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Practica n 2

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  • 1. PRACTICA N°2 MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULAI. OBJETIVOS Que el alumno conózcalas técnicas de estudio celular Practicar y dominar las técnicas de estudio celularII. FUNDAMENTOClasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandesgrupos:1) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionaresta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son: a) Centrifugación b) Cromatografía c) Electroforesis d) Cultivos "in vitro"2) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer como es suforma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente: a) Microscopia óptica b) Microscopia electrónica Microscopio electrónico de Trasmisión (MET) Microscopio electrónico de barrido (MEB)1) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULASe utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias queconstituyen la materia viva.Presentan dos problemas principalmente:a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de unagran complejidad.A) CENTRIFUGACIÓNConsiste en la separación de los componentes de unamezcla en función de las diferencias entre lasvelocidades que presentan al someterlos a elevadasaceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar lamezcla en un rotor a un gran número de vueltas porminuto. Los aparatos empleados con este fin sedenominan ultracentrifugas.Esta técnica requiere los siguientes pasos:1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACION: Elmaterial biológico, por ejemplo: un fragmento de tejidodel hígado, es triturado para disgregarlo y romper lasmembranas celulares.La rotura de las membranas deja en libertad losorgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si lahomogeneización se realiza suavemente, los orgánulospermanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla"que estará compuesta de restos de membranas,orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.2) CENTRIFUGACION: Las ultracentrífugas sonmaquinas que consiguen velocidades de rotación muyelevadas, hasta 500.000 v/mn. Los materiales biológicossometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia elfondo de los recipientes que los contienen convelocidades que dependen de su masa, de su forma yvolumen, y de la naturaleza del medio en el que serealice la centrifugación.B) CROMATOGRAFÍASe fundamenta en la separación de los componentes deuna mezcla por sus diferencias de absorción. Estasdiferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van derWals que se establecen entre los componentes de lamezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria.
  • 2. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremoslos siguientes tipos de cromatografía: 1) CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL: Se emplea para la separación de sustancias químicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedara embebida. A continuación se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazara por capilaridad y los ira arrastrando. Los componentes de la mezcla viajaran más o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos grandes con las moléculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas específicas. 2) CROMATOGRAFIA DE GASES: Consiste en un serpentín largo y delgado cuyas paredes están impregnadas de un liquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos, azucares u hormonas. C) ELECTROFORESIS En este método, la mezcla a separar se deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o también gel de almidón). A continuación seestablece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias quecomponen la mezcla se desplazaran en función de su carga eléctrica.Naturalmente este método se empleara con sustancias que presenten cargas eléctricas(proteínas y ácidos nucleicos)D) CULTIVOS IN VITROEstos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismoen condiciones favorables a su multiplicación.La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y suestandarización.Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condicionesfísicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no soncapaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cadatipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo.2) MÉTODOS MORFOLÓGICOSEl ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre si 0,2 mm. Este es elpoder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellasdetalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder deresolución del ojo.CLASES DE MICROSCOPIOSA) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICOA1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos deDe Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Comoondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al serpartículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes.En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un haz
  • 3. de electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre elcátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primeralente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra.Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Unatercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen finales proyectada sobre una pantalla o fotografiada.Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 mde alto y llegan a pesar 500 kg. FIJACION. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los mas corrientes son el tetroxido de osmio (OsO4), el formaldehido (HCHO) y el permanganato potásico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan mas los metales aparecerán mas oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado. DESHIDRATACION e INCLUSION. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte. CORTE. Los cortes se realizan mediante ultra micrótomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observación al microscopio.A2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar.Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplicaobtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se formanson captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estosmicroscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscopicas, sinembargo su aumento no suele pasar de 20.000.B) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICOFunciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primeralente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar.Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagenaumentada de este. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por elobjetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.PREPARACION DEL MATERIAL:CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominadosmicrotomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor,corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse enparafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.FIJACION. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible,para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismocelular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustanciasquímicas (por ejemplo: formaldehido y tetroxido de osmio).DESHIDRATACION. La extracción del agua del interior de las células permitirá tambiénuna mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material aobservar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución iránextrayendo el aguaTINCION. Es la coloración de las células o de partes de estas para que resalten yposibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partesconcretas de la célula.MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre unporta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y"cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y solosirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayorduración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.III. PROCEDIMIENTO
  • 4. ANEXO DE PRÁCTICA: MICROSCOPIAI. OBJETIVOS Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos.II. FUNDAMENTOUna célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño máspequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñasy para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Unalente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentosmayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores sedesarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes quelogran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otroobjetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de loscomponentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo delmicroscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio selocaliza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia lamuestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee unorificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos quepermiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo sedisponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio(macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poneren foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde seencuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada unade las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde selocalizan elementos del sistema óptico.La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y laocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de lafuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee untornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptimailuminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz queatraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentesocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante. Figura 1: Esquema del funcionamiento de un microscopio compuesto. La luz proveniente de una fuente pasa a través de una lente condensadora y luego atraviesa al espécimen localizado en el soporte o platina del microscopio. La lente objetiva forma luego una imagen real (es decir que puede ser proyectada en una pantalla) intermedia que se proyecta justamente en el diafragma fijo de la lente ocular. Esta imagen es posteriormente aumentada aún más por la lente ocular generándose una imagen virtual (no puede ser proyectada en una pantalla) invertida del objeto que es percibida por el ojo como si estuviese a 2.5 cm de distancia.Características de las lentes objetivas:La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal(primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar una
  • 5. imagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberracionesópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de todalente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidades plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción delas diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se veanborrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración sedenominan planapocromáticas.La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como sumagnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de unmicroscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas paraproyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacerúnicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lentedurante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominanparafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes,por lo cual se denominan paracentrales.Iluminación:Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizandotanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme entoda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema deiluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuentegeneradora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localizaexactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera unhaz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma delcondensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando laposición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también laapertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz selocalice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas deiluminación de la muestra.La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, estoes una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles delmismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayorserá la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprenderentonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en laimagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta noaportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil paratransformarse en “magnificación vacía”.Límite de resolución:El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntospara ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es
  • 6. de 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm seránpercibidos por el observador como un único punto. La capacidad de distinguir (separar) detalles pequeños será entonces el poder de resolución del microscopio. Teniendo en cuenta esta definición, el poder de resolución de un microscopio aumenta cuando lamínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. Ellímite de resolución de una lente puede calcularseutilizando la ecuación de Abbe:Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es laapertura numérica, la que se calcula como:AN = Ƞ. sen θ.La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente(2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva (Ƞ) (figura 3).Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de granapertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre elespécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva.Considerando las ecuaciones anteriores es evidenteque existen tres maneras de modificar el límite deresolución de una lente: variando la longitud de ondade trabajo, variando el índice de refracción, y elángulo del cono de luz que incide sobre la muestra.Trabajando con longitudes de onda cercanas alvioleta (ver apéndice), se logra el mejor poder deresolución, es decir valores de límite de resoluciónpequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo delcono de luz que incide sobre la muestra puedevariarse la distancia del condensador al objeto o eldiseño del condensador. Para variar el índice derefracción, lo que se hace es modificar el elementoque está en contacto con el objeto y con la lenteobjetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, eldel agua es 1.33 y el del aceite y vidrio esaproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivoutilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva,se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la lente. Figura 4: Principio de trabajo de lentes de objetivas de inmersión en aceite. La presencia de aceite en el espacio comprendido entre el cubreobjetos y la lente objetiva, incrementa el número de rayos provenientes del espécimen que son captados por la lente objetiva.En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de granapertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentescon aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo conlentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminuciónde la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajodel plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que ladistancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor aperturanumérica (pues θ es mayor).
  • 7. 2) Microscopía de contraste de fase:Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de lamuestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución delmicroscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantenerinalterada la muestra, sin teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contrastenatural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz através de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojohumano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de unaforma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variabledependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerádel índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo quegeneralmente es de 1/4 λ.El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en losespecímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferenciasde amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido porun disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio.Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayosque atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillotransparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo delobjetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lenteobjetiva en ese plano.El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entrelas ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que noson retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad,o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6).Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicosya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra paragenerar contraste.3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC):El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticosque ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractadautilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halosbrillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera unfalso volumen de la muestras (Figura 5).III. PROCEDIMIENTO1. Observación de célula vegetales: Realizar cortes Colocar una gota de agua en el portaobjetos y observar2. Observación de células animales Colocar una gota de sangre en el portaobjetos realizar un barrido con el cubreobjetos y observar3. Observación de hongos Colocar una gota de agua en el portaobjetos, con el asa de siembra esparcir la muestra, colocar el cubreobjetos y observar
  • 8. IV. CUESTIONARIO1. Registre los aumentos (X) y las aperturas numéricas (AN) de las lentes objetivas instaladas en su microscopio. Aumento (×) Apertura numérica (AN) 2. En condiciones de observación con luz verde (λ = 550 nm) y usando la ecuación de Abbe, indique el mejor límite de resolución (LR) obtenible con su microscopio. Explicite los cálculos realizados. 3. Escriba los fundamentos de Microscopía de epifluorescencia. 4. Escriba los fundamentos de Microscopía láser confocal 5. Dibuje lo observado indicando el aumento correspondiente: 6. Escriba la ecuación de Abbe y explique brevemente su significado. 7. Explique brevemente el concepto de apertura numérica. 8. Explique la diferencia entre resolución y magnificación. 9. Identifique en el diagrama adjunto:
  • 9. PRACTICA N°3 PERMEABILIDAD CELULAR.I. OBJETIVOS Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células animales y vegetales. Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad y su importancia.II. FUNDAMENTO Las membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas (fosfolípidos) y proteicas (aproximadamente 5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. En microscopía electrónica de transmisión las membranas se observan como una estructura trilaminar debido a que la región ocupada por las cabezas de los fosfolípidos se tiñe con el tetróxido de osmio quedando electrón densa y la región hidrofóbica electrón lúcida. Una de las principales funciones que desempeñan las membranas es mantener las diferencias esenciales entre el medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables. Conceptos básicos: 1) Permeabilidad de membrana: - membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas. - membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula. - membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a distintas moléculas. 2) Tonicidad de una solución: - solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. - solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución. 3) Ósmosis: Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no ejercen la misma presión osmótica). 4) Osmolaridad: Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución. Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe con células vivas. 24 2) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAR Es el conteo de las células vivas Protocolo de obtención de células para (sanas) o muertas en una muestra. iniciar un cultivo primario (no será utilizado Generalmente los métodos de en clase) determinación de la viabilidad se basan - Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm en el análisis de dos parámetros: con 2 escalpelos en una gota de tampón salino actividad metabólica de la célula o (PBS, pH 7.2-7.4). integridad de membrana plasmática. - Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en Los métodos más comunes para tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA). evaluar la integridad de membrana y - Incubar 15min a 37ºC y agregue así determinar el índice de células aproximadamente 4 ml de medio de cultivo suplementado con suero. viables en una suspensión celular son - Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a los test de exclusión de colorantes fin de obtener una suspensión celular vitales (ej.: Azul Tripán). Las células homogénea. vivas, cuyas membranas celulares - Tomar una muestra de 500μl y agregar 500μl estén integras, excluyen a estos de solución de Azul Tripán diluida. colorantes en forma activa. El método - Observar rápidamente al microscopio del Azul Tripán pone en evidencia el montando una gota entre porta y cubreobjeto. Tampón fosfato salino (PBS) NaCl (8.0g), KCl (0.2g), Na2HPO4 (2.1g), KH2PO4 (0.2g), H2O (1litro). Sol. concentrada de azul tripán: 200mg de Azul Tripán en 50ml de agua destilada. Diluir 4 veces en PBS. Tripsina: enzima proteolítica no específica. EDTA: agente quelante de cationes divalentes
  • 10. funcionamiento de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática. Por este procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las células muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo previo a iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo optimizar las condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia de agentes terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos.III. PROCEDIMIENTO1. Morfología normal de eritrocitos y hoja de Elodea sp. Corte una hoja de Elodea sp. y monte entre porta y cubreobjetos Tome una gota de sangre y monte entre porta y cubreobjetos Observe al microscopio2. Comportamiento de las células vegetales frente a soluciones con diferenteconcentración de solutos Realice montajes de hojas de Elodea en soluciones de cloruro de sodio en diferentes concentraciones Observe al microscopio Luego de algunos minutos, vuelva a montar y observe al microscopio el Comportamiento de células animales (eritrocitos) frente a soluciones de diferente concentración.IV. CUESTIONARIO 1.- Exprese la presión osmótica en términos de la ley de vant Hoff. Justifique brevemente. 2.- ¿Qué es la osmolaridad? ¿Cómo puede determinarse experimentalmente? 3.- Describa de forma breve en qué consiste la regla de Overton 4.- Indique con una flecha hacia dónde se producirá el flujo de agua en los siguientes ejemplos. Justifique brevemente. 5.- ¿En qué se basa el método de determinación de la viabilidad celular con el colorante azul Tripán?