo sa glukuronskom kiselinom i takokonjugovane, zahvaljujuci MRP2, vrši se njegovo prebacivanje u ţuĉne kanaliće. Podsećanje:bilirubin koji je vezan za albumin, preko ova 3 mehanizma: ili OATP2 ili bilitranslokazom ilielektroneutralnim transportom dolazi u hepatocite, tu se konjuguje, preko MRP2 se ubacuje uţuĉne kanaliće. Iz ţuĉnih kanalića se deponuje u ţuĉnu kesu. Ko prazni ţuĉnu kesu?Holecistokinin. Praţnjenjem ţuĉne kese ovaj konjugovani bilirubin se izbacuje u duodenum, tuse pretvara u nekonjugovani bilirubin, koga bakterije pretvaraju u bezbojni urinobilinogen, on seprevodi u obojeni sterkobilin i daje boju fecesa. Kod ţutice, u zavisnosti od faktora nastanka,feces moţe da bude tamnozeleni ili beo, jer uopšte nema ţuĉnih boja itd.
  • 114. 114 Molekularni mehanizmi regulacije krvnog pritiska Krvni pritisak je pritisak koji krv vrši na zidove krvnih sudova kroz koje protiĉe i uzavisnosti od toga da li su to arterije, vene ili kapilari postoji arterijski, venski i kapilarni pritisak.Nas danas interesuje arterijski pritisak. Sistolni krvni pritisak u komori je 120 mmHg, a u aortikada je otvoren semilunarni zalistak je isto 120 mmHg, što znaĉi da je to pritisak u arteriji,odnosno u velikim venama. Pritisak u komori tokom dijastole, kada je ona opuštena je 0 mmHg,a u aorti je 80 mmHg, zato što je to izuzetno elastiĉan krvni sud koji se izboĉi i ima tendenciju dase vrati, tako da odrţava tonus i pritisak. Krvni pritisak raste od 80 do 120, zatim opada dodijastole. Dikrotski zubac je malo povećanje pritiska kada se krv vrati i zatvori zalistke. Od ĉega zavisi visina krvnog pritiska? Pre svega zavisi od udarnog volumena levekomore (što je veći udarni volumen, veći je pritisak) i od periferne vaskularne rezistencije,odnosno otpora protoku krvi. Sećamo se Poiseuille-Hagenove jednaĉine iz koje vidimo da jeotpor protoku krvi obrnuto srazmeran duţini krvnog suda i viskozitetu, a direktno srazmeranobimu i polupreĉniku. U fiziološkim uslovima je polupreĉnik jedini koji varira, pa moţemo rećida je ta varijabla kljuĉna za odreĊivanje visine krvnog pritiska. Sećate se da najveći pad krvnogpritiska u celom sistemu krvnih sudova imamo na mestu mišićnih arteriola, jer one imaju debeosloj mišićnih vlakana u zidu, mogu da menjaju svoj promer skoro 4 puta, pa pritisak moţe dapada od 85-35 mmHg. ΔP π r 4 Q 8 η L Visina krvnog pritiska zavisi i od osmolarnosti i zapremine vanćelijskih teĉnosti. Zato
  • 115. 115hipertenziĉarima lekari prvo ukidaju so u ishrani, jer so povećava osmolarnost i dovodi dozadrţavanja vode, to povećava zapreminu, što dovodi do povećanja arterijskog pritiska. Pritisakzavisi i od uzrasta i povećava se starenjem (deca imaju proseĉno 70 mmHg, u toku ţivotapovećava se do 95 mmHg, a u poznim godinama dostiţe 130 mmHg). Već smo rekli da zavisi iod elastiĉnosti arterija koja se naţalost tokom ţivota smanjuje, što je jedan od uzroka nastankaesencijalne hipertenzije. Pritisak zavisi i od plejade neurotransmitera i hormona kao što sukateholamini, vazopresin, aldosteron, angiotenzin II, endotelini, prostaglandini, bradikinini, VIP,NO, natriuretiĉki peptidi itd. Postoji podatak da je 2006. godine 17,5 miliona ljudi umrlo od kardiovaskularnih bolesti,u 99% sluĉajeva bolest je nastala usled hipertenzije, dakle to je veliki faktor rizika. MeĊutim, bezobzira što je stvarno veliki deo nauĉne javnosti fokusiran na istraţivanja esencijalne hipertenzijejoš uvek je nepoznat taĉan razlog nastanka ove bolesti. U koronarnim krvnim sudovima naprimer, ali i u ostalim, moţe doći do nagomilavanja masnih naslaga, smatra se da veliku ulogu utome ima genetski faktor i naĉin ţivota. Ukoliko ste nasledili loš lipidni metabolizam,nagomilava se LDL holesterol, a ukoliko pri tom ne vodite raĉuna o ishrani, jedete masnu hranu,ne bavite se fiziĉkim aktivnostima pa ni ne trošite lipide koje unosite, a zbog loše genetike vamje zid krvnog suda prijemĉiv za LDL holesterol, on se taloţi, dovodi do suţavanja krvnog suda,što povećava rizik od nastanka plaka, pucanja ili zaĉepljenja krvnog suda. Udarni volumen zavisi od snage i frekvencije rada srca. Srce je inervisanoparasimpatiĉkim i simpatiĉkim nervnim sistemom. Simpatiĉka inervacija podrazumeva da sekrajevi postganglijskih vlakana simpatikusa završavaju na SA ĉvoru, samim tim smanjuju tonus,a u manjoj meri se nalaze i na AV ĉvoru i na miokardu pretkomora. Što se tiĉe parasimpatiĉkeinervacije, vlakna se završavaju pre svega na SA ĉvoru, svuda postoje nastavci ovih vlakana, anajviše na miokardu komora, ĉime parasimpatikus utiĉe na snagu srca. Srţ nadbubreţne ţlezdepredstavlja transformisanu simpatiĉku gangliju koja je izgubila svoje postganglijske nastavke,tako da direktno u cirkulaciju luĉi noradrenalin i adrenalin, hormone koji su srodnineurotransmiterima simpatiĉkog nervnog sistema. Parasimpatiĉki nervni sistem ima negativan hronotropni, inotropni, batmotropni idromotropni efekat (usporava rad srca, smanjuje snagu, provodljivost i nadraţljivost). Sve efekteostvaruje pomoću acetilholina koji se oslobaĊa na krajevima postganglijskih nastavaka i vezuje
  • 116. 116za muskarinske M2 receptore na ćelijama SA ĉvora. Dolazi do odvajanja α subjedinice od Gproteina i βγ subjedinica aktivira GIRK kanal za kalijum, kroz koji kalijum izlazi iz ćelije. Todovodi do hiperpolarizacije i do brahikardije, odnosno, postiţe se miran vagusni tonus od oko 70otkucaja u minuti. Sa druge strane, stimulacija simpatikusa ima pozitivno hronotropni pozitivno inotropni,pozitivno batmotropni, pozitivno dromotropni efekat na rad srca. Simpatiĉki nervni sistem delujepreko noradrenalina koji se vezuje za β1 receptore na ćelijama SA ĉvora. β1 receptori su uvekspregnuti sa „putem A“ tj. dolazi do aktivacije adenil ciklaze, stvara se cAMP koji aktivira PKA.cAMP takoĊe dovodi do aktivacije HCN4 kanala. To su hiperpolarizacijom aktivirajući kanalikoji su zavisni od cAMP-a. To znaĉi da mogu da se otvaraju kada se na njih veţe cAMP uodgovoru na neurotransmitere, a sa druge strane oni se spontano otvaraju u odgovoru na voltaţnuhiperpolarizaciju i upravo tako ostvaruju svoj pejsmejkerski efekat. Otvaranje HCN4 kanaladovodi do stvaranja funny struje, pošto su ovi kanali nespecifiĉni i propuštaju i K+ i Na+. UlazakNa+ izaziva poĉetnu depolarizaciju koja otvara T kanale za kalcijum (to su tranzitorni kanali kojise brzo otvaraju i brzo zatvaraju). Ulazak Ca2+ stvara kalcijumsku struju koja dovodi do okidanjaakcionog potencijala. Ubrzanje frekvencije srca, srĉani ciklus, se skraćuje na raĉun dijastole. Zato je tahikardijaopasna. Srce se manje odmara, a to je štetno pošto se srce snapdeva krvlju iskljuĉivo tokomdijastole, tokom sistole su koronarne arterije komprimovane. Što se tiĉe negativnog inotropnog efekta noradrenalina i adrenalina, on se takoĊe odvijapreko β1 receptora koji se nalaze na kardiocitama. Ovi receptori su vaţni zato što se jednageneracija antihipertenziva zasniva na njihovoj blokadi. αs subjedinica G proteina aktivira adenilciklazu koja stvara cAMP, koji aktivira PKA. PKA dovodi do fosforilacije L kanala za kalcijum(to su dugoţiveći, dugootvoreni kanali) koji se nalaze na sarkolemi i T tubulama. T tubule suinvaginacije sarkoleme koje dovode u vezu L kanale sa CIC kanalima koji se nalaze nasarkoplazmatiĉnom retikulumu i dovode do Ca2+ indukovanog oslobaĊanja Ca2+. Ca2+ koji je uSR bio vezan za kalsekvestrin (protein koji ima ĉak 50 vezujućih mesta za Ca2+) izlazi i vezujese za miofibrile. Ca2+ se vezuje za troponin C, dovodi do izmeštanja troponina sa miozinskeglavice, što joj omogućava da uspostavi vezu za aktinom i vesla dovodeći do skraćivanjamišićnog konĉića i kontrakcije. L kanal za Ca2+ se nalazi na sarkolemi, njega PKA fosforiliše i
  • 117. 117dovodi do ulaska Ca2+ u ćeliju. Drugi kanal za Ca2+ nalazi se na SR i naziva se rijanodinskireceptor (Ryr) jer se za njega vezuje rijanodin. Postoje razliĉite izoforme, ali je izoforma Ryr2prisutna iskljuĉivo na SR. On je deo velikog kompleksa koji se nalazi na SR i u citosolu, a kogaĉine kalmodulin (CaM) koji vezuje Ca2+, kalmodulin zavisna kinaza 2 (CaMII), protein kinaza A(PKA), kalstabin koji stabilizuje otvaranje i zatvaranje Ryr receptora, protein fosfataza 1 iprotein fosfataza 2A (PP1 i PP2A su enzimi koji uklanjaju fosfatne grupe koje dodaje kinaza).To je veliki kompleks koji uĉestvuje u finoj regulaciji oslobaĊanja Ca2+ iz SR. Kada kalstabin nemoţe da se veţe za Ryr, što se dešava kada je Ryr hiperfosforilisan, dešava se da Ca 2+ curi krozkanal i to ima znaĉajne posledice. PKA fosforiliše rijanodinske receptore na serinu, a kalmodulinzavisna kinaza II ga fosforiliše na treoninu i tako ga aktivira. Balans Ca2+ zavisi od: L kanala zaCa2+ (kroz koji Ca2+ ulazi), od Ryr receptora (kroz koji Ca2+ izlazi), ali i od SERCA2A koja senalazi na sarkoplazmatiĉnom retikulumu i koja omogućava ubacivanje Ca2+. Tokom kontrakcijeza SERCA2A je vezan fosfolamban i na taj naĉin je inhibirana. Tokom relaksacije, odnosnodijastole, PKA fosforiliše fosfolamban, što ga inaktivira, a to aktivira SERCA pumpu. SERCAtada upumpava višak Ca2+ u SR i omogućava završetak kontrakcije. Na taj naĉin, adrenalin,preko β1 receptora ubrzava nastupanje dijastole i samim tim srĉani ciklus. Na promet Ca2+ utiĉe iNCX, izmenjivaĉ koji se takoĊe nalazi na sarkolemi i koji izbacuje Ca2+ iz ćelije, a ubacuje Na+. Na koji naĉin su regulisane kontrakcija i relaksacija? Tokom relaksacije, Ca2+ disosuje odTnC, a β1 agonisti ubrzavaju relaksaciju promovišući fosforilaciju TnI (deo troponinskogkompleksa koji se vezuje za aktin). Fosforilacija TnI podstiĉe odvajanje Ca2+ od TnC ikontrakcija se završava. Srĉana insuficijencija nastaje usled hiperfosforilacije Ryr2 za koji se ne vezuje (ili seoteţano vezuje) kalstabin, pa kroz kanal curi Ca2+. Ukoliko Ca2+ ima više u citoplazmi, uslednefunkcionalnosti nekog od kanala, dolazi do ishemiĉne srĉane bolesti, nastaje hipertrofijamiokarda i atrijalna fibrilacija. Samim tim što se Ca2+ nagomilava u citosolu, aktivira se NCXkoji izbacuje jedan Ca2+, a ubacuje 3 Na+ što dovodi do depolarizacije i aritmije – poremećajaritma rada srca. Spregnutost L kanala za Ca2+ i Ryr2 (dovedeni su u blisku vezu uz pomoć trijadaT tubula-SR-T tubula) je bitna da bi se odigralo Ca2+-zavisno oslobaĊanje Ca2+.
  • 118. 118 Vazokonstriktori Promer krvnih sudova zavisi pre svega od aktivnosti simpatiĉkog nervnog sistema.Noradrenalin se luĉi na krajevima simpatiĉkih završetaka kojih ima manje u srcu, mišićima,mozgu, a više u GIT, bubrezima, koţi, slezini. Priĉali smo da je noradrenalin opštivazokonstriktor i kad se veţe za svoje α1 receptore, izaziva vazokonstrikciju, preko fosfolipazeCβ. Mnogi drugi vazokonstriktori ispoljavaju svoje dejstvo na isti naĉin. Preko αq subjedinice, sakojom je spregnut α1 receptor, aktivira se fosfolipaza Cβ koja razlaţe membranski PIP2 i nastajuIP3 i DAG. IP3 difunduje u citoplazmu i vezuje se za svoje IP3 zavisne kanale za Ca2+ (ovikanali su srodni Ryr kanalima koji ne postoje na ER glatkih mišića krvnih sudova). Izlazak Ca 2+omogućava translokaciju PKC u membranu, na nju moţe da deluje DAG koji dovodi dootvaranja kanala za Ca2+ kroz koji ekstraćelijski Ca2+ ulazi u ćeliju. Što se tiĉe Ca2+ u ER, on jevezan za kalretikulin (sliĉan kalsekvestrinu, kog i ovde ima, ali u manjoj koliĉini). Šta se dešavasa Ca2+ koji je izbaĉen u citoplazmu? Da li glatke mišićne ćelije imaju TnC i uopšte troponinskikompleks, T tubule? Nemaju. Taj Ca2+ se vezuje za kalmodulin, aktivira kinazu lakog lancamiozina (MLCK) koja fosforiliše regulatorni deo lakog lanca glavice miozina i omogućava njenoveslanje po aktinu. Preko α1 receptora deluje i adrenalin. Pominjali smo da adrenalin ima i vazodilatatorno ivazokonstriktorno dejstvo. Tokom stresa, kada se veţe za α1 receptore ostvarujevazokonstriktorno dejstvo u unutrašnjim organima (u gastrointestinalnom traktu, jetri i slezini), aistovremeno vazodilatatorno u mišićima. Slezina je vaţan depo krvi. U stresu se momentalnooslobaĊa velika koliĉina adrenalina što dovodi do kontrakcije kapsule slezine kod maĉaka (ĉimese kontrahuje cela slezina), a kod ljudi do konstrikcije krvnih sudova slezine i samim tim seizbacuje ogromna koliĉina krvi i eritrocita u sistemsku cirkulaciju, ĉime se povećava hematokritkako bi se mišići snabdeli kiseonikom. Noradrenalin pored toga što vrši vazokonstrikciju i povećava krvni pritisak, on se vezujeza svoje β1 receptore na jukstaglomerularnim ćelijama bubrega. Ove ćelije oslobaĊaju renin,hormon koji dovodi do isecanja α2 globulina koji se sintetiše u jetri, ĉime nastaje dekapeptidangiotenzin I. Na njega deluje angiotenzin konvertujući enzim i isecanjem ga prevodi u potentnivazokonstriktor angiotenzin II koji je oktapeptid. Angiotenzin II se vezuje za AT1A receptore ipreko αq subjedinice, fosfolipaze C, DAG i IP3 dovodi do oslobaĊanja Ca 2+ (preko IP3 zavisnih
  • 119. 119kanala za Ca2+). Ca2+ se vezuje za kalmodulin, kalmodulin aktivira kinazu lakog lanca miozinaMLCK, što dovodi do konstrikcije. Angiotenzina u fiziološkim uslovima nema u velikimkoncentracijama u organizmu, ali se izuzetno brzo oslobaĊa u uslovima stresa, fiziĉkog napora,hemoragije (iskrvarenje koje dovodi do hipotenzije i smanjenja promera krvnih sudova) i uodgovoru na smanjen protok krvi kroz bubrege (smanjen protok NaCl), jer se tada momentalnooslobaĊa renin. Izuzetno je potentan vazokonstriktor, oko 40 puta jaĉi od noradrenalina. Angiotenzin se vezuje i za AT1 receptore na zona glomerulosa kore nadbubreţne ţlezde ipreko istog puta dovodi do prebacivanja holesterola u mitohondrije. Dovodi do aktivacije P450SCC enzima koji prevodi holesterol u pregnenolon i aktivacije aldosteron sintetaze kojakonvertuje kortikosteron u aldosteron, što dovodi do oslobaĊanja mineralokortikoida. Za razlikuod glukokortikoida koji se oslobaĊaju preko sprege hipotalamus-hipofiza, ovaj sistemfunkcioniše preko renin-angiotenzin sistema. Aldosteron se vezuje za svoje receptore na ćelijamadistalnih tubula i sabirnih kanalića, kompleks hormon-receptor se vezuje za hormon responsivnielement (HRE) u promotoru gena za ENaC kanal za Na+ (epitelni kanal za Na+ ili amiloridsenzitivni kanal) kroz koji se reapsorbuje natrijum, kanal za K+, enzime koji dovode do sintezeATP-a i Na+/K+ ATP-azu. Na taj naĉin se fakultativno, pod uticajem mineralokortikoidareapsorbuje 2-3% Na+ što dovodi do povećanja volumena vanćelijskih teĉnosti i hipertenzije. Rekli smo da na krvni pritisak utiĉe i osmolarnost, tih 2-3% Na+ koji se reapsorbujudejstvom angiotenzina nije malo. Kada se reapsorbuje, momentalno dovodi do povećanjavolumena vanćelijskih teĉnosti, odnosno do hipertenzije. Angiotenzin vrši vazokonstrikciju,omogućava oslobaĊanje mineralokortikoida, ali deluje i na hipotalamus. Angiotenzin II uhipotalamusu stvara osećaj ţeĊi (ĉime nas tera da pijemo vodu i povećavamo volumenvanćelijskih teĉnosti) i stimuliše sintezu i sekreciju vazopresina (ADH). ADH se sintetiše umagnocelularnim neuronima hipotalamusa i aksoplazmatskim transportom se dovodi doneurohipofize. OslobaĊa se u cirkulaciju i vezuje za svoje B2 receptore na bazolateralnojmembrani osnovnih ćelija drugog dela distalnih tubula i sabirnih kanalića, gde preko cAMP-aaktivira PKC koja fosforiliše CRE (cAMP responsive elements) vezujuće proteine (proteini kojise vezuju za sekvence na promotoru gena za akvaporine 2). To dovodi do sinteze akvaporina 2.Pored toga, protein kinaza C fosforiliše već sintetisane akvaporine 2 koji su spakovani uagregoforama. Fosforiliše se serin, formiraju se vezikule i dolazi do egzocitoze i eksprimiranja
  • 120. 120akvaporina na apikalnoj strani membrane. Antidiuretiĉki hormon vrši fakultativnu reapsorpciju,u zavisnosti od potreba organizma. Angiotenzin ne ostvaruje svoju funkciju kad unosimodovoljno vode i tada se akvaporini ne eksprimiraju na apikalnoj membrani, već samo kad smodehidrirani. Kada se smanji koliĉina antidiuretiĉkog hormona, kada je balans vode u organizmuzadovoljen, akvaporini se ubacuju u ćeliju endocitozom i na taj naĉin se zaustavlja fakultativnareapsorpcija. Antidiuretiĉki hormon se naziva i vazopresin, jer ispoljava vazokonstriktorno dejstvo.Kada se vazopresin veţe za V1 receptore na ćelijama glatkih mišića krvnih sudova on preko putaαq, IP3, DAG, dovodi do otvaranja IP3 zavisnih kanala za Ca2+ na endoplazmatiĉnomretikulumu. Ca2+ se vezuje za kalmodulin, on aktivira kinazu lakog lanca miozina i ostvarujevazokonstrikciju. Angiotenzin II ima pozitivno inotropno i hronotropno dejstvo. Stimuliše oslobaĊanjenoradrenalina i inhibira njegovo preuzimanje iz sinapse. Zatim, stimuliše oslobaĊanjekateholamina iz srţi nadbubreţne ţlezde i stimuliše sintezu endotelina. Angiotenzin II ima idodatno vazokonstriktorno dejstvo. Pored toga što se vezuje se za svoje postsinaptiĉke AT1receptore na krvnom sudu, vezuje se i za presinaptiĉke AT1 receptore na postganglijskom vlaknusimpatiĉkog nervnog sistema i stimuliše oslobaĊanje noradrenalina. Noradrenalin se dalje vezujeza α1 receptore, što takoĊe dovodi do vazokonstrikcije. Endotelini su mnogo snaţniji vazokonstriktori od angiotenzina II. Kao što sam nazivkaţe, endotelini se oslobaĊaju iz endotelnih ćelija oštećenih krvnih sudova i to prvi mehanizamzaštite od povrede. Odmah se oslobaĊaju endotelini koji suţavaju krvni sud, spreĉavajuiskrvarenje, a zatim se aktivira sistem koagulacije i zatvaranja krvnog suda. Endotelin se sintetišeu vidu preproendotelina 1. Iz preproendotelina 1 stvara se tzv. Big ili proendotelin 1 kogaendotelin konvertujući enzim 1 (ECE 1) konvertuje u fiziološki aktivan endotelin 1. NaoslobaĊanje endotelina 1 pozitivno utiĉu adrenalin, angiotenzin II, antidiuretiĉki hormon,interleukin 1, TGF β, ciklosporini i hipoksija, dakle svi vazokonstriktori. S druge strane, njegovooslobaĊanje inhibiraju prostaciklini, azot oksid, atrijalni natriuretiĉki peptid, epidermalni faktorrasta, uglavnom vazodilatatori. Endotelin se vezuje za svoje ETA i ETB receptore na ćelijamaglatkih mišića krvnih sudova i preko fosfolipaze C, IP3 i DAG, odnosno aktivacije kinaze lakoglanca miozina dovodi do vazokonstrikcije, odnosno kontrakcije. Sa druge strane, vezujući se za
  • 121. 121svoje ETB receptore na endotelnim ćelijama, aktiviraju azot oksid sintazu i dovode do stvaranjaazot oksida. Azot oksid difunduje u ćeliju glatkih mišića krvnih sudova, što dovodi do dilatacije.Postavlja se pitanje zašto jedan jedini potentni vazokonstriktor izaziva istovremeno ivazodilataciju. Odgovor na ovo pitanje još uvek nije jasan, ali ono što donekle moţe da objasniovaj fenomen je da on uzrokuje tranzitornu dilataciju i mali pad pritiska koji je prolazan, a zatimsledi produţena vazokonstrikcija, odnosno produţena i stabilna hipertenzija. TakoĊe, endotelinipovećavaju kontraktilnost i frekvenciju rada srca i samim tim, posredno, povećavaju krvnipritisak. Vazodilatatori Već smo pominjali adrenalin koji moţe biti i vazodilatator i vazokonstriktor. Kada seveţe za β2 receptore na ćelijama glatkih mišića krvnih sudova izaziva vazodilataciju preko putana A, αs subjedinice koja aktivira adenil ciklazu, cAMP, protein kinazu A, koja fosforiliše iinaktivira kinazu lakog lanca miozina. Ona ne moţe da fosforiliše laki lanac miozina ionemogućava veslanje miozina preko aktina. Na isti naĉin deluje i VIP (vazoaktivni intestinalni polipeptid). Dobio je naziv VIP zatošto je prvi put izolovan iz neurona intestinalnog trakta, kasnije je pronaĊen i u urogenitalnomtraktu, u neuronima koji inervišu krvne sudove u mozgu. VIP se vezuje za VPAC2 receptore naćelijama glatkih mišića i preko protein kinaze A fosforiliše kinazu lakog lanca miozina.MeĊutim, VIP deluje i na drugi naĉin, otvaranjem Ca2+ aktivirajućih i voltaţno zavisnih kanalaza K+. To dovodi do hiperpolarizacije i zatvaranja voltaţno zavisnih kanala za Ca2+, smanjenjakoliĉine kalcijuma u ćeliji i relaksacije, odnosno dilatacije. Preko puta na A deluje i histamin. On se oslobaĊa tokom alergijskih reakcija. Dovodi dovazodilatacije krvnog suda na mestu povrede ili alergijske reakcije, što omogućava dovoĊenjećelija imunskog sistema. Histamin se vezuje za H2 receptore na ćelijama glatkih mišića krvnihsudova i preko protein kinaze A koja fosforiliše MLCK dovodi do dilatacije. Acetilholin se vezuje za svoje muskarinske M3 receptore na endotelnim ćelijama krvnogsuda. αq subjedinica aktivira fosfolipazu C i preko IP3 dolazi do oslobaĊanja Ca2+. Obratitepaţnju, to se dešava u endotelnoj ćeliji, ne u glatkoj mišićnoj ćeliji. Kalcijum se vezuje zakalmodulin koji aktivira enzim endotelnu azot oksid sintazu (eNOS). Ona dovodi do stvaranja
  • 122. 122azot oksida (stari naziv za azot oksid je faktor relaksacije poreklom iz endotelijuma, EDRF). Upitanju je gas koji brzo difunduje u susednu ćeliju glatkog mišića krvnog suda i vezuje se zasolubilnu guanil ciklazu sto dovodi do stvaranja cGMP-a. cGMP aktivira protein kinazu G kojafosforilise i inaktivira MLCK. TakoĊe, protein kinaza G aktivira SERCA pumpu naendoplazmatiĉnom retikulumu koja ubacuje Ca2+ u ER, što dovodi do relaksacije. Srĉanibolesnici koriste nitroglicerin, koji se daje pod jezik i momentalno dovodi do širenja krvnihsudova, jer oslobaĊa azot oksid. Za otkiće azot oksida kao signalnog molekula ukardiovaskularnom sistemu Robert Furchgott, Louis Ignarro iFerid Murad su dobili Nobelovunagrada 1998 godine. Osim što deluje preko gore pomenutog puta, acetilholin dovodi dostvaranja EDHF (eng. Endothelium-derived hyperpolarizing factor). On takoĊe difunduje ususednu glatku mišićnu ćeliju što dovodi do hiperpolarizacije i otvaranja Ca2+ aktivirajućihkanala za K+. Ovakva vrsta vazodilatacije koju ostvaruje acetilholin naziva se vazodilatacijauzrokovana hiperpolarizacjom. Azot oksid prevashodno širi velike arterije, a EDHF male.MeĊutim, u nedostatku azot oksida i EDHF širi veće arterije. Bradikinin stvara kalikrein iz alfa 2 globulina jetre koji se naziva kininogen. Interesatnoje da taj enzim dovodi do stvaranja vazodilatatora bradikinina, ali takoĊe dovodi do stvaranjarenina koji produkuje vazokonstriktore angiotenzine. Bradikinin je vazodilatator koji se vezujeza svoje B2 receptore i preko PLC, IP3, Ca2+-CaM, eNOS, NO u endotelnim ćelijama i cGMP iPKG u glatkim mišićnim ćelijama krvnog suda fosforiliše MLCK i aktivira SERCA pumpu. Povećanje zapremine krvi dovodi do istezanja kardiomiocita pretkomora i komora štodovodi do oslobaĊanja ANP-a ukoliko se isteţu pretkomore, odnosno BNP-a ukoliko se isteţukomore. ANP i BNP se vezuju za NPR-A i NPR-B membranske guanil ciklaze, stvara se cGMPkoji aktivira proteinsku kinazu G. PKG dovodi do vazodilatacije, deluje na bubreg i inhibirasekreciju renina. Kada je inhibirana sekrecija renina izostaje i sinteza angiotenzina, vazopresina,mineralokortikoida itd. Na taj naĉin se ostvaruje diureza (nema ADH, gubi se voda) i natriureza(nema aldosterona, gubi se natrijum). ANP i BNP se takoĊe direktno vezuju za koru nadbubregai inhibiraju sintezu i sekreciju aldosterona. Vezuju se i za neurohipofizu i inhibiraju sekrecijuADH. Dakle, sve su to faktori koji omogućavaju diurezu i natriurezu i dovode do smanjenjakrvnog pritiska. Osim ANP-a i BNP-a sliĉan hormon se stvara u endotelnim ćelijama krvnogsuda – CNP koji se vezuje za B receptore membranske guanil ciklaze i ostvaruje
  • 123. 123hiperpolarizaciju preko EDHF, hiperpolarišućeg faktora poreklom iz endotela. To je najnovijimehanizam, ono što se sigurno zna je da parakrino deluje, iz susedne ćelije u kojoj se sintetisao, iinhibira renin-angiotenzin sistem preko PKG. Eikozanoidi su istovremeno vazodilatatori i vazokonstriktori. Na arahidonsku kiselinudeluje enzim ciklooksigenaza i dovodi do stvaranja tromboksana (TXA2), prostaciklina (PGI2) iprostaglandina (PGD2, PGE2 i PGF2). PGD2 se vezuje za D prostanoidske receptore, PGE2 za Ereceptore, PGF2 za F receptore, PGI2 za I receptore i TXA2 za T prostanoidske receptore.Vazodilatatorno i vazokonstriktorno dejstvo ispoljavaju vezujući se za razliĉite receptore. PGE2ukoliko se veţe za EP1 ili EP3 receptore dovodi do vazokonstrikcije. TakoĊe, PGF2 i TXA2 suvazokonstriktori. S druge strane, kada se PGE2 veţe za svoje EP2 i EP4 receptore izazivavazodilataciju. Pominjali smo PGE2 kod fetusa, koji omogućava vazodilataciju krvnog suda kojiomogućava premošćavanje plućnog krvotoka. Vazodilatatori su još i PGI2 i PGD2. Dakle,prostaglandin preko EP1 receptora koji se nalaze na ćelijama bubreţnih arterija i arteriolaispoljava vazokonstrikciju preko klasiĉnog vazokonstriktornog puta koji ukljuĉuje IP3 i DAG.MeĊutim, u corpus cavernosum penisa, gde su konstitutivno koeksprimirani EP2 i EP4 receptoriza prostaglandin E2, on ispoljava vazodliatatorno dejstvo. Vazodilatacija se opet odvija prekoputa na A, protein kinaze A koja fosforiliše MLCK. TakoĊe, vazodilatacija se na ovaj naĉinostvaruje u bubrezima i krvnim sudovima mozga. Još jedan vaţan vazodilatator je adenozin. Njega smo pominjali kada smo priĉali okoronarnoj cirkulaciji i o tome zašto je opasan infarkt, odnosno pucanje krvnog suda. Tokominfarkta se u sekundi oslobaĊa skoro 50% adenozina, koji je izuzetno vaţan vazodilatatorni agensza koronarne arterije. Adenozin se stvara hidrolizom ATP-a. Nastaje ADP, odnosno AMP koji seu fiziološkim uslovima brzo fosforilišu i ponovo se u ćeliji sintetiše ATP. MeĊutim u sluĉajupojaĉane hidrolize ATP-a i hipoksije, aktivira se membranski enzim 5` nukleotidaza koja odAMP-a stvara adenozin – purin koji je izuzetno vaţan i obavlja spektar razliĉitih aktivnosti uorganizmu. Kada se adenozin veţe za purinske A2A receptore na glatkom mišiću krvnog suda onpreko adenil ciklaze, cAMP i protein kinaze A otvara KATP kanale regulisane adeninskimnukleotidima, što dovodi do hiperpolarizacije. Sa druge strane, protein kinaza A dovodi dofosforilacije MLCK, a treći mehanizam je inhibicija kanala za Ca2+. Adenozin deluje u glatkimmišićima krvnih sudova, skeletnim mišićima, ali je izuzetno vaţna dilatacija koju ostvaruje u
  • 124. 124 koronarnim arterijama. Tu se adenozin vezuje za svoje A1 receptore na ćelijama SA i AV ĉvora i preko Gi smanjuje aktivnost adenil ciklaze i koncentraciju cAMP-a, ĉime ostvaruje negativno dromotropno i negativno hronotropno dejstvo. Dakle, vezujući se za A1receptore na ćelijama AV ĉvora, dovodi do inhibicije L kanala za Ca2+ , što dovodi do smanjenja mogućnosti provoĊenja akcionog potencijala kroz miokard. Na ćelijama SA ĉvora direktno inhbira KCN kanale odnosno inhibira funny struju i na taj naĉin ostvaruje negativno hronotropno dejstvo. Antihipertenzivi Hipertenzija je povišen arterijski pritisak koji se konstantno odrţava iznad 140/90 mmHg. Pri ĉemu je: - normalan pritisak <120/80 mmHg - prehipertenzija 120-139/80-89 mmHg - I faza hipertenzije 140-159/90-99 mmHg - II faza hipertenzije ≥ 160/100 mmHg U principu prehipertenzija i I faza hipertenzije mogu da se koriguju promenom naĉina ţivota, ishrane (što manje masti, naroĉito hrane bogate holesterolom i slane hrane) i bavljenjem fiziĉkom aktivnošĉu, prestankom pušenja, itd. Iznad 150/95 mmHg uvode se antihipertenzivi. Postoje razliĉite generacije lekova:1. Blokatori kateholaminskih receptora ili antagonisti2. Ca2+ antagonisti, blokatori kanala za Ca2+3. Inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE)4. Antagonisti receptora za angiotenzin II5. Diuretici6. Blokatori receptora za endotelin7. Vazodilatatori
  • 125. 125 Antagonisti kateholaminskih receptora Godine 1948. Alquist je prvi kategorisao receptore za kateholamine i nazvao ihadrenotropni receptori. Istorijski gledano, prvo su proizvedeni lekovi koji blokiraju α1 receptoreza adrenalin i nordrenalin i na taj naĉin sniţavaju pritisak (α blokatori). Ti prvi antihipertenzivisu bili neselektivni, npr. fentolamin koji deluje i na α1 i na α2 receptore. Zatim su se razvililekovi selektivni za α1 receptore, kao što je prazosin, koji se danas koristi samo u istraţivanjimana pacovima, a retko u medicinskoj praksi i lekovi selektivni za α2 receptore, kao što jejohimbin. Zašto je napuštena ova generacija antihipertenziva? Zato što se javlja kompenzatornibaroreceptorni refleks. Kada su blokirani α1 receptori dolazi do dilatacije i pada pritiska, kojiregistruju baroreceptori u karotidnim sinusima i luku aorte. Oni obaveštavaju nc. tractussolitarius produţene moţdine preko IX (n. sinus carotici) i X nerva (n. aorticus). Informacijaodlazi u nc. ambiguus koji povećava frekvenciju i snagu rada srca, javlja se kompenzatornimehanizam i pritisak se povećava. Onda su se kardiolozi i farmakolozi usmerili na β receptore idobijeni su lekovi, β blokatori koji se i danas koriste. Za njihovo otkriće Sir James Black jedobio Nobelovu nagradu 1988. godine. Prvoj generaciji lekova pripada propanolol (komercijalninaziv Inderal) neselektivni blokator koji deluje na β1 i β2 receptore, ali se više ne koristi. Zatimje razvijena druga generacija selektivnih β1 blokatora, koji se i danas koriste, kao što su atenolol(Prinorm) i metoprolol (Presolol), koga kardiolozi ĉesto prepisuju. U treću generaciju spadakarvedilol koji je α1 i β blokator. β blokatori, za razliku od α blokatora, ispoljavaju dejstvo samokod hipertoniĉara, kada je povećana aktivnost simpatiĉkog nervnog sistema, imaju negativnohronotropno i inotrpono dejstvo, smanjuju sekreciju renina i angiotenzina II tako što povećavajusintezu NO. Kateholaminski receptori sadrţe 7 transmembranskih segmenata, a najbitniji su petlja i Ckraj u citosolu koji omogućavaju interakciju sa Gs proteinom. Ustanovljeno je da je na receptoruizuzetno vaţan Arg na 389. mestu, izmeĊu 7. segmenta i te petlje. Ukoliko doĊe do mutacije naovom mestu, receptor ne moţe da interaguje sa Gs proteinom. Za vezivanje agonista neophodnisu Asp113 i Ser 204 i 207, tada dolazi do interakcije sa Gs proteinom i stvaranje sekundarnogglasnika. Kaverdilol deluje na β1 receptore tako što omogućava konformacione promenereceptora, pribliţava C kraj trećoj petlji, gde se nalazi kljuĉni Asp 389. To onemogućavainterakciju receptora sa Gs subjedinicom, ne stvara se cAMP i ostvaruje se negativno inotropno i
  • 126. 126negativno hronotrpono dejstvo. Rekli smo da je kaverdilol istovremeno i α1 blokator.Ustanovljeno je da deluje na α1 receptore tako što dovodi do izlaska ATP-a, jer omogućavaotvaranje mehanosenzitivnih kanala kroz koje izlazi ATP. ATP izalazi iz ćelije, na spoljašnjojstrani se vezuje za svoje P2Y purinske receptore i preko njih dovodi do povećanja Ca2+ koji sevezuje za kalmodulin i nastaje NO. Na taj naĉin ovaj lek ostvaruje vazodilataciju iantihipertenzivno dejstvo. Prošle godine je pokazano da osim što blokira β receptor primicanjempetlje i dovodi do oslobaĊanja NO vezivanjem za α1 receptore, kaverdilol moţe da skraćujevreme otvaranja Ryr2. Kada je Ryr2 kratko otvoren, nema izlaska Ca2+ i tako se ostvarujeantihipertenzivni efekat. Blokatori kanala za Ca2+ Sledeća generacija lekova su blokatori ulaska Ca2+, ĉime se spreĉava kontrakcija. Lvoltaţno zavisni kanal za Ca2+ se sastoji od α1, α2, β, γ i δ lanaca. Naroĉito je vaţan α1 lanac kojiformira poru i omogućava Ca2+ indukovano oslobaĊanje Ca2+ u trijadi. Lek verapamil (Isoptin)deluje tako što blokira ulazak Ca2+ vezujući se za šesti transmembranski segment ĉetvrtogdomena. Diltiazem (Cortiazem) se vezuje za most izmeĊu trećeg i ĉetvrtog domena. Amplodipin(Norvasc) se najĉešće primenjuje, a vezuje se za šesti transmembranski segment trećeg i ĉetvrtogdomena. Ova tri leka, Isoptin, Cortiazem i Norvasc se vezuju za L voltaţno zavisne kanale zaCa2+ i imaju negativno hronotopno dejstvo, drugim reĉima smanjuju snagu mišićne kontrakcije.Za razliku od prethodno pomenutih lekova, mibefradil blokira T voltaţno zavisne kanale za Ca 2+na ćelijama SA ĉvora i na taj naĉin ostvaruje negativno hronotropno dejstvo. ACE (angiotensin-converting enzyme) inhibitori Znajući koja su sve dejstva angiotenzina, potpuno je jasno zašto su farmakolozi išli upravcu razvijanja lekova na bazi ovog vazokonstriktora koji podstiĉe delovanje noradrenalina,utiĉe na mineralokortikoide i antidiuretiĉki hormon. Ukoliko se spreĉi njegova sinteza i/iliblokiraju njegovi receptori, doći će do smanjenja krvnog pritiska. ACE je dipeptidil karboksi metalopeptidaza sa dva katalitiĉka mesta i dva Zn2+ vezujućamesta. Poseduje dugaĉak N ekstraćelijski, kratak C unutarćelijski i hidrofobni region od 17AKna luminalnoj površini endotelnih ćelija svih krvnih sudova. Cirkulišući ACE je produktproteolize od strane sekretaza. ACE vrši konverziju angiotenzina I u angiotenzin II. Angiotenzin
  • 127. 127I je dekapeptid i isecanjem dve aminokiseline na C-terminusu konvertuje se u oktapeptid,angiotenzin II. Inhibitori ACE su Captopril, Enalapril i Fosinopril. Oni su ili odmah aktivni ili ihaktivira esteraza hepatocita. Imaju specifiĉne grupe. Captopril ima sulfhidrilnu grupu(merkapto), Enalapril dve karboksilne grupe, a Fosinopril fosfornu grupu. Captopril pomoćusvojih specifiĉnih sulfhidrilnih grupa formira merkapto alkanoil derivate, dok Enalapril sa svojedve karboksilne grupe formira karboksi alkanoil. Inhibicija ACE ostvaruje se grupamainhibitora, koje duţinom odgovaraju dipeptidima, koje se isecaju iz angiotenzina I ilibradikinina. Smanjuju stvaranje angiotenzina II, povećavaju nivo bradikinina, koji utiĉe nasintezu prostaglandina. Ovi lekovi su naroĉito dobri zato što nakon smanjenja tonusa mišićakrvnih sudova ne dolazi do kompenzatornog baroreceptornog refleksa, jer na neki naĉinmodulišu senzitivnost baroreceptora i inhibiraju oslobaĊanje noradrenalina preko angiotenzina II. Antagonisti receptora za angiotenzine U sledećoj generaciji su razvijani lekovi koji deluju kao antagonisti receptora zaangiotenzin I i II. Poznati su još i pod skraćenicom ARBs (eng. angiotensine receptors blockers).Receptor za angiotenzin I je heptahelijaĉan i spregnut sa G proteinom. Prvi blokatori koji surazvijeni jos sedamdesetih godina prošlog veka su bili peptidni (1-sarcosine), da bi devedesetihgodina bio sintetisan nepeptidni blokator losartan, a danas se koristi u modifikivanoj formi podnazivom valsartan (Diovan) jer su mu dodate difenil grupe. Valsartan (6 bifenil tetrazoil) sevezuje za alternativna mesta u odnosu na angiotenzin II i omogućava internalizaciju receptora.Na taj naĉin se inhibira vazokonstrikcija, oslobaĊanje mineralokortikoida, antidiuretiĉkoghormona, hormona srţi nadbubrega, noradrenalina itd. Blokiranjem presinaptiĉkih AT1 receptorasmanjuje se oslobaĊanje noradrenalina u sinaptiĉku pukotinu, a blokiranjem postsinaptiĉkih AT1receptora se inhibira vazokonstriktorno dejstvo angiotenzina II. Diuretici Diuretici su lekovi koji se prvi primenjuju u akutnom stanju hipertenzije, jer seizbacivanjem teĉnosti iz organizma smanjuje krvni pritisak. To je prva mera u redukcijihipertenzije, a na duţi rok se moraju koristiti antihipertenzivi. Diuretici koji se danas koriste:
  • 128. 1281. Acetazolamid (Diamox) - blokira karboanhidrazu i time dolazi do smanjenja koncentracije bikarbonata i protona u proksimalnim tubulama. Zbog toga Na+/H+ izmenjivaĉ i Na+/HCO3- kotransporter ne funkcionišu i nema reasorpcije natrijuma.2. Furosemid (Lasix) - inhibira NKCC2 (koji ubacuje Na+, a izbacuje K+ i 2Cl- ) u debljem uzlaznom delu Henleove petlje.3. Thiazidi - inhibiraju NaCl simporter u prvom delu distalnih tubula.4. Amilorid - inhibira ENaC (amilorid senzitivni) kanal za Na+ u drugom delu distalnih tubula.5. Spironolakton - antagonist aldosterona, vezuje se za mineralokortikoidne receptore i onemogućava delovanje mineralokortikoida. Blokatori receptora za endotelin Poslednja generacija antihipertenziva podrazumeva upotrebu antagonista endotelinskih receptora. Bosentan je neselektivni blokator koji inhibira ETA i ETB receptore. Njegova primena je najĉeća kod hipertenzije u maloj cirkulaciji tj. plućnoj arteriji, koja je ĉesto posledica plućne embolije. On takoĊe ostvaruje dejstvo na sistemsku cirkulaciju, ukljuĉujući koronarne arterije i spreĉava njihov vazospazam (konstrikcija krvnih sudova koja moţe dovesti do krvarenja ili nekroze tkiva, u koronarnoj cirkulaciji dovodi do angine ili infarkta), poremećaj rada srca i hipertrofiju srĉanog miĉića. Treba pomenuti da Bosentan pored blokade vazokonstriktornog dejstva endotelina, blokira i njegovo kardiotoniĉno (inotropno) dejstvo.
  • 129. 129 Molekularni mehanizmi transporta u tubulocitama Mokraća se stvara procesima filtracije, reasorpcije i sekrecije iz krvi koja se dovodi dobureţnog glomerula kroz aferentu arteriolu. Galen je još pre 2000 godina pretpostavio da bubrezipreĉišćavaju krv. Filtrira se sve osim proteina krvi, prelazi u sistem bubreţnih kanalića, gde sevraća u krv ono što je organizmu potrebno, a izluĉuje se ono što nije potrebno i tako se stvaraprimarna mokraća. Filtracija se vrši kroz glomerularnu membranu, endotel glomerularnihkapilara, bazalnu laminu i kroz podocite visceralnog sloja epitela Boumanove kapsule. Brzinaglomerularne filtracije zavisi pre svega od protoka krvi, pa što je dovodni sud do glomerula širito će vrše krvi dolaziti i više će da se filtrira. Ukoliko doĊe do vazokonstrikcije, manje krvi sedovodi u glomerul i manje se mokraće izluĉuje. Autoregulacija je veoma bitna, jer odreĊena koliĉina moţe da se vrati. Ukoliko bubrezine bi imali tu mogućnost dovoljno bi bilo samo malo povećanje sistemskog pritiska za 20mmHg, da se dnevna brzina filtracije poveća sa 178 na 225l/24h, što bi nateralo naše bubrege dastvaraju skoro 5l mokraće. To omogućava jukstaglomerularni aparat koji nastaje kada se debljiuzlazni deo Henleove petlje nasloni na arteriolu, pa su u bliskom kontaktu naĊujukstaglomerularne ćelije aferentne arteriole i ćelije macula densa tok uzlaznog dela Henleovepetlje. Ukoliko se poveća brzina filtracije, jukstaglomerularni aparat donosi veću koliĉinu soli.To detektuju ćelije macula densa koje imaju NKCC2 kotransporter koji detektuje da više Na+prolazi, dakle, njegova akrivnost se povećava, što dovodi do pojaĉanog ulaska Cl- u ćeliju. Ovodalje dovodi do otvaranja kanala za Cl- na bazolateralnoj membrani, otvaranja neselektivnihkanala za katjone i ulaska Ca2+. Dešava se egzocitoza granula sa parakrinim faktorima kao štosu ATP, adenozin i tromboksan. Tromboksan je vazokonstriktor i vezuje se za TP receptore. Iakosmo za ATP i adenozin do sad uĉili da šire krvne sudove, oni se ovde vezuju za drugaĉijereceptore i usled toga mogu da dovedu i do konstrikcije krvnih sudova. ATP se vezuje za P2Y, aadenozin za P1A3, pokreće se signalni put preko αq subjedinice, IP3 i DAG. Usledvazokonstrikcije aferentne arteriole brzina glomerularne filtracije se smanjuje i to je ta parakrinaregulacija brzine filtracije. Drugi vid je miogena autoregulacija. Povećan pritisak i rastezanje
  • 130. 130zidova aferentne arteriole dovodi dootvaranja SA (eng. stretch activated) neselektivnihkatjonskih kanala i ulaska Ca2+, što momentalno dovodi do vazokonstrikcije. Treći naĉin je dase kontrahuju podocite, tada se smanjuje broj filtracionih pukotina ili mesangialne ćelije sliĉneglatkim mišićnim, oko glomerularnih kapilara i sve to utiĉe na brzinu filtracije. Što se tiĉe nervne regulacije samo simpatiĉki nervni sistem inerviše bubreţne arterije. Ovakav vid regulacije je aktuelan samo u ekstremnim uslovima kao što su hemoragija,stres, bol ili ishemija mozga. Konstrikcija aferentne arteriole je veća od eferentne, što vodismanjenju brzine glomerularne filtracije. Noradrenalin preko β1 receptora dovodi do oslobaĊanjarenina i povećanja reapsorpcije Na+ u tubulima. Kod humoralne regulacije, svi hormoni koji dovode do suţavanja aferentne arteriole ćedovoditi do smanjenja brzine filtracije, a vazodilatatori će da je povećaju. Noradrenalin,adrenalin, angiotenzin i endotelim smanjuju brzinu filtracije, dok je ANP, BNP, prostaglandin E,azot oksid povećavaju.noradrenalin, adrenalin: samo u ekstremno visokim koncentracijamaangiotenzin II: ulazak Ca2+ kroz voltaţno zavisne kanale → konstrikcija aferentne arteriolemobilizacija unutrašnjih rezervi Ca2+ → konstrikcija eferentne arteriole povećava senzitivnostaferentne arteriole na signale macule densaeendotelin: vazokonstriktor endotelnih ćelija kapilara bubregaANP, BNP: vazodilatacija aferentne > eferentne arteriole → ↑BGF smanjuje senzitivnostaferentne arteriole na signale macule densae inhibira sekreciju reninaprostaglandin E: vazodilatator koji `puferizuje` vazokonstriktorni efekat angiotenzinaNO: endotelijalnih ćelija bubrega, jak vazodilatator u bazalnim koncentracijama štiti odvazokonstriktornog dejstva angiotenzina, mogući medijator dilatacije aferentne arteriole utubuloglomerularnoj sprezi Transport Na + Natrijum se u izvesnoj meri transportuje ne samo transcelularno, već i paracelularnozajedno sa vodm, preko meĊućelijskih pukotina. A ovaj elektrogeni transport koji se vršizahvaljujući transportu Na+ , izuzetno velika koliĉina Na+ se transportuje i samim tim seostavlja izvesno negativno naelektrisanje u lumenu, u poĉetnom delu proksimalnih tubula, štodovodi do toga da Na+ u manjoj meri moţe da proĊe nazad. Dakle povratak Na+ tzv. „backleak“zbog ovog slabog negativnog naelektrisanja koje se nalazi samo u tom poĉetnom deluproksimalnih tubula. U silaznom delu Henleove petlje Na+ se transportuje paracelularno, dakle kroz pukotine itransportuje se, naravno, pasivno, a u debljem uzlaznom (ţutom) delu Henleove petlje sesituacija komplikuje. Tu se nalazi NKCC2 kotransporter i prošli put smo rekli da, diuretici (npr.
  • 131. 131Lasix) deluju upravo preko ovog kotransportera. Dakle u ovom delu H.petlje Na+ se reapsorbujepreko NKCC2 i preko natrijumskog osmotskog izmenjivaĉa NHE-3, a na suprotnoj straniizbacuje se u krv, dakle reapsorbuje se iz tubulocita nazad u krv preko Na/K ATPaze. Naapikalnom delu membrane tubulocite, debljeg dela H.petlje, nalazi se jedan specifiĉan kanal zaK+ koji se zove ROMK ( R-renal; O- outer, M-medullary, K-channel; prvi put otkriven uspoljnjem delu medule, spoljnom delu srţi bubrega) i omogućava recikliranje kalijuma. Znaĉizajedno sa Na+ u ćeliju se ubacuje i K+ koji momentalno prelazi kroz ROMK u lumen, daklevraća se nazad i omogućava recikliranje kalijuma. TakoĊe omogućava, odnosno daje pozitivnonaelektrisanje ovom debljem delu H.petlje, što omogućava pasivni elektrogeni transport još 50%Na+ i to paracelularno. Znaĉi, ukoliko doĊe do zastoja funkcionisanja ovog kanala i izostanerecikliranje, to utiĉe i na paracelularnu difuziju Na+ kroz paracelularne pukotine. Ovaj deo jenepropustljiv, nikada ne propušta vodu i ceo ovaj segment je razblaţujući segment, mokraća sekoncentruje kako idemo ka vrhu H.petlje i ovde se razblaţuje kako idemo ka vrhu i naziva serazblaţujući segment. Distalni izuvijani tubuli (DCT) – tu se nalazi NCC, to je kotransporter Na+ i Clˉ . Tiaziddirektno deluje na ovaj kotransporter, Na+ se transportuje preko NCC u tubulocitu, a preko Na/KATPaze u intersticijum. I ovaj deo nikada ne propušta vodu. Dakle, deblji deo H.petlje i DCT suobligatno nepropustljivi za vodu. Sabirni kanalići kore (CCT) osnovne ćelije i sabirni kanalići srţi – tu se nalaze dobropoznati epitelni kanal za Na+ osetljiv na amilorid, pomoću kog se reapsorbuje Na+ i sa drugestrane Na/K ATPaza koja reapsorbuje Na+ u intersticijum. Tu se i na apikalnoj i nabazolateralnoj membrani nalaze kanali za K+ koji omogućavaju sekreciju kalijuma, o ĉemu ćebiti reĉi kasnije, i recikliranje K+ na Na/K ATPazi. Podsećamo se da se ovde vrši fakultativnareapsorpcija zahvaljujući aldosteronu, koji omogućava transkripciju gena za kanal za Na+,kanale za K+ i Na/K ATPazu. Transport Cl - obavlja se iskljuĉivo paracelularno, kroz pukotine izmeĊu tubulocita, a netranscelularno. Za razliku od drugog dela proksimalnih tubula gde se odvija transcelularno,zahvaljujući tercijernom aktivnom transportu. Tercijerni aktivni transport znaĉi da ga obavlja i na taj naĉin ga reapsorbuje iz lumena u tubbaze iz tubulocita (u pitanju je dakle exchanger, kontratransporter). Tercijerni aktivni transportzahteva sekundarni aktivni transport, odnosno Na/H izmenjivaĉ. O ĉemu se tu radi? Da bi ova , kako se on ovde reapsorbuje, neophodni su odreĊeniformati baze, kao što su oksalati, bikarbonati...Dakle, da bi nastale ove baze potrebano je dakiselina (npr. oksalna, mravlja, ugljena...) disosuje i daje bazu za ovaj kontratransporter, a protonkoji nastaje tom prilikom preuzima Na/H izmenjivaĉ i tako se vrši sekundarni aktivni transportna raĉun gradijenta za Na+, koji vrši Na/K ATPaza. Znaĉi Na/K ATPaza je primarni aktivni
  • 132. 132transport jona, jedina troši ATP. Na raĉun gradijenta Na+ radi Na/H izmenjivaĉ koji izbacujeovaj proton, nastao disosovanjem kiselina, ubacuje Na+, a ova baza sada sluţi za izmenu, u drugom delu proksimalnih tubula, - . Znaĉi na bazolateralnoj membrani senjagova reapsorpsija vrši zajedno sa kalijumom. U ovom delu je transcelularni transportdominantan, dok je u prvom delu bio dominantan paracelularni transport, koji se ne odvija naosnovu gradijenta koncentracije, već samo na osnovu elektrogenog transporta. Tu (u prvom delu)je lumen negativan, iznosi -3mV i na osnovu elektrogenog transporta vrši se paracelularno . Deblji deo Henleove petlje (TAL) – opet isti kotransporter NKCC2, koji je malopretransportovao Na, sad ubacuje i Clˉ i sa druge strane, ka intersticijumu, nalazi se transportuje zahvaljujućiovom kanalu koji se nalazi na bazolateralnoj membrani. U ovom delu H.petlje kompletnareapsorpcija obavlja se transcelularno, dok se Na+ transportuje pola transcelularno, polaparacelularno. Distalni izuvijani tubuli (DCT) – isti onaj pomenuti transporter NCC koji transportuje . Deblji deo Henleove petlje (TAL) – opet isti kotransporter NKCC2, koji je malopre se transportuje zahvaljujućiovom kanalu koji se nalazi na bazolateralnoj membrani. U ovom delu H.petlje kompletnareapsorpcija obavlja se transcelularno, dok se Na+ transportuje pola transcelularno, polaparacelularno. Distalni izuvijani tubuli (DCT) – isti onaj pomenuti transporter NCC koji transportuje . U sabirnim kanalićima kore vrši se paracelularna difuzija, elektrogena, a u ćelijamatranscelularna reapsorpcija. Opet da se podsetimo šta je to što utiĉe na reapsorpciju Na – to je presvega koliĉina krvi, koliĉina soli u krvi, koja momentalno pokreće simptiĉki nervni sistem i svemoguće agense na koje ispoljava dejstvo, oslobaĊa se renin, sintetiše se angiotenzin. Stvara sealdosteron koji aktivira transkripciju gena za epitelni kanal za Na, kanal za K, Na-K ATPazu.Pitanje je hroniĉna natrijumska? isuficijencija, upravo zbog toga što se (sintetiše, izluĉuje?)manje mineralkortikoida, manje ovih kanala se eksprimira, dovodi do hipotenzije,hiponatriemije, nema kanala za Na, slabo se eksprimiraju, manje je reapsorpcija Na.U organizmumanjak Na, vise K, jer ostaje K u krvi, ne trosi se, ne vrši se njegova sekrecija u ovom delukanalića i opet dolazimo do hipotenzije jer dovodi do diureze.
  • 133. 133 Za receptore za mineralkortikoide se sa potpuno istim afinitetom vezuju glukokortikoidi.Zašto onda glukokortikoidi ne ostvarjuu mineralkortikoidno dejstvo? Zato što se u ćelijama okojima priĉamo kolokalizuje jedan enzim 11 beta HSD prevodi kortizol u kortizon koji nemaafinitet za ovaj receptor što znaĉi da na taj naĉin glukokortikoidi ne mogu da ostvaremineralkortikoidno dejstvo i da utiĉu na promet vode, odnosno soli. Ovaj enzim moţe bitiblokiran jednom komponentom - glicirizinska? kiselina i ne postoji enzim koji prevodi kortizol ukortizon i na taj naĉin se kortizol vezuje za mineralkortikoidne receptore i ispoljavamineralkortikoidno dejstvo. Zadrţava Na, zadrzava vodu , hipertenzija i ovaj se signal nazivaMES. Svi vazokonstriktori utiĉu na koliĉinu vode u krvi. Angionetenzin dovodi do stvaranjaosećaja ţeĊi. Ono što nisam ranije rekla na sl. zeleno aktivira, crveno inhibira. Noradrenalinvezujući se za svoje alfa receptore na proksimalnim tubulama aktivita IP3 i Na-K ATP-azu.Noradrenalin podstiĉe reapsorpciju Na preko NHE izmenjivaĉa i preko Na-K ATPaze.Antidiuretiĉki hormon podstiĉe NKCC2 i kanal za K. Na koji naĉin deluje antidiurtiĉki hormon?Deluje na već sintetisane, već postojeće kanale za Na i sve to preko protein kinaze A.Prostaglandin E2 inhibira PKC, koja fosforiliše kanal za K koji omogućava recirkulaciju NKCC2samim tim inhibira reapsorpciju Cl. Prostaglandin E2 inhibira fosforilaciju kanal za K,onemogućava recirkulaciju NKCC2, onemogućava reapsorpciju Na. Prostaglandin E2 Ibradikinin, vazodilatator inhibiraju (crvena strelica) epitelni kanal za Na osetljiv na amiloid? Nakraju dopamine inhibira Na-H izmenjivaĉ, Na-K ATPazu, ne samo na proksalnim tubulama veći uzlazni deo Henleove petlje. Reaposrpciju Na iz tubulocite u intersticijum reguliše Na-KATPaza, postoje razliĉite izoforme Na-K ATPaza. Alfa 1je široko rasprostranjena, alfa 2 npr.testisi, srce. Ono što smo priĉali da se za Na-K ATPazu vezuje ouabain kao kardijaĉni glikozidi,vezuju se za ovu ATPazu kad je ona u E2 stanju, ona je prazna i otvorena ka vanćelijskoj sredini.Kod ĉoveka postoje endogeni ouabainu sliĉni steroidi. Ustanovljeno je da organizam proizvodi odreĊene steroide koji su nazvani endogenioubainu sliĉni steroidi (EO). Izolovani su pre nekoliko godina, pitanju su cardenolid ibufadienolid (ne pamtiti nazive). To su endogeni inhibitori Na/K ATPaze i logiĉno je da ihsintetišemo kada je potrebno spreĉiti apsorpciju Na+, dakle kada je visok pritisak tj. visokakoncentracija Na+. Kod hipertoniĉara EO se sintetišu u odgovoru na povećanu koncentracijuNa+ u krvi kada treba da se smanji njegova reapsorpcija (ne treba hipertoniĉarima dodavati Na+).On se vezuje za α1 izoformu i direktno blokira transport Na+ preko Na/K ATPaze. Za istuizoformu EO se vezuje i u miocitama srca i utice na oslobaĊanje natriuretiĉkih peptida, jer setreba osloboditi Na+, a natriuretiĉki peptidi omogućavaju natriurezu, tako da EO utiĉu naoslobaĊanje Na+ preko natriuretiĉkih peptida. EO se vezuje za α2 izoformu na aferentnoj arteriolii utiĉe na brzinu glomerularne filtracije. Vezuje se i za α3 izoformu u neuronima i utiĉe naoslobaĊanje dopamina. Rekli smo da dopamin inhibira Na/H izmenjivaĉ 3 i Na/K ATPazu.
  • 134. 134 Transport vode U prvom delu proksimalnih tubula voda se transportuje zahvaljujuci akvaporinima 1 kojisu konstitutivno eksprimirani na bazolateralnoj i apikalnoj membrani tubulocita. Deo transportavode u proksimalnim tubulama se odvija i paracelularno.U silaznom delu Henlejeve petlje transport je uglavnom paracelularan, ali ima i akvaporina 1 naobe strane ćelija. Diabetes insipidus je relativno retko obolenje koje postoji u dve forme: neurogeni ilicentralni DI, koji nastaje usled poremecaja u sekreciji ADH, na nivou hipotalamusa ilineurohipofize, ili nefrogeni DI kod koga bubrezi neadekvatno reaguju na fizioloskekoncentracije ADH. Centralni DI moze biti nasledan ili nastaje zboh povreda ili tumorahipotalamusa ili hipofize, infekcije ili razvoja autoimunskog procesa. Nefrogeni DI je vezan zaporemecaj nivoa elektrolita, bubrezna obolenja vezana za abemiju srpastih celija, upotrebulekova, a takodje moze biti I nasledan. Transport uree Da vidimo šta se dešava sa ureom koja je u krvi. Isfiltrira se u Boumanovoj kapsuli. Uproksimalnim tubulama zna se da se urea transportuje transcelularno i paracelularno. Ne zna setaĉno na koji naĉin.Ono što treba da znamo je da se 50% uree reapsorbuje u proksimalnimtubulama.Sada 50% uree prelazi dalje u Henleovu petlju gde se vrsi sekrecija uree, zahvaljujućiUT2 transporteru, u pitanju je pasivan proces jer je sada nizak gradijent uree u tubulama, a visoku intersticijumu. Ovaj gradijent omogućava pasivnu sekreciju uree izmeĊu intersticijuma itubula. Kako izgleda UT2 transporter , sadrţi 6 ili 10 transmembranskih segmenata, nije bitno,bitno je napraviti razliku izmeĊu UT2 i UT1. Dakle u silaznom i uzlaznom delu Henleove petlje se vrši sekrecija još 60% uree na onih50% se dodaje 60% uree, zahvaljujući UT2 transporteru. Dakle sad praktiĉno kad stignemo dokanalića 110% uree se nalazi u lumenu kanalića. 50% je ostalo posle procesa reapsorpcije i 60%je sekretovano iz intersticijuma u lumen tubula. U samim kanalićima medule se vrši reapsorpcijauree putem dva transporetera – UT1 se nalazi na apikalnoj membrani, a UT4 se nalazi nabazolateralnoj strani. Na ovaj UT1 deluje antidiuretiĉki hormon. Zašto nije bitno da li ima 6 ili10 segmenata? Zato što je gen koji kodira UT1 nastao duplikacijom gena za UT2, pošto ovajprotein izgleda potpuno identiĉno, dva ponovka UT2 transportera koji su povezani jednomspecifiĉnom hidrofilnom petljom koja se nalazi u citosolu koja je mesto fosforilacije PKA.Zašto ADH ne moţe da deluje na UT2? Zbog toga što on nema mesto fosforilacije za PKA.ADH preko PKA utiĉe na fosforilaciju petlje u citosolu koja spaja ova dva ponovka UT2transportera kod UT1 transportera i na taj naĉin ADH podstiĉe reapsorpciju uree. Zbog ĉega jeneophodno da pijemo što više teĉnosti? Da bismo se oslobodili uree. Kad ne pijemo dovoljnoteĉnosti stvara se ADH, a on ne samo što zadrţava vodu već reapsorbuje ureu, vraćamo je nazadumesto da je izluĉimo putem mokraće.
  • 135. 135 Transport glukoze Glikemija 4-5, mada se povećajavaju granice. Glukoza se sva isfiltrira u Boumanovukapsulu , 98% glukoze se vraća u proksimalnim tubulama zahvaljujući kotransporteru glukoza-Na. Na se transportuje nizvodno u pravcu gradijenta koncentracije i omogućava uzvodnotransport glukoze zahvaljujući EFT2 transporteru. Ovaj transporter reapsorbuje glukozu u prvomdelu proksimalnih tubula na stuprotnu stranu, GLUT2 olakšanom difuzijom transportuje glukozuuz gradijent koncentracije iz ćelije u krv. U drugom delu proksimalnih tubula glukoza sereapsorbuje zahvaljujući drugom transporteru, SGLT1. Ovaj transporter ima viši afinitet za Na(ali manji kapacitet), transportuje dva Na zajedno sa 1 glukozom. GLUT 1 transportuje glukozuu pravcu gradijenta koncentracije. U normalnim fiziološkim uslovima u mokraći ne bi trebalo dabude šecera. Kada se šećer pojavljuje u mokraći? U sluĉaju hroniĉno povećane koncentracijenpr. kod diabetes melitusa. Svaka materija se reapsorbuje nezavisno od drugih ali svaka ima svoj transportnimaksimum.Transportni maksimum za glukozu iznosi 14 mmol, normalna glikemija u krvi 4-5.Transporteri su u stanju do 14 da je vrate nazad iznad 14 glukoza ne moze da se reapsorbuje ivrši se njena sekrecija putem mokraće i zato nastaje glikozurija, posledica povećanekoncentracije glukoze u krvi. Posle obroka moţe da skoĉi ali se vraća brzo kod zdravih ljudi jerto insulin reguliše i momentalno je spusta.