Practica n 2

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Practica n 2

  1. 1. GUIA PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA GENERALFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICAGUIA DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Autor: Lic Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque Magister en Microbiología Clínica AREQUIPA – PERÚ 2010
  2. 2. NORMAS DEL LABORATORIO.El laboratorio de biología es un lugar convenientemente habilitado donde con lasdebidas precauciones se pueden manejar y examinar organismos. Cuandomanejamos cualquier tipo de muestra debemos tener en cuenta la posibilidad deriesgos, estos pueden ser biológicos, del ambiente del Laboratorio o riesgos asociadoscomo el manejo substancias químicas, eléctricos, fugas de gas.Todos los organismos que se manipulen deben ser manejados con precaución por supotencial patogenicidad.Etiquetas para materiales o químicos, identificación de tuberías, políticas de calidad,misiones, anuncios de oficina o procesos, planes de contingencia, layouts,señalamiento para emergencias, ecología, ahorro de energéticos, etc.
  3. 3. PELIGROIndica situación de peligro con alta probabilidad demuerte o lesión seria. No debe considerarse para dañosa la propiedad salvo que exista riesgo de lesionespersonales.ADVERTENCIAIndica situación de peligro con alguna probabilidad demuerte o lesión seria. No debe considerarse para dañosa la propiedad salvo que exista riesgo de lesionespersonales.CUIDADOIndica situación de peligro con probabilidad de lesionesmenores o moderadas. No debe usarse cuando existaprobabilidad de muerte o lesion seria.AVISOIndica una política de la compañía relacionada directa oindirectamente con la seguridad del personal oprotección de la propiedad. No debe usarse en vez dePELIGRO, ADVERTENCIA, CUIDADO.SEGURIDADIndica instrucciones generales para prácticas,recordatorios de procedimientos y ubicación de equiporelativo a seguridad en el trabajo.
  4. 4. NO PODRÁ USARSE EN ÁREAS DE LA FACULTAD1. En caso que el profesor lo indique se deberá usar guantes y/o mascarilla, o propipetas.2. Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos escrupulosamente con agua y jabón.3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al finalizar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo con alcohol de 70, solución de fenol o benzol.4. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio. Los microorganismos deben manejarse cerca de la flama del mechero.5. Esta prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando se manipulen microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la nariz, boca, ojos etc.6. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos biológico infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos. El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.7. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposición a esta radiación es peligrosa.8. En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio notificar inmediatamente al instructor o al personal técnico para tomar las medidas higiénicas y de seguridad apropiadas, así como su registro.9. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este será desechado.10. No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente prohibido retirar del Laboratorio cultivos o cepas a menos que así lo indique el profesor. Al finalizar la práctica entregar el material empleado debidamente separado .
  5. 5. PRÁCTICA N°1 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIOI. OBJETIVOSAl finalizar la práctica el estudiante será capaz de: Aplicar las reglas básicas de higiene y seguridad para los laboratorios. Analizar la importancia que tiene cada una de estas reglas, tanto en las actividades académicas de aprendizaje, como en el ejercicio profesional.II. FUNDAMENTOS Bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas destinadas a mantener elcontrol de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos oquímicos, logrando la prevención de impactos nocivos,asegurando que el desarrollo oproducto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y seguridad detrabajadores de la salud, pacientes,visitantes y el medio ambiente. Se podría clasificar a estos riesgos en Riesgos Biológicos (virus, bacterias,clamidias, rickettsias, parásitos u hongos) y en No Biológicos. Estos últimos incluyenlos riesgos químicos (p.e. uso de lavandina y solventes inflamables o cáusticos),físicos (p.e. cortaduras), eléctricos (p.e. descargas eléctricas por enchufes o cables enmal estado) y el fuego (p.e. quemaduras), que son comunes a otros laboratorios.El riesgo biológico es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, otoxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos. Un agente Biológico se entiende por agente biológico cualquier microorganismo -incluyendo de los genéticamente modificados- cultivo celular, animal o planta oproducto de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad enhumanos, animales u otros seres vivos.1. SEGURIDAD BIOLÓGICALas Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgorelacionado con la manipulación de material peligroso, y su rigurosidad varía con lapeligrosidad de los agentes.La seguridad biológica se fundamenta entonces en tres elementos: Técnicas de Laboratorio. Se refieren a todas aquellas prácticas y técnicas que se realizan dentro y fuera del laboratorio para contener los riesgos biológicos, siendo necesario la adopción por parte de cada laboratorio de un Manual de Seguridad Biológica en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como así también las responsabilidades. Equipo de seguridad (Barreras Primarias): Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de seguridad biológica), como las prendas de protección personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, etc.). Diseño y Construcción de la Instalación (Barreras Secundarias): La magnitud de las barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas donde tiene acceso el público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación (autoclaves), filtrado del aire de salida al exterior, flujo de aire direccional, etc.2. NIVELES DE BIOSEGURIDAD• Grupo de microorganismos infectantes• Técnicas y prácticas de laboratorio
  6. 6. • Equipo de seguridad• Tipo de laboratorio3. CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOSPara la clasificación se pueden considerar los siguientes factores, capacidadpatógena, modos de transmisión y gama de huéspedes, disponibilidad de medidas deprevención eficaces y disponibilidad de tratamiento eficaz GRUPOS DE RIESGO DE MICROORGANISMOS INFECTANTESGrupo 1 Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien Bacillus subtillis identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente. Es poco probable que el microorganismo produzca enfermedad en humanos o animales.Grupo 2 Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes Leptospira, tbc, asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión salmonela, o exposición percutánea o mucosa. histoplasma, Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos o animales toxoplasma, pero es poco probable que sea un problema serio para los trabajadores hepatitis, HIV. del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles y el riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado.Grupo 3 Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales Brucella, aftosa infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal. Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están disponibles.Grupo 4 Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que Ebola, Marburg, tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o Machupo que se desconoce su riesgo de transmisión. Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.4. CLASIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS Esta clasificación es considerando: El Tipo de microorganismo, lugar de lasinstalaciones, características de las instalaciones y el acceso al laboratorio.Nivel 1. Microorganismos no patógenos para el hombre.Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos delgrupo I, es decir, los que no producen enfermedad en el serhumano sano y de susceptibilidad conocida y estable a losantimicrobianos. Es el habitualmente utilizado en los laboratoriosde prácticas de universidades o centros docentes donde seemplean cepas no patógenas. Se debe trabajar en condicionesmínimas de asepsia y esterilidad. Ejemplos típicos son Escherichiacoli, como así también todos aquellos microorganismos que seutilizan en la industria alimenticia, para la elaboración de quesos,cerveza, embutidos, etc.
  7. 7. Nivel 2. Microorganismos y procedimientos de riesgo moderado.En él se trabaja con agentes del grupo II, como así también conalgunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre,son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedadmoderada o limitada. Deben ser manipulados por personalespecializado y son los que con más frecuencia se estudian enlaboratorio de microbiología clínica: Salmonella typhi,Mycobacterium tuberculosis, Virus de la Hepatitis B, etc.Otros aspectos que se deben considerar en este nivel son:- El área de riesgo debe restringirse al personal, no permitiéndoseel acceso a personas que tengan aumentado, por alguna causa, elriesgo de infección (Ej: inmunosuprimidos).- En el acceso al laboratorio figurarán señales de riesgo biológico,condiciones de ingreso y responsables del mismo (nombre,teléfono y domicilio).- El personal debe estar vacunado (si correspondiera) y entrenadopara prevenir accidentes y actuar correctamente en caso de queocurriere.- Control permanente de roedores e insectos.- Uso de guardapolvo en el área de trabajo exclusivamente(considerar que el guardapolvo es potencialmente un elementocontaminante).- Evitar el uso de jeringas o cualquier otra práctica que genereaerosoles.“Las muestras deben tratarse siempre como potencialmenteinfectadas y tenerse en cuenta las precauciones citadas.”Nivel 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellosde riesgo moderadoEn este nivel se trabaja con agentes biológicos del grupo III,microorganismos que causan patología grave, de difícil y largotratamiento, que pueden dejar secuelas y ocasionalmente producirla muerte, en cuya manipulación se aplican procedimientos detrabajo, que implican alto riesgo de infección. El mayor y másfrecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida através de aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello las principalesmedidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y lautilización de cabinas de seguridad (incluidas las medidas de losniveles anteriores como las condiciones mínimas de asepsia yesterilidad, además del uso de batas, máscaras, respiradores,guantes, etc.). En los laboratorios de microbiología clínica losejemplos más típicos de este tipo de microorganismos son el Virusde la fiebre de Lassa, Brucella spp, Histoplasma capsulatum, etc.Solo pueden ser procesados por personal calificado, por ello sedebe restringir el acceso al personal del laboratorio y llevar unregistro de las visitas, del personal de servicio y de accidentes. Lainfraestructura apropiada para el nivel de contención 3, incluye,además, aire acondicionado independiente, sin recirculación, congradiente de presión, entre otras. Periódicamente se tomaránmuestras de sangre a todo el personal.
  8. 8. Nivel 4: Microorganismos exóticos y/o altamente peligrosos yprocedimientos de alto riesgo.Este nivel se requiere cuando se procesa con certeza y sesospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso,exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existetratamiento o es poco fiable. Normalmente son microorganismosde dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel tambiénpuede utilizarse para trabajar con animales de experimentacióninfectados con microorganismos del grupo IV.Debe trabajarse en laboratorios especiales de máxima seguridad(contención máxima), en los que es necesario ducharse ycambiarse de ropa tanto a la entrada como a la salida del mismo yen donde existen barreras de aire con el exterior. El manejo delmaterial limpio y contaminado se realiza por canales altamentecontrolados.Ejemplos de este nivel son el virus Junín, virus Ébola, el virus de lafiebre aftosa, el virus del HIV, el Machupo y el Marburg. Además,deben incluirse en este nivel de contención los microorganismospropios del grupo 3 que adquieren propiedades patógenas que loselevan al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovismultirresistente que puede causar fallecimiento por fracasoterapéutico.III. MATERIALES Y MÉTODOS Jabón Guantes Toalla desechable Gorros MandilIV. PROCEDIMIENTOSUno de los elementos de riesgo por factores humanos son los malos hábitos dehigiene, considerando:1. Manos: Lavado y uso de guantes
  9. 9. Uso de guantes:2. Cabello: Uso de Gorro.3. Uso de ropa protectora4. Protección de ojos.V. TRABAJO1. ¿Qué entiendes por bioseguridad?2. Dibuje las diferentes cabina de bioseguridad según los niveles3.
  10. 10. PRACTICA N°2 MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULAI. OBJETIVOS Que el alumno conózcalas técnicas de estudio celular Practicar y dominar las técnicas de estudio celularII. FUNDAMENTOClasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandesgrupos:1) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionaresta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son: a) Centrifugación b) Cromatografía c) Electroforesis d) Cultivos "in vitro"2) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer como es suforma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente: a) Microscopia óptica b) Microscopia electrónica Microscopio electrónico de Trasmisión (MET) Microscopio electrónico de barrido (MEB)1) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULASe utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias queconstituyen la materia viva.Presentan dos problemas principalmente:a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de unagran complejidad.A) CENTRIFUGACIÓNConsiste en la separación de los componentes de unamezcla en función de las diferencias entre lasvelocidades que presentan al someterlos a elevadasaceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar lamezcla en un rotor a un gran número de vueltas porminuto. Los aparatos empleados con este fin sedenominan ultracentrifugas.Esta técnica requiere los siguientes pasos:1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACION: Elmaterial biológico, por ejemplo: un fragmento de tejidodel hígado, es triturado para disgregarlo y romper lasmembranas celulares.La rotura de las membranas deja en libertad losorgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si lahomogeneización se realiza suavemente, los orgánulospermanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla"que estará compuesta de restos de membranas,orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.2) CENTRIFUGACION: Las ultracentrífugas sonmaquinas que consiguen velocidades de rotación muyelevadas, hasta 500.000 v/mn. Los materiales biológicossometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia elfondo de los recipientes que los contienen convelocidades que dependen de su masa, de su forma yvolumen, y de la naturaleza del medio en el que serealice la centrifugación.B) CROMATOGRAFÍASe fundamenta en la separación de los componentes deuna mezcla por sus diferencias de absorción. Estasdiferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van derWals que se establecen entre los componentes de la
  11. 11. mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la faseestacionaria, tendremoslos siguientes tipos de cromatografía: 1) CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL: Se emplea para la separación de sustancias químicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedara embebida. A continuación se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazara por capilaridad y los ira arrastrando. Los componentes de la mezcla viajaran más o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos grandes con las moléculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas específicas. 2) CROMATOGRAFIA DE GASES: Consiste en un serpentín largo y delgado cuyas paredes están impregnadas de un liquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos, azucares u hormonas. C) ELECTROFORESIS En este método, la mezcla a separar se deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o también gel de almidón). A continuación seestablece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias quecomponen la mezcla se desplazaran en función de su carga eléctrica.Naturalmente este método se empleara con sustancias que presenten cargas eléctricas(proteínas y ácidos nucleicos)D) CULTIVOS IN VITROEstos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismoen condiciones favorables a su multiplicación.La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y suestandarización.Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condicionesfísicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no soncapaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cadatipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo.2) MÉTODOS MORFOLÓGICOSEl ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre si 0,2 mm. Este es elpoder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellasdetalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder deresolución del ojo.CLASES DE MICROSCOPIOSA) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICOA1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos deDe Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Comoondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al serpartículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes.
  12. 12. En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un hazde electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre elcátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primeralente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra.Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Unatercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen finales proyectada sobre una pantalla o fotografiada.Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 mde alto y llegan a pesar 500 kg. FIJACION. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los mas corrientes son el tetroxido de osmio (OsO4), el formaldehido (HCHO) y el permanganato potásico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan mas los metales aparecerán mas oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado. DESHIDRATACION e INCLUSION. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte. CORTE. Los cortes se realizan mediante ultra micrótomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observación al microscopio.A2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar.Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplicaobtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se formanson captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estosmicroscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscopicas, sinembargo su aumento no suele pasar de 20.000.B) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICOFunciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primeralente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar.Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagenaumentada de este. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por elobjetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.PREPARACION DEL MATERIAL:CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominadosmicrotomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor,corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse enparafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.FIJACION. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible,para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismocelular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustanciasquímicas (por ejemplo: formaldehido y tetroxido de osmio).DESHIDRATACION. La extracción del agua del interior de las células permitirá tambiénuna mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material aobservar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución iránextrayendo el aguaTINCION. Es la coloración de las células o de partes de estas para que resalten yposibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partesconcretas de la célula.MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre unporta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y"cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y solosirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayorduración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.III. PROCEDIMIENTO
  13. 13. ANEXO DE PRÁCTICA: MICROSCOPIAI. OBJETIVOS Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos.II. FUNDAMENTOUna célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño máspequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñasy para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Unalente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentosmayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores sedesarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes quelogran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otroobjetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de loscomponentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo delmicroscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio selocaliza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia lamuestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee unorificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos quepermiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo sedisponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio(macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poneren foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde seencuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada unade las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde selocalizan elementos del sistema óptico.La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y laocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de lafuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee untornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptimailuminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz queatraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentesocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante. Figura 1: Esquema del funcionamiento de un microscopio compuesto. La luz proveniente de una fuente pasa a través de una lente condensadora y luego atraviesa al espécimen localizado en el soporte o platina del microscopio. La lente objetiva forma luego una imagen real (es decir que puede ser proyectada en una pantalla) intermedia que se proyecta justamente en el diafragma fijo de la lente ocular. Esta imagen es posteriormente aumentada aún más por la lente ocular generándose una imagen virtual (no puede ser proyectada en una pantalla) invertida del objeto que es percibida por el ojo como si estuviese a 2.5 cm de distancia.Características de las lentes objetivas:
  14. 14. La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal(primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar unaimagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberracionesópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de todalente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidades plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción delas diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se veanborrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración sedenominan planapocromáticas.La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como sumagnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de unmicroscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas paraproyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacerúnicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lentedurante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominanparafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes,por lo cual se denominan paracentrales.Iluminación:Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizandotanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme entoda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema deiluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuentegeneradora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localizaexactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera unhaz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma delcondensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando laposición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también laapertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz selocalice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas deiluminación de la muestra.La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, estoes una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles delmismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayorserá la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprenderentonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en laimagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta noaportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil paratransformarse en “magnificación vacía”.Límite de resolución:
  15. 15. El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntospara ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia esde 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm seránpercibidos por el observador como un único punto. La capacidad de distinguir (separar) detalles pequeños será entonces el poder de resolución del microscopio. Teniendo en cuenta esta definición, el poder de resolución de un microscopio aumenta cuando lamínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. Ellímite de resolución de una lente puede calcularseutilizando la ecuación de Abbe:Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es laapertura numérica, la que se calcula como:AN = Ƞ. sen θ.La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente(2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva (Ƞ) (figura 3).Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de granapertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre elespécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva.Considerando las ecuaciones anteriores es evidenteque existen tres maneras de modificar el límite deresolución de una lente: variando la longitud de ondade trabajo, variando el índice de refracción, y elángulo del cono de luz que incide sobre la muestra.Trabajando con longitudes de onda cercanas alvioleta (ver apéndice), se logra el mejor poder deresolución, es decir valores de límite de resoluciónpequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo delcono de luz que incide sobre la muestra puedevariarse la distancia del condensador al objeto o eldiseño del condensador. Para variar el índice derefracción, lo que se hace es modificar el elementoque está en contacto con el objeto y con la lenteobjetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, eldel agua es 1.33 y el del aceite y vidrio esaproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivoutilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva,se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la lente. Figura 4: Principio de trabajo de lentes de objetivas de inmersión en aceite. La presencia de aceite en el espacio comprendido entre el cubreobjetos y la lente objetiva, incrementa el número de rayos provenientes del espécimen que son captados por la lente objetiva.En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de granapertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentescon aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo conlentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminuciónde la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajodel plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que ladistancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor aperturanumérica (pues θ es mayor).
  16. 16. 2) Microscopía de contraste de fase:Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de lamuestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución delmicroscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantenerinalterada la muestra, sin teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contrastenatural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz através de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojohumano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de unaforma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variabledependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerádel índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo quegeneralmente es de 1/4 λ.El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en losespecímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferenciasde amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido porun disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio.Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayosque atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillotransparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo delobjetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lenteobjetiva en ese plano.El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entrelas ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que noson retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad,o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6).Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicosya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra paragenerar contraste.3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC):El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticosque ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractadautilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halosbrillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera unfalso volumen de la muestras (Figura 5).III. PROCEDIMIENTO1. Observación de célula vegetales: Realizar cortes Colocar una gota de agua en el portaobjetos y observar2. Observación de células animales Colocar una gota de sangre en el portaobjetos realizar un barrido con el cubreobjetos y observar3. Observación de hongos
  17. 17. Colocar una gota de agua en el portaobjetos, con el asa de siembra esparcir la muestra, colocar el cubreobjetos y observarIV. CUESTIONARIO1. Registre los aumentos (X) y las aperturas numéricas (AN) de las lentes objetivas instaladas en su microscopio. Aumento (×) Apertura numérica (AN) 2. En condiciones de observación con luz verde (λ = 550 nm) y usando la ecuación de Abbe, indique el mejor límite de resolución (LR) obtenible con su microscopio. Explicite los cálculos realizados. 3. Escriba los fundamentos de Microscopía de epifluorescencia. 4. Escriba los fundamentos de Microscopía láser confocal 5. Dibuje lo observado indicando el aumento correspondiente: 6. Escriba la ecuación de Abbe y explique brevemente su significado. 7. Explique brevemente el concepto de apertura numérica. 8. Explique la diferencia entre resolución y magnificación. 9. Identifique en el diagrama adjunto:
  18. 18. PRACTICA N°3 PERMEABILIDAD CELULAR.I. OBJETIVOS Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células animales y vegetales. Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad y su importancia.II. FUNDAMENTO Las membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas (fosfolípidos) y proteicas (aproximadamente 5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. En microscopía electrónica de transmisión las membranas se observan como una estructura trilaminar debido a que la región ocupada por las cabezas de los fosfolípidos se tiñe con el tetróxido de osmio quedando electrón densa y la región hidrofóbica electrón lúcida. Una de las principales funciones que desempeñan las membranas es mantener las diferencias esenciales entre el medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables. Conceptos básicos: 1) Permeabilidad de membrana: - membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas. - membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula. - membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a distintas moléculas. 2) Tonicidad de una solución: - solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. 3) Ósmosis: Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no ejercen la misma presión osmótica). 4) Osmolaridad: Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución. Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe con células vivas. 24 2) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAR Es el conteo de las células vivas Protocolo de obtención de células para (sanas) o muertas en una muestra. iniciar un cultivo primario (no será utilizado Generalmente los métodos de en clase) determinación de la viabilidad se basan - Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm en el análisis de dos parámetros: con 2 escalpelos en una gota de tampón salino actividad metabólica de la célula o (PBS, pH 7.2-7.4). integridad de membrana plasmática. - Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en Los métodos más comunes para tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA). evaluar la integridad de membrana y - Incubar 15min a 37ºC y agregue así determinar el índice de células aproximadamente 4 ml de medio de cultivo suplementado con suero. viables en una suspensión celular son - Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a los test de exclusión de colorantes fin de obtener una suspensión celular vitales (ej.: Azul Tripán). Las células homogénea. vivas, cuyas membranas celulares - Tomar una muestra de 500μl y agregar 500μl estén integras, excluyen a estos de solución de Azul Tripán diluida. - Observar rápidamente al microscopio montando una gota entre porta y cubreobjeto. Tampón fosfato salino (PBS) NaCl (8.0g), KCl (0.2g), Na2HPO4 (2.1g), KH2PO4 (0.2g), H2O (1litro). Sol. concentrada de azul tripán: 200mg de Azul Tripán en 50ml de agua destilada. Diluir 4
  19. 19. colorantes en forma activa. El método del Azul Tripán pone en evidencia el funcionamiento de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática. Por este procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las células muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo previo a iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo optimizar las condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia de agentes terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos.III. PROCEDIMIENTO1. Morfología normal de eritrocitos y hoja de Elodea sp. Corte una hoja de Elodea sp. y monte entre porta y cubreobjetos Tome una gota de sangre y monte entre porta y cubreobjetos Observe al microscopio2. Comportamiento de las células vegetales frente a soluciones con diferenteconcentración de solutos Realice montajes de hojas de Elodea en soluciones de cloruro de sodio en diferentes concentraciones Observe al microscopio Luego de algunos minutos, vuelva a montar y observe al microscopio el Comportamiento de células animales (eritrocitos) frente a soluciones de diferente concentración.IV. CUESTIONARIO 1.- Exprese la presión osmótica en términos de la ley de vant Hoff. Justifique brevemente. 2.- ¿Qué es la osmolaridad? ¿Cómo puede determinarse experimentalmente? 3.- Describa de forma breve en qué consiste la regla de Overton 4.- Indique con una flecha hacia dónde se producirá el flujo de agua en los siguientes ejemplos. Justifique brevemente. 5.- ¿En qué se basa el método de determinación de la viabilidad celular con el colorante azul Tripán?
  20. 20. PRACTICA N°4 PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOSI. OBJETIVOS Obtención de una fracción subcelular enriquecida en cloroplastos. Identificación de cloroplastos en dicha fracción. Estudio de la ultraestructura del cloroplasto.II. FUNDAMENTO En algas y plantas superiores, la fotosíntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo posee, al igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una externa y una interna, pero además posee un tercer sistema de membrana, la membrana tilacoidal. Esta membrana forma pequeños sacos aplanados, denominados tilacoides, cuyo lumen es el espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques denominados grana (cada bloque en singular es un granum). Los grana están interconectados por regiones de la membrana tilacoidal alargadas, denominadas laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el espacio tilacoidal. El estroma es el espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la membrana tilacoidal (Figura 1). La fotosíntesis es un complejo proceso en el cual la energía de la luz se usa para generar energía química en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su vez para convertir el CO2 del aire en carbohidratos, liberándose paralelamente O2 a partir de agua (en plantas, algas y algunas bacterias). La reacción global de la fotosíntesis es: 6 CO2 + 6 H2O → 6 O2 + C6H12O6 Las reacciones de la fotosíntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones fotoquímicas, que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y NADPH, y las reacciones bioquímicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y continúan en el citosol, en las que el CO2 es convertido en carbohidratos.
  21. 21. Las reacciones fotoquímicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH, constituyen unproceso de dos fases, denominado fotofosforilación no cíclica, para distinguirlo de otro proceso,la fotofosforilación cíclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de lafotofosforilación no cíclica, la absorción de luz por el fotosistema II le permite removerelectrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar alfotosistema I. Allí, una nueva absorción de luz confiere suficiente energía a los electrones parapoder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH (Figura 2).Los fotosistemas son complejos formados por varios polipéptidos y distintos tipos depigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrón en una molécula declorofila particular. En el fotosistema II, este electrón es transferido a la plastoquinona, unapequeña molécula análoga a la coenzima Q de la fosforilación oxidativa. Cada electróntransferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una complejareacción cuyo resultado final es la liberación de O2 a partir de agua. La plastoquinonatransfiere electrones al complejo b6-f, análogo al complejo b-c1 de la mitocondria, el cualbombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una proteína pequeña quecontiene un átomo de cobre que varía de estado de oxidación, transporta electrones desde elcomplejo b6-f hasta el fotosistema I. Allí, la absorción de un fotón aumenta la energía de estoselectrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una proteína con un grupo prostético quecontiene hierro y azufre. Esta a su vez transfiere los electrones al NADP+, en una reaccióncatalizada por la enzima NADP reductasa. Además de generar NADPH, este proceso detransporte de electrones provoca la acumulación de protones en el espacio tilacoidal, con laconsecuente generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidal, elcual es usado para sintetizar ATP.En 1937, Robert Hill descubrió que cuando cloroplastos aislados son iluminados en ausenciade CO2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2 paralelamente. Esteresultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa directamente enel proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reacción química, denominadareacción de Hill: luz, cloroplastos H2O + A AH2 + ½ O2En el práctico realizaremos un protocolo de separación de pigmentos fotosintéticos mediantecromatografía. Los pigmentos fotosintéticos son responsables de absorber y atrapar laenergía lumínica en los primeros pasos de la fotosíntesis. Los principales pigmentos son lasclorofilas. En plantas verdes existen las clorofilas a y b. También existen pigmentos accesoriosllamados carotenoides. Dada su estructura molecular, las clorofilas son capaces de absorberluz en el rojo y el azul del espectro visible y transmiten en el verde. Los carotenoides, por suparte, absorben en el azul y transmiten en el amarillo-anaranjado. Ya que el espectro deabsorción de los pigmentos accesorios difiere del de las clorofilas, tienen el efecto de ampliar elrango de longitudes de onda que puedan ser utilizados en la fotosíntesis.La cromatografía es un procedimiento para separar los componentes de una mezcla,permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Existen varios tiposde cromatografía pero en todos los casos la separación se logra por la distribución de loscomponentes en una fase estacionaria (fija) y una fase móvil. En la cromatografía en papel, loscomponentes de la mezcla se separan en zonas discretas en una tira de papel de filtro,
  22. 22. utilizando en la fase móvil una mezcla de solventes en la cual cada componente de la muestra a separar se disuelve de manera diferencial. La fase estacionaria está constituida por el papel. Durante la cromatografía existen dos fuerzas opuestas. La fuerza del solvente en movimiento que se extiende por capilaridad hacia el otro extremo del papel, que tiende a llevarse cada componente consigo. También existe una fuerza de resistencia debida a la disolución de cada componente en la fase estacionaria. De la interacción de estas dos fuerzas en cada componente de la muestra, es que resulta la separación de cada uno de ellos. El grado de separación obtenido es una función de la solubilidad relativa de cada componente en la fase estacionaria y la fase móvil (Figura 3).III. PROCEDIMIENTO 1. Extracción de clorofila por cromatografía. a) Método I: Cortar en trozos una hoja y macerarla en un mortero con 5 mL de acetona. Tomar la tira de papel de filtro por el borde y marcar una línea con lápiz a aproximadamente dos cm de uno de los extremos. A lo largo de la línea marcada, sembrar con un capilar una muestra de la extracción orgánica y dejar secar. Repetir el procedimiento unas 10 veces para concentrar la muestra. Agregar con pipeta el solvente cromatográfico (eter/acetona, 3:1) hasta un nivel intermedio entre el extremo del papel y la línea de siembra, y colocar la tira de papel de filtro en la probeta de vidrio. Tapar la probeta para reducir la evaporación de solventes. Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar de la probeta con pinza, y antes que el solvente se evapore, marcar con lápiz una línea en el cromatograma que represente el frente de migración. Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración de cada uno de los pigmentos. Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según: Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) . distancia migrada por el solvente b) Método II: Cortar en trozos una hoja y macerarla en con 20 mL de alcohol. Tomar una gasa y filtrar Tomar la tira de papel de filtro por el borde y colocarla sobre el extracto aproximadamente dos cm de uno de los extremos. Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar y marcar con lápiz una línea en el cromatograma que represente el frente de amigración. Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración de cada uno de los pigmentos.
  23. 23. Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según: Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) . distancia migrada por el solvente 2. Extracción de pigmentos. Cortar en un mortero trozos de las muestras a evaluar y macerarla en con 20 mL de alcohol. Adicionar una cucharadita de carbonato de calcio Filtrar con ayuda de una gasa Adicionar 20 ml de gasolina y 10 ml de agua Llevara a la pera de decantación y obtener las dos fases por separadoIV. CUESTIONARIO 1. ¿En qué compartimientos ocurre la fase fotoquímica (luminosa) y la fase bioquímica (oscura) de la fotosíntesis? Justifique brevemente su respuesta. 2. Señale cuál(es) de las siguientes afirmaciones acerca del fotosistema II NO es correcta. Justifique su respuesta. a) Está ubicado en las membranas tilacoidales. b) Está involucrado en la oxidación de H2O. c) Posee una clorofila oxidable: P680. d) Tiene asociado un complejo de antena para su función de capturar luz. e) Es necesario para la fotofosforilación cíclica. 3. ¿Cómo se explica el comportamiento de los pigmentos en el cromatograma? Justifique. 4. Además del Rf, ¿qué otra característica podría utilizarse para identificar un pigmento desconocido? 5. ¿Por qué se utilizan solventes orgánicos en la cromatografía de pigmentos fotosintéticos y no por ejemplo, agua?
  24. 24. PRACTICA N°5 NÚCLEOI. OBJETIVOS Identificación de una fracción subcelular enriquecida en núcleos mediante la reacción de Feulgen y comparación con núcleos en cortes histológicos. Estudio de la ultraestructura del núcleo.II. FUNDAMENTOEl núcleo es el organelo celular donde se localiza el ADN. Su forma varía dependiendo del tipocelular, puede ser esférico, ovoide o multilobulado. Su tamaño oscila entre 3 a 15 μm y suposición depende del tipo celular. Está delimitado por una envoltura nuclear constituida pordos membranas celulares (dos bicapas lipídicas) separadas por una cisterna perinuclear. Estaenvoltura se continúa en el citoplasma con el retículo endoplásmico rugoso, y por lo tanto sucara externa presenta ribosomas asociados.En la cara interna de la envoltura se localiza una red de filamentos intermedios denominadalámina nuclear, constituida por las proteínas denominadas laminas. Tanto la lámina nuclearcomo la envoltura se ven interrumpidas en regiones denominadas poros nucleares,destinados al transporte de moléculas desde y hacia el citosol.En el interior del núcleo el ADN que constituye los cromosomas se empaqueta conproteínas denominadas histonas. El conjunto del ADN, las histonas, y proteínascromosómicas no histonas, se denomina cromatina. La unidad fundamental deempaquetado recibe el nombre de nucleosoma y está constituido por un octámero dehistonas rodeado por dos vueltas de ADN.La cromatina posee diversos grados de compactación dentro del núcleo, y pueden existirvariaciones durante el ciclo celular. En su estado más laxo o descondensado la cromatina sedenomina eucromatina y se aprecia en microscopía electrónica de transmisión comoregiones electrón-lúcidas (ver figura). Esta cromatina es transcripcionalmente activa ya quepermite el acceso de factores de transcripción y toda la maquinaria enzimática necesariapara la transcripción. La cromatina condensada se denomina heterocromatina y se observaen microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-densas, generalmenteasociadas a la envoltura nuclear. Esta cromatina se asocia con estados transcripcionalmenteinactivos ya que dificulta el acceso de factores de transcripción al ADN. Es importanterecordar que la compactación y descompactación de la cromatina son fenómenosreversibles. Podemos encontrar diferentes niveles de compactación del ADN que van desdela fibra de 2 nanómetros (doble hélice de ADN), pasando por la fibra de 11nm quecorresponde al “collar de cuentas” que incluye los nucleosomas (complejo de histonasrodeadas de dos vueltas del ADN), la fibra de 30nm, la de 300nm, la de 700nm hasta elcromosoma mitótico.
  25. 25. El nucléolo es una región dentro del núcleo, no delimitada por membrana, donde ocurre latranscripción del ARNr y ensamblado de las subunidades ribosomales por separado. Allí selocalizan loops de ADN de distintos cromosomas, que contienen clusters de genes de ARNr.Cada uno de estos clusters se denomina Región Organizadora Nucleolar (NOR). En unamicrografía electrónica de transmisión pueden distinguirse tres regiones en el nulceolo: (1)una región pálida denominada componente fibrilar o centro fibrilar que contiene ADN queno está siendo transcrito, (2) un componente fibrilar denso que contiene moléculas deARNr que están siendo sintetizadas, y (3) componente granular que contiene partículasprecursoras ribosomales en maduración. El tamaño del nucleolo refleja su actividad por loque varía en distintos tipos celulares y puede variar también dentro de una misma célula.III. PROCEDIMIENTO1. Extracción de ADN.a) Método I: Lavar las hojas de espinaca y llenar hasta aproximadamente completar una Beaker de 100mL. ( mg) En una licuadora se coloca la espinaca más 200 ml de agua y 20mg de cloruro de sodio (licuar por 15 segundos) Filtrar la espinaca, adicionar 1/6 parte de un detergente no antibacteriano (según la cantidad adquirida). Dejar reposar por 10min Dividir la muestra en 4 tubos con 40 ml cada tubo, Tubos 1 y 3 → Enzima Tubos 2 y 4 → Extracto de piña o papaya (filtrar) Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes lentamente. Tubos 1 y 2→ 40 ml de alcohol isopropilico Tubos 3 y 4→ 40 ml de alcohol etílico Extraer con ayuda de la varilla en ADNb) Método II: En 100ml de agua adicionar 10g de cloruro de sodio, realizar un enjuague bucal con la solución anteriormente preparada Tomar 50 ml de detergente y adicionar 50ml de agua. Mezcal el enjuague bucal y el detergente. Dejar reposar por 10min Dividir la muestra en 2 tubos con 40 ml cada tubo, Tubos 1 y 2 → Enzima Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes lentamente). Tubos 1 → 40 ml de alcohol isopropilico Tubos 2 → 40 ml de alcohol etílico Extraer con ayuda de la varilla en ADN2. Mitosis en cebolla Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud. Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5 Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida.
  26. 26. Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale. Observar al microscopioIV. CUESTIONARIO1.- ¿Qué niveles de compactación de la cromatina conoce? Mencione un caso extremo decompactación que conozca.2.- Mencione las principales características de la envoltura nuclear y explique por qué NO esapropiado denominarla membrana nuclear.3.- Se sospecha la presencia de una proteína particular en los complejos de poro nuclear.Describa brevemente una estrategia para verificarlo.4.- Enumere los principales pasos del fraccionamiento subcelular, y explique brevemente enqué consisten.
  27. 27. PRACTICA N°6 MITOCONDRIAI. OBJETIVOS Identificación de una fracción subcelular enriquecida en mitocondrias mediante la detección de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH). Estudio de la ultraestructura de la mitocondria.II. FUNDAMENTOLa mitocondria es el lugar donde ocurre la mayorparte de las reacciones del metabolismo oxidativoen las células eucariotas. Esto es, es el sitio en elcual se realiza la mayor parte de la degradaciónoxidativa de compuestos como carbohidratos,ácidos grasos y aminoácidos, que terminandando lugar a la generación de energía en formade síntesis de ATP. La mitocondria es unorganelo de morfología y tamaño variables, peroque típicamente tiene una forma elipsoide, deaproximadamente 0,5 μm de diámetro y 1 μm delargo. Las mitocondrias están delimitadas por dosmembranas, una membrana externa lisa y unamembrana interna extensamente invaginada. Elespacio entre ambas membranas se conocecomo espacio intermembrana, y lasinvaginaciones de la membrana interna, queamplían enormemente su área, se denominancrestas (Figura 1). El compartimento interno de lamitocondria es la matriz mitocondrial. Mientrasque la membrana externa permite la difusión librede moléculas de hasta 10 kDa, la membrana interna sólo deja pasar libremente O2, CO2 yH2O, y posee varios transportadores que controlan el pasaje de diversos metabolitos.En la figura anterior se esquematizan dos de los principales procesos metabólicos que ocurrenen la mitocondria, y que nos van a permitir identificarla: el ciclo de Krebs y la cadenarespiratoria.
  28. 28. El resultado neto del ciclo de Krebs es la oxidación de un grupo acetilo (CH3−C=O)perteneciente a la acetil-CoA a dos moléculas de CO2, y en paralelo la reducción de tres NAD+y un FAD para dar 3 NADH y un FADH2, respectivamente. Todas las enzimas que catalizan lasreacciones del ciclo de Krebs se hallan en la matriz mitocondrial, excepto la succinatodeshidrogenas, que está inserta en la membrana mitocondrial interna.En la cadena respiratoria, los electrones de alta energía del NADH y el FADH2 pasan porsucesivos complejos aceptores de potencial redox creciente, con lo que esta energía se valiberando. En cada complejo se bombean protones hacia el espacio intermembrana, con lo quese establece una diferencia de concentración de H+ (y de carga) a través de la membranamitocondrial interna. La energía liberada por el transporte de electrones queda almacenada enforma de un gradiente electroquímico.Los tres complejos, así como los dos transportadores, que constituyen la cadena respiratoria,están insertos en la membrana mitocondrial interna. Los electrones provenientes del NADHpasan al complejo NADH deshidrogenasa, y de allí pasan a la coenzima Q, una pequeñamolécula hidrofóbica, que los transporta al complejo citocromo b-c1. Los citocromos sonproteínas que contienen grupos hemo, en los que un átomo de hierro alterna entre los estadosde oxidación Fe (II) y Fe (III). Existen varios tipos de citocromos, que pueden hallarse formandoparte de complejos, o bien aislados, como el citocromo c, que transporta electrones delcomplejo citocromo b-c1 al complejo citocromo oxidasa. En este complejo, los electrones llegana su aceptor final, el O2, para formar H2O.La oxidación del FADH2 es menos favorable que la del NADH, y sus electrones entran en lacadena respiratoria más adelante, siendo cedidos a la coenzima Q. El FADH2 está unidocovalentemente a la succinato deshidrogenasa, que está inserta en la membrana mitocondrialinterna, como mencionamos más atrás.La succinato deshidrogenasa es una enzima que sólo se encuentra en mitocondrias, y por lotanto la medición de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias enuna fracción subcelular. Esto se puede realizar utilizando un aceptor artificial de electrones quetenga mayor afinidad por los electrones que el FAD, como por ejemplo: 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto cambia el color según su estado de oxidación:es azul cuando se encuentra en estado oxidado e incoloro cuando está reducido.III. PROCEDIMIENTO1. Respiración. Pesar 20 g de levadura y llevara un matraz de 200 mL Adicionar agua ( enrazar a 200mL) Pesar 1g de azúcar y llevar a matraz ( mas una pisca de sal), tapar con el corcho y el tubo acodado o en forma de U Paralelamente llenar otro matraz con agua de cal ( 15g de oxido de calcio en 1000ml de agua destilada hervida) Unir los dos matraces mediante el tubo acodado o en forma de U.2. Fermentación Con la probeta medir 200 ml de leche y llevar a un frasco de vidrio
  29. 29. Medir 100 ml de yogurt prebiótico y adicionar a los 200mL leche, tapar y llevar a incubar por 24 h Sacar de la incubadora y medir el pH. Tomar una gota de muestra en el portaobjetos, expandir y realizar tinción de gram.IV. CUESTIONARIO1. Compare de forma breve las características de las membranas mitocondriales interna y externa.2. De las siguientes afirmaciones, señale la(s) falsa(s), y justifique brevemente su respuesta. a) Las mitocondrias se encuentran en todas las células eucariotas. b) A nivel mitocondrial se produce la oxidación de carbohidratos, aminoácidos y ácidos grasos. c) En todas las células eucariotas, la mayor parte del ATP celular es de origen mitocondrial. d) Las mitocondrias presentan intenso dinamismo y plasticidad. e) La localización de las mitocondrias en la célula es independiente de la función propia de cada célula.3. Explique brevemente qué procesos ocurren en la matriz mitocondrial y qué procesos ocurren en las membranas.
  30. 30. PRACTICA N°7 ANÁLISIS DE PARÁMETROS DEL CICLO CELULARI. OBJETIVOS Reconocimiento al microscopio de luz de células en interfase y en las distintas etapas de la mitosis. Estimación del índice mitótico de una población celular. Estimación de la duración de las fases del ciclo celular en base a datos tomados de la literatura, obtenidos mediante la técnica de autorradiografía.II. FUNDAMENTOParte 1El ciclo de vida de la célula, visto almicroscopio, se divide en dos grandesfases, la interfase y la fase M, etapa dedivisión compuesta por la mitosis (divisiónnuclear) y la citocinesis (división delcitoplasma). A su vez, la interfase sesubdivide típicamente en las fases G1, S yG2. La fase S corresponde a la etapa deduplicación del ADN; la fase G1 es elintervalo entre la salida de la fase M y laentrada en fase S; y la fase G2 es elintervalo entre la fase S y una nueva fase M:La duración de estas fases es variable ydepende de distintos factores, en particular de la duración de G1.Al microscopio, las células en interfase se reconocen por la presencia de un núcleo que se tiñedifusamente, sin que sea posible individualizar cromosomas, aunque sí puede observarsedentro del núcleo un punto oscuro, el nucléolo.Por otra parte, la mitosis también se subdivide en etapas, claramente distinguibles almicroscopio:Profase. La cromatina en el núcleo comienza a condensarse en cromosomas bien definidos,visibles al microscopio. Cada cromosoma se ha duplicado y consiste en dos cromátidashermanas. Cada una de ellas posee una región especializada, el centrómero, y amboscentrómeros las mantienen apareadas. Hacia el fin de la profase los microtúbuloscitoplasmáticos se desensamblan y reensamblan para formar el huso mitótico.Prometafase. La prometafase comienza con el desensamblaje de la envoltura nuclear. Losmicrotúbulos del huso mitótico pueden entrar ahora a la región nuclear. En los centrómeros,comienzan a formarse complejos proteicos denominados cinetocoros. A ellos se adhieren partede los microtúbulos del huso, y permiten que los cromosomas empiecen a moverse. Estosmicrotúbulos reciben el nombre de microtúbulos cinetocóricos, mientras que los restantesmicrotúbulos del huso mitótico se denominan microtúbulos polares (los que crecen alejando loscentros polares) y astrales (que interactúan mediante proteínas con la envoltura tirando de loscentros polares).Metafase. Los microtúbulos cinetocóricos desplazan a los cromosomas a lo largo del huso yterminan por alinearlos en la línea media del huso mitótico, la placa metafásica. Estaorganización ayuda a asegurar que en la próxima fase, cuando los cromosomas se separan,cada nuevo núcleo recibirá una copia de cada cromosoma.Anafase. La anafase comienza cuando los cinetocoros en cada cromosoma se separan,permitiendo que las dos cromátidas hermanas se desapareen y se desplacen hacia polosopuestos. A partir de este momento cada cromátida pasa a ser considerada un cromosoma. Elmovimiento de los cromosomas se divide en dos etapas. Durante la anafase A, losmicrotúbulos cinetocóricos se acortan, acercando los cromosomas a los polos del husomitótico. Durante la anafase B, los microtúbulos polares se alargan, aumentando la separaciónentre los polos.La citocinesis usualmente comienza en esta fase y luego continúa durante la telofase.Telofase. Una nueva envoltura nuclear se forma alrededor de cada grupo de cromosomashijos, que vuelven a descondensarse y dejan de ser visibles al microscopio óptico. En célulasvegetales, se puede observar en esta fase una estructura denominada fragmoplasto en elespacio entre ambos núcleos, y es el precursor de la nueva pared celular que va a separar alas células hijas.
  31. 31. Una población de células que se dividen activamente puede clasificarse en: Población sincrónica, en que las células van atravesando las distintas etapas del ciclo a lavez, y en particular se dividen al mismo tiempo. Las células de los embriones tempranos de lamayoría de los animales son un ejemplo de población sincrónica. Población asincrónica, las células atraviesan el ciclo desfasadamente, y a cada momentopueden encontrarse células en todas las etapas del ciclo celular.Estrategia experimentalEl análisis de los parámetros de la cinética celular ha sido objeto de intenso estudio,principalmente debido a sus implicaciones en el desarrollo de terapias para el cáncer. En estaactividad práctica introduciremos algunos conceptos clave para el análisis de estos parámetros.El índice mitótico de una población celular es la proporción de células en mitosis que hay enesta población:IM = nº de células en mitosis / nº de células totales.En una población asincrónica, el número de células en mitosis va a depender de la proporciónque ocupe la mitosis dentro de la duración del ciclo celular. Por ejemplo, si para ciertapoblación celular la mitosis ocupa un 5 % del total del ciclo celular, cabría esperar, porprobabilidad, que aproximadamente un 5 % de las células estuviera en mitosis en un momentodado. A la inversa, al obtener el índice mitótico de una población celular asincrónica, se obtienela proporción que ocupa la mitosis dentro del ciclo celular para esa población. Además, puestoque en la mayoría de las células la mitosis dura aproximadamente una hora, conocer el índicemitótico permite calcular la duración total aproximada del ciclo celular. En el ejemplo anterior, elciclo celular duraría 20 horas (1 hora * 100/5).La población celular que utilizaremos en la parte 1 es un meristemo de raíz de cebolla. Unmeristemo es un tejido vegetal no diferenciado, en el cual las células se dividen activamentepara luego diferenciarse, y por lo tanto es ideal para reconocer células en interfase y endistintas etapas de la mitosis, así como para calcular el índice mitótico.Parte 2La autorradiografía es una técnica que permite localizar en tejidos y células un isótoporadiactivo, que puede haberse incorporado de diversas maneras. Consiste en cubrir al tejido océlulas que contienen al isótopo radiactivo con una delgada capa de emulsión fotográfica,dejándolo en oscuridad por un cierto tiempo, para que la emulsión quede expuesta a laradiación emitida por el espécimen. La emulsión que se encuentra exactamente arriba de laszonas que poseen radiactividad va a velarse, y luego del revelado se van a ver al microscopiocomo granos oscuros.En la tabla I del protocolo de actividades prácticas, se muestran datos obtenidos medianteautorradiografía.Un cultivo de células de mamífero en crecimiento rápido fue incubado por 30 minutos con 3H-timidina. La timidina es la base timina unida a desoxirribosa, y es un precursor del ADN. La 3H-timidina contiene tritio, el isótopo radiactivo del hidrógeno. La 3H-timidina va a incorporarse alADN de las células, pero sólo al de las células que estén en la fase de síntesis de ADN, esdecir en la fase S del ciclo celular.Luego de la incubación, la 3H-timidina fue removida del medio de cultivo y se extrajeronmuestras a intervalos regulares de 3 horas, que fueron procesadas para autorradiografía.Posteriormente, las muestras fueron teñidas con hematoxilina, para visualizar los núcleos delas células que no incorporaron timidina marcada. En cada muestra, se contó el número decélulas mitóticas, y se las clasificó en marcadas y no marcadas, calculándose el porcentaje demitosis marcadas sobre mitosis totales, tal como aparece en la tabla. Por último, se graficó esteporcentaje en función del tiempo.Para entender cómo puede obtenerse la duración de las fases del ciclo celular a partir de estetipo de gráfico, consideraremos una situación simplificada.Un cultivo celular típico es una población asincrónica, en la que las células entran y salen de lafase M a distintos tiempos. Más aún, la duración de cada fase, en particular G1, va a serdistinta para cada célula. Para hacer más sencillo el análisis, consideraremos una poblaciónasincrónica, pero en la cual las fases del ciclo celular duran lo mismo para todas las células.También asumiremos que la fase M es tan corta comparada con las demás fases que puedetomarse como instantánea. La pregunta a resolver es: ¿qué forma tendría una gráfica demitosis marcadas sobre mitosis totales en función del tiempo, en esta situación?
  32. 32. Veamos en primer lugar como se distribuyen las células a T0, o sea al final del pulso de 3H- timidina: A este tiempo, las células marcadas están todas en fase S, porque sólo las células que sintetizan ADN pueden incorporar 3H-timidina y marcarse. Por lo tanto, a T0 el porcentaje de mitosis marcadas será igual a 0. Cuando las primeras células marcadas lleguen a la fase M, a T = T1, la distribución será la siguiente:Como las células atraviesan el ciclo a la misma velocidad (porque la duración de cada fase esigual para todas), cuando las células marcadas llegan a fase M, las células que a T0 estabanen G2 ya pasaron la fase M y ahora están en G1. Por lo tanto, a T1, en fase M solo hay célulasmarcadas, y el porcentaje de mitosis marcadas es 100%. A medida que vayan llegando célulasmarcadas a fase M, el porcentaje de mitosis marcadas se mantendrá en 100%.Cuando la última célula marcada salga de fase M, a T = T2, el porcentaje de mitosis marcadasvolverá a caer a 0. Eventualmente, a T = T3, las células marcadas volverán a llegar a fase M,repitiéndose el esquema correspondiente a T1.Por lo tanto, la gráfica de mitosis marcadassobre mitosis totales en función del tiempo,para esta situación, tendrá la siguiente forma: Una serie de picos regulares…El 100% de mitosis marcadas se alcanza a T1, cuando las primeras células marcadas llegan afase M. A su vez, las primeras células marcadas en llegar a fase M son células que a T0
  33. 33. estaban al final de la fase S, y por ende sólo les queda recorrer G2 para llegar a fase M (veresquema a T = T0). Por lo tanto, en este gráfico, T1 -- T0 es igual a G2.El 100% de mitosis marcadas se mantiene hasta que llegan a fase M las últimas célulasmarcadas. Estas son células que a T0 estaban al comienzo de S. Por lo tanto, el tiempo quetranscurre entre que llegan a fase M las primeras y las últimas células marcadas es igual a laduración de la fase S. Este tiempo es igual a T2 – T1.Por último, el tiempo entre T1 y T3 es igual a la duración total del ciclo celular, ya que es eltiempo entre dos fases M para las mismas células.En suma, de esta gráfica se obtienen la duración de G2, de S y del total del ciclo celular. Siconocemos la duración de la fase M (en general igual a 1 hora), podemos además obtener laduración de G1.En resumen, la idea básica es usar la mitosis como una ventana y observar a la cohorte decélulas marcadas con timidina tritiada pasar por ella.El análisis de la gráfica obtenida con los datos de la tabla I es muy similar, pero debeconsiderarse el efecto de la variación del ciclo celular y sus fases dentro de la poblacióncelular. El efecto gráfico que produce esta consideración es una curva suavizada de unaoscilación amortiguada. El problema biomatemático que se suscita es cómo obtenerinformación de los parámetros celulares a partir de éste gráfico.El propio Henry Quastler, pionero en el análisis autorradiográfico del ciclo celular también fue elpadre del concepto de utilizar las intersecciones de la curva con el 50% de las mitosismarcadas/mitosis totales como un estimador de las duraciones medias de las fases del ciclo.Este es el método que se utilizará en clase. Sin perjuicio de ello, debe saberse que en loscasos en que el segundo pico no alcanza al 50% se debe recurrir a modelos matemáticoscomplejos que están fuera de la órbita de este curso.Como verán en la parte práctica, para poder obtener una curva de la que se puedanestimar los tiempos de las etapas del ciclo celular se deberá, previamente, sincronizar lapoblación celular. Hablamos de sincronizar una población asincrónica cuando logramosque todas las células se encuentren en la fase M en un determinado momento.Parte 3Análisis de parámetros del ciclo celular mediante citometría de flujoCuantificación de ADN Para determinar rápidamente parámetros del ciclo de una población celular puede utilizarse citometría de flujo. Un método clásico consiste en incubar a las células (vivas o fijadas y previamente permeabilizadas) con ioduro de propidio (PI), un agente que se intercala en el ADN de forma estequiométrica y emite fluorescencia cuando es excitado con una determinada longitud de onda. El material teñido es entonces medido en el citómetro de flujo, y la señal fluorescente genera un pulso electrónico en los detectores con una altura (amplitud) que es proporcional a la emisión de fluorescencia total de la célula. La clave para esta interpretación es que la célula incorpora una cantidad de colorante proporcional a su contenido de ADN. Utilizando estándares adecuados, con contenidos diploides conocidos como eritrocitos de pollo, se puede determinar la ploidía de las células de interésDeterminación de parámetros cinéticos del ciclo celular (análisis multivariado)El análisis cuantitativo de ADN es ampliamente utilizado para estimar la distribución de lasfases del ciclo celular. Sin embrago, este tipo de análisis no aporta información citodinámicacomo la duración del ciclo o el tiempo de tránsito entre las fases. Estos parámetros puedendeterminarse utilizando autorradiografía y determinando la cantidad de mitosis marcadas, omediante técnicas más modernas de marcaje de células que están sintetizando ADN.Fase S
  34. 34. Uno de los abordajes más utilizados es la incorporación en el medio de cultivo de un nucleótidono radiactivo, la bromodesoxiuridina (BrdU), un análogo de timidina que puede ser identificadomediante el uso de anticuerpos anti-BrdU conjugados a una molécula fluorescente. Lacitometría de flujo permite la medición simultánea de la cantidad de BrdU incorporado y delcontenido de ADN en cada célula, permitiendo realizar el seguimiento de un grupo de células através del ciclo.Fase MLa histona H3 es fosforilada durante la mitosis entre la profase y la anafase tanto mitótica comomeiótica, y por tanto su fosforilación puede ser utilizada para determinar la cantidad de célulasque se encuentran en fase M. Para ello se utiliza un anticuerpo conjugado a un fluorocromo (enel ejemplo, Alexa-647) capaz de unirse sólo a la forma fosforilada de la histona H3.Combinando esta técnica con la tinción de ADN, es posible discriminar las células que seencuentran en fase M de la región G2M, y por consecuencia también aquellas que seencuentran en G2, como se muestra en las siguientes gráficas.III. PROCEDIMIENTOS1. Mitosis en cebolla Preparación de la cebolla Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud. Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5 Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida. Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale Observar al microscopioIV. CUESTIONARIO. 1. Describa los observado en práctica
  35. 35. PRACTICA N°8 DESARROLLO EMBRIONARIOI. OBJETIVOS Introducción al estudio de algunas etapas del desarrollo embrionario temprano y análisis comparado de tipos de ovocitos, patrones de segmentación y gastrulación en los distintos modelos. Integración de conceptos de estructura y dinámica celular utilizando como modelo el desarrollo. Introducción al análisis de problemas fundamentales de la biología del desarrollo.II. FUNDAMENTO1. SEGMENTACIÓN:El desarrollo de un organismo multicelular, luego de la fecundación, ocurre mediante unproceso denominado clivaje o segmentación (serie de divisiones mitóticas que dividen alcitoplasma del cigoto en numerosas células más pequeñas, las blastómeras). El patrón desegmentación embrionaria está determinado principalmente por 2 parámetros: 1) factoresgenéticos que establecen el ángulo y momento de formación del huso mitótico y 2) la cantidady distribución del vitelo.En general, el vitelo inhibe la segmentación; el polo animal del embrión se encuentrarelativamente libre de vitelo y su opuesto, el polo vegetal, es rico en éste.De acuerdo a la cantidad de vitelo que presentan, los ovocitos se clasifican en: oligolecitos(poca cantidad de vitelo, generalmente con distribución homogénea (isolecito)), mesolecitos(cantidad moderada de vitelo distribuido hacia el polo vegetal) y telolecitos (abundantecantidad de vitelo que ocupa prácticamente todo el volumen ovocitario). El patrón desegmentación en embriones provenientes de ovocitos isolecitos y mesolecitos es holoblásticoo total y en embriones provenientes de ovocitos telolecitos es meroblástico o parcial.Hacia el final de esta primera etapa del desarrollo embrionario ocurre la formación de unacavidad dentro de la masa de blastómeras en división denominada blastocele. El embriónresultante se conoce como blástula.2. GastrulaciónEs un proceso de movimiento celular que involucra a todo el embrión y resulta en laorganización de las 3 hojas embrionarias: ectodermo (capa celular externa), mesodermo(capa celular intermedia) y endodermo (capa celular interna).Aunque el patrón de gastrulación es variable dependiendo de la especie, usualmente involucrauna combinación de los siguientes tipos de movimientos básicos:- invaginación: plegamiento de una capa de células hacia el interior del embrión.- involución: movimiento de una capa de células utilizando otra como sustrato hacia el interiordel embrión.- ingresión: migración de células individuales hacia el interior del embrión.- delaminación: generación de una capa de células que se desprende a partir de otra capa celular.- epibolia: expansión de una capa celular sobre otras células o capas.III. PROCEDIMIENTO.1. OBSERVACIÓN DEL DESARROLLO EMBRIONARIO DE ANFIBIOS Preparar la muestra eliminando todo tipo de impurezas. Llevar a un portaobjetos y observar en el microscopio o con ayuda de la lupaIV. CUESTIONARIO 1.- ¿Cuáles son las 4 grandes etapas del desarrollo embrionario? 2.- ¿Cómo afecta el vitelo la segmentación del cigoto? 3.- ¿Qué es la medialuna gris y qué vinculación tiene con las etapas posteriores en el desarrollo de los batracios? 4.- Construya una oración que vincule los siguientes términos: gastrulación, blastoporo, células en botella, invaginación. 5.- ¿Cuál es el nombre de las células que ingresan al inicio de la gastrulación en erizo de mar? Estas células formarán un anillo que marca el sitio donde se inicia la formación
  36. 36. del_________________________ por invaginación de la _________________________________.6.- ¿Cómo se denomina la región del cigoto de batracios que se forma al ingresar elespermatozoide, opuesta a su entrada, que se produce debido a una rotación deaproximadamente 30º en el citoplasma cortical? Ésta región determina el sitio donde seformará el _________________ ___________________ del blastoporo.
  37. 37. PRACTICA N°9 MEIOSIS I. OBJETIVOS Reconocer y diferenciar los estados fisiológicos por los que atraviesan los cromosomas durante el proceso meiótico en células animales II. FUNDAMENTO La meiosis es un proceso celular, ligado a la reproducción sexual, por el cual, la célula madre de naturaleza diploide, da origen a los gametos de naturaleza haploide, de tal manera que en la fecundación se re establece el número diploide de cromosomas. Así, mientras la mitosis es un proceso de división celular con formación de dos núcleos hijos con el mismo número de cromosomas que la célula original, en la meiosis en cambio hay dos divisiones celulares con reducción del número de cromosomas a la mitad. La meiosis es un proceso citológico que comprende dos divisiones celulares. En la primera división meiótica ocurre una serie de intercambios de material genético entre los cromosomas homólogos. Este fenómeno es un proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y comprensión, se distinguen los estadios: Leptoteno, Cigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinesis. Entre latelofase I y el comienzo de la segunda división meiótica, a diferencia con la mitosis, no hay un período desíntesis y duplicación del ADN, por lo demás la división meiótica II, tiene lugar como la mitosis normal encada una de las células haploides (meiocitos de segundo orden), resultantes de la división meióticaIII. PROCEDIMIENTO. 1. MATERIALES Y METODOS Un excelente material para la observación de los procesos de división celular lo constituyen insectos de la especie Grillos asimilis “grillo domestico” y Laplatacris sp “langosta”. En los individuos machos debe recuperarse el testículo después de la disección en el que se estudiará la meiosis en células de maduración (espermatocitos) de la zona proximal al canal deferente. El material a usar en el presente ejercicio es el siguiente: -Microscopio -Mechero de alcohol -Cloroformo -Carmín acético -Carnoy -Solución salina 0.7% -Placas petri -Laminas, laminilla - Algodón -Papel filtro -Estilete de punta fina Anasteciar los animales en las placas petri, colocando dentro de un pedazo de algodón embebido en cloroformo. Disecar el animal con la ayuda del estereomicroscopio o lupas, colocándolo en posición dorsal.Separar los testículos adicionándoles la solución salina procurando no exponer los órganos al airepara evitar posibles desecaciones. Seccionar los testículos en partes pequeñas de 2 a 3 mm y colocarlos en un vial con fijador carnoypor espacio de 30 min. Traspasar los fragmentos a una luna de reloj que contiene carmín acético y lleve al calor delmechero hasta que entre en ebullición por espacio de 15 segundos de 5 a 7 veces. Retire el fragmento del testículo con una pinza de punta fina y colóquela sobre un portaobjetos yagréguela una gota de carmín acético. Tape la preparación con una laminilla cubre objetos y sobre esta ponga un papel absorbente.Presione el cubre objetos con la yema del dedo pulgar y luego con la extremidad plana de un lápizpresionar un poco mas fuerte hasta convertir el material del porta objetos en una capa delgada(squash). Al realizar esta operación, tenga cuidado para no romper el cubre objetos.
  38. 38. Limpie el exceso de colorante del porta objetos con papel higiénico y lleve el preparado almicroscopio para su observación a menor y mayor aumento. Observar y esquematizar.IV. CUESTIONARIO
  39. 39. PRACTICA N°9 FECUNDACIÓNI. OBJETIVOS Identificar gametos masculinos y femeninos en erizo de mar.- Evidenciar el proceso de la fecundación.II. FUNDAMENTO La fecundación es el proceso de unión del óvulo y el espermatozoide, y en virtud de la cual se origina el cigoto o célula huevo. La fecundación en la especie humana es interna, pues se lleva a cabo en el interior del aparato reproductor de la hembra, concretamente en las trompas de Falopio. En esta práctica se observará el proceso de fecundación entre un gameto masculino(espermatozoides) y un gameto femenino (ovulo), en erizo de mar. Se podrán observar los gametos o Células reproductoras masculina y femenina, cuyo núcleo sólo contiene un cromosoma de cada par. El óvulo es una célula redonda de gran tamaño. Posee un núcleo donde se alojan los cromosomas portadores de la información genética materna, y un citoplasma que posee sustancias nutritivas para alimentar al embrión en sus primeras etapas, en el caso de que ocurra la fecundación. El espermatozoide, o gameto masculino, es una célula pequeña con capacidad de movimiento para poder alcanzar al óvulo. Según donde se encuentren el espermatozoide y el óvulo, existen dos tipos de fecundación: a) Fecundación EXTERNA, cuando tanto el macho como la hembra liberan sus gametos al medio externo, que es el agua, de manera que los espermatozoides nadan en el agua hasta encontrar a los óvulos. Es lo típico de todos los animales invertebrados acuáticos, y en los vertebrados se da en los peces y en los anfibios

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