Gold nanoprobe detection specific DNA sequence

859 views
760 views

Published on

Published in: Health & Medicine, Technology
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
859
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
8
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide
  • มะเร็งเต้านม ( Breast cancer) เป็นมะเร็งที่พบบ่อยในผู้หญิงไทย เป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับต้นๆ ของโรคมะเร็งที่พบในผู้หญิง จากข่าวการตัดสินใจผ่าตัดเต้านมออกของดาราดังอย่าง แอนเจลิน่า โจลี่ ด้วยเหตุผลที่ว่าเธอมีโอกาสการเป็นมะเร็งเต้านมสูงถึง 87% เพราะมีความผิดปกติที่ยีน BRCA1 สาเหตุของโรคมะเร็งเต้านม รวมถึงเป็นยีนที่กดการเกิดมะเร็ง ( tumor suppressor genes) ดังนั้นยีนทั้งสองนี้จึงมีหน้าที่ควบคุมการแบ่งเซลล์ ดำรงเสถียรภาพของสารพันธุกรรมและป้องกันการเจริญเติบโตที่ผิดปกติของเซลล์ หากเกิดความผิดปกติของยีนดังกล่าวจะทำให้การแบ่งตัวของเซลล์เต้านมผิดปกติไป อันเป็นสาเหตุของมะเร็งเต้านมนั่นเอง ไม่เพียงแต่สาเหตุการเกิดการกลายพันธุ์ของยีนที่จะส่งผลให้เกิดมะเร็งเต้า ยังเกี่ยวพันถึงอายุ ฮอร์โมน การถ่ายทอดทางพันธุกรรม แม้กระทั่งจากการดำเนินชีวิตในแต่ละวันอีกด้วย
  • BRCA1 จะพบได้ในโครโมโซมแท่งที่ 17 ใน q arm ตำแหน่งที่ 21 จัดเป็นยีนที่กดการเกิดมะเร็ง ( tumor suppressor genes) ดังนั้นยีนทั้งสองนี้จึงมีหน้าที่ควบคุมการแบ่งเซลล์ ดำรงเสถียรภาพของสารพันธุกรรมและป้องกันการเจริญเติบโตที่ผิดปกติของเซลล์ หากเกิดความผิดปกติของยีนดังกล่าวจะทำให้การแบ่งตัวของเซลล์เต้านมผิดปกติไป อันเป็นสาเหตุของมะเร็งเต้านมนั่นเอง ไม่เพียงแต่สาเหตุการเกิดการกลายพันธุ์ของยีนที่จะส่งผลให้เกิดมะเร็งเต้า ยังเกี่ยวพันถึงอายุ ฮอร์โมน การถ่ายทอดทางพันธุกรรม แม้กระทั่งจากการดำเนินชีวิตในแต่ละวันอีกด้วย
  • แมมโมแกรม ( Mammogram): การเอกซเรย์เต้านม โดยการถ่ายภาพของเต้านมลงบนแผ่นฟิล์ม สามารถ แสดงรายละเอียดโครงสร้างภายในของเต้านมได้อย่าง ชัดเจน MRI (Magnetic resonance imaging)  เป็นการตรวจโดยเครื่องมือที่ใช้สำหรับสร้างภาพอวัยวะภายในร่างกาย โดยอาศัยหลักการของคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าและคลื่นวิทยุ แล้วนำสัญญาณที่ได้มาประมวลผลด้วยคอมพิวเตอร์ ทำให้ได้ภาพอวัยวะภายในของร่างกาย การตัดชิ้นเนื้อไปตรวจ ( Biopsy): การนำเซลล์หรือเนื้อเยื่อไปตรวจภายใต้กล้องจุลทรรศน์
  • วิเคราะห์ตามขั้นตอนคือใช้วิธี polymerase chain reaction (PCR) ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ และทำการตรวจกรอง mutation ตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับ DNA sequencing ซึ่งใช้เวลาในการตรวจเป็นสัปดาห์จึงจะทราบผล จากวิธีการตรวจมะเร็งเต้านมข้างต้นมีค่าใช้จ่ายสูง ใช้ระยะเวลาในการวิเคราะห์นานพอสมควร รวมถึงไม่เป็น point of care เนื่องจากเครื่องมือที่ใช้มีขนาดใหญ่จึงได้มีการพัฒนาการตรวจวัดอีกหนึ่งเทคนิคซึ่งคือ ไบโอเซนเซอร์ ( Biosensor) หรือตัวตรวจวัดทางชีวภาพ คืออุปกรณ์ตรวจวัดทางชีวภาพเป็นอุปกรณ์ที่นักวิทยาศาสตร์พัฒนา ขึ้นเพื่อที่อาศัยการทำงานร่วมกันระหว่าง ส่วนแปลงสัญญาณ ( Transducer) และสารชีวภาพ ( Biological Component) Sensitive biological element : ส่วนของสารชีวภาพ จะเป็นส่วนที่มีการทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการตรวจวัด ตัวอย่างสารชีวภาพที่นำมาใช้บ่อย เช่น  เนื้อเยื่อ , แบคทีเรีย , เอนไซม์ , แอนติบอดี , กรดนิวคลีอิค เป็นต้น ซึ่งสารเหล่านี้จะถูกปรับเปลี่ยนให้เกิดความเหมาะสม กับวิธีการตรวจนั้นๆ โดยใช้ความรู้ทางด้านชีววิศวกรรมมาใช้ Transducer หรือ detector element : ส่วนที่จะแปลงสัญญาณจากการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้น เช่น  สัญญาณทางเคมี เสียง แสง แรง ความร้อน กรด - เบส ให้เป็นสัญญาณไฟฟ้า เพื่อจะนำไปวิเคราะห์ต่อไป Associated electronics หรือ signal processors : เมื่อได้สัญญาณมาแล้วจะนำเข้าสู่กระบวนการวิเคราะห์สัญญาณที่ได้มาเพื่อให้ได้ค่าที่ถูกต้องและแปลผลได้ สามารถตรวจวิเคราะห์สารตัวอย่างได้อย่างเฉพาะเจาะจงและใช้ตรวจวิเคราะห์สารต่างๆ ได้หลากหลายชนิด โดยมีขนาดเล็ก เคลื่อนย้ายได้ , ราคาไม่แพง , สามารถวัดหลายตัวอย่างในเวลาเดียวกัน
  • ได้มีการนำอนุภาคทองระดับนาโนมาใช้สำหรับงาน biosensor ในการทำ hybridization และทำการศึกษาขนาดของอนุภาคทองหลังจาดดัดแปลงให้ใช้สำหรับในการตรวจวิเคราะห์ได้ และอีกหนึงงานวิจัยที่มีการดัดแปลงอนุภาคทองโดยการใช้ ethylene glycol ให้บริเวณ surface มีความเสถียรสามารถใช้งานได้
  • ดีเอ็นเอสายเดี่ยวจะจับกับประจุลบของซิเตรทไอออน ( negatively charged citrate ions) บนอนุภาคของทอง
  • ค่าการดูดกลืนแสง UV-vis ที่ความยาวคลื่นสามค่า ของ Au-NPs พบว่า Au-NPs ที่ยังไม่มีการ modified บริเวณ surface ที่ 512 nm พบว่า Au-NPs มีขนาดประมาณ 15 nm Au-NPs ที่ modified บริเวณ surface ค่าการดูดกลืนแสงจะเปลี่ยนแปลงไปเล็กน้อยจาก 521 เป็น 525 nm Au-NPs ที่ modified บริเวณ surface (Au-OEG-DNA) ค่าการดูดกลืนแสงที่ 527 nm เปรียบเทียบกับความเข้มข้นของ Au-NPs solution เริ่มต้นจนถึงสุดท้าย เมื่อนำมาตรวจสอบด้วย TEM จะพบว่าอนุภาคมีขนาดประมาณ 4 nm.
  • รูป 3A บทบาทเกลือโซเดียมประกอบด้วย 2 แบบที่ทำให้ Au-NPs มีความเสถียร ที่ความเข้มข้นเกลือต่ำ , NaCl จะขัดขวางจากการรวมตัวของ AuNP, การเพิ่มความเข้มข้น NaCl เป็นสาเหตุของการรวมตัวของ AuNP เป็นผลจากแรง electrostatic repulsive ลดลง ระหว่าง AuNPs นอกจากนี้การเพิ่มความเข้มข้น NaCl อย่างต่อเนื่องที่จะรบกวนการรวมตัวของ AuNP ที่เกิดขึ้น ( รูปที่ 3) โดยค่า UV-vis spectra อนุภาคคอลลอย์ของทองในความเข้มของ NaCl ต่างๆจะยังมีการเปลี่ยนแปลงได้ไม่ชัดเจน รูป 3B สิ่งสำคัญในวิธีนี้ที่ใช้ hb ในการอธิบายถึงความแตกต่างของประสิทธิภาพระหว่างการทำ hybridization ของ ss DNA 2 เส้น ที่กลายเป็นคู่ของ dsDNA และแยกเป็น ssDNA ใหม่ 2 เส้น โดยมีลำดับ sequence เหมือนกัน . ที่ความเข้มข้นเกลือเพิ่มขึ้นจาก 0.1-0.5 M. ค่าการดูดกลืนจะค่อยๆเพิ่มขึ้น เป็นสิ่งที่สอดคล้องกับข้อสรุปเมื่อมีการเพิ่มขึ้นของ dielectric ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือบัฟเฟอร์ในการทำ hybridization จะรักษาสภาพของการเชื่อมต่อกับ duplex DNA
  • รูป 3A บทบาทเกลือโซเดียมประกอบด้วย 2 แบบที่ทำให้ Au-NPs มีความเสถียร ที่ความเข้มข้นเกลือต่ำ , NaCl จะขัดขวางจากการรวมตัวของ AuNP, การเพิ่มความเข้มข้น NaCl เป็นสาเหตุของการรวมตัวของ AuNP เป็นผลจากแรง electrostatic repulsive ลดลง ระหว่าง AuNPs นอกจากนี้การเพิ่มความเข้มข้น NaCl อย่างต่อเนื่องที่จะรบกวนการรวมตัวของ AuNP ที่เกิดขึ้น ( รูปที่ 3) โดยค่า UV-vis spectra อนุภาคคอลลอย์ของทองในความเข้มของ NaCl ต่างๆจะยังมีการเปลี่ยนแปลงได้ไม่ชัดเจน รูป 3B สิ่งสำคัญในวิธีนี้ที่ใช้ hb ในการอธิบายถึงความแตกต่างของประสิทธิภาพระหว่างการทำ hybridization ของ ss DNA 2 เส้น ที่กลายเป็นคู่ของ dsDNA และแยกเป็น ssDNA ใหม่ 2 เส้น โดยมีลำดับ sequence เหมือนกัน . ที่ความเข้มข้นเกลือเพิ่มขึ้นจาก 0.1-0.5 M. ค่าการดูดกลืนจะค่อยๆเพิ่มขึ้น เป็นสิ่งที่สอดคล้องกับข้อสรุปเมื่อมีการเพิ่มขึ้นของ dielectric ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือบัฟเฟอร์ในการทำ hybridization จะรักษาสภาพของการเชื่อมต่อกับ duplex DNA
  • การเติม NaCl ลงไปจะทำให้ ประจุบวกของ Na จะเข้าไปคลุมประจุลบของ gold colloid ที่ให้เกิดการรวมกลุ่มกันของอนุภาคทองให้มีขนาดใหญ่ขึ้น ส่งผลให้สารละลาย colloid มีสีน้ำเงิน
  • การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงถึง steric crowding ที่เกิดขึ้นจากการบดบังของสารโมเลกุลใหญ่ก็จะขัดขวาง interaction หรือบดบังแรงบางชนิดที่ใช้เชื่อมกับกับบริเวณหนึ่งๆ เรียกว่า steric hindrance บน DNA-Oligomer บน surface ที่มีการ modified จึงทำให้มีผลต่อประสิทธิภาพการทำ hybridization เนื่องจาก แรง electrostatic แบบ repulsive และ steric hindrance เป็นสาเหตุที่จะทำให้ probe เข้าไป hybrid สาย ได้น้อยลง เมื่อมี Au-NPs พร้อมกับ functionalized group และ spacer ที่จะเป็นตัวที่เพิ่มประสิทธิภาพการ hybridization ให้ถูกต้องแม่นยำขึ้นโดยอาศัย OEG mixture เนื่องจาก ในการเข้าการวมกันของ SS-DNA ต้องการความเข้มเข้น NaCl สูง แต่อนุภาคทองที่ไม่ modified ไม่ stable เมื่ออยู่ในสภาวะดังกล่าว ดังนั้นในการเปลี่ยนแปลง linker system ก็จะช่วยให้การเข้าจับที่ binding site และความไวเพิ่มมากขึ้นด้วย แต่จะมี background ที่เป็นสาเหตุของการจับแบบ nonspecific ที่จะรบกวนในระหว่างการทำ hybidization ความเสถียรที่เพิ่มขึ้นของ surface-oligonucleotide complex น่าจะเกิดจาก target ที่น้อยและ probe ที่หายไประหว่างขั้นตอนการล้าง
  • ในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง จะเกิด ปฏิกิริยา reductio ของ HAuCl 4 ใช้ sodium citrate เป็นตัวรีดิวซ์ ( reducing agent ) ดังนั้นเมื่อ อนุภาคทองที่อยู่ในสารละลายก็มีประจุประจุลบจาก sodium citrate ล้อมรอบที่ผิวภายในสารละลาย ซึงปริมาณของประจุในสารละลายที่จะมากหรือน้อยขึ้นกับความเข้มข้นของสารละลาย สารละลายของอนุภาคทองที่ไม่ได้รับการ gold nanoparticle colloid จะไม่เสถียรเมื่อแสดงในความเข้มข้นของ electrolyte สูง เนื่องจากความเข้มข้นที่สูงของ electrolyte จะไปบดบังประจุที่ผิวของอนุภาคทำให้อนุภาคทองไม่ stable และเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีฟ้าหรือน้ำเงินอย่างรวดเร็ว ดังนั้น การรวมตัวเกาะกันเองของอนุภาคทองไม่เพียงแต่ ทำให้อนุภาค stable แต่จะช่วยปกป้องการดูดซับบนผิวหรือผิวหน้าจาก nonspecific
  • สารที่ใช้เชื่อมระหว่าง carboxylic acid groups จาก aspartic และ glutamic acid และ หมู่อะมิโนจาก lysine
  • การเติมเกลือเข้าไปนั้น จะทำให้ค่า Tm สูงขึ้น เนื่องจากเกลือที่มีประจุบวก จะเข้าไป stabilize ในสาย DNA ที่มีประจุลบจาก phosphate group ทำให้การแยกสาย DNA แยกออกจากกันได้ยากขึ้น ปกติ nucleotide ก็จะมี phosphate group เกาะอยู่ ดังนั้น เมื่อเราแยก DNA ออกเป็นสายเดี่ยว แต่ละสายก็จะมีโอกาสที่จะมา Hybridization กันได้ ถ้านึกเปรียบเทียบใน 2 สภาวะ ระหว่าง มีเกลือ กับไม่มีเกลือ ภาวะมีเกลือ ประจุบวกจากเกลือจะไปจับกับ phosphate group ทำให้ลดผลักระหว่างประจุลบจากหมู่ฟอสเฟตของ ssDNA ทั้งสองสาย ทำให้จับกันได้ง่าย เมื่อจับกันได้ง่าย จับกันแล้วก็แยกออกยาก ในขณะที่ ภาวะที่ไม่มีเกลือ การจะจับกันได้ลำบาก เพราะ การจะสร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบส ต้องมีแรงที่สามารถเอาชนะแรงผลักกันของประจุลบของฟอสเฟตของสาย DNA แต่ละสาย
  • Gold nanoprobe detection specific DNA sequence

    1. 1. Miss. Siriporn Tontipattananon ID 565020075-3 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Khon Kaen University Gold-based optical biosensor for single mismatched DNAGold-based optical biosensor for single mismatched DNA detection using salt-induced hybridizationdetection using salt-induced hybridization Zongrui Zhan, Xingyi Ma, Cuong Cao, Sang Jun Simb Biosensors and Bioelectronics 32 (2012) 127–132
    2. 2. 22 Statistic of cancerStatistic of cancer (http://www.chulacancer.net)
    3. 3. BRCA1 gene located Breast CancerBreast CancerBRCA1 -  The BRCA1 protein is classified as a tumor suppressor 33 Breast CancerBreast Cancer
    4. 4. Method of breast cancer detectionMethod of breast cancer detection  mammography  magnetic resonance imaging (MRI)  Biopsy 44
    5. 5.  polymerase chain reaction (PCR)  Biosensor Early detection http://www.biomed.in.th/biosensor/ 55
    6. 6. Previous of study 66
    7. 7. (http://www.parkafm.com/jp/gallery_list.php?id=167) The atomic force microscope (AFM) of gold nanoparticles Gold-based optical biosensor gold nanoparticle (Au-NP)  stable metal particles  conduct electricity, magnetic and optical properties 77
    8. 8. The diameter of gold nanoparticles determines the wavelengths of light absorbed and the colors in this diagram illustrate this effect. 88 gold nanoparticle (Au-NP)
    9. 9. Main steps of sandwich ELISA assay (http://www.epitomics.com/products/product_info/1257 ) sandwich ELISA assay 99
    10. 10. DNA hybridization Scheme of DNA hybridization (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/figure/A1569/?report=objectonly) 1010
    11. 11. ObjectivesObjectives To investigate in various concentrated salt solutions discriminating single-mismatched DNA in a homogeneous solution. To evaluate the relative importance of the salt concentration that contributes to hybridization efficiency. 1111
    12. 12. Scope of studyScope of study 1212 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
    13. 13. Materials and methodsMaterials and methods Preparation of the gold colloid Sodium citrate (reducing agent) HAuCl4 e- gold colloid (colorless red) Au+3 (aquoues) + Auo (solid) 3e- 1313
    14. 14. Scope of studyScope of study 1414 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
    15. 15. centrifuged and washed 14,000 rpm, 30 min, 4o C Preparation of OEG-stabilized gold nanoprobes Materials and methodsMaterials and methods Absolute ethanol EG6-COOH/EG3-OH 1:9 molar Au-NPs solution 9 mL 1 mL overnight incubation supernatant (decant) pellet Added NHS/EDC solution suspended in PBS buffer solution *5’-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3’ add detection probe* 1515OEG : Oligo ethylene glycol
    16. 16. Fig. 2 Scheme of the nanoprobe preparation and comparison of UV–vis spectra for colloidal gold nanoparticles in aqueous solution, OEG-functionalized AuNPs, and nanoprobes in PBS solution. The inset image shows the size of colloidal gold nanoparticles. Results and discussionsResults and discussions  Characterization of gold nanoprobes 1616
    17. 17. Scope of studyScope of study 1717 Preparation of the gold colloid Preparation of gold nanoprobes preparation of PMP capture probes DNA hybridization procedure Experimental procedures for BRCA-1 detection
    18. 18. preparation of PMP capture probes Materials and methodsMaterials and methods PMPs Incubated 30min at room temp. and wash 0.01M PBS solution conjugated with biotinylated capture DNA wash stored in a 0.5 mL stock solution (0.01 M PBS solution contained 1% BSA) streptavidin/capture probe* *Capture probe 5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-Biotin-3’ (Streptavidin coated MagnetSphere Para- Magnetic Particles) 1818
    19. 19. Scope of studyScope of study 1919 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
    20. 20. DNA hybridization procedure Materials and methodsMaterials and methods wash with hybridization buffer DNA solutions (non-cognate DNA and target DNA*) *Detection probe 5-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3 Non-cognate DNA 5-ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTT-3 Incubate 1h at 37o C wash + Au-NPs + Buffer** Incubate wash ** 0.1-0.5M Hybridization buffer 50 uL 2020
    21. 21. Materials and methodsMaterials and methods Experimental procedures for BRCA-1 detection Au 5’-Amino-(C6)-(T)15GTATGAATTATAATCAAA-3’ 3’-CATACTTAATATTAGTTT∙∙∙CTTTGGGATACATACGAG-5’ 3’-CATACTTAXTATTAGTTT∙∙∙CTTTGGGATACATACGAG-5’ 5’-GAAACCCTATGTATGCTC(T)10-Biotin-3’ detection probe Capture probe PMP Fig. 1 Schematic illustration for the entire experimental strategy for BRCA-1 detection. Target DNA Single-mismatched DNA 2121
    22. 22. Fig. 3 (A) Absorbance spectra of gold nanoprobe in various concentrations of salt. (Experimental condition: nanoprobes 50 µL; Na+ concentrations of HB range from 0.1 to 0.5 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussion  Effect of salt concentration Wavelength (nm) A 2222 527 nm
    23. 23. MMT : single-mismatched DNA PMT : perfectly matched DNA Fig. 3 (B) Effect of salt concentration on DNA hybridization efficiency. Results and discussions  Effect of salt concentration 0.25 M 0.4 M 2323 0 M
    24. 24. Fig. 4 (A) Nanoprobe-based colorimetric detection for single-base mismatches. (Experimental condition: target DNA 10 pM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦ C.) Results and discussionsResults and discussions  Discrimination of single mismatches 2424 Target DNA 5’-GAGCATACA··· ATTATAATTCATAC-3’ Single-mismatched DNA 5’-GAGCATACA··· ATTATXATTCATAC-3’ (“X” stands for T, C, G)
    25. 25. Fig. 4 (B) Absorbance intensity in colorimetric detection of target DNA spanning a 0.1 fM to 100 pM concentration range. (Experimental condition: target DNA 100 aM to 100 pM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussionsResults and discussions 2525  Hybridization signal intensity versus DNA concentration
    26. 26. Fig. 5. Detection of 10 pM DNA target (black bars) and 10 nM non-cognate DNA (gray bars) in buffer, 1/5 diluted serum, and undiluted serum. (Experimental condition: target DNA 10 pM; Non-cognate DNA 10 nM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussionsResults and discussions  Hybridization signal intensity versus DNA concentration 2626
    27. 27. ConclusionsConclusions The absorption peak of detection probe (Au-OEG-DNA) centered at 527 nm was assigned to 15 nm NaCl concentration also caused the AuNP finally to aggregate as a result of decreased electrostatic repulsion between AuNPs 2727
    28. 28. ConclusionsConclusions Increasing salt concentration from 0.1 to 0.5 M, optical absorbance of MMT and PMT increased and A maximum difference appeared at 0.25 M 2828 selectively identify DNA targets concentration of 0.1 fM ; Na+ concentrations of HB 0.25 M
    29. 29. Thank youThank you!!
    30. 30. Previous studies have shown factors of hybridization  Steric crowding  steric hindrance Results and discussionsResults and discussions Electrostatic repulsive ►functionalized group ►spacer
    31. 31. Au C6H5Na3O7 Au Results and discussionsResults and discussions
    32. 32. centrifuged 14,000 rpm, 30 min, 4o C Preparation of OEG-stabilized gold nanoprobes Materials and method Absolute ethanol EG6-COOH/EG3-OH 1:9 molar Au-NPs solution 9 mL 1 mL overnight incubation supernatant (decant) pellet HS(CH2)11(OCH2CH2)6OCH2COOH(EG6- COOH) and HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH (EG3-OH)
    33. 33. DNA hybridization procedure Materials and method
    34. 34. Capture probe 5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-Biotin-3’ Detection probe 5’-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3’ Target DNA 5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3’ Single-mismatched DNA 5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATXATTCATAC-3’ (“X” stands for T, C, G) Non-cognate DNA 5’- ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTT-3’
    35. 35. HS(CH2)11(OCH2CH2)6OCH2COOH (EG6-COOH) HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH (EG3-OH)
    36. 36. N-(3-dimethylaminopropyl)- N’-ethylcarbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide(NHS) • Covalent • non-cytotoxic in vitro • Crosslinking agents introduce &zero length' amide- crosslinks between carboxylic acid groups from aspartic and glutamic acid residues, and amino groups from (hydroxy-) lysine residues
    37. 37. BRCA1 founder mutations c.181T>G (BIC: 300T>G), c.4035delA (BIC: 4154delA) and c.5266dupC (BIC: 5382insC) and found negative earlier. BRCA1 mutations (Breast Cancer Information Core : BIC database)
    38. 38. Phosphate buffered saline : PBS buffer One of the common composition of PBS Salt Concentration Concentration (mmol/L) (g/L)   NaCl   137 8.01   KCl   2.7 0.20   Na2HPO4 • 2 H2O   10 1.78   KH2PO4   2.0 0.27 pH 7.4  
    39. 39. Au—ester----NHS/EDC---peptide bond---DNA

    ×