REPLICACIÓN DEL ADN
Tres modelos de replicación del ADN
El modelo de Watson y Crick
        de la replicación del ADN

•La replicación del ADN es semiconservativa

•Una de las ca...
Modelo de Watson-Crick de replicación


1. Doble hélice original



2. Las cadenas se separan

3. Las bases complementaria...
Pruebas experimentales de la
     replicación semiconservativa




1958 – Matthew Meselson y Franklin Stahl
•¿Como diferen...
Transfer to 14N           Invalidates
                          conservative




                         Invalidates
    ...
El mecanismo molecular de la replicación del ADN
• Es un proceso complejo que ocurre durante la
  fase S del ciclo celular...
Inicio de la replicación en E. coli
La síntesis de ADN comienza en el genoma bacteriano en un sitio
específico denominado ...
Replicación de DNA: iniciación
Mecanismo de iniciación
 •El ADN se relaja en el origen de replicación con la
  ayuda de las proteínas de iniciación.
 •El...
Se requiere la síntesis de un iniciador para que
comienze la DNA polimerasa
•Las dos cadenas de DNA son antiparalelas
•La ...
La DNA polimerasa no puede inciar la síntesis
Sin un extremo 3-OH libre.
La RNA primasa crea un iniciador corto de
RNA par...
primasa
                                                         Primasa:         3’
La primasa se une a la helicasa para ...
Proteínas de unión al DNA de cadena simple
(ssDBP): Estabilizan al ssDNA, para que las
• Cadenas no se re-asocien entre ca...
Síntesis de ADN: Elongación
• La elongación es semi-discontínua

•La síntesis de la cadena retrasada del DNA se lleva
 a c...
The Mechanism of DNA Replication: Elongation
Las cadenas de DNA son
antiparalelas
La síntesis de DNA ocurre de
manera contínua en la cadena
adelantada y de manera dis-...
Mecanismo de síntesis de ADN en E. coli
DNA Polimerasa (DNAP)
•Adiciona nucleótidos al extremo de la cadena creciente de
 ...
Replicación 1: polimerización
Después que ocurre la replicación del DNA, se deben
remover los iniciadores de RNA de los fragmentos
de Okazaki y unir las...
Función de la DNA
polimerasa I
• remover el iniciador
   de RNA (exonu-
   cleasa 5’-3’)
• Rellenar los huecos
  con nucle...
DNA ligasa:




Requiere ATP para sellar las muescas y crear el enlace fosfodiester

También, durante el desenrollado del ...
Topoisomerasas:

La enzima topoisomerasa II (una girasa), corta
ambas cadenas de DNA para aliviar la tensión
creada por el...
Bidirectional replication of a circular chromosome

Topoisomerases:
Replicación 2: DNA polimerasa
Replicación 3
REACCIÓN EN CADENA DE
           LA POLIMERASA (PCR)




Consiste en la síntesis enzimática in vitro de millones
de copias...
PCR: Polymerase Chain Reaction
      (Reacción en cadena de la polimerasa)

•Es una técnica desarrollada en 1983 por
•Kare...
MECÁNICA DE LA PCR

                                            Mezcla de reacción


               ADN molde, ADNpol,
   ...
Mezcla de reacción de PCR:

ADN templado
Iniciador 1
Iniciador 2
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq polimerasa
Buffer PCR
...
Programa de PCR

temp, tiempo      función

94 oC, 1 minuto   desnaturalización
60 oC, 1 minuto   alineamiento DNA-iniciad...
Termociclador: Aparato de PCR para proporcionar
el programa requerido (temperatura y tiempo) para
amplificar ADN




Termo...
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa 1
UTILIDAD DE LA PCR

•Diagnóstico clínico de patógenos como virus, bacterias,
 micoplasmas de animales o de plantas.

•Para...
Caracterización molecular del agente causal del
mosaico amarillo de la okra en Guerrero, México.




    A       B     C  ...
Detección de
plantas
transgénicas




               Amplificación por PCR de secuencias específicas del
               pr...
RAPDs con cuatro formas especiales
         de Fusarium oxysporum

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9   1   2 3 4 5 6 7 8 9   M
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  1. 1. REPLICACIÓN DEL ADN
  2. 2. Tres modelos de replicación del ADN
  3. 3. El modelo de Watson y Crick de la replicación del ADN •La replicación del ADN es semiconservativa •Una de las cadenas (parental) se conserva y actúa como templado o molde para la síntesis de la cadena complementaria
  4. 4. Modelo de Watson-Crick de replicación 1. Doble hélice original 2. Las cadenas se separan 3. Las bases complementarias se alinean al templado 4. La ADN polimerasa une los nucleótidos alineados en una nueva cadena contínua
  5. 5. Pruebas experimentales de la replicación semiconservativa 1958 – Matthew Meselson y Franklin Stahl •¿Como diferenciar a la cadena parental de la cadena hija del ADN •Se les ocurrió incorporar de manera controlada isótopos pesados de 15N a la nueva cadena sintetizada
  6. 6. Transfer to 14N Invalidates conservative Invalidates discontinuous Etc.
  7. 7. El mecanismo molecular de la replicación del ADN • Es un proceso complejo que ocurre durante la fase S del ciclo celular Dos etapas : iniciación y elongación Mecanismos de síntesis de ADN en E. coli 1) Iniciación Consiste en desenrollar a la doble hélice en el origen de replicación y mantenerla así hasta que se posicionan las proteínas de iniciación y el primosoma. ADN ds Horquilla de replicación
  8. 8. Inicio de la replicación en E. coli La síntesis de ADN comienza en el genoma bacteriano en un sitio específico denominado ori C y termina en un punto fijo denominado ter C. Las bacterias tienen un solo origen de replicación Tanto en procariotes como en eucariotes la replicación es bidireccional. Origen de replicación ADN de E. coli ter C (terminacion) El origen es rico en AT
  9. 9. Replicación de DNA: iniciación
  10. 10. Mecanismo de iniciación •El ADN se relaja en el origen de replicación con la ayuda de las proteínas de iniciación. •El ADN de doble cadena se “funde” • La helicasa también se une a las proteínas de iniciación y utiliza energía para desenrollar al ADN. Helicasas: Grupo de enzimas que usan energía para romper los enlaces de H. Se unen al ssDNA y se mueven en dirección 5’-3’. origin 5’ 3’ 3’ helicase 5’
  11. 11. Se requiere la síntesis de un iniciador para que comienze la DNA polimerasa •Las dos cadenas de DNA son antiparalelas •La síntesis de DNA: • Se lleva a cabo de manera continua en una cadena • De manera discontinua en la otra cadena La síntesis de DNA es semidiscontínua • Con una cadena adelantada y otra retrasada Dirección de replicación origen 3’ Cadena contínua 5’ 5’ 3’ adelantada 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Cadena retrasada 5’ discontínua
  12. 12. La DNA polimerasa no puede inciar la síntesis Sin un extremo 3-OH libre. La RNA primasa crea un iniciador corto de RNA para proporcionar una extremo 3’-OH para para que la DNA pol III inicie la síntesis La helicasa y la primasa forman un compejo en la horquilla de replicación (RF=replication fork) denominado primosoma •La helicasa separa las dos cadenas de DNA en la horquilla de replicación •La primasa hace los iniciadores de RNA tanto en la cadena adelantada como en la retrasada. •La primasa se mueve en la dirección 5’-3’
  13. 13. primasa Primasa: 3’ La primasa se une a la helicasa para formar al primosoma. La primasa es activada por la helicasa 5’ La primasa no requiere un 3’-OH libre. 5’ Inicia de manera contínua en la cadena 3’ 3’ retrasada adelantada 5’ origen retrasada Se mueve en la dirección 5’ 5’-3’ sintetizando al 3’ 3’ iniciador Iniciador de RNA helicase 5’
  14. 14. Proteínas de unión al DNA de cadena simple (ssDBP): Estabilizan al ssDNA, para que las • Cadenas no se re-asocien entre cadenas complementarias o intramolecularmente. • Protege al DNA de la degradación • Estímula a la DNAP III.
  15. 15. Síntesis de ADN: Elongación • La elongación es semi-discontínua •La síntesis de la cadena retrasada del DNA se lleva a cabo en fragmentos de 1000-2000 bp denomi- nados como fragmentos de Okazaki. •Okazaki encontró fragmentos de DNA unidos a pequeños iniciadores de RNA.
  16. 16. The Mechanism of DNA Replication: Elongation
  17. 17. Las cadenas de DNA son antiparalelas La síntesis de DNA ocurre de manera contínua en la cadena adelantada y de manera dis- contínua en la cadena retrasada. •La primasa reinicia muchas veces en la cadena retrasada. •El primosoma se mueve en la direc- ción 5’-3’. •La primasa hace los iniciadores en dirección 5’-3’.
  18. 18. Mecanismo de síntesis de ADN en E. coli DNA Polimerasa (DNAP) •Adiciona nucleótidos al extremo de la cadena creciente de ADN. Requiere de un templado o molde. •Sólo puede añadir nucleotidos en la dirección 5’ a 3’ •Requiere de un 3’-OH libre para polimerizar •Adiciona nucleótidos complementando al templado Hay tres tipos de DNAP (I, II y III) Pol III es la enzima responsable de la síntesis de las nuevas cadenas Pol I es responsable de la remoción de los iniciadores de RNA Tres actividades en las DNA polimerasas 1) Actividad polimerasa 5’-3’ 2) Actividad exonucleasa 3’-5’ (edición) 3) Actividad exonucleasa 5’-3’ (degradación de iniciadores)
  19. 19. Replicación 1: polimerización
  20. 20. Después que ocurre la replicación del DNA, se deben remover los iniciadores de RNA de los fragmentos de Okazaki y unir las piezas sueltas. No hay RNA en la cadena final, entonces: • se debe remover el iniciador de RNA • reemplazar con nucleótidos de DNA • unir los fragmentos de DNA Los fragmentos sintetizados de DNA de la cadena retrasada deben de ligarse
  21. 21. Función de la DNA polimerasa I • remover el iniciador de RNA (exonu- cleasa 5’-3’) • Rellenar los huecos con nucleótidos de ADN (polimerasa 5’-3’)
  22. 22. DNA ligasa: Requiere ATP para sellar las muescas y crear el enlace fosfodiester También, durante el desenrollado del DNA, se forman nudos adelante de la horquilla de replicación que deben ser eliminados RF Overwound ahead of fork tension
  23. 23. Topoisomerasas: La enzima topoisomerasa II (una girasa), corta ambas cadenas de DNA para aliviar la tensión creada por el superenrollamiento Ejemplo: tratar de separar los dos hilos de un cordel y notar como se crea superenrolla- miento y tensión adelante del sitio de apertura y a medida que se abre más, el enrollamiento Se incrementa y se traslada hacia adelante. Las toposiomerasas alivian este problema.
  24. 24. Bidirectional replication of a circular chromosome Topoisomerases:
  25. 25. Replicación 2: DNA polimerasa
  26. 26. Replicación 3
  27. 27. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Consiste en la síntesis enzimática in vitro de millones de copias de un segmento específico de ADN
  28. 28. PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) •Es una técnica desarrollada en 1983 por •Karen Mullis que permite sintetizar DNA in vitro de manera enzimática. •K. Mullis recibió el premio Nobel de química 10 años después •Una muestra pequeña de DNa puede amplificarse exponencialmente mediante PCR •Es una de las técnicas más útiles y poderosas de la Biología Molecular
  29. 29. MECÁNICA DE LA PCR Mezcla de reacción ADN molde, ADNpol, dNTPs, iniciadores, buffer PCR gel de agarosa ADN genómico
  30. 30. Mezcla de reacción de PCR: ADN templado Iniciador 1 Iniciador 2 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Taq polimerasa Buffer PCR H2O
  31. 31. Programa de PCR temp, tiempo función 94 oC, 1 minuto desnaturalización 60 oC, 1 minuto alineamiento DNA-iniciador 72 oC, 1 minuto alargamiento del DNA 35 ciclos
  32. 32. Termociclador: Aparato de PCR para proporcionar el programa requerido (temperatura y tiempo) para amplificar ADN Termociclador Hybaid para 24 muestras Termociclador Perkin Elmer para 48 muestras
  33. 33. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa 1
  34. 34. UTILIDAD DE LA PCR •Diagnóstico clínico de patógenos como virus, bacterias, micoplasmas de animales o de plantas. •Para detectar y diagnosticar mutaciones causantes de enfermedades hereditarias. •Diferenciar un organismo transgénico de uno no transgénico •Generar huellas genéticas de animales o plantas (analisis forense, criminalístico, paternidad, etc). •Usos especiales en biología molecular e ingeniería genética
  35. 35. Caracterización molecular del agente causal del mosaico amarillo de la okra en Guerrero, México. A B C D E Yellow Mosaic on Okra leaves M b 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 M PM (pb) Marcadores 2 036 1 636 de ADN 1 018 indicativos 506, 517 396 de geminivirus Panel A Panel B
  36. 36. Detección de plantas transgénicas Amplificación por PCR de secuencias específicas del promotor 35S y de NPTII en ADN de Arabidopsis transformada y de A. tumefaciens C58C1(pBI121)
  37. 37. RAPDs con cuatro formas especiales de Fusarium oxysporum M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1, 2: f. sp. coffeae 3, 4: f. sp. ciceri 5, 6: f. sp. radicis-lycopersici 7, 8: f. sp. lycopersici 9: garbanzo Iniciador 09 Iniciador 14
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