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  • 1. NORMA TÉCNICA NTCCOLOMBIANA 4939 2001-05-30CALIDAD DE AGUA.ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichiacoli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN YTÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICOE: WATER QUALITY. COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI COUNTING. FERMENTATION TUBE TECHNIQUE AND ENZYMATIC SUBSTRATE TECHNIQUECORRESPONDENCIA:DESCRIPTORES: Coliformes, E. coli.I.C.S.: 67.040, 07.100.20Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435Prohibida su reproducción
  • 2. PRÓLOGOEl Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismonacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamentalpara brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con elsector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas enlos mercados interno y externo.La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnicaestá garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este últimocaracterizado por la participación del público en general.La NTC 4939 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-05-30.Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda entodo momento a las necesidades y exigencias actuales.A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma através de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología.ACEGRASAS FRIGORÍFICOS SUIZO S.A.ALPINA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.AQUALAB GASEOSAS LUXASINAL LTDA ICAAVESCO INGENIO PICHICHIBIOQUILAB LTDA. INGENIO RIOPAILACALIDAD MICROBIOLÓGICA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.CALIDAD TOTAL LESNIAK E.U.CARULLA Y CÍA. MEALS S.A.CERVECERÍA LEONA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.EMPRESA DE ACUEDUCTO Y NULAB LTDA.ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOSFÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS QUIOS LTDAEL REY S.A. TECNOCLEAN DE COLOMBIAFRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. TRES M DE COLOMBIAAdemás de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de lassiguientes empresas:ALGARRA DISA S.A.ASEBIOL EMPRESA DE ACUEDUCTO YBEATRIZ DEL PILAR MACÍAS ALCANTARILLADO DE BOGOTÁCASA LUKER S.A. HACIENDA SANTA HELENACOLOMBINA S.A. INVIMACOLSUBSIDIO LA CAMPIÑA S.A.COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PARACONGELAGRO LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOSCONSESIONARIO TIBITOC LABORATORIO PROCALIDAD
  • 3. LABORATORIOS GRAM PRODUCTORA DE JUGOS S.A.LLOREDA GRASAS S.A. QUALA S.A.MERCK RICA RONDOMINISTERIO DE SALUD UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUDPANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PÚBLICAPASSIFLORA COLOMBIANA S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANOPROCESADORA DE LECHE S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesadosnormas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
  • 4. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939CALIDAD DE AGUA.ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli.TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICADE SUSTRATO ENZIMÁTICO1. OBJETOLa presente norma especifica dos métodos para la enumeración de Coliformes y E. coli. ElMétodo A describe la Técnica de tubos de fermentación y el Método B describe la Técnica deSubstrato enzimático empleando tubos múltiples, presencia y ausencia o multiceldas enmuestras de agua tratada, cruda o residual, de acuerdo con lo propuesto por el StandardMethods 20 edición 1998. Método A Técnica de los tubos de fermentación2. DEFINICIÓNPara los propósitos de este método se aplica la siguiente definición.Coliformes: bacterias gramn negativas que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) causanfermentación de lactosa con producción de gas en las condiciones de ensayo especificadas eneste método.3. PRINCIPIO3.1 PRUEBA PRESUNTIVAInoculación de quince tubos con medio selectivo líquido (Véase el numeral 4.2), con serie decinco tubos con 10 ml, 1,0 ml y 0,1 ml de muestra de ensayo respectivamente ó diez tubos conmedio selectivo líquido con 10ml de la muestra de ensayo o inoculación de cinco tubos conmedio selectivo líquido con 20 ml de la muestra de ensayo.3.2 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C de los tubos inoculados durante 24 h a 48 h y análisis deestos tubos. 1
  • 5. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 49393.3 PRUEBA CONFIRMATIVAAislamiento de los cultivos procedentes de la serie de tubos en los cuales se haya observadoformación de gas y acidez en medio líquido para confirmación (Véase el numeral 4.3).3.4 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h3.5 Cálculo del número más probable de coliformes por 100 ml de muestra (es decir elNMP), a partir del número de tubos que muestren formación de gas, usando una tabla paradeterminación de números más probables.3.6 Para establecer la presencia de coliformes y establecer una carta de control de calidad,se utiliza el ensayo completo sobre al menos el 10 % de los tubos confirmados.Simultáneamente se inoculan en Caldo bilis verde brillante lactosa para coliformes totales ycaldo EC para coliformes fecales o EC+MUG para E. coli a 44,5 ºC. Los resultados positivos dela prueba indican un ensayo completoParalelamente la presencia de tubos positivos en caldo bilis verde brillante pero negativos encaldo EC o EC+MUG indican la presencia de coliformes no fecales4. MEDIOS DE CULTIVO4.1 GENERALIDADESEn la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica actual de laboratorio.4.2 CALDO LAURYL TRIPTOSA Composición Triptosa 20 g Lactosa 5,0 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g Lauril sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada, desionizada 1 000 mlPreparaciónEl caldo lauryl triptosa debe prepararse teniendo en cuenta que la concentración original delmedio debe mantenerse al adicionar la muestra. Por ejemplo: se prepara el medio a dobleconcentración si el volumen de la muestra es igual al volumen del medio a utilizar.Se añaden los ingredientes deshidratados al agua destilada, se mezcla cuidadosamente y secaliente para disolverlo. El pH deberá ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización.Antes de esterilizarlo, se agrega caldo a los tubos de fermentación en cantidad suficiente paracubrir los tubos durham invertidos, (al menos parcialmente después de la esterilización). Secierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. 2
  • 6. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.Como alternativa, se omite el tubo durham invertido y se añade 0,01 g/l de púrpurabromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido en lugar de laformación de gas, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba.4.3 CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (MEDIO SELECTIVO) Composición Peptona 10 g Lactosa 10 g Bilis de buey deshidratada (sales biliares) OXGALL 20 g 1 Verde brillante 0,0133 g Agua destilada, desionizada 1 000 mlPreparaciónSe añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calientapara disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente demedio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Secierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.4.4 CALDO E C Composición Triptosa 20 g Lactosa 3,0 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g Lauryl sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada, desionizada 1 000 mlPreparaciónSe añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calientepara disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente demedio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Secierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. 3
  • 7. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.Los tubos de fermentación no de en contener burbujas de aire después de la esterilización.4.5 AGAR LES ENDO Composición Peptona 10 g Lactosa 10 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,5 g Sulfito sódico anhidro 3,3 g Pararrosanilina (fuscina) 0,3 g Agar 12,5 Agua destilada, desionizada 1 000 mlPreparaciónSe añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calientepara disolverlos. El pH debe ser de 7,4 ± 0,2 después de la esterilización.Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.Se vierten en cajas de petri de 100 mm x 15 mm4.6 AGAR MACCONKEY Composición Peptona caseinada 17,0 g Peptona de carne Proteasa 3,0 g SorbitolLactosa 10,0 g Sales biliares No.3 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo neutro 0,03 g Violeta cristal 0,001 g a Agar 12 g a 15 g Agua 1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agarPreparaciónSe añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente hasta ebullición paradisolverlos. Se esteriliza en el autoclave por 15 min a 121 °C. Tras la esterilización, se vierte el agaren cajas de petri (100 mm x 15 mm). El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización. 4
  • 8. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 49394.7 AGAR NUTRITIVO Composición Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Cloruro de sodio 5,0 g a Agar 12 g a 18 g Agua 1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agar.PreparaciónSe añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos.El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, se dispensa elmedio en tubos con tapón de rosca. Después de la esterilización, inmediatamente coloque enposición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajustar los taponesdespués de que se hayan enfriado y conserve en una zona fría y protegida.4.8 REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE GRAM4.8.1 Oxalato de amonio - cristal violeta (de Hucker)Se disuelven 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 %) en 20 ml de alcoholetílico al 95 %; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4.H2O en 80 ml de agua destilada; se mezclanambas soluciones y se deja reposar durante 24 h antes de usarlas; se filtra a través de unpapel y se conserva en un frasco de tinción.4.8.2 Solución de Lugol, modificación de GramnSe tritura en un mortero, 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Se añade lentamente aguadestilada y se tritura con cuidado después de cada adición hasta que se complete la solución.Se almacena en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (usando un total de300 ml).4.8.3 ContrasteSe disuelven 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 %. Se añaden de 10 ml a100 ml de agua destilada.4.8.4 Alcohol acetonaSe mezclan partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona. 5
  • 9. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 49394.9 CALDO E C + MUG Composición Triptosa o tripticasa 20 g Lactosa 5,0 g Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 g Fosfato dipotásico K2HPO4 4,0 g Fosfato de potasio KH2PO4 1,5 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g 4-methylumberiferil B D glucoronidasa MUG 0,05 g Agua destilada, desionizada 1 000 mlPreparaciónSe disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediantecalentamiento si es necesario.Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea 6,9 +/-2 a25 °C.Se distribuye el medio, en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 180 mm (véaseel numeral 5.4)Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos no debenpresentar fluorescencia bajo la luz UV a 366nmNo es necesario utilizar tubos invertidos. Las tapas pueden ser metálicas o plásticas resistentesal calor5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIONota 1. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material devidrio reutilizable.Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente. Véase la NTC 4092(ISO 7218).5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE)Véase la NTC 4092 (ISO 7218).5.2 INCUBADORACon capacidad de funcionar a 35 °C ± 2 °C.5.3 ASASHechas de platino/iridio o níquel/cromo o asas desechables. 6
  • 10. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 49395.4 TUBOS DE ENSAYOCon capacidad apropiada para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo y laincubación de medios.5.5 TUBOS DURHAMCon capacidad de 50 mm x 10 mm5.6 PIPETAS DE ENTREGA TOTALCon capacidad nominal de 1ml y 10 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y0,5 ml.5.7 MEDIDOR DE PHCon capacidad para dar lecturas con aproximación a 0,01 unidades de pH a 25 °C, que permitarealizar mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH5.8 PIPETEADOR5.9 CAJAS PETRI6. MUESTREOPara la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el StandardMethods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14.7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYOSe comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección.Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia8. PROCEDIMIENTOVéase el diagrama del Anexo A (Normativo).8.1 MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES Tabla 1. Preparación del medio líquido de Lauril Triptosa Medio líquido de lauril Inóculo Cantidad de medio en el Volumen del medio + triptosa deshidratado ml tubo inóculo requerido ml ml g/l 1 10 o más 11 o más 35,6 10 10 20 71,2 10 20 30 53.4 20 10 30 106,8 100 50 150 106,8 100 35 135 137,1 100 20 120 213,6 7
  • 11. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 49398.2 PRUEBA PRESUNTIVA (Inoculación e incubación)Se agrupan los tubos de fermentación en hileras de cinco o diez en una gradilla para tubos deensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de lacantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar.Para agua potable: se utilizan cinco porciones de 20 ml o diez porciones de 10 ml, o una solabotella de 100 ml.Si se trata de agua no potable: se utiliza cinco tubos por dilución (de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, etc.).Se agita vigorosamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Se inocula cada tubo en ungrupo de cinco con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, sise utilizan cantidades decimales de la muestra). Se mezclan las porciones a estudiar medianteagitación suave. Se verifica que en los tubos durham invertidos no halla quedado aire.Se incuban los tubos inoculados o las botellas a 35 °C ± 0,5 °C. Después de 24 h ± 2 h, seagita cada tubo o botella suavemente y se observa si se produce crecimiento, gas o unareacción ácida (color amarillo) y, en caso contrario, se reincuba y se vuelve a examinar al finalde 48 h ± 3 h. Se registra la presencia o ausencia de crecimiento, gas y reacción ácida. Si nose ha utilizado el tubo de durham, un crecimiento con acidez significa una presunta reacciónpositiva.Interpretación. La aparición de gas o ácido en los tubos o botellas dentro de las 48 h ± 3 hconstituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben serestudiados en la fase confirmatoria.La ausencia de reacción ácida o de formación de gas al finalizar las 48 h ± 3 h de incubaciónindica una reacción negativa.Se someten las muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción ácidao formación de gas a la fase confirmatoria. El límite arbitrario de 48 h para la observaciónexcluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen demanera muy lenta8.3 PRUEBA CONFIRMATIVASe someten todos los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren crecimiento,cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 h ± 2 h de incubación a la faseconfirmatoria. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 h ± 2 h,transfiera al medio de confirmación; preferiblemente examine los tubos a las 18 h ± 1 h. Si hayotros tubos o botellas de la fase presuntiva con crecimiento ácido después de las 48 h ± 3 h deincubación, también se llevarán a la fase confirmatoria.Se agitan suavemente o se hacen rotar los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestrengas o crecimiento ácido para que se produzca una resuspensión de los microorganismos.Con una asa estéril de 3,0 mm a 3,5 mm de diámetro, se transfiere un asa completa de cultivoal tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introduzca unaplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, se retira rápidamente y seintroduce hasta el fondo en la botella o el tubo de fermentación con el medio mencionado. 8
  • 12. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Se retira y desecha el aplicador. Se repite esta operación para todos los tubos posiblementepositivos.Se incuba el medio de verde brillante lactosa bilis a 35 °C ± 0,5 °C. La formación de cualquiercantidad de gas en el tubo durham invertido en el medio de fermentación verde brillante delactosa bilis a cualquier tiempo (por ejemplo, 6,0 h ± 1 h, 24 h ± 2 h) dentro de las 48 h ± 3 hconstituye un resultado positivo en la fase confirmatoria.Se calcula el NMP a partir del número de tubos positivos en el medio de fermentación verdebrillante de lactosa bilis.Procedimiento alternativo. Se usa esta alternativa sólo para aguas contaminadas oresiduales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos.En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante24 h, lleve sólo a la fase confirmatoria los tubos de la dilución más alta (menor muestra deinóculo) en la cual todos los tubos son positivos y algunos tubos positivos en diluciones aúnmás altas.Se somete a la fase confirmatoria todos los tubos que presenten gas o crecimiento ácido sólodespués de las 48 h.8.4 PRUEBA COMPLETAPara establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control decalidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10 % de los tubos positivosconfirmados.Simultáneamente, se inocula en medio líquido verde brillante de lactosa bilis para coliformestotales y medio líquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio líquido EC-MUGpara Escherichia coli.Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldomedio líquido EC y medio líquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 °C).Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medioEC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales.Se siembra asépticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo demedio verde brillante lactosa bilis que ha producido gas; se realiza la operación lo antes posibletras la detección del gas.Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas,separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevadaproporción de aislamientos satisfactorios, se deben tener las siguientes precauciones: (a) Seutiliza un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en lapunta; (b) se abre e inclina el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquiermembrana o espuma; (c) se introduce el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a unaprofundidad de alrededor de 0,5 cm, y (d) se siembra la caja con la parte curvada de la agujaen contacto con el agar para no arañar la superficie.Se flamea el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de lascolonias. 9
  • 13. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Se incuban las cajas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h.Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como típicas (rosas arojo oscuras con un brillo verde metálico superficial) o atípicas (rosas, rojas, blancas o incolorassin brillo) a las 24 h de incubación.Las colonias típicas de la fermentación de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkeyson rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar.Se toma de cada caja una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o másentre las que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupocoliforme y se las pasa a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agaren inclinado (este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable).Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la horade tomarlas de las cajas de agar LES Endo o agar MacConkey.Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estén bien aisladas y se toca apenas susuperficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible elpeligro de transferir un cultivo mixto.Se incuban los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con tubosdurham de fermentación invertidos) a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h; si no se produce gasen este período se prolonga la incubación hasta 48 h ± 3 h.Se estudian microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivosde pendiente de agar a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas.Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción deGramn en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gramnpositivas ymicroorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva.Existen varias modificaciones de la técnica de Gramn. Se utiliza la modificación de Hucker parateñir las extensiones de cultivos puros; se incluye un control para organismos grampositivos yotro para gramnegativos.Se preparan emulsiones ligeras distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de loscultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas deagua destilada colocadas en el cristal.Se dejan secar al aire y se fijan pasando el porta sobre una llama, se tiñen por 1 min con lasolución de oxalato de amonio cristal violeta. Se enjuaga con agua corriente y se aplica lasolución de Lugol durante 1 min.Se lava de nuevo el porta teñido con agua corriente. Se decolora durante aproximadamente15 s - 30 s con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y deje que el alcoholacetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No decolore en exceso.Contraste con safranina durante 15 s, lave con agua corriente, seque con papel absorbente o alaire y examine microscópicamente. Los microorganismos grampositivos son azules y losgramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacciónadecuada. 10
  • 14. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Interpretación. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en lostubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 h ± 3 h y la demostración de bacteriasalargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo quedemuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme.9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS9.1 PRECISIÓN DE LA PRUEBA DE TUBOS DE FERMENTACIÓNA menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba detubos de fermentación es muy baja. Por ejemplo, si sólo 1 ml es examinado en una muestraque contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 % de los tubos de 1 ml pueden producir resultadosnegativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra.Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la muestra, sepuede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de 1 % de las veces.Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muyelevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de losresultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra,sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado.9.2 CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMPPara calcular la densidad de coliformes, se calcula en términos del Número Más Probable(NMP). Las Tablas 2, 3 y 4 indican los valores del NMP para distintas series de siembras yresultados. En estas tablas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP.Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, se reporta el valorcorrespondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma deNMP/100 ml o se reporta como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales.Los volúmenes de muestra indicados en las Tablas 2 y 3 están relacionados de forma másespecífica con las aguas terminales.La Tabla 4 ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativoscuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml.En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, seseleccionan los valores de NMP de la Tabla 4 por la combinación de tubos positivos,calculando de acuerdo con la siguiente fórmula: 10 Valor del NMP (de la tabla) x = NMP / 100 ml Mayor volumen estudiadoCuando se utilice más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán losresultados de tres de ellas para calcular el NMP. 11
  • 15. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinación del índice del NMP, seescoje la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ningunadilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas.Se usan los resultados de estos tres volúmenes para calcular el índice del NMP. En el ejemplosiguiente, los resultados de la dilución significativa se dan en negritas. El numeradorrepresenta los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados; la combinaciónde positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución: Combinación Índice NMP / Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml de positivos 100 ml a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5 000 b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2 200 c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20En c, se selecciona las tres primeras diluciones, de manera que se incluya el resultado positivoen la dilución media.Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea d, en el queuna dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, elresultado se incorpora a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e: Combinación Índice NMP / Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml de positivos 100 ml d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1 400 e 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1 400Si desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurriráa la media geométrica o la mediana.En la Tabla 4 se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecencombinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que latécnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que sebasa el cálculo del NMP.El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tuboso diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas: No. de tubos positivos NMP/100 ml = x 100 ml de muestra en los tubos negativos x ml de muestra en todos los tubosAunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables paradeterminar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudioadecuados. 12
  • 16. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 2. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 20 ml No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados) Índice dan reacción positiva de NMP/ un total de cinco 100 ml Superior Inferior de 20 ml c/u 0 <2,2 0,0 6,0 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 >16,0 8,0 Infinito Tabla 3. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados) Índice dan reacción positiva de NMP/ un total de diez 100 ml de 10 ml c/u Superior Inferior 0 <1,1 0,0 3,0 1 1,1 0,03 5,9 2 2,2 0,26 8,1 3 3,6 0,69 10,6 4 5,1 1,3 13,4 5 6,9 2,1 16,8 6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5 10 >23,0 13,5 Infinito 13
  • 17. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 4. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml) Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados) Combinación NMP/ de positivos 100 ml Superior Inferior 0-0-0 <2 - - 0-0-1 2 1,0 10 0-1-0 2 1,0 10 0-2-0 4 1,0 13 1-0-0 2 1,0 11 1-0-1 4 1,0 15 1-1-0 4 1,0 15 1-1-1 6 2,0 18 1-2-0 6 2,0 18 2-0-0 4 1,0 17 2-0-1 7 2,0 20 2-1-0 7 2,0 21 2-1-1 9 3,0 24 2-2-0 9 3,0 25 2-3-0 12 5,0 29 3-0-0 8 3,0 24 3-0-1 11 4,0 29 3-1-0 11 4,0 29 3-1-1 14 6,0 35 3-2-0 14 6,0 35 3-2-1 17 7,0 40 4-0-0 13 5,0 38 4-0-1 17 7,0 45 4-1-0 17 7,0 46 4-1-1 21 9,0 55 4-1-2 26 12 63 4-2-0 22 9 56 4-2-1 26 12 65 4-3-0 27 12 67 4-3-1 33 15 77 4-4-0 34 16 80 Continúa . . . 14
  • 18. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 4. (Final) Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados Combinación NMP/ de positivos 100 ml Superior Inferior 5-0-0- 23 9 86 5-0-1 30 10 110 5-0-2 40 20 140 5-1-0 30 10 120 5-1-1 50 20 150 5-1-2 60 30 180 5-2-0 50 20 170 5-2-1 70 30 210 5-2-2 90 40 250 5-3-0 80 30 250 5-3-1 110 40 300 5-3-2 140 60 360 5-3-3 170 80 410 5-4-0 130 50 390 5-4-1 170 70 480 5-4-2 220 100 580 5-4-3 280 120 690 5-4-4 350 160 820 5-5-0 240 100 940 5-5-1 300 100 1300 5-5-2 500 200 2000 5-5-3 900 300 2900 5-5-4 1600 600 5300 5-5-5 >1600 - -10. INFORME DE ENSAYOEn el informe de ensayo se debe especificar el método usado, la temperatura seleccionada, ylos resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles de las operacionesno especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles decualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados.En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificacióncompleta de la muestra. Método B Técnicas con sutrato enzimático11. DEFINICIONPara los propósitos de este método se aplican las siguientes definiciones:Bacterias Coliformes TotalesCuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo Coliforme Total se define como toda bacteriaque posea la Enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de abrir el substratocromogénico, resultando en la liberación del cromógeno. 15
  • 19. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939Escherichia coliCuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria queda respuesta positiva al grupo Coliforme Total y además posee la enzima β-glucoronidasa, lacual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación delfluorógeno.12. PRINCIPIOBacterias Coliformes TotalesSubstratos cromogénicos tales como Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido (ONPG) o clorofenolrojo β-D-galactopiranósido (CPRG) son utilizados para detectar la enzima β-D- galactosidasa lacual es producida por las Bacterias Coliformes Totales. La enzima β-D-galactosidasa hidrolizael substrato y produce un cambio de color, lo cual indica una prueba positiva para Coliformestotales en 24 h (ONPG) o 28 h (CPRG) sin procedimientos adicionales.Escherichia coliUn substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronido (MUG) es utilizado paradetectar la enzima β-glucoronidasa la cual es producida por E.coli. La enzima β-glucoronidasahidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta deonda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli.El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual empleanutrientes - indicadores que producen color y/o fluorescencia al ser metabolizados por losmicroorganismos Coliformes Totales y E coli; los cuales son detectados simultáneamente.El reactivo proporciona dos nutrientes indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d-galactopiranósido) y MUG ( 4-metil-umbeliferil-β- D- glucorónido). Durante la metabolización deéstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, seproduce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmadala presencia de Coliformes totales y de E coli respectivamente.InterferenciasLa técnica del substrato enzimático ONPG-MUG tiene limitaciones, particularmente en aguascon alta turbiedad; para tales aguas es conveniente hacer diluciones con agua destilada estéril.Además, si la muestra tiene un color de fondo, se debe comparar bolsas o tubos según elformato utilizado, que contienen muestra con medio de cultivo inoculado, contra un blanco decontrol de la misma muestra de agua y para este caso se recomienda usar CPRG-MUG.Bacterias no Coliformes tales como Aeromonas y especies de Pseudomonas, pueden producirpequeñas cantidades de la enzima β- D-galactosidasa, pero son suprimidas y generalmente noproducen una respuesta positiva dentro del tiempo de inoculación a menos que esténpresentes mas de 104 UFC/ml.Algunas cepas de Shigella spp también pueden producir una respuesta positiva a lafluorescencia, pero debido a que este microorganismo es un conocido patógeno humano, seconsidera que no va en detrimento para la prueba de calidad sanitaria de agua. 16
  • 20. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 493913. EQUIPOS Y MATERIALES13.1 Autoclave13.2 Cabina de flujo laminar13.3 Incubadora a 35,5 °C ± 0,5 °C13.4 Pipetas Bacteriológicas estériles de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml13.5 Frascos o bolsas estériles de 100 ml13.6 Tubos tapa rosca ó Bolsas multiceldas13.7 Sellador para bolsas multiceldas13.8 Pipeteador13.9 Lámpara UV de 366 nm y 6 watios de intensidad14. MEDIOS DE CULTIVOMedio substratoComercialmente se encuentran formulaciones predispensadas para el procedimiento de tubosmúltiples o de botellas por 100 ml para el ensayo presencia ausencia.15. PROCEDIMIENTO15.1 PROCEDIMIENTO DE TUBOS MÚLTIPLESSe selecciona el número apropiado de tubos por muestra con medio predispensado paraprueba de tubos múltiples.Se siguen las instrucciones del fabricante para preparar seriales de diluciones para variasformulaciones.Asépticamente, se agregan 10 ml de muestra a cada tubo, se tapa ajustadamente y se mezclavigorosamente para disolver.La mezcla permanece sin color con la prueba con base en ONPG y se torna amarilla en elformato CPRG. Algunas partículas pueden permanecer indisolubles durante la prueba; esto noafecta el comportamiento del ensayo.Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por el periodo especificado por el fabricante del substrato.El procedimiento también puede desarrollarse agregando la cantidad apropiada de substrato ala muestra, mezclando completamente y dispensando en 5 o 10 tubos estériles. Se incubacomo se establece para el procedimiento de tubos múltiples, utilizando las series establecidasen el Método A. 17
  • 21. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 493915.2 PROCEDIMIENTO MULTICELDAEl procedimiento multicelda es desarrollado con paquetes desechables estériles de medio. Seagrega la muestra a un recipiente de 100 ml, luego se agrega el substrato, se agitavigorosamente y se vierte dentro de la bolsa. El sellador de bolsa dispensa la muestra dentrode los pozos y la sella. Se incube a 35 °C ± 0,5 °C por el período especificado por 24 h. El valordel NMP es obtenido de la tabla suministrada por el fabricante.15.3 PROCEDIMIENTO PARA PRESENCIA/AUSENCIA (P/A)Asépticamente, se agrega el medio enzimático previamente pesado a 100 ml de muestra ,enun recipiente de vidrio borosilicato no fluorescente y estéril o en una botella equivalente.Opcionalmente, se agrega 100 ml de muestra al substrato enzimático, en un recipiente estérilsuministrado por el fabricante. Asépticamente, se tapa y se mezcla completamente paradisolver el substrato. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por 24 h.16. INTERPRETACIÓNBacteria Coliforme TotalDespués del período de incubación mínima apropiada se examinan los tubos o los recipientespara el cambio de color apropiado (véase la Tabla 5). El ONPG es hidrolizado por la enzima dela bacteria para producir un color amarillo. El CPRG es hidrolizado por la enzima de la bacteriapara producir un color rojo o magenta. Si la respuesta de color no es uniforme a través del tuboó la bandeja multicelda, se mezcla invirtiéndolo antes de leer. Se leen las instrucciones delfabricante como guía para la interpretación. Algunos fabricantes sugieren comparar los tubos óbandeja multiceldas de muestra contra un comparador de color disponible suministrado por elfabricante. Las muestras son negativas para Coliformes totales si no se observa color en elensayo con ONPG o si el tubo es amarillo cuando se utiliza CPRG. Si hay una respuestacromogénica cuestionable después de 18 h o de 24 h para ONPG, se incuba por un tiempoadicional de 4 h. Si la respuesta es negativa después de 28 h para el CPRG se incuba hastapor un tiempo adicional de 20 h. Si el cromógeno se intensifica la muestra es positiva paraColiformes Totales. Si no la muestra es negativa.Escherichia coliSe examinan los tubos positivos de Coliformes totales o los recipientes para fluorescenciausando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm).Se compara cada tubo ó bandeja multicelda contra el comparador de referencia disponible. Lapresencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia escuestionable se incuba por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta porun periodo adicional de 20 h para las pruebas con CPRG; la fluorescencia intensificada es unaprueba de resultado positivo.17. INFORME DEL ENSAYOSi se desarrolla un procedimiento tubos múltiples, calcule el NMP para Coliformes totales yE. coli del numero de tubos positivos como se describe en el numeral 9. Si se desarrolla elprocedimiento de bandeja multiceldas, calcule el NMP para Coliformes y E. coli tomando comoreferencia la tabla suministrada por el fabricante. Si se sigue un procedimiento de presenciaausencia, se reportan los resultados como presencia/ausencia de Coliformes totales y E. coli en100 ml de muestra. 18
  • 22. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 5 Cambios de Color para varios medios Substrato Coliforme Positivo E. Coli Positivo Resultado Negativo Color demasiado pálido/ ONPG- MUG Amarillo Azul fluorescente No fluoresce CPRG- MUG Rojo o Magenta Azul fluorescente Amarillo/ No fluoresce18. CONTROL DE CALIDADSe prueba el comportamiento de cada lote de medio adquirido, inoculando con tres baterías decontrol: Escherichia coli, una Coliforme total diferente a E. coli (por ejemplo Enterobactercloacae) y una no Coliforme. También, se agrega un control de agua estéril. Si el control deagua estéril presenta tinte fluorescente o tinte de resultado positivo Coliforme se descarta y seutiliza un nuevo lote de substrato. Se debe evitar utilizar un inóculo pesado. Si se utilizaPseudomonas como el no Coliforme se selecciona una especie no fluorescente. Se incubaestos controles a 35 °C ± 0,5 °C como se indicó antes. Se lee y se registra los resultados.19. APÉNDICE19.1 NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTARLas siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de estetexto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas lasediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes,mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la últimaversión de las normas mencionadas a continuación.NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generalespara los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997).NTC-ISO 5667-3:1995 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para laConservación y manejo de las muestras.NTC-ISO 5667-5:1996 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de aguapotable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas.NTC-ISO 5667-14:1999 Calidad de agua muestreo. Parte 14: Guía para el control de la calidaden el muestreo y en el manejo ambiental del agua.19.2 DOCUMENTO DE REFERENCIAAMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION;WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water andWastewater, 20 TH EDITION.1998.Washington Multiple Tube Fermentation Technique forMembers of the Coliform Group (SM 9921) and Enzyme Sustrate Coliform Test (SM 9223). 19
  • 23. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Anexo A (Normativo ) Esquema de las pruebas presuntiva, confirmativa y completa para la detección de coliformes totales Inocular caldo lauril triptosa o caldo presencia asencia en tubos de fermentación o botellas e incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C (1) Producción de gas y/o crecimiento ácido. (2) Ausencia de gas o ácido. Transferir a fase confirmatoria a caldo bilis lactosa Incubación adicional 24 horas verde brillante. Incubar 48 +/- horas a 35 +/- 0,5°C (total 48 +/- 3 horas) (a) Gas producido. Transferir a agar (b) No gas producido. LES Endo o agar MacConkey. Prueba negativa. Grupo (a) Gas o ácido producido. Incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C coliforme ausente. continue en (1a) (b) Crecimiento ácido (1,1) Colonias de coliformes típicas o atípicas. Confirmar como en (1) Transferir a agar blando y tubos de (1,2) Colonias negativas. fermentación con caldo lauril triptosa. Incubar Grupo coliforme ausente agar blando 18 a 24 h y caldo lauril triptosa (c) no producción de ácido de 24 +/- 2h a 48 +/- 3h a 35 +/- 0,5°C y gas. Prueba negativa Grupo coliforme ausente (a) Producción de gas. (b) Ausencia de gas. teñir con gran parte Prueba negativa del crecimiento en agar blando Ausencia de grupo coliforme.(1,11) Presencia de bacilos gramnegativos. Ausencia de esporas. Prueba completa: (1,12) Presencia de esporas o esporas y presencia de grupo coliforme. bacilos grampositivos. Prueba completa: Presencia de bacilos gramnegativos y Ausencia de grupo coliforme grampositivos. Repetir el procedimiento comenzando en 1,1 20