Gold nanoprobe detection specific DNA sequence

on

  • 809 views

 

Statistics

Views

Total Views
809
Views on SlideShare
809
Embed Views
0

Actions

Likes
0
Downloads
5
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment
  • มะเร็งเต้านม ( Breast cancer) เป็นมะเร็งที่พบบ่อยในผู้หญิงไทย เป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับต้นๆ ของโรคมะเร็งที่พบในผู้หญิง จากข่าวการตัดสินใจผ่าตัดเต้านมออกของดาราดังอย่าง แอนเจลิน่า โจลี่ ด้วยเหตุผลที่ว่าเธอมีโอกาสการเป็นมะเร็งเต้านมสูงถึง 87% เพราะมีความผิดปกติที่ยีน BRCA1 สาเหตุของโรคมะเร็งเต้านม รวมถึงเป็นยีนที่กดการเกิดมะเร็ง ( tumor suppressor genes) ดังนั้นยีนทั้งสองนี้จึงมีหน้าที่ควบคุมการแบ่งเซลล์ ดำรงเสถียรภาพของสารพันธุกรรมและป้องกันการเจริญเติบโตที่ผิดปกติของเซลล์ หากเกิดความผิดปกติของยีนดังกล่าวจะทำให้การแบ่งตัวของเซลล์เต้านมผิดปกติไป อันเป็นสาเหตุของมะเร็งเต้านมนั่นเอง ไม่เพียงแต่สาเหตุการเกิดการกลายพันธุ์ของยีนที่จะส่งผลให้เกิดมะเร็งเต้า ยังเกี่ยวพันถึงอายุ ฮอร์โมน การถ่ายทอดทางพันธุกรรม แม้กระทั่งจากการดำเนินชีวิตในแต่ละวันอีกด้วย
  • BRCA1 จะพบได้ในโครโมโซมแท่งที่ 17 ใน q arm ตำแหน่งที่ 21 จัดเป็นยีนที่กดการเกิดมะเร็ง ( tumor suppressor genes) ดังนั้นยีนทั้งสองนี้จึงมีหน้าที่ควบคุมการแบ่งเซลล์ ดำรงเสถียรภาพของสารพันธุกรรมและป้องกันการเจริญเติบโตที่ผิดปกติของเซลล์ หากเกิดความผิดปกติของยีนดังกล่าวจะทำให้การแบ่งตัวของเซลล์เต้านมผิดปกติไป อันเป็นสาเหตุของมะเร็งเต้านมนั่นเอง ไม่เพียงแต่สาเหตุการเกิดการกลายพันธุ์ของยีนที่จะส่งผลให้เกิดมะเร็งเต้า ยังเกี่ยวพันถึงอายุ ฮอร์โมน การถ่ายทอดทางพันธุกรรม แม้กระทั่งจากการดำเนินชีวิตในแต่ละวันอีกด้วย
  • แมมโมแกรม ( Mammogram): การเอกซเรย์เต้านม โดยการถ่ายภาพของเต้านมลงบนแผ่นฟิล์ม สามารถ แสดงรายละเอียดโครงสร้างภายในของเต้านมได้อย่าง ชัดเจน MRI (Magnetic resonance imaging)  เป็นการตรวจโดยเครื่องมือที่ใช้สำหรับสร้างภาพอวัยวะภายในร่างกาย โดยอาศัยหลักการของคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าและคลื่นวิทยุ แล้วนำสัญญาณที่ได้มาประมวลผลด้วยคอมพิวเตอร์ ทำให้ได้ภาพอวัยวะภายในของร่างกาย การตัดชิ้นเนื้อไปตรวจ ( Biopsy): การนำเซลล์หรือเนื้อเยื่อไปตรวจภายใต้กล้องจุลทรรศน์
  • วิเคราะห์ตามขั้นตอนคือใช้วิธี polymerase chain reaction (PCR) ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ และทำการตรวจกรอง mutation ตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับ DNA sequencing ซึ่งใช้เวลาในการตรวจเป็นสัปดาห์จึงจะทราบผล จากวิธีการตรวจมะเร็งเต้านมข้างต้นมีค่าใช้จ่ายสูง ใช้ระยะเวลาในการวิเคราะห์นานพอสมควร รวมถึงไม่เป็น point of care เนื่องจากเครื่องมือที่ใช้มีขนาดใหญ่จึงได้มีการพัฒนาการตรวจวัดอีกหนึ่งเทคนิคซึ่งคือ ไบโอเซนเซอร์ ( Biosensor) หรือตัวตรวจวัดทางชีวภาพ คืออุปกรณ์ตรวจวัดทางชีวภาพเป็นอุปกรณ์ที่นักวิทยาศาสตร์พัฒนา ขึ้นเพื่อที่อาศัยการทำงานร่วมกันระหว่าง ส่วนแปลงสัญญาณ ( Transducer) และสารชีวภาพ ( Biological Component) Sensitive biological element : ส่วนของสารชีวภาพ จะเป็นส่วนที่มีการทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการตรวจวัด ตัวอย่างสารชีวภาพที่นำมาใช้บ่อย เช่น  เนื้อเยื่อ , แบคทีเรีย , เอนไซม์ , แอนติบอดี , กรดนิวคลีอิค เป็นต้น ซึ่งสารเหล่านี้จะถูกปรับเปลี่ยนให้เกิดความเหมาะสม กับวิธีการตรวจนั้นๆ โดยใช้ความรู้ทางด้านชีววิศวกรรมมาใช้ Transducer หรือ detector element : ส่วนที่จะแปลงสัญญาณจากการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้น เช่น  สัญญาณทางเคมี เสียง แสง แรง ความร้อน กรด - เบส ให้เป็นสัญญาณไฟฟ้า เพื่อจะนำไปวิเคราะห์ต่อไป Associated electronics หรือ signal processors : เมื่อได้สัญญาณมาแล้วจะนำเข้าสู่กระบวนการวิเคราะห์สัญญาณที่ได้มาเพื่อให้ได้ค่าที่ถูกต้องและแปลผลได้ สามารถตรวจวิเคราะห์สารตัวอย่างได้อย่างเฉพาะเจาะจงและใช้ตรวจวิเคราะห์สารต่างๆ ได้หลากหลายชนิด โดยมีขนาดเล็ก เคลื่อนย้ายได้ , ราคาไม่แพง , สามารถวัดหลายตัวอย่างในเวลาเดียวกัน
  • ได้มีการนำอนุภาคทองระดับนาโนมาใช้สำหรับงาน biosensor ในการทำ hybridization และทำการศึกษาขนาดของอนุภาคทองหลังจาดดัดแปลงให้ใช้สำหรับในการตรวจวิเคราะห์ได้ และอีกหนึงงานวิจัยที่มีการดัดแปลงอนุภาคทองโดยการใช้ ethylene glycol ให้บริเวณ surface มีความเสถียรสามารถใช้งานได้
  • ดีเอ็นเอสายเดี่ยวจะจับกับประจุลบของซิเตรทไอออน ( negatively charged citrate ions) บนอนุภาคของทอง
  • ค่าการดูดกลืนแสง UV-vis ที่ความยาวคลื่นสามค่า ของ Au-NPs พบว่า Au-NPs ที่ยังไม่มีการ modified บริเวณ surface ที่ 512 nm พบว่า Au-NPs มีขนาดประมาณ 15 nm Au-NPs ที่ modified บริเวณ surface ค่าการดูดกลืนแสงจะเปลี่ยนแปลงไปเล็กน้อยจาก 521 เป็น 525 nm Au-NPs ที่ modified บริเวณ surface (Au-OEG-DNA) ค่าการดูดกลืนแสงที่ 527 nm เปรียบเทียบกับความเข้มข้นของ Au-NPs solution เริ่มต้นจนถึงสุดท้าย เมื่อนำมาตรวจสอบด้วย TEM จะพบว่าอนุภาคมีขนาดประมาณ 4 nm.
  • รูป 3A บทบาทเกลือโซเดียมประกอบด้วย 2 แบบที่ทำให้ Au-NPs มีความเสถียร ที่ความเข้มข้นเกลือต่ำ , NaCl จะขัดขวางจากการรวมตัวของ AuNP, การเพิ่มความเข้มข้น NaCl เป็นสาเหตุของการรวมตัวของ AuNP เป็นผลจากแรง electrostatic repulsive ลดลง ระหว่าง AuNPs นอกจากนี้การเพิ่มความเข้มข้น NaCl อย่างต่อเนื่องที่จะรบกวนการรวมตัวของ AuNP ที่เกิดขึ้น ( รูปที่ 3) โดยค่า UV-vis spectra อนุภาคคอลลอย์ของทองในความเข้มของ NaCl ต่างๆจะยังมีการเปลี่ยนแปลงได้ไม่ชัดเจน รูป 3B สิ่งสำคัญในวิธีนี้ที่ใช้ hb ในการอธิบายถึงความแตกต่างของประสิทธิภาพระหว่างการทำ hybridization ของ ss DNA 2 เส้น ที่กลายเป็นคู่ของ dsDNA และแยกเป็น ssDNA ใหม่ 2 เส้น โดยมีลำดับ sequence เหมือนกัน . ที่ความเข้มข้นเกลือเพิ่มขึ้นจาก 0.1-0.5 M. ค่าการดูดกลืนจะค่อยๆเพิ่มขึ้น เป็นสิ่งที่สอดคล้องกับข้อสรุปเมื่อมีการเพิ่มขึ้นของ dielectric ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือบัฟเฟอร์ในการทำ hybridization จะรักษาสภาพของการเชื่อมต่อกับ duplex DNA
  • รูป 3A บทบาทเกลือโซเดียมประกอบด้วย 2 แบบที่ทำให้ Au-NPs มีความเสถียร ที่ความเข้มข้นเกลือต่ำ , NaCl จะขัดขวางจากการรวมตัวของ AuNP, การเพิ่มความเข้มข้น NaCl เป็นสาเหตุของการรวมตัวของ AuNP เป็นผลจากแรง electrostatic repulsive ลดลง ระหว่าง AuNPs นอกจากนี้การเพิ่มความเข้มข้น NaCl อย่างต่อเนื่องที่จะรบกวนการรวมตัวของ AuNP ที่เกิดขึ้น ( รูปที่ 3) โดยค่า UV-vis spectra อนุภาคคอลลอย์ของทองในความเข้มของ NaCl ต่างๆจะยังมีการเปลี่ยนแปลงได้ไม่ชัดเจน รูป 3B สิ่งสำคัญในวิธีนี้ที่ใช้ hb ในการอธิบายถึงความแตกต่างของประสิทธิภาพระหว่างการทำ hybridization ของ ss DNA 2 เส้น ที่กลายเป็นคู่ของ dsDNA และแยกเป็น ssDNA ใหม่ 2 เส้น โดยมีลำดับ sequence เหมือนกัน . ที่ความเข้มข้นเกลือเพิ่มขึ้นจาก 0.1-0.5 M. ค่าการดูดกลืนจะค่อยๆเพิ่มขึ้น เป็นสิ่งที่สอดคล้องกับข้อสรุปเมื่อมีการเพิ่มขึ้นของ dielectric ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือบัฟเฟอร์ในการทำ hybridization จะรักษาสภาพของการเชื่อมต่อกับ duplex DNA
  • การเติม NaCl ลงไปจะทำให้ ประจุบวกของ Na จะเข้าไปคลุมประจุลบของ gold colloid ที่ให้เกิดการรวมกลุ่มกันของอนุภาคทองให้มีขนาดใหญ่ขึ้น ส่งผลให้สารละลาย colloid มีสีน้ำเงิน
  • การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงถึง steric crowding ที่เกิดขึ้นจากการบดบังของสารโมเลกุลใหญ่ก็จะขัดขวาง interaction หรือบดบังแรงบางชนิดที่ใช้เชื่อมกับกับบริเวณหนึ่งๆ เรียกว่า steric hindrance บน DNA-Oligomer บน surface ที่มีการ modified จึงทำให้มีผลต่อประสิทธิภาพการทำ hybridization เนื่องจาก แรง electrostatic แบบ repulsive และ steric hindrance เป็นสาเหตุที่จะทำให้ probe เข้าไป hybrid สาย ได้น้อยลง เมื่อมี Au-NPs พร้อมกับ functionalized group และ spacer ที่จะเป็นตัวที่เพิ่มประสิทธิภาพการ hybridization ให้ถูกต้องแม่นยำขึ้นโดยอาศัย OEG mixture เนื่องจาก ในการเข้าการวมกันของ SS-DNA ต้องการความเข้มเข้น NaCl สูง แต่อนุภาคทองที่ไม่ modified ไม่ stable เมื่ออยู่ในสภาวะดังกล่าว ดังนั้นในการเปลี่ยนแปลง linker system ก็จะช่วยให้การเข้าจับที่ binding site และความไวเพิ่มมากขึ้นด้วย แต่จะมี background ที่เป็นสาเหตุของการจับแบบ nonspecific ที่จะรบกวนในระหว่างการทำ hybidization ความเสถียรที่เพิ่มขึ้นของ surface-oligonucleotide complex น่าจะเกิดจาก target ที่น้อยและ probe ที่หายไประหว่างขั้นตอนการล้าง
  • ในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง จะเกิด ปฏิกิริยา reductio ของ HAuCl 4 ใช้ sodium citrate เป็นตัวรีดิวซ์ ( reducing agent ) ดังนั้นเมื่อ อนุภาคทองที่อยู่ในสารละลายก็มีประจุประจุลบจาก sodium citrate ล้อมรอบที่ผิวภายในสารละลาย ซึงปริมาณของประจุในสารละลายที่จะมากหรือน้อยขึ้นกับความเข้มข้นของสารละลาย สารละลายของอนุภาคทองที่ไม่ได้รับการ gold nanoparticle colloid จะไม่เสถียรเมื่อแสดงในความเข้มข้นของ electrolyte สูง เนื่องจากความเข้มข้นที่สูงของ electrolyte จะไปบดบังประจุที่ผิวของอนุภาคทำให้อนุภาคทองไม่ stable และเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีฟ้าหรือน้ำเงินอย่างรวดเร็ว ดังนั้น การรวมตัวเกาะกันเองของอนุภาคทองไม่เพียงแต่ ทำให้อนุภาค stable แต่จะช่วยปกป้องการดูดซับบนผิวหรือผิวหน้าจาก nonspecific
  • สารที่ใช้เชื่อมระหว่าง carboxylic acid groups จาก aspartic และ glutamic acid และ หมู่อะมิโนจาก lysine
  • การเติมเกลือเข้าไปนั้น จะทำให้ค่า Tm สูงขึ้น เนื่องจากเกลือที่มีประจุบวก จะเข้าไป stabilize ในสาย DNA ที่มีประจุลบจาก phosphate group ทำให้การแยกสาย DNA แยกออกจากกันได้ยากขึ้น ปกติ nucleotide ก็จะมี phosphate group เกาะอยู่ ดังนั้น เมื่อเราแยก DNA ออกเป็นสายเดี่ยว แต่ละสายก็จะมีโอกาสที่จะมา Hybridization กันได้ ถ้านึกเปรียบเทียบใน 2 สภาวะ ระหว่าง มีเกลือ กับไม่มีเกลือ ภาวะมีเกลือ ประจุบวกจากเกลือจะไปจับกับ phosphate group ทำให้ลดผลักระหว่างประจุลบจากหมู่ฟอสเฟตของ ssDNA ทั้งสองสาย ทำให้จับกันได้ง่าย เมื่อจับกันได้ง่าย จับกันแล้วก็แยกออกยาก ในขณะที่ ภาวะที่ไม่มีเกลือ การจะจับกันได้ลำบาก เพราะ การจะสร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบส ต้องมีแรงที่สามารถเอาชนะแรงผลักกันของประจุลบของฟอสเฟตของสาย DNA แต่ละสาย

Gold nanoprobe detection specific DNA sequence Gold nanoprobe detection specific DNA sequence Presentation Transcript

  • Miss. Siriporn Tontipattananon ID 565020075-3 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Khon Kaen University Gold-based optical biosensor for single mismatched DNAGold-based optical biosensor for single mismatched DNA detection using salt-induced hybridizationdetection using salt-induced hybridization Zongrui Zhan, Xingyi Ma, Cuong Cao, Sang Jun Simb Biosensors and Bioelectronics 32 (2012) 127–132
  • 22 Statistic of cancerStatistic of cancer (http://www.chulacancer.net)
  • BRCA1 gene located Breast CancerBreast CancerBRCA1 -  The BRCA1 protein is classified as a tumor suppressor 33 Breast CancerBreast Cancer
  • Method of breast cancer detectionMethod of breast cancer detection  mammography  magnetic resonance imaging (MRI)  Biopsy 44
  •  polymerase chain reaction (PCR)  Biosensor Early detection http://www.biomed.in.th/biosensor/ 55
  • Previous of study 66
  • (http://www.parkafm.com/jp/gallery_list.php?id=167) The atomic force microscope (AFM) of gold nanoparticles Gold-based optical biosensor gold nanoparticle (Au-NP)  stable metal particles  conduct electricity, magnetic and optical properties 77
  • The diameter of gold nanoparticles determines the wavelengths of light absorbed and the colors in this diagram illustrate this effect. 88 gold nanoparticle (Au-NP)
  • Main steps of sandwich ELISA assay (http://www.epitomics.com/products/product_info/1257 ) sandwich ELISA assay 99
  • DNA hybridization Scheme of DNA hybridization (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/figure/A1569/?report=objectonly) 1010
  • ObjectivesObjectives To investigate in various concentrated salt solutions discriminating single-mismatched DNA in a homogeneous solution. To evaluate the relative importance of the salt concentration that contributes to hybridization efficiency. 1111
  • Scope of studyScope of study 1212 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
  • Materials and methodsMaterials and methods Preparation of the gold colloid Sodium citrate (reducing agent) HAuCl4 e- gold colloid (colorless red) Au+3 (aquoues) + Auo (solid) 3e- 1313
  • Scope of studyScope of study 1414 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
  • centrifuged and washed 14,000 rpm, 30 min, 4o C Preparation of OEG-stabilized gold nanoprobes Materials and methodsMaterials and methods Absolute ethanol EG6-COOH/EG3-OH 1:9 molar Au-NPs solution 9 mL 1 mL overnight incubation supernatant (decant) pellet Added NHS/EDC solution suspended in PBS buffer solution *5’-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3’ add detection probe* 1515OEG : Oligo ethylene glycol
  • Fig. 2 Scheme of the nanoprobe preparation and comparison of UV–vis spectra for colloidal gold nanoparticles in aqueous solution, OEG-functionalized AuNPs, and nanoprobes in PBS solution. The inset image shows the size of colloidal gold nanoparticles. Results and discussionsResults and discussions  Characterization of gold nanoprobes 1616
  • Scope of studyScope of study 1717 Preparation of the gold colloid Preparation of gold nanoprobes preparation of PMP capture probes DNA hybridization procedure Experimental procedures for BRCA-1 detection
  • preparation of PMP capture probes Materials and methodsMaterials and methods PMPs Incubated 30min at room temp. and wash 0.01M PBS solution conjugated with biotinylated capture DNA wash stored in a 0.5 mL stock solution (0.01 M PBS solution contained 1% BSA) streptavidin/capture probe* *Capture probe 5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-Biotin-3’ (Streptavidin coated MagnetSphere Para- Magnetic Particles) 1818
  • Scope of studyScope of study 1919 1.Preparation of the gold colloid 2.Preparation of gold nanoprobes 3.Preparation of PMP capture probes 4.DNA hybridization procedure 5.Experimental procedures for BRCA-1 detection
  • DNA hybridization procedure Materials and methodsMaterials and methods wash with hybridization buffer DNA solutions (non-cognate DNA and target DNA*) *Detection probe 5-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3 Non-cognate DNA 5-ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTT-3 Incubate 1h at 37o C wash + Au-NPs + Buffer** Incubate wash ** 0.1-0.5M Hybridization buffer 50 uL 2020
  • Materials and methodsMaterials and methods Experimental procedures for BRCA-1 detection Au 5’-Amino-(C6)-(T)15GTATGAATTATAATCAAA-3’ 3’-CATACTTAATATTAGTTT∙∙∙CTTTGGGATACATACGAG-5’ 3’-CATACTTAXTATTAGTTT∙∙∙CTTTGGGATACATACGAG-5’ 5’-GAAACCCTATGTATGCTC(T)10-Biotin-3’ detection probe Capture probe PMP Fig. 1 Schematic illustration for the entire experimental strategy for BRCA-1 detection. Target DNA Single-mismatched DNA 2121
  • Fig. 3 (A) Absorbance spectra of gold nanoprobe in various concentrations of salt. (Experimental condition: nanoprobes 50 µL; Na+ concentrations of HB range from 0.1 to 0.5 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussion  Effect of salt concentration Wavelength (nm) A 2222 527 nm
  • MMT : single-mismatched DNA PMT : perfectly matched DNA Fig. 3 (B) Effect of salt concentration on DNA hybridization efficiency. Results and discussions  Effect of salt concentration 0.25 M 0.4 M 2323 0 M
  • Fig. 4 (A) Nanoprobe-based colorimetric detection for single-base mismatches. (Experimental condition: target DNA 10 pM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦ C.) Results and discussionsResults and discussions  Discrimination of single mismatches 2424 Target DNA 5’-GAGCATACA··· ATTATAATTCATAC-3’ Single-mismatched DNA 5’-GAGCATACA··· ATTATXATTCATAC-3’ (“X” stands for T, C, G)
  • Fig. 4 (B) Absorbance intensity in colorimetric detection of target DNA spanning a 0.1 fM to 100 pM concentration range. (Experimental condition: target DNA 100 aM to 100 pM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussionsResults and discussions 2525  Hybridization signal intensity versus DNA concentration
  • Fig. 5. Detection of 10 pM DNA target (black bars) and 10 nM non-cognate DNA (gray bars) in buffer, 1/5 diluted serum, and undiluted serum. (Experimental condition: target DNA 10 pM; Non-cognate DNA 10 nM; Na+ concentrations of HB 0.25 M; hybridization 1 h at 37 ◦C.) Results and discussionsResults and discussions  Hybridization signal intensity versus DNA concentration 2626
  • ConclusionsConclusions The absorption peak of detection probe (Au-OEG-DNA) centered at 527 nm was assigned to 15 nm NaCl concentration also caused the AuNP finally to aggregate as a result of decreased electrostatic repulsion between AuNPs 2727
  • ConclusionsConclusions Increasing salt concentration from 0.1 to 0.5 M, optical absorbance of MMT and PMT increased and A maximum difference appeared at 0.25 M 2828 selectively identify DNA targets concentration of 0.1 fM ; Na+ concentrations of HB 0.25 M
  • Thank youThank you!!
  • Previous studies have shown factors of hybridization  Steric crowding  steric hindrance Results and discussionsResults and discussions Electrostatic repulsive ►functionalized group ►spacer
  • Au C6H5Na3O7 Au Results and discussionsResults and discussions
  • centrifuged 14,000 rpm, 30 min, 4o C Preparation of OEG-stabilized gold nanoprobes Materials and method Absolute ethanol EG6-COOH/EG3-OH 1:9 molar Au-NPs solution 9 mL 1 mL overnight incubation supernatant (decant) pellet HS(CH2)11(OCH2CH2)6OCH2COOH(EG6- COOH) and HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH (EG3-OH)
  • DNA hybridization procedure Materials and method
  • Capture probe 5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-Biotin-3’ Detection probe 5’-Amino-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3’ Target DNA 5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3’ Single-mismatched DNA 5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATXATTCATAC-3’ (“X” stands for T, C, G) Non-cognate DNA 5’- ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTT-3’
  • HS(CH2)11(OCH2CH2)6OCH2COOH (EG6-COOH) HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH (EG3-OH)
  • N-(3-dimethylaminopropyl)- N’-ethylcarbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide(NHS) • Covalent • non-cytotoxic in vitro • Crosslinking agents introduce &zero length' amide- crosslinks between carboxylic acid groups from aspartic and glutamic acid residues, and amino groups from (hydroxy-) lysine residues
  • BRCA1 founder mutations c.181T>G (BIC: 300T>G), c.4035delA (BIC: 4154delA) and c.5266dupC (BIC: 5382insC) and found negative earlier. BRCA1 mutations (Breast Cancer Information Core : BIC database)
  • Phosphate buffered saline : PBS buffer One of the common composition of PBS Salt Concentration Concentration (mmol/L) (g/L)   NaCl   137 8.01   KCl   2.7 0.20   Na2HPO4 • 2 H2O   10 1.78   KH2PO4   2.0 0.27 pH 7.4  
  • Au—ester----NHS/EDC---peptide bond---DNA