Diversidade Genética De Populações E Criopreservação De Sêmen De Pirapitinga-Do-Sul  Brycon opalinus
<ul><li>Empresa Proponente:  </li></ul><ul><ul><li>CESP - Companhia Energética de São Paulo </li></ul></ul><ul><ul><li>Ger...
<ul><li>A conservação da biodiversidade tem sido uma das questões importantes nas discussões sobre o uso dos recursos aquá...
<ul><li>Em programas de repovoamento de peixes há a necessidade de assegurar a manutenção da diversidade genética dos esto...
<ul><li>Avaliar a diversidade genética das populações encontradas em tributário do Rio Paraíba do Sul da espécie de peixe ...
<ul><li>Amostragem e coleta de nadadeiras. </li></ul><ul><ul><li>Itagaçaba e Paraibuna, no estado de São Paulo, e Preto e ...
<ul><li>Sequenciamento:  Macrogen Sequencing Service (Macrogen Inc., Coréia do Sul).  </li></ul><ul><li>A variabilidade ge...
<ul><li>Seleção e estimulação da espermiação. </li></ul><ul><li>Coleta  e avaliação do sêmen (n=29); características semin...
<ul><li>Avaliação espermática:  </li></ul><ul><ul><li>motilidade espermática, duração da motilidade, e contagem objetiva d...
<ul><li>Plantel de reprodutores da EHA Paraibuna </li></ul><ul><ul><li>Rio Paraibuna - 184 indivíduos; Rio Itagaçaba - 54 ...
RESULTADOS OBTIDOS <ul><li>A análise molecular de variância indica que há diferenciação genética entre as populações, suge...
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RESULTADOS OBTIDOS   CARACTERIZAÇÃO, CRIOPRESERVAÇÃO E FERTILIZAÇÃO COM SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL Table III Taxas de fer...
<ul><li>O conhecimento da variabilidade genética da pirapitinga-do-sul é fundamental para traçar estratégias de conservaçã...
<ul><li>Devido à grande diversidade da ictiofauna brasileira, as informações existentes relativas às espécies de peixes e ...
Agradecemos pela atenção ! Laura Helena Orfão [email_address] (11) 8796-0074
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  1. 1. Diversidade Genética De Populações E Criopreservação De Sêmen De Pirapitinga-Do-Sul Brycon opalinus
  2. 2. <ul><li>Empresa Proponente: </li></ul><ul><ul><li>CESP - Companhia Energética de São Paulo </li></ul></ul><ul><ul><li>Gerente do Projeto: Danilo Caneppele </li></ul></ul><ul><li>Entidades Executoras: </li></ul><ul><ul><li>Universidade de Mogi das Cruzes </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Núcleo Integrado de Biotecnologia </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Laboratório de Genética e Organismos Aquáticos e Aquicultura </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><li>Universidade Federal de Lavras </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Departamento de Zootecnia </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Coordenador: Alexandre W. S. Hilsdorf </li></ul></ul>FORMAÇÃO DE UM BANCO DE GERMOPLASMA DA ICTIOFAUNA AMEAÇADA DA BACIA DO RIO PARAÍBA DO SUL
  3. 3. <ul><li>A conservação da biodiversidade tem sido uma das questões importantes nas discussões sobre o uso dos recursos aquáticos. Um dos problemas referentes à geração de energia hidroelétrica, é que inevitavelmente esta se dá com danos ao meio ambiente. </li></ul><ul><li>Ao longo dos anos, o Rio Paraíba do Sul e seus tributários vêm sofrendo represamentos, desmatamentos da mata ciliar e poluição em razão da industrialização e atividade agrícola nas áreas ribeirinhas. Esses impactos ambientais resultam na perda da diversidade genética implicando em danos consideráveis sobre ecossistemas terrestres e aquáticos. </li></ul><ul><li>A habilidade de adaptação e de resposta das espécies às frequentes mudanças ambientais ocorre devido à diversidade genética. Um dos pontos centrais para o planejamento de medidas de conservação da biodiversidade aquática é o entendimento da estrutura populacional das espécies para que se determinem tanto as respostas fisiológicas às variações ambientais como as estratégias de manejo das populações naturais </li></ul>CONCEITO E CARACTERÍSTICAS DO PROJETO
  4. 4. <ul><li>Em programas de repovoamento de peixes há a necessidade de assegurar a manutenção da diversidade genética dos estoques de reprodutores, de acordo com a estrutura genética e populacional da espécie no meio ambiente. </li></ul><ul><li>A manutenção de um estoque reprodutivo ex-situ de algumas espécies de peixes vem sendo conduzida pela Companhia Energética de São Paulo (CESP). </li></ul><ul><li>Para a ampliação genética e numérica deste plantel, a CESP desenvolveu o projeto “Formação de um banco de germoplasma da ictiofauna ameaçada da bacia do rio Paraíba do Sul” que mapeou a distribuição genética e populacional da pirapitinga-do-sul ( Brycon opalinus ), do surubim-do-paraíba ( Steindachneridion parahybae ), da piabanha ( Brycon insignis ). </li></ul><ul><li>O projeto teve por objetivo resgatar na natureza o que ainda resta de variabilidade genética dessas espécies e propor uma metodologia de reintrodução baseada no conhecimento da distribuição genética das populações selvagens. </li></ul>CONCEITO E CARACTERÍSTICAS DO PROJETO
  5. 5. <ul><li>Avaliar a diversidade genética das populações encontradas em tributário do Rio Paraíba do Sul da espécie de peixe pirapitinga-do-sul Brycon opalinus </li></ul><ul><li>Desenvolver protocolo para criopreservação de sêmen, auxiliando em ações de conservação dessa espécie. </li></ul>OBJETIVOS
  6. 6. <ul><li>Amostragem e coleta de nadadeiras. </li></ul><ul><ul><li>Itagaçaba e Paraibuna, no estado de São Paulo, e Preto e Santíssimo, no estado do Rio de Janeiro. </li></ul></ul><ul><ul><li>Amplificações da região do D-loop (Polymerase Chain Reaction”, PCR) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>BO_DLoop2-R (5’ GAGCATGTCACAACATATACACA 3’) e F-TTF (5’ GCCTAAGAGCATCGGTCTTGTAA 3’ </li></ul></ul></ul><ul><li>Mix : </li></ul><ul><ul><li>1µM de cada iniciador, 2,5 mM MgCl 2 , 2,5 mM de dNTPs, 1 unidade de Taq DNA polimerase, 50-100 ng de DNA total, 5 µl de tampão 10× Taq e volume de água para completar 50 µl. </li></ul></ul><ul><li>Condições dos ciclos de amplificação: </li></ul><ul><ul><li>denaturação inicial 94 °C por 5 min, seguida de 35 ciclos de denaturação a 94 °C por 30 s, anelamento a 54 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 1 min com extensão final de 10 min a 72 °C. </li></ul></ul>METODOLOGIA DIVERSIDADE GENÉTICA DA PIRAPITINGA-DO-SUL
  7. 7. <ul><li>Sequenciamento: Macrogen Sequencing Service (Macrogen Inc., Coréia do Sul). </li></ul><ul><li>A variabilidade genética foi estimada usando os seguintes parâmetros: </li></ul><ul><ul><li>diversidades nucleotídicas (π) </li></ul></ul><ul><ul><li>diversidades haplotípicas (Hd) </li></ul></ul><ul><ul><li>número de sítios polimórficos pelo programa DnaSP. </li></ul></ul><ul><ul><li>diversidade genética dentro e entre as populações foi AMOVA agrupando as amostras dentro de diferentes rios com para testar a significância da comparação entre pares das amostras. </li></ul></ul>METODOLOGIA DIVERSIDADE GENÉTICA DA PIRAPITINGA-DO-SUL
  8. 8. <ul><li>Seleção e estimulação da espermiação. </li></ul><ul><li>Coleta e avaliação do sêmen (n=29); características seminais </li></ul><ul><li>Parâmetros testados: </li></ul><ul><ul><li>diluidores (composição e osmolaridade); crioprotetores; tipos de palheta: tempo de equilíbrio; temperatura de descongelamento. </li></ul></ul><ul><li>Envase das amostras de sêmen palhetas de 0,5 mL ou 4 mL, e congeladas botijão de vapor de nitrogênio a -170 °C por 24 horas </li></ul><ul><li>Transferência para o nitrogênio liquido a -196 °C. </li></ul><ul><li>Descongelamento </li></ul>METODOLOGIA CARACTERIZAÇÃO E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL
  9. 9. <ul><li>Avaliação espermática: </li></ul><ul><ul><li>motilidade espermática, duração da motilidade, e contagem objetiva do número de espermatozóides vivos por meio de coloração diferenciada (eosina-nigrosina). </li></ul></ul><ul><li>Fertilização: </li></ul><ul><ul><li>glicose 365 mOsm/kg e MG (n=4 machos), 30 min de tempo de equilíbrio, o sêmen diluído foi envasado em palhetas de 4 mL (n = 3 palhetas x 4 machos), congeladas em vapor de nitrogênio liquido e então armazenadas em nitrogênio liquido como descrito anteriormente. </li></ul></ul><ul><li>Fêmeas: indução e coleta de ovos </li></ul><ul><li>Procedimento de fertilização: </li></ul><ul><ul><li>100 ul de sêmen em 0,4g de ovócitos (~ 100 ovócitos); controle </li></ul></ul><ul><li>Taxa de fertilização e taxa de eclosão </li></ul>METODOLOGIA CARACTERIZAÇÃO E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL
  10. 10. <ul><li>Plantel de reprodutores da EHA Paraibuna </li></ul><ul><ul><li>Rio Paraibuna - 184 indivíduos; Rio Itagaçaba - 54 indivíduos; Rio Preto - 89 indivíduos; Ribeirão Santíssimo - 51 indivíduos, </li></ul></ul><ul><li>O alinhamento final das sequências, obtidas das 87 amostras de quatro populações de pirapitinga-do-sul analisadas gerou uma matriz de dados que definiu um total de 45 haplótipos. </li></ul>RESULTADOS OBTIDOS DIVERSIDADE GENÉTICA DA PIRAPITINGA-DO-SUL
  11. 11. RESULTADOS OBTIDOS <ul><li>A análise molecular de variância indica que há diferenciação genética entre as populações, sugerindo que cada população deve ser tratada como um estoque geneticamente diferente. </li></ul><ul><li>O conhecimento dos efeitos da variabilidade genética em uma população de peixes é de fundamental importância para o entendimento de como essa diversidade está distribuída em uma espécie. </li></ul><ul><li>Se a espécie apresenta diversidade contínua, qualquer área de sua distribuição é representativa da espécie, enquanto que, havendo estruturação, a representatividade de cada população terá que ser preservada. </li></ul>
  12. 12. RESULTADOS OBTIDOS CARACTERIZAÇÃO, CRIOPRESERVAÇÃO E FERTILIZAÇÃO COM SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL Tabela I. Características do sêmen fresco de pirapitinga-do-sul. 1 n é o número de animais utilizados 2 EPM: erro padrão da média
  13. 13. RESULTADOS OBTIDOS CARACTERIZAÇÃO, CRIOPRESERVAÇÃO E FERTILIZAÇÃO COM SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL Table II Motilidade espermática, duração da motilidade e espermatozóides vivos no sêmen fresco e após o congelamento em glicose 365 mOsm/kg e metilglicol, em palhetas de 4 mL com 30 min de tempo de equilíbrio e descongelado a 60 °C (média ± EPM;) de pirapitinga-do-sul Diferenças entre o sêmen fresco e descongelado são indicadas com * quando significativas (F; P<0,05).
  14. 14. RESULTADOS OBTIDOS CARACTERIZAÇÃO, CRIOPRESERVAÇÃO E FERTILIZAÇÃO COM SÊMEN DE PIRAPITINGA-DO-SUL Table III Taxas de fertilização e de eclosão dos ovócitos fertilizados com sêmen fresco e após o congelamento em glicose 365 mOsm/kg e metilglicol, em palhetas de 4 mL com 30 min de tempo de equilíbrio e descongelado a 60 °C (média ± EPM) de pirapitinga-do-sul. Diferenças entre o sêmen fresco e descongelado são indicadas com * quando significativas (F; P<0,05).
  15. 15. <ul><li>O conhecimento da variabilidade genética da pirapitinga-do-sul é fundamental para traçar estratégias de conservação para esta espécie. </li></ul><ul><ul><li>O manejo dessas populações para fins de repovoamento deve ser diferenciado, mantendo-se os reprodutores isolados e a reprodução artificial levar em consideração a caracterização genética. </li></ul></ul><ul><li>A criopreservação de sêmen é uma técnica que auxilia na reprodução artificial. </li></ul><ul><ul><li>A formação de um banco de sêmen deve considerar a caracterização genética da espécie e, por isso, uma identificação minuciosa de todo material preservado precisa ser feita. </li></ul></ul><ul><li>Os programas de repovoamento e outras ações para conservação da ictiofauna são objetos de vários estudos que tentam demonstrar sua eficácia. </li></ul><ul><ul><li>A reprodução artificial para fins de repovoamento, por exemplo, é muito questionada quanto à perda da variabilidade genética ou ainda da adaptação dos indivíduos que são liberados na natureza. Se esses programas forem delineados a partir das informações genéticas das populações e ainda utilizando gametas de grande número de reprodutores, esses efeitos negativos podem ser minimizados. </li></ul></ul>CONCLUSÕES
  16. 16. <ul><li>Devido à grande diversidade da ictiofauna brasileira, as informações existentes relativas às espécies de peixes e sua variabilidade genética ou criopreservação de sêmen ainda são insuficientes. </li></ul><ul><ul><li>As técnicas usadas neste estudo podem ser aplicadas a outras espécies, sejam elas de importância ecológica ou comercial, as quais necessitam de mais conhecimento para a conservação ou melhoramento genético. </li></ul></ul><ul><li>Uma vez que temos o conhecimento da diversidade genética de um estoque fundador, deve-se buscar formas de monitoramento genético para verificar se o repovoamento dos rios estão sendo efetivos. </li></ul>CONCLUSÕES
  17. 17. Agradecemos pela atenção ! Laura Helena Orfão [email_address] (11) 8796-0074

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