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  1. 1. HERDCHEK* PRRS X3 _______________________________________________________________ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen das PRRS Virus (Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom) Die deutsche Fassung der Gebrauchsinformation ist entsprechend §17c TierSG zugelassen. Trousse de détection d’anticorps contre le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin Kit para la detección de Anticuerpos frente al Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino Kit di ricerca degli anticorpi del virus della sindrome respiratoria e riproduttiva suina HerdChek* (DE) Zul.-Nr.: FLI-B 504 version 06-40959-00
  2. 2. ______________________________________________________________________________________________________ 16 HerdChek PRRS X3 Kit para la detección de Anticuerpos frente al Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino HerdChek* PRRS X3 Nombre y uso previsto ___________________________________________________________________ El kit HerdChek*PRRS X3, es un ensayo inmunoenzimático de IDEXX para la detección de anticuerpos frente al virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV) en muestras de suero y plasma de cerdo. . Información general _____________________________________________________________________ El virus del Síndrome Respiratorio y reproductor porcino (PRRSV) es un arterivirus que fue identificado tanto en Europa como en Estados Unidos a finales de los 80 como cepas diferentes de antigenicidad variable. El virus causa problemas reproductivos (abortos, lechones débiles, esterilidad y muerte en cerdas), enfermedad respiratoria (pneumonía, dificultad respiratoria, bajo rendimiento y muerte) así como signos neurológicos moderados 1 . El PRRS se considera como una de las enfermedades con mayor impacto económico que afecta a la industria porcina. La evaluación de la exposición en la explotación al virus tras una infección natural o tras una vacunación es posible gracias a la ayuda de la medición de tasa de anticuerpos en el suero o plasma. Es importante que el diagnóstico empleado para la medición de la tasa de anticuerpos sea capaz de detectar las diferentes cepas existentes del virus. Reservado a uso veterinario. Descripción/Principios___________________________________________________________________ HerdChek* PRRS X3 es un kit de detección inmunoenzimática diseñado para detectar la presencia de anticuerpos IgG frente al PRRSV en el suero y plasma porcino. Se ha configurado un formato de microtitulación mediante el tapizado con antígenos IgG PRRSV en la placa. Cuando se incuba la muestra en el pocillo tapizado, los anticuerpos IgG específicos frente al PRRSV forman un complejo con los antígenos virales del tapizado. Después de lavar y eliminar el material no fijado en los pocillos, se añade un conjugado anti- porcino-IgG peroxidasa que se une a los anticuerpos porcinos fijados en los pocillos. Durante la última etapa de la prueba, se elimina el conjugado no fijado, y se añade a los pocillos un sustrato TMB. El desarrollo del color está relacionado con la cantidad de anticuerpos específicos frente a PRRSV presentes en el pocillo. Reactivos______________________________________________________________________________ Conserve todos los reactivos entre 2° y 8°C Volumen 1. Placas tapizadas con antígenos recombinantes del PRRSV 5 Placas 2. Control Positivo PRRSV. 4 ml 3. Control Negativo 4 ml 4. Conjugado anti-porcino IgG:HRPO 60 ml 5. Diluyente de la Muestra. 120 ml A. Concentrado de Lavado (x10). 235 ml B. Sustrato TMB. 60 ml C. Solución de Frenado (SDS). 60 ml Materiales necesarios pero no suministrados ________________________________________________ • Pipetas de precisión monocanal o multicanal apropiadas para distribuir de 5 a 1000 µl • Puntas de pipeta desechables • Cilindro graduado de 500 ml para la solución de lavado • Lector de microplacas • Agua destilada o desionizada • Dispositivo para la aplicación y aspiración de solución de lavado • Trampa de retención de aspirado y desinfectante • Tubos para dilución de muestras
  3. 3. ______________________________________________________________________________________________________ HerdChek PRRS X3 17 Precauciones a tomar y advertencias a los usuarios___________________________________________ • Maneje todo el material biológico como material potencialmente infectado. • No use la boca para pipetear. • No coma, beba ni fume en los lugares donde se esté trabajando con las muestras o los reactivos del kit. • La solución substrato TMB irrita los ojos, las vías respiratorias y la piel. Evite el contacto con la piel y los ojos. • No exponga la solución substrato TMB a una luz intensa ni a agentes oxidantes. Maneje dicha solución con material limpio de plástico o vidrio. • Almacene todos los reactivos entre 2° y 8°C. Deje que adquieran la temperatura ambiente (de 18° y 25°C) antes de utilizarlos, y refrigérelos de nuevo a entre 2° y 8°C después del uso. • Todo el material usado deberá descontaminarse adecuadamente antes de su eliminación. • Manipule con cuidado los componentes del kit para evitar contaminaciones. • No use componentes que hayan caducado y no mezcle componentes de diferentes lotes. • Obtendrá resultados óptimos si sigue escrupulosamente este protocolo. Para mantener la precisión y reproducibilidad es necesario un pipeteo correcto, respetar los tiempos de incubación y un lavado adecuado. • Los dos controles deben usarse para cada serie de ensayos. • Utilice sólo agua desionizada o destilada para la preparación de los reactivos que se empleen en el ensayo. • Los pocillos que no se usen deberán almacenarse bien cerrados dentro de su bolsa de plástico entre 2° y 8°C. • Sólo para uso veterinario. Preparación de los reactivos ______________________________________________________________ Diluya las muestras de la prueba a 1/40 con el diluyente de muestras (por ejemplo disolviendo 5 µl de muestra con 195 µl de Diluyente de muestra). NOTA: No diluir los controles. Asegúrese de cambiar de punta para cada muestra, y registrar la posición de cada muestra en la placa mediante una hoja de trabajo. Las muestras deben mezclarse antes de dispensarlas en la placa tapizada con PRRSV. Solución de lavado El concentrado de lavado debe llevarse a temperatura ambiente (18°–25°C) y agitarse con el fin de obtener la disolución de cualquier sal precipitada. El concentrado de lavado debe disolverse con agua destilada/desionizada antes de usarlo (por ejemplo, 30 ml de concentrado en 270 ml de agua por placa analizada). Protocolo del ensayo ____________________________________________________________________ Debe dejarse que todos los reactivos lleguen a la temperatura ambiente (18°–25°C) antes de usarlos. Los reactivos deben mezclarse mediante agitación suave o vortex. 1. Tome las placas tapizadas de antígeno y registre la posición de la muestra en una hoja de trabajo. 2. Dispense 100 µl de control negativo SIN DISOLVER en dos pocillos de la placa de ensayo 3. Dispense 100 µl de control positivo SIN DISOLVER en dos pocillos de la placa de ensayo 4. Dispense 100 µl de muestra DISUELTA en los pocillos correspondientes. 5. Incube durante 30 + 2 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 6. Aspire el contenido líquido de todos los pocillos a un recipiente de desperdicios adecuado. 7. Lave bien cada pocillo con aproximadamente 300 µl de solución de lavado tampón fosfato, entre tres y cinco veces. Aspire el contenido de todos los pocillos después de cada lavado. No permita que las placas se sequen entre uno y otro lavado, o antes de añadir el conjugado. Después de la última aspiración de la solución de lavado, golpeé ligeramente pero con firmeza cada placa para eliminar la solución de lavado residual en algún material absorbente dispuesto para tal efecto. 8. Añada 100 µl de conjugado Anti-porcino IgG:HRPO en cada pocillo. 9. Incube durante 30 + 2 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 10. Repita los pasos 6 y 7. 11. Añada 100 µl de solución sustrato a cada pocillo de la placa.
  4. 4. ______________________________________________________________________________________________________ 18 HerdChek PRRS X3 12. Incube durante 15 + 1 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 13. Añada 100 µl de solución de frenado a cada pocillo de la placa para detener la reacción. 14. Mida y registre la A(650) de las muestras y de los controles. 15. Calcule los resultados. Resultados ____________________________________________________________________________ Para que el ensayo sea válido, deben seguirse las especificaciones siguientes. La media del control positivo menos la media del control negativo debe de ser mayor o igual a 0,150.. Además la media del control negativo (NCx) debe ser menor o igual que 0,150. Si la prueba es inválida, se sospechará de la técnica empleada, y deberá repetirse después de un examen detallado de las instrucciones que acompañan a este producto. La presencia o ausencia de anticuerpos frente al PRRSV se determina calculando el coeficiente muestra sobre positivo (M/P). Ver los ejemplos en la sección Cálculos. NOTA: IDEXX tiene a su disposición instrumentos y sistemas de software para el cálculo de valores medios y diferencias M/P, y la elaboración de resúmenes de datos. Cálculos_______________________________________________________________________________ Cálculo de la media del control negativo (NCx _ ) NCx _ = NC1 A650 + NC2 A650 2 Ejemplo: 0,064 + 0,08 = 0,072 2 Cálculo de la media del control positivo (PCx _ ) PCx _ = PC1 A650 + PC2 A650 2 Ejemplo: 0,560 + 0,596 = 0,578 2 Cálculo del coeficiente muestra sobre positivo (E/P) E/P = (muestra A(650) - NCx _ ) (PCx _ - NCx _ ) Ejemplo: Si la muestra A(650) = 0,750 P/PK =(0,750 – 0,072) = 1,34 (0,578 – 0,072) Interpretación de los resultados ___________________________________________________________ La presencia o ausencia de anticuerpos frente al PRRSV se determina calculando el coeficiente M/P de cada muestra. 1. Si el coeficiente M/P es inferior a 0,40, la muestra se clasifica como NEGATIVA en anticuerpos frente al PRRSV. 2. Si el coeficiente M/P es superior o igual a 0,40, la muestra se clasifica como POSITIVA en anticuerpos frente al PRRSV. Basándonos en los resultados realizados por IDEXX, utilizando este kit podemos publicar los siguientes valores de sensibilidad y especificidad relativas para la detección de anticuerpos frente al PRRSV, con un intervalo del nivel de confianza (CL) del 95%. Sensibilidad y especificidad relativas del kit HerdChek PRRS X3 Se utilizaron muestras positivas y negativas caracterizadas Tamaño de muestra Kit/Referencia Tipo de muestra Sensibilidad y especifidad relativas Nivel de confianza del 95% Estudio ID 1 +/+ 1029 -/+ 13 +/- 1 -/- 1446 suero Sen. 98,8% (95% KI 97,8% - 99,3%) Espec. 99,9% (95% KI 99,6% - 100%) Estadística Kappa 0,99 1. Los sueros positivos proceden de animales infectados experimentalmente y de animales positivos de campo caracterizados por el historial de la explotación con resultados positivos en el kit PRRS 2Xr y/o IFA. Las muestras negativas se obtuvieron de explotaciones conocidas libres de PRRS. Bibliografía ____________________________________________________________________________ J. Zimmerman and K.-J. Yoon, Editors, The PRRS Compendium (second ed.), National Pork Board, Des Moines, IA (2003).
  5. 5. ______________________________________________________________________________________________________ HerdChek PRRS X3 19 Resumen del protocolo del test ____________________________________________________________ Se recomienda antes de la realización del test por primera vez, realizar una lectura completa del manual de instrucciones. Paso Acción 1. Preparación - Tome las placas tapizadas de antígeno y registrar la posición de la muestra en una hoja de trabajo. - Preparación de la solución de lavada. 2. Distribución de las muestras - Dispense 100 µl de control negativo SIN DISOLVER en dos pocillos de la placa de ensayo. - Dispense 100 µl de control positivo SIN DISOLVER en dos pocillos de la placa de ensayo. - Dispense 100 µl de muestra DISUELTA en los pocillos correspondientes. 3. Incubación de las muestras - Incube durante 30 + 2 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 4. Lavado de la placa - Aspire el contenido líquido de todos los pocillos a un recipiente de desperdicios adecuado. - Lave bien cada pocillo con aproximadamente 300 µl de solución de lavado tampón fosfato, entre tres y cinco veces. Aspirar el contenido de todos los pocillos después de cada lavado. No permita que las placas se sequen entre uno y otro lavado, o antes de añadir el conjugado. Después de la última aspiración de la solución de lavado, golpeé ligeramente pero con firmeza cada placa para eliminar la solución de lavado residual en algún material absorbente dispuesto para tal efecto. 5. Dispensación del conjugado - Añada 100 µl de conjugado Anti-porcino IgG:HRPO en cada pocillo. 6. Incubación del conjugado - Incube durante 30 + 2 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 7. Repita el paso 4 8. Distribución del substrato - Añada 100 µl de solución sustrato a cada pocillo de la placa. 9. Incubación del substrato - Incube durante 15 + 1 min. a temperatura ambiente (18°–25°C). 10. Frenado de la reacción - Añada 100 µl de solución de frenado a cada pocillo de la placa para detener la reacción. 11. Medición de la placa - Mida y registre la A(650) de las muestras y de los controles. - Calcule los resultados. < 0,40 ≥ 0,4012. Interpretación Suero/Plasma negativo positvo Fabricado por: Para asistencia técnica: contacte el representante local IDEXX IDEXX Switzerland AG o visite: Stationsstrasse 12 www.idexx.com/production/contact 3097 Liebefeld-Bern, Switzerland IDEXX Technical Support: 00-800-727-43399 No. de Registro: *HerdChek es una marca fabrica o una marca registrada de IDEXX Laboratories, Inc. en los Estados Unidos de America y/o en otros países. Covered by European Patent No. 587,780 B2. ©2009 IDEXX Switzerland AG
  6. 6. ______________________________________________________________________________________________________ 24 HerdChek PRRS X3 Manufacturer/Hersteller/Fabricant/Fabricante: Distributor/Vertrieb/Distributeur/Distribuidor: IDEXX Switzerland AG IDEXX Laboratories B.V. Stationsstrasse 12 Scorpius 60 3097 Liebefeld-Bern, Switzerland 2132 LR HOOFDDORP, The Netherlands

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