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Tecnicas%20de%20identificacion%20bacteriana

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  • 1. V. TAXONOMÍA DE LOS PROCARIOTASTema 41. Técnicas de identificación bacteriana.
  • 2. Técnicas de identificación bacteriana. I. Concepto y tipos de diagnóstico II. Técnicas utilizadas en el diagnóstico directo 1. Técnicas de microbiología clásica 2. Técnicas inmunológicas. 3. Técnicas de biología molecular 4. Otras técnicas específicas. III. Técnicas utilizadas en el diagnóstico indirecto
  • 3. Técnicas de identificación bacteriana. I. Concepto y tipos de diagnóstico II. Técnicas utilizadas en el diagnóstico directo 1. Técnicas de microbiología clásica 2. Técnicas inmunológicas. 3. Técnicas de biología molecular 4. Otras técnicas específicas. III. Técnicas utilizadas en el diagnóstico indirecto
  • 4. I. Concepto y tipos de diagnósticoDIAGNÓSTICO DIRECTO: se identifican los microorganismos, sus antígenos,sus metabolitosDIAGNÓSTICO INDIRECTO: se identifican los anticuerpos frente a losmicroorganismos
  • 5. Diagnóstico directo:•Se analiza cualquier muestraDiagnóstico indirecto:*la muestra estudiada es siempre la sangre
  • 6. II. Técnicas utilizadas en eldiagnóstico directo.1. Técnicas de microbiología clásica2. Técnicas de biología molecular3. Técnicas inmunológicas4. Otras técnicas específicas.
  • 7. 1. TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÁSICA• Observación macroscópica y microscópica• Enriquecimiento y aislamiento• Cultivo puro• Identificación2. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS: para identificar Ag• IF: inmunofluorescencia• RIA: radioinmunoanálisis• ELISA: enzimoinmunoanálisis• CIE: contrainmunoelectroforesis
  • 8. 3. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR•PCR + SONDAS ESPECÍFICAS4. OTRAS TÉCNICAS ESPECÍFICAS•BIOENSAYO: ensayos en animales deexperimentación o en cultivos celulares•CROMATOGRAFÍA GASEOSA: ácidosgrasos(Mycobacterium)•TEST DEL ALIENTO (Helicobacter)
  • 9. II. Técnicas utilizadas en eldiagnóstico directo1. Técnicas de microbiología clásica Etapas:-Toma de muestra-Análisis macroscópico-Microscopía-Enriquecimiento-Aislamiento-Identificación
  • 10. Toma de muestras: primera etapaLa muestra a tomar y la forma de hacerlodependerá del tipo de enfermedadinfecciosa •Orina: ITU •Heces: infección intestinal •Esputo: infección respirartorio inferior •Sangre: infección sistemica •Secreciones: ETS •Otras Los recipientes serán estériles
  • 11. Tosferina: como elmicroorganismo es muy lábil elpaciente tose sobre la muestra
  • 12. Muestras usadas en el diagnóstico directo Las muestras de Dispositivo para tomar una heces se toman muestra de orina enrecipientes directamente en la vegija anchos
  • 13. Toma de muestra del respiratorio inferior y superiorEscobillón estéril
  • 14. Toma de muestra de sangreToma de muestra del LCR(meningitis)
  • 15. Examen macroscópico de la muestra:segunda etapaPuede orientar el diagnósticoEsputo: color, presencia de sangreOrina: turbidez, olor, colorLCR: turbidezHeces: pus, sangre, restos celulares
  • 16. Examen microscópico de la muestra: segunda etapaSegún cada caso se recurrirá a unatécnica microscópica (óptica,fluorescencia, contraste de fase)y tipo de tinción (Gram, Ziehl-Neelsen)Muy útil cuando…La bacteria tiene una morfología muy típica:Neisseria, Vibrio, TreponemaLa bacteria no se puede cultivar
  • 17. Mycobacterium: tinción de AAREjemplos: Neisseria: tinción de Gram IFTreponema: contraste de fase
  • 18. Enriquecimiento: cuarta etapa(opcional)•Si la muestra esta diluida•Si la bacteria que se desea aislarpresenta una característica útilpara su enriquecimiento
  • 19. EjemplosAISLAMIENTO DE VIBRIOCHOLERAE-Enriquecimiento selectivo enagua de peptona alcalina.DESPUÉS-Aislamiento en TCBS(tiosulfato, citrato, bilis ysacarosa)-Sensibilidad al O/129.
  • 20. Staphylococcus aureus: puede crecer enpresencia de salesEnriquecimiento con NaCl 10% (TSB;Giolitti Cantoni)
  • 21. DESPUES: Medios selectivos para Staphylococcus aureus Baird-Parker (telurito) Manitol salado
  • 22. Aislamiento: quinta etapa Se utilizan Medios ordinarios Medios enriquecidos Medios selectivos Medios diferenciales Medios de enriquecimientoSu tipo depende del análisis y juega unpapel decisivo el buen criterio del analista
  • 23. Aislamiento Medios TCBS para Escherichia coliMedios selectivos y diferenciales para las enterobacterias Medio ordinario
  • 24. A veces es aconsejable usarincubación en bajastensiones de oxígeno parafavorecer el aislamiento oactividad de determinadasbacteriasEj: crecimiento y hemolisisde Streptococcus
  • 25. Identificación: sexta etapa, utilizandopruebas hechas en el laboratorio ominiaturas comercializadas
  • 26. Ejemplos Pruebas Bioquímicas, fisiológicas y nutricionales Betahemolisis Sistema API DNAsa
  • 27. Sistema API
  • 28. Antibiograma: séptima etapa•No siempre se realiza•No es una técnica de identificación•Para seleccionar los antimicrobianos aensayar debería tenerse ya elmicroorganismo identificado
  • 29. ANTIBIOGRAMA: Técnica de Müeller-Hinton Disco impregnado de antibiótico
  • 30. II. Técnicas utilizadas en el diagnóstico directo.1.Técnicas de microbiología clásica2.Técnicas de biología molecular3. Técnicas inmunológicas.4. Otras técnicas específicas.
  • 31. Hibridación con sondas específicas marcadas
  • 32. AMPLIFICACIÓN DEL DNA DE LA MUESTRA POR PCR
  • 33. Técnicas de identificación bacteriana. I. Concepto y tipos de diagnóstico II. Técnicas utilizadas en el diagnóstico directo 1. Técnicas de microbiología clásica 2. Técnicas de biología molecular Tecnicas Inmunológicas 2. Técnicas inmunológicas. Directas 4. Otras técnicas específicas. III. Técnicas utilizadas en el diagnóstico indirecto Tecnicas inmunológicas indirectas
  • 34. TECNICAS INMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNOSTICO DIRECTO•Se investigan los microorganismos mediante sus antígenos.•La muestras pueden ser diversas•Reactivo: el AbTECNICAS INMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNOSTICOINDIRECTO (serología)•Se investigan los anticuerpos formados frente a unmicroorganismo.•La muestra es el suero•Reactivo: el Ag
  • 35. Existen ya pruebas comercializadas para identificara los microorganismos patógenos más importantes
  • 36. 1. Reacciones de precipitación: medio sólido Cuando el Ag y el Ab se mezclan en las proporciones adecuadas se forma un precipitado
  • 37. Inmunodifusión (precipitación) Ag Un suero que puede tener Ab Anillo de precipitación
  • 38. Inmunoelectroforesis: inmunodifusion + electroforesis1. electroforesis: las mezcla de Ag se separa2. Se enfrentan al anticuerpo3. Si son específicos precipitan juntos
  • 39. Reacciones de aglutinación: Medio líquido: se hacen en tubos o en placas de microtitulación. Diagnóstico indirecto Distintas muestras Muestra positiva La concentración de Ab va disminuyendoASLO (anti-estreptolisina O): Se buscan Ab frente a laestreptolisina O de Streptococcus pyogenes (diagnósticode la fiebre reumática)
  • 40. Aglutinación en medio líquido
  • 41. Aglutinación en látex para StaphylococcusaureusSe mezcla un colonia con Ab específicos contra laproteína ASe observa la aparición o no de grumos
  • 42. Inhibición de la hemaglutinaciónAl bloquear el microorganismo con sus Ab específicos(presentes en el suero del enfermo) no se da lahemaglutinación
  • 43. Fijación del Complemento-Ab +Ab El C se une sólo si Ag y Ab han reaccionado Como el C está libre produce la lisis de los hematíes que a su vez han reaccionado con su Ab; en el tubo de la derecha no es posible porque el C se ha consumido en la otra reacción
  • 44. 4. Inmunofluorescencia (IF, IFD)
  • 45. InmunofluorescenciaIndirecta (IFI)
  • 46. Bacteria (Legionella) teñida con anticuerposfluorescentes y vista al microscopio de luz UV
  • 47. 6. Enzimoinmunoanálisis(ELISA)
  • 48. Inmunoblot oInmunotransferencia