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Se aisló Vibrio spp. de juveniles de Argopecten purpuratus concha de abanico para medir su efecto antagonista en cepas infecciosas de Aeromonas spp. Se determinó que Vtibrio spp. tuvo efecto …

Se aisló Vibrio spp. de juveniles de Argopecten purpuratus concha de abanico para medir su efecto antagonista en cepas infecciosas de Aeromonas spp. Se determinó que Vtibrio spp. tuvo efecto antagónico en el crecimiento de Aeromonas spp. observándose anillos de inhibición.

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  • 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE BIOLOGIA EN ACUICULTURA INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Utilización de Vibrio spp. aislado de adultos de Argopecten purpuratus “concha de abanico”, como antagonista de Aeromonas sp. en condiciones de laboratorio. AUTORES: Gonzalez Ferrer José Arturo Velásquez Dávalos Darwin Alexander ASESOR: M. SC .Ángel Castro Alvarado Nuevo Chimbote, diciembre de 2011
  • 2. Introducción Argopecten purpuratus“Concha de abanico”, es un bivalvo pectínido que habita en el Pacifico suroriental a lo largo de la costa del Perú y Chile, su distribución abarca desde Paita Perú (5ºS) hasta Valparaíso, Chile (33ºS). – esta especie vive, en las aguas costera entre los 5 a 30 m de profundidad, (Farías et al, 1997). La presencia constante de bacterias en los tejidos de moluscos bivalvos es considerada un fenómeno natural, ya que debido a su capacidad de filtrar diferentes partículas entre ellas las bacterias, concentraría en sus órganos una mayor carga de estos microorganismos en comparación con otros invertebrados marinos (Prieur et al. 1990, Araya et al. 1999). El género Aeromonas, perteneciente a la familia Vibrionaceae, está formado por bacilos gramnegativos, no esporulantes y anaerobios facultativos. Presentan numerosas similitudes con la familia Enterobacteriaceae. El género se divide en dos grupos. El grupo de las aeromonas psicrófilas inmóviles está formado por una única especie, A. salmonicida, un patógeno obligado de peces que no se aborda más a fondo en este documento. El grupo de las aeromonas mesófilas móviles (con un flagelo polar único), considerado potencialmente peligroso para la salud humana, está formado por las especies A. hydrophila, A. caviae, A. veronii subsp. sobria, A. jandaei, A. veronii subsp. veronii y A. schubertii. Estas bacterias viven de manera habitual en el agua dulce y están presentes en el agua, el suelo y muchos alimentos, especialmente en la carne y la leche. Un método alternativo al uso de antibióticos y que está ganando aceptación en la acuicultura es el uso de bacterias probióticas para controlar patógenos microbianos (Gómez-Gil et al. 2000, Robertson et al. 2000, Balcázar et al. 2006). Estas interacciones antagónicas de tipo bacteriana que involucran la inhibición del crecimiento, corresponden a un mecanismo que puede ayudar a mantener la composición de especies bacterianas a nivel de micro-escala (Long & Azam 2001). Riquelme et al. (2001) y Araya et al. (1999), señalan que la adición de un antagonista bacteriano podría implicar el desplazamiento de bacterias por la producción de componentes inhibitorios, relaciones competitivas del espacio y una mejor utilización del sustrato. Los objetivos de este trabajo fueron la utiización de Vibrio spp. aislado de adultos de Argopecten purpuratus “concha de abanico”, como antagonista de Aeromonas sp. en condiciones de laboratorio y evaluar su uso como agente de control biológico de Aeromonas sp.
  • 3. Materiales y métodos Se trabajo con 5 adultos de Argopecten Purpuratus “concha de abanico”, los cuales presentaron una talla promedio de 8.5 cm, posteriormente se lavaron a individuos con agua corrida por un lapso de 5 minutos aproximadamente, después de esto se extrajo una muestra de contenido estomacal de cada individuo y se preparo una suspensión con las mismas en solución salina, posteriormente se saco una azada de cada suspensión las cuales fueron sembradas en placas con medio TCBS, para luego incubarlas en una estufa convencional a 37 ºC por 72 horas. Fig 1. Preparación de agar TCBS Fig 2. Especímenes de A. Purpuratus “concha de abanico “
  • 4. Fig 3. Obtención de las muestras de A. Purpuratus Fig 4. Suspensión del contenido estomacal de adultos de Argopecten Purpuratus Fig 5. Colonias de vibrio aisladas de adultos de Argopecten Purpuratus
  • 5. Fig 6. Selección de colonias de vibrio y sembrado en frascos de penicilina con agar común. Fig 7. Incubación de las cepas aisladas Una vez finalizado el periodo de incubación se puedo observar las características de las colonias crecientes en cada placa, de donde posteriormente se seleccionaron 5 colonias al azar para luego ser sembradas en frascos de penicilina con agar común para su posterior uso. Prueba de la capacidad inhibitoria de las bacterias aisladas de Argopecten Purpuratus “concha de abanico “ Para hacer la prueba de inhibición bacteriana se utilizo Aeromonas sp como patógeno, asimismo con la finalidad de tener cultivos de la misma edad y en las mismas condiciones se volvió a sembrar las bacterias de vibrio aisladas a partir de adultos de Argopecten Purpuratus “concha de abanico” en otros frascos de penicilina con agar común, lo mismo se hizo con la bacteria patógena, una vez obtenido el cultivo joven de cada bacteria se preparo una suspensión de de cada una, de donde se tomo un mililitro de la suspensión de Aeromonas sp y se espacio en dos placas con agar común, posteriormente se incubo por 20 minutos a 37 ºC, una vez culminado este tiempo se
  • 6. coloco discos estériles en forma dispersa sobre el medio con Aeromonas sp para posteriormente introducir una azada de la suspensión de cada bacteria de vibrio, y finalmente se incubo a 37º C por 24 horas. Fig. 8. Prueba de inhibición de las cepas aisladas de Vibrio sp mediante la utilización de discos estériles. Fig. 9. Colocación de los discos e incubación de las placas.
  • 7. Prueba de fermentación de sacarosa: Para esta prueba se preparo el medio sacarosa en tubos de ensayo, y posteriormente se coloco una azada de la suspensión de cada bacteria de vibrio aislada de adultos de Argopecten purpuratus “concha de abanico “y incubo a 37 ºC por 24 horas, de donde se puedo observar el cambio de color del medio, debido a la fermentación de la sacarosa. Prueba de oxidasa: Se puso una azada de la suspensión bacteriana de la bacteria 1 y 5 en la cinta de oxidasa de donde se pudo observar el cambio de color de la cinta Fig. 10. Prueba de citocromo oxidasa Coloración Gram: Para la coloración Gram se tomo una azada de la bacteria 1 y con una de solución salina en una laminilla, posteriormente se fijó y asimismo se agrego cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina respectivamente en forma ordenada. Finalmente se observó a inmersión a 100x. Fig. 11. Lámina montada con tinción Gram.
  • 8. Resultados Los resultados determinaron que de las 5 cepas aisladas la 1 y 5 dieron positivo en la prueba de sacarosa, las demás fueron negativas y sin formación de gas. Asimismo se observó que únicamente las cepas 1 y 3 presentaron halo de inhibición, siendo el mayor de 8 mm en la cepa 1, por lo que fue seleccionada para la prueba de citocromo oxidasa que resultó positiva. De igual manera se obtuvo que la bacteria 1 fue Gram positiva y presentó forma bacilar. Fig. 12. Resultados de la prueba de sacarosa Fig. 13. Prueba citocromo oxidasa positiva
  • 9. Fig. 14. Formación de halos de inhibición en las cepas 1 y 5 Tabla 1. Medición de los halos de inhibición presentadas por las bacterias 1 y 5 Bacteria N° Medida de halo Medida de disco Inhibición 1 8 mm 5.5 mm 2.5 mm 5 6 mm 5.5 mm 0.5 mm Tabla 2. Características de la bacteria 1. Bacteria N° Sacarosa Oxidasa Coloración Gram Morfología celular Color de Colonia 1 + + + bacilar amarilla
  • 10. Fig. 15. Observación microscópica de la cepa seleccionada (bacteria 1). Discusión En la actualidad cada vez más se investiga sobre los aspectos benéficos o antagónicos de la interacción de algunas especies bacterianas y los demás componentes del ciclo microbiano (Leyton & Riquelme 2008). Estas interacciones antagónicas de tipo bacteriana que involucran la inhibición del crecimiento, corresponden a un mecanismo que puede ayudar a mantener la composición de especies bacterianas a nivel de micro- escala (Long & Azam 2001). Riquelme et al. (2001) y Araya et al. (1999), señalan que la adición de un antagonista bacteriano podría implicar el desplazamiento de bacterias por la producción de componentes inhibitorios, relaciones competitivas del espacio y una mejor utilización del sustrato. En el estudio realizado se obtuvo que de las 5 cepas aisladas, sólo las cepas 1 y 5 presentaron halos de inhibición (Tabla 1), seleccionando la cepa 1 por presentar el halo más grande. De esta manera, los resultados obtenidos indicarían que la bacteria 1 sería aeróbica y no fermentadora o que fue corroborado en la prueba de sacarosa al no observarse formación de gas en la campana Durham. Esto unido al hecho de ser Gram positiva nos daría más datos en la identificación del género. La bacteria 1 fue la que presentó el halo más grande con 8 mm de diámetro, siendo pequeño en comparación con lo encontrado por Avendaño-Herrera et a. (2005) quienes reportan que, las actividades inhibitorias de las cepas seleccionadas variaron desde
  • 11. simples halos de inhibición de escasos 2 mm hasta potentes antagonismos bacterianos de 30 mm de diámetro. Asimismo, León et al. (2010), reporta que los diámetros de halo de inhibición variaron de 3,7 mm a 20 mm. Esto significaría que los porcentajes de substancias inhibitorias en las bacterias muestran valores fluctuantes según las cepas (Prescott et al., 1999). Sin embargo, el tamaño del halo de inhibición del crecimiento bacteriano no tiene relación lineal con el efecto bactericida de los antibióticos utilizados, ya que éste está relacionado también con la concentración del mismo y con la capacidad de difusión del antibiótico en el medio (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 1999). Además, la efectividad in vitro de un probiótico no garantiza los mismos resultados in vivo (Campa-Córdova et al., 2011). De esta manera, para determinar la sensibilidad de una determinada especie frente a un antibiótico, se realiza una comparación con datos conocidos (Ajello García-Tello 2004; Fajardo, 2002). Por otro lado, León et al, 2010 destaca el aislamiento de cepas pigmentadas de amarillo, las cuales mostraron fuerte actividad inhibitoria contra Staphylococcus aureus, así como las dos cepas de actinomicetos (EM-10 y EM-14) ambos procedentes de Heliaster helianthus “estrella de mar”. Asimismo, García-Tello & Fajardo (2002) aislaron 23 cepas hallándose morfología celular de bacillus y cocco siendo todas oxidasa citocrómica positivas sólo 2 fueron Gram negativas, las demás fueron Gram positivas colonias amarillas y cremas. Del mismo modo en la experiencia realizada se observó que a bacteria seleccionada presentó color amarillo y forma bacilar, siendo insuficiente estos datos para determinar el género por lo que debe hacerse más pruebas y el análisis morfológico para este propósito. Igualmente, en el estudio realizado, se determinó que la cepa seleccionada resultó ser Gram positiva ofreciendo esto una ventaja pues, el uso de bacterias Gram positivas como indicadoras de antibiosis permite recuperar mayor número de cepas marinas gracias a la alta sensibilidad inhibitoria mostrada en comparación con las Gram negativas (León et al, 2010).
  • 12. Conclusiones - Se aislaron 5 cepas de los ejemplares de A. purpuratus anualizados, teniéndose los mejores resultados en la cepa 1 presentando un halo de inhibición de 8 mm de diámetro. - Se registró que la bacteria seleccionada presentó color de colonia amarilla, forma bacilar y Gram positiva y tuvo resultado positivo a las pruebas de sacarosa y citocromo oxidasa. - Por los resultados obtenidos se sugiere su utilidad probiótica en acuicultura. No obstante para medir su sensibilidad inhibitoria es pertinente determinar las concentraciones y dosis apropiadas para efectivizar sus propiedades antagónicas en Aeromonas sp. Recomendaciones Los resultados de este estudio son prometedores si se considera que los antibióticos son cada vez más escasos, especialmente frente a patógenos causantes de enfermedades emergentes y aquellos oportunistas de creciente importancia en organismos de cultivo tales como A. purpuratus, a lo cual hay que agregar el incremento de la resistencia a enfermedades por el uso indiscriminado de estos compuestos. Por esta razón se considera pertinente las siguientes recomendaciones: - Realizar estudios de identificación a nivel de género y morfología celular y presencia o ausencia de flagelos, de las cepas aisladas con capacidad inhibitoria. - Realizar pruebas de antibiosis utilizando la cepa seleccionada en este estudio, en otros patógenos identificados en Argopecten purpuratus. - Se hace necesario la realización de estudios adicionales para evaluar diferente concentración/dosificación y determinar la que resulte más adecuada para mejorar la condición fisiológica de los organismos en cultivo y su respuesta inmune ante agentes patógenos y condiciones ambientales de estrés.
  • 13. Bibliografía Ajello, G. ; Cheryl Bopp; J. Elliott; R. Facklam; J. Knapp; T. Popovic; J. Wells & S. Dowell. 2004. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Organización Mundial de la Salud. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, Georgia, EUA. Araya, R.; M. Jorquera & C. Riquelme. 1999. Asociación de bacterias al ciclo de vida de Argopecten purpuratus. Revista chilena de Historia Natural 72: 261-271. Avendaño-Herrera, R. ; M. Lody & C. Riquelme. 2005. Producción de substancias inhibitorias entre bacterias de biopelículas en substratos marinos. Revista de Biología Marina y Oceanografía 40(2): 117 – 125. Campa-Córdova, A.; A. Luna-González; J. Mazón-Suastegui; G. Aguirre-Guzmán; F. Ascencio & H. González-Ocampo. 2011. Efecto de bacterias probióticas en el cultivo larvario del ostión de placer Crassostrea corteziensis (Bivalvia: Ostreidae) Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 59 (1): 183-191. García-Tello, P.; V. Ardiles & J. Fajardo. 2002. Bacterias en la hemolinfa de Argopecten purpuratus (Lamark, 1819) (Bivalvia: Pectinidae). Revista de Biología Marina y Oceanografía 37 (2): 147 – 149. León, J.; L. Liza, I. Soto, M. Torres & A. Orosco. 2010. Bacterias marinas productoras de compuestos Antibacterianos aisladas a partir de invertebrados Intermareales. Rev Peru Med Exp Salud Publica 27(2): 215-21. Leyton, Y. & C. Riquelme. 2008. Vibrios en los sistemas marinos costeros. Revista de Biología Marina y Oceanografía 43(3): 441-456. Madigan, M.; J. Martinko & J. Parker. 2003. Brock Biología de los Microorganismos. 10ª edición. Prentice-Hall. Madrid.
  • 14. Prescott, L.; J. Harley & D. Klein. 1999. Microbiología. 4ª edición. McGraw-Hill Interamericana.

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