Tecnicas de inmunodiagnostico
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Tecnicas de inmunodiagnostico Tecnicas de inmunodiagnostico Document Transcript

  • TECNICAS DE INPORTANCIA EN EL INMUNODIAGNOSTICO.Información recopilada de interés veterinario.Por; Alba Miriam Poche CeballosLCV. UDCA1. AGLUTINACIÓN.Son técnicas más sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia deAc específicos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos asus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve asimple vista.Esta técnica puede ser:- Cualitativa: resultado positivo o negativo.- Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac.Título de Ac es la inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacciónde aglutinación.Dependiendo de la conformación del Ag, se pueden distinguir dos tipos básicos deaglutinación:1.1.1. AGLUTINACIÓN DIRECTA.Se utilizan Ag formes o particulados en suspensión (bacterias protozoos o esporas).Todos ellos exhiben determinantes antigénicos o epitopos en su periferia.Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un suero problema:
  • - REACCIÓN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos producirán la correspondiente aglutinación y formación de IC,evidenciándose mediante la aparición de un velo malla característico en el medio.- REACCIÓN NEGATIVA: sí no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Agparticulados sedimentan formándose un anillo o botón bien definido en el fondo deltubo o pocillo de reacción.2.1.2. AGLUTINACIÓN INDIRECTA.Para esta técnica se utilizan Ag particulado soluble sensibilizado (epitopos sobre unsoporte sólido inerte en solución). Se usan bolas de látex, carbón activo, bentonita,etc.1.1.2.1. AGLUTINACIÓN INDIRECTA EN PORTA.Se suele efectuar sobre un porta y no en tubo o placa, mezclándose una gota de látexsensibilizado y una gota de suero, verificándose la reacción en un tiempo muy corto(2-10 minutos).La reacción positiva se evidencia por la aparición de un moteado característico,ausente en la negativa. Normalmente la técnica es cualitativa, con resultado +/-; peropuede convertirse en cuantitativo, si la reacción se efectúa con diluciones seriadas.1.1.2.2. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA.Cuando en lugar de partículas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados(hematíes de carnero tanizados), como soporte de los Ag (hematíes sensibilizados), sedenomina HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI). Se efectúa en placa demicrotitulacion, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de laaglutinación directa.Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa paradeterminar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos.- PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA: detecta Ac contra el Ag Rh en la madre gestante.
  • - PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: detecta la presencia de IC sobre la superficie de loseritrocitos del recién nacido.1.1.3. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN.Una variante es la INHIBICIÓN DE LA HAMAGLUTINACIÓN (IHA), en la que los posiblesAc existentes en la muestra problema son neutralizados previamente, por lo que lalectura de resultados se interpreta en sentido contrario a la hemaglutinación:- REACCIÓN POSITIVA: presencia de botón.- REACCIÓN NEGATIVA: aparición de velo.Esta técnica se usa para diagnosticar microorganismos que por sí solos son capaces deaglutinar glóbulos rojos, como el virus de la rubéola. Sí en el suero del enfermo hay Accontra el virus de la rubéola, se produce un bloqueo de los virus y se inhibe laaglutinación. La ausencia de aglutinación se interpreta como POSITIVO, porque hay Accontra el virus de la rubéola.1.2. REACCIONES DE LISIS.Las reacciones inmunológicas que utilizan el complemento se basan en su capacidadlítica. Esta capacidad lítica esta disminuida en enfermedades autoinmunes, deficienciascongénitas y enfermedades infecciosas.La formación de IC conlleva en muchos casos la fijación de complemento. Esta fijaciónno es visible, pero puede revelarse al manifestarse alguna de las reacciones biológicasdel complemento (hemolisis).1.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.1.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLÍTICA (CH50).Es la principal prueba en el screning de los déficits del complemento
  • Se determina la concentración de suero que es capaz de producir la lisis del 50% de un preparado estándar deeritrocitos sensibilizados con Ac antieritrocitos. La prueba se efectúa en tubos o placas,de acuerdo con la siguiente metodología:a) Sensibilización de hematies de carnero, previamente lavados, por incubación conhemolisina de carnero (Ac antieritrocitos de carnero).b) Preparación de los sueros: se disponen tubos con diferentes cantidades de suero, alos que se añade un volumen determinado de hematies de carnero sensibilizados.Como control se dispone un tubo de lisis total, que contiene sólo hematiessensibilizados y agua destilada. Después de la incubación se efectúa la lectura en elespectrofotómetro.c) Interpretación de resultados:- Cada lectura se divide por la correspondiente a la lisis total y se multiplica por 100.- Se representa gráficamente los ml de suero (ordenadas) frente a los porcentajescalculados (abcisas) en un papel semilogarítmico.- Se determina por extrapolación el valor correspondiente al 50%, que será la cantidadde suero necesaria para lograr una capacidad hemolítica 50.1.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE.Es similar a la inmunodifusión radial simple, pero aquí se produce hemolisis (se formaun halo de hemolisis). Mide la actividad total de la vía clásica o CH100.1.2.1.3. OTROS MÉTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.Se usan para medir los componentes individuales del complemento por separado:- Nivel total: RIA, ELISA, nefelometría, turbidimetría.- Nivel funcional: hemolisis de eritrocitos sensibilizados o reacción enzimática con unsustrato que genera calor.1.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL COMPLEMENTO: REACCIÓN DEFIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (RFC).- Esta prueba se usa para detectar Ac o Ag.- El principio básico de una prueba de fijación de complemento es la activación y elconsumo (fijación) del complemento en presencia de una reacción Ag:Ac específica.- El sistema de detección usado es la lisis de GR en la presencia del antisueroespecífico para los GR (sistema hemolítico) si el complemento no se consume en lareacción Ag:Ac inicial.- En la mayoría de las reacciones Ag-Ac, el complemento se une al complejo y esusado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeñas deAcs. La concentración que detecta es de mgr/ml.- Su ejecución requiere de gran cuidado y buenos controles.- Se hace en dos etapas: la fijación del C’ y el revelado de la reacción con el sistemahemolítico.Las fases de la técnica:
  • a) Se añade una cantidad determinada del Ag específico de aquellos Ac que se pretende detectar. si hay Ac enel suero problema, se unirán a los Ag y se forman IC.b) Se añade el complemento a la mezcla. Sí hay IC, éstos fijaran el complemento y seconsumirá. En caso contrario, el complemento quedara libre.c) Se añade el sistema revelador de la reacción o sistema indicador, constituido poruna mezcla de células indicadoras (eritrocitos de carnero) y una cantidad de Acsubaglutinante (Ac antieritrocitos de carnero).d) Lectura de la prueba:- REACCIÓN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumió en lareacción inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.- REACCIÓN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumió en lareacción inicial. Indica la ausencia de Ac en el suero problema.La prueba suele efectuarse en placas de plástico y realizando un banco de dilución parahallar el título de Ac (ultimo pocillo en el que la reacción es positiva). Hay que realizarcontroles porque los IC y algunos Ag bacterianos pueden fijar el complemento.
  • 2. FLUORESCENCIAEs el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas(fluoróforos)1°:Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a unfluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito(típicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puedeinteraccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energía de S1’ esparcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que seemite la fluorescencia; no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno alfluoróforo al nivel S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado,la energía de este fotón es menor.La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (h?EX – h?EM) que esfundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión delfluoróforo permite distinguirse del background.2.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA- El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para moléculaspoliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por unespectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión. Elancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dosfluoróforos son detectados simultáneamente.- El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud deonda a la cual se excita. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud delespectro de excitación a la longitud de onda de excitación.- Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen comoexcitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos deabsorción del fluoróforo.- Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general estánpróximos (l más cortas y l más largas respectivamente). Esto es importante en laelección de los filtros.
  • – La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia, aunque también de la fuente deexcitación (comúnmente un láser de ion argón, longitud de 488 nm) y de la eficienciade recolección del detector.- Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más deuna especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. Otrasseñales ópticas (como S2) quizás correspondan al background o a una segunda sondafluorescente.- La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtrosadecuados que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1.- Quenching de fluorescencia: En muestras biológicas el fluoróforo está en solución ypuede interaccionar con otras moléculas. Como consecuencia de esta interacción sepuede producir una perdida de emisión fluorescente. Es un proceso de desexcitatciónno radiativa provocado por una molécula ajena al fluoróforo (compuestos nofluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina“quenching” de la fluorescencia2.2. ELECCIÓN DEL FLUOROCROMO- La elección de un fluorocromo dependerá de una serie de factores. Si se necesita unúnico color el fluorocromo de elección será el FITC. El FITC es barato, tiene un altorendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico. La rápida pérdida de lafluorescencia bajo una intensa iluminación ultravioleta puede ser solucionado por elañadido al preparado de fenilendiamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivosson tóxicos para células vivas. El derivado triazínico de la fluoresceína, el dicloro-triazinilamino fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy similares al FITCpero es mucho más estable.- El segundo fluorocromo más popular es el isotiocianatotetrametil de rodamina(TRITC), que es mucho más fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensafluorescencia roja del TRITC es fácilmente distinguible de la verde del FITC. Debido aello por varios años fueros los dos fluorocromos de elección para experimentos con
  • fluorescencia combinada. La pérdida de la fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.2.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA- La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtroexcitador que sólo permite que pase la radiación excitada de la longitud de ondadeseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente delobjetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan yemiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz esenfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no serefleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de laradiación de excitación.- Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que nollegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.- Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l más largas. Barrera:Transparente a l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.2.3.1. FUNDAMENTO.Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo despuéseste conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos,
  • frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y seexpone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopiode inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o unaenzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia2.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS PORSUSTANCIAS FLUORESCENTESA) ConjugadosCompuestos fluorescentes + Anticuerpos = ConjugadosUn buen conjugado debe tener:- Fluorescencia intensa- Reacción específica con los antígenosDepende de:- Calidad y concentración de los Acs en el suero- Propiedades de la sustancia fluorescente- Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acopleTambién influyen:- Intensidad de marcación- Homogeneidad de marcación- Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadasB) Anticuerpos- Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar- Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales- Purificar la fracción de Ig a marcar- Verificar título de anticuerpos- Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente- Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.C) Fluorocromos-El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtración en geles. DisponibilidadfiltrosD) Intensidad de marcación- Fluorocromo puede ser conjugado en un número variable a cada molécula deproteína, resultando diferentes grados de marcación.- Mayor intensidad de marcación, mayor intensidad- Marcación excesiva:
  • - Disminución del PI de las proteínas- Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas defluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo)- Quenching de fluorescencia (disminución del rendimiento de emisión)E) Homogeneidad de marcación- Altamente marcadas: Fluorescencia inespecífica- Medianamente marcadas: Resultados más satisfactorios- Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa2.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA2.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO. Ac Policlonal Ac Monoclonal Pool de Ac monoclonalesFuerza de señal Excelente Regular a Buena ExcelenteEspecificidad Buena, pero a Excelente pero con Excelente veces el posible reacción cruzada background es altoVentajas Señal fuerte Específico Señal fuerteDesventajas No renovable Baja señal Específico Background Disponibilidad Se necesita titular2.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE. Es una técnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac específicos en el suero. En esta técnica la visualización del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que recibe el nombre genérico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son formes o partículas (cortes de tejidos, bacterias, parásitos o cortes de parásitos, etc).2.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).
  • Se añade la solución de Ac fluorescente sobre el Ag, previamente fijado en un porta o placa, se incuba, se lava y seleen los resultados.2.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego seañade el anti-Ac fluoresceinado contra la región Fc del primero, se lavan y se leen losresultados.Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedadesautoinmunes.2.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA PORCOMPLEMENTO.Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, después deañadir el Ac, se añade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se hanfijado los Ac. Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del complemento,una molécula de Ac puede fijar muchas moléculas de C3b al Ag, que se revelan con Acanti C3b fluoresceinado. Es una técnica mucho más sensible.En los tres casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observación del porta enun microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). Elpatrón de fluorescencia es característico de cada Ag.3. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICAHistoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método deanálisis empleado. En la práctica se emplea la palabra para designar el método juntocon el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicosen las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productosinsolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .A. PRINCIPIOS BÁSICOS.
  • 1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados pormedio de la fijación del tejido.- Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustanciashidrosolubles como el glucógeno.- Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico.Los fijadores más utilizados son:- Formaldehído para el MO .- Glutaraldehído para el ME.2. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión .3 .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPOQUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del colorproducido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.En este caso sepuede medir dicha sustancia con un histofotómetro.B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLEHISTOQUÍMICAMENTE.1. IONESIÓN DETERMINACIÓNHIERRO - EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERRO- CIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro férrico. - Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los tejidos .FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reacción se usa para el estudio del hueso.2. LÍPIDOS.Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDANNEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muyliposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico deenfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares.3. ÁCIDOS NUCLÉICOS.ÁCIDO DETERMINACIÓNNUCLÉICODNA Se usa la reacción de FEULGEN que consiste : - Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar. - El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso)
  • reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo. Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del núcleo.RNA Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.4. PROTEÍNAS.Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos.- Reacción de aminobenceno.- Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como lashistonas y protaminas.5. POLISACÁRIDOS.Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. En el caso de ser un polímero,antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere losazucares.La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). El ácido oxida a losazucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivode SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra lapresencia de:- Glucógeno en el hígado y músculo.- Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.- Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.- Glucoproteínas.Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.6. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendocompuestos fluorescentes.7. ENZIMAS. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertementecoloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática.ENZIMA DETERMINACIÓNFOSFATASA ÁCIDA Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 . La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble.Después se añade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado. Se usa para localizar lisosomas.DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.Eltetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.
  • Se usa para detectar mitocondrias.PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos, transfiriendo iones hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se reduce. Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.B. FLUORESCENCIA.Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada yemite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopía se suele usar la excitacióncon luz ultravioleta.1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.- Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A, riboflavina(B2) y lasporfirinas.- Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina quese une a los ácidos nucléicos:- DNA: fluorescencia verde amarillenta.- RNA: fluorescencia roja amarillenta.Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).2. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).Sirve para identificar proteínas especificas. Se basa en la reacción Ag-Ac. Al Ac se lepuede marcar con un compuesto fluorescente. Es la método más usado para ladetección de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.PREPARACIONES PERMANENTESDescribiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para elestudio al microscopio óptico. Con este instrumento los objetos se examinan portransparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente(mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”, sin fijar yteñir, como sucede en las preparaciones permanentes.Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son:1º. Fijación2º. Inclusión3º. Corte con microtomo4º. ColoraciónA. FIJACIÓN.- Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular.- Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.
  • - Tiene por fin endurecer los tejidos, volviéndolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la técnicahistológica.Hay que conservar la morfología y la composición química de loscomponentes de los tejidos.- Suele durar unas 12 horas.La fijación puede ser realizada por procesos:MÉTODO CARACTERÍSTICASFÍSICO - Calor, como en bacterilogía. - Frió, como en el criostato.QUÍMICO (uso de fijadores Fijadores:que inmovilizan las proteínasde los tejidos).Es la más - Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitanusada en Histología. proteínas. - Formaldehído, tetraóxido de osmio y glutaraldehído apenas causan coagulación y se usan en ME. Mezclas fijadoras: - Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial - Liquido de HELLY: dicromato potásico/cloruro de mercurio/formolEste paso es ESENCIAL, puesto que las proteínas son las principales responsables de laestructura celular y se degrada después de la muerte celular.Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de:- Glutaraldehído.- Tetraóxido de osmio.B. INCLUSIÓN.- Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortessuficientemente finos.- Las sustancias más usadas para este fin son:- GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.- RESINA EPOXI para la ME.Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de lainclusión:TRATAMIENTO CARACTERÍSTICASDESHIDRATACIÓN Se extrae el agua de los tejidos con baños de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%).ACLARAMIENTO O Sustitución del etanol por un liquido miscible enDIAFANIZACIÓN etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que dejan a la pieza translúcida.
  • INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN - Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC en el interior de una estufa. - Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina. - Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar. - Inconvenientes: - Destruyen muchas enzimas - Eliminan compuestos liposolublesC. CORTE CON MICROTOMO.- Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obteniéndosecortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente ydespués se llevan a un portaobjetos.- Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El materialse incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa unultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.- El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LASESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgánicos los eliminan. Usa nievecarbónica para congelar el tejido.- CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtenciónrápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Sonmuy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un materialpatológico.El criostato es también muy útil en histoquímica , pues no inactiva las enzimas, perodificulta la difusión de las moléculas.- MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. Secongela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.D. COLORACIÓN.- Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciablesunos de otros.- Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.- La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden aformar sales con los radicales ionizables de los tejidos.- Los componentes de los tejidos pueden ser:SUSTRATO COLORANTE EJEMPLOSBASÓFILO (tejidos que se BÁSICO (azul de toluidina y Nucleoproteínas ytiñen fácilmente con azul de metileno, glicoproteínas ácidas.colorantes básicos). hematoxilina).
  • ACIDÓFILO (tejidos que se ÁQCIDO (orange G, eosina y Proteínas básicas del tiñen fácilmente con la fuschina ácida). citoplasma. colorantes ácidos). La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica histológica. OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los componentes a los que se unen.TÉCNICA COMPONENTES NÚCLEO CITOPLASMA FIBRAS FIBRAS RETICULINA COLÁGENAS ELÁSTICASHematoxilina- Hematoxilina Azul - - Irregular -eosina Eosina - Rosa Rosa Irregular - Hematoxilina Negro - - - - férricaTricromoMasson Fuchina-ácida y - Rojo - - - Panceau Verde luz - - Verde - -Fuchina- Fuchina y - - - Púrpura -resorcina resorcinaImpregnación Sales de plata - - Castaño - Negroargéntica Los factores que influyen en la tinción son: - Pureza y concentración del colorante. - pH y temperatura. - Tiempo. E. METACROMASIA. Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul de toluidina, se modifica el color azul por unión al tejido, pasando a púrpura. A este fenómeno se le denomina metacromasia. Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos, como el azul de toluidina y tionina. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados cromotropos, son principalmente: - Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo. - Nucleoproteínas. F. MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS. Las técnicas de tinción pueden ser: - VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. Se inyecta al animal vivo.
  • - SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células o tejidos que permanecen vivos después de ser separados delorganismo.Ejemplos:- El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis.- El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.- El verde jano tiñe las mitocondrias.- La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio dela formación del hueso.G. CRIOFRACTURA.Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactosproducidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). Sirve para elexamen de cortes ultrafinos.Fases:1º. Congelar el tejido a temperatura muy baja.2º. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muybaja temperatura y en alto vacío, así se elimina el agua por sublimación. La superficiefracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversasestructuras de los tejidos.3º. Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa decarbono.4º. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar unaspecto sombreado.5º. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por unasustancia que no ataque el molde (ácido fuerte, hipoclorito sódico).6º. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.RADIOAUTOGRAFIASe basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienenbromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que sonalcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra almicroscopio óptico (MO).Fases:1º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio.2º. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica.3º. Dejar un período de exposición y revelar la película. Los puntos negros queaparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo.La cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y asípermite también la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia.
  • a) Técnica de emulsión liquida:- Se sumergen las preparaciones biológicas en la emulsión calentada y fundida.- Retirar las láminas y queda sobre su superficie una fina película de emulsión.- Secar y guardar al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura.- Proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas en una cámaraoscura.- Llevar al microscopio (ME ó MO).b) Aplicaciones: con el uso de isótopos radiactivos de C, H, N, S, P, es posible marcarlas moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De estaforma se localiza el proceso metabólico y su velocidad, como la secreción de gránulosde zimógeno.5. CITOMETRÍA DE FLUJO.5.1. FUNDAMENTOLa Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyofundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmentecélulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. Elimpacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden adiferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estosconvierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serándigitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una mismacélula.En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células puedenestar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célulaúnica. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujocontinuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente comoconsecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros quetípicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamañocelular.2. Dispersión de la luz ortogonal (sidescatter), proporcional a la cantidad deestructuras granulares o complejidad de la célula.3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
  • 5.2. ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJOLos citómetros de flujo están formados por complejos sistemas:A) El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hastaconseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los separadores celulares o“cellsorters”, se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme paraconseguir la separación de células individuales.B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducidopara impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente.Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:
  • - La óptica de excitación, compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz;- La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego dela interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtrospara direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que dejapasar hacia el detector. Estos pueden ser:- DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);- DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos:- Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640nm)- Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada (Porej: < 575 nm)- Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Porej: > 520 nm)C) El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos defluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue lacarga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para podersometerlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin, o sobre pocillosde cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células porcada muestra, y representar los resultados gráficamente.5.3. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJOBásicamente podemos obtener los siguientes datos:- El tamaño celular relativo ( ForwardScatter o FSC)- La complejidad interna o granularidad relativa (SideScatter o SSC)- Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)
  • A través de dos tipos de señales:A) Señales de dispersión.La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce uncambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio.Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz sonfundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granulardel interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dosfracciones de dispersión:-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la direcciónde la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional altamaño de la partícula que produce la dispersión.-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (SideScatter). Es proporcional a lacomplejidad de la estructura interna de la partícula.(WWW.CITOMETRIADEFLUJO.COM)B) Señales de Fluorescencia.Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes decomplejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula,siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de lacantidad de componentes fluorescentes de la partícula.5.4. ANÁLISIS DE DATOSEn general todos los citómetros presentan los datos en algunos formatos standard.- Histograma: según un parámetro.- Gráficos de puntos: Cualquier combinación de dos parámetros de los datos obtenidospara la población de células.
  • 5.5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJODebido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos,cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobrela arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, asícomo la ineracción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusosde los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas frenteal microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas, como:- Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y lamicroscopia de fluorescencia.- Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período detiempo (5000 partículas/segundo).- Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia.- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínimaresidual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normalescomo los basófilos.- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares.- Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizaren cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad.- Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular.5.6. QUÉ DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CÉLULAS UTILIZANDO UNCITÓMETRO DE FLUJO? A QUÉ VELOCIDAD?La iluminación de las células con luz LASER nos permite conocer el tamaño y lacomplejidad de los diferentes tipos de células. Si agregamos el uso de moléculasfluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. ácido desoxirribonucleico oADN, ácido ribonucleico o ARN, antígenos, etc.) se amplía enormemente susposibilidades de detección. Dichas sustancias fluorescentes, al ser iluminadas por la luzLASER, emiten señales lumínicas en diferentes longitudes de onda (que son captadaspor diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa información de laspropiedades de una población celular. En un citómetro convencional logramosinformación sobre al menos 5 parámetros (por ejemplo tamaño, complejidad,contenido de ADN, viabilidad celular y presencia o ausencia de antígenos). Lointeresante de esta metodología es que no sólo aporta muchos datos en formasimultánea, sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capazde analizar al menos 1000 células en solamente un segundo!Los citómetros de flujo de mayor complejidad son también capaces de clasificar a lascélulas que resulten de interés para el investigador. Entendemos por clasificar la
  • posibilidad de separar del resto a un conjunto de células que comparten una o varias propiedades y recolectarlasen un tubo, placa de cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios mássofisticados de una población de células similares, iniciar cultivos de un mismo tipocelular, etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separación de loscitómetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos decromosomas de la especie humana u otras especies. La obtención de suspensionescromosómicas de elevada pureza mediante citometría de flujo ha permitidoformidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtención desondas moleculares aplicables a diagnóstico citogenético de diversas patologías.Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos decélulas o cromosomas excede los objetivos de esta introducción. Basta mencionar quepara lograrlo se fragmenta la columna líquida en pequeñas gotitas haciendo vibrar laboquilla a más de 20.000 veces por segundo!. Luego de ajustes apropiados, se lograque cada gotita contenga una célula o cromosoma. Cuando el citómetro detecta unacélula o cromosoma de interés para clasificar, el aparato carga eléctricamente lacolumna liquida de forma tal que sólo la gota que contiene el evento de interés (célula)queda cargada. Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la célula hacia untubo recolector al ser desviada por un intenso campo eléctrico.5.7. QUÉ APLICACIONES TIENEN LOS CITÓMETROS DE FLUJO EN LAINVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA?El campo de aplicación de este tipo de instrumentos crece rápidamente día a día yaque son numerosas las áreas de la biología y medicina que se benefician de su uso.Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificación de las leucemias y los linfomasque permite alcanzar un diagnóstico preciso, permitiendo un tratamiento yseguimiento más adecuado y eficaz. Otra aplicación muy importante es el estudio delas poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana(VIH) causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permiteconocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capitalimportancia para el seguimiento de la evolución de la infección y el tratamientoadecuado para el paciente.El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones.En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios genéticos en poblaciones decélulas tumorales. La presencia de estos cambios tiene importancia en el prónostico dela enfermedad maligna. Dado el elevado número de células a analizar para realizarestos diagnósticos, el citómetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo deestudios. También es posible estimar si las células han sufrido cambios relevantes enel ADN, así como evaluar su nivel de proliferación ya que con frecuencia las célulasmalignas crecen con mayor rapidez que las normales. El citómetro es capaz decuantificar el grado de proliferación celular, es decir la tasa con que las células semultiplican. En el campo de la biología, la citometría de flujo se ha tornado el métodomás empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie, lo cuál esde suma importancia para estudios genéticos, evolutivos y biotecnológicos. A su vez,se pueden realizar estudios del nivel de ploidia, análisis cromosómicos y estudios deldaño del ADN.6. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.
  • Revelan la presencia de Ag o Ac mediante unareacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se mide por unareacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de losreactivos, en presencia del sustrato adecuado.El ELISA se basa en dos supuestos:- El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase sólida reteniendo su actividadinmunológica.- Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima, y el conjugado mantiene tantosu actividad inmunológica como enzimática.Los métodos inmunoenzimáticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones:- Localizar los constituyentes celulares.- Medición de pequeñas cantidades de componentes en los líquidos biológicos.- Detección de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa.6.1. ENZIMOINMUNOANÁLISISEl ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) se basa en la reacción de un Ac ode un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado(fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimática con ayudade sustratos específicos. Tipos de ELISAs:A) HOMOGÉNEOS: son en medio líquido y no se requiere la separación de los reactivos. La reacción sigue la ley de acción de las masas.A1) Ventajas:Más precisosEn general automatizados, se llevan a cabo sin entrenamiento especialA2) Desventajas:Son más costosos en reactivosEn general sólo sirven para fármacosB) HETEROGÉNEOS: se requiere separación entre el reactivo libre y el unido. Para ello,el Ag o el Ac están inmovilizados. El reactivo complementario difunde hacia él y se leune específicamente.B1) Ventajas :Menos interferencias, más específicos y sensiblesInstrumentación menos costosa
  • Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye ellímite de detección.Más versátiles en cuanto a tipo de analitoB2) Desventajas :Más difíciles de automatizarMayor tiempo de análisisLos métodos de ELISA HETEROGÉNEOS dependiendo de la actividad enzimática sedividen en dos tipos:- – Competitivos: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con elconjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia decolor en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzimaporque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.- – No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo queestá en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustratodesarrollando color.Dentro de los no competitivos tenemos:- – Los directos que detectan antígenos- – Los indirectos que detectan anticuerpos.
  • 6.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina,que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción(Ag o Ac).3. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos4. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en elposillo.5. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido6. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima7. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida9. Adición del sustrato10. Unión del sustrato a la enzima11. Generación de la señal. La última parte de un inmunoensayo en que la marca esenzimática es la cuantificación de la enzima. Métodos de detección:a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo.b) Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto fluorescentec) Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un producto luminiscente.12. Lectura del color en un lector de placas.13. Cuantificación en ELISA: curvas standard
  • 6.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato dela enzima utilizada:d) Puede generar productos coloreados y solubles que se miden porespectrofotometría.- En presencia de agua oxigenada, los cromógenos usados para la peroxidasa sereducen y dan productos solubles y coloreados. Los sustratos son la o-dianazina, o-fenilenodiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), ácido- 2,2-acino-di-(3-etil)benzatiazolina-6- sulfónico (ABTS).- Cuando queremos un precipitado, se usa para revelar la reacción a la peroxidasa ydiaminobenzidina, que generan un precipitado de color café.- La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detectapor una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Sí queremos un precipitado, podemosusar una sal de tetrazolio.- La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato aelparanitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-beta–D-galactopiranosido, los cuales sonhidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble.- Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de laenzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizarconstituyentes celulares (inmunohitoquímica).6.3. TIPOS DE ELISAS6.3.1. ELISA DIRECTOLas placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que sesospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican lapresencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativosque serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, …) pero en lasque se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen
  • controles positivos (soluciones donde se encuentra elantígeno buscado, o bien se le ha añadido).Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado paraeliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerposreaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminarlos anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea.• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.6.3.2. ELISA INDIRECTOLas placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controlespositivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. Ladetección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a launión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo máspopular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundariomarcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad deantígenos.Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto deestudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
  • • Adición del suero problema, de tal forma que susanticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavadopara eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan conlos anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados alos antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado.• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea.• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.6.3.3. ELISA SANDWICHEnsayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata deun ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema enla que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por elprimer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenidose aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así puescada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y unsegundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidady sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.A) ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno adetectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), detal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado paraeliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopodiferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados conuna enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problemay que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerposmarcados que no hayan reaccionado.• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea.• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.B) ELISA Sándwich “HADAS”.
  • Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno adetectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), detal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado paraeliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopodiferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cualesreaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentranfijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayanreaccionado.• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en elpaso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado.• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea.• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.7. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN: Electroforesis.7.1. ELECTROFORESIS.Separación de proteínas del suero en función de su comportamiento en el campoeléctrico.
  • La velocidad de las particulas depende de: La carga de las mismas La intensidad del campo eléctrico y Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medioTIPOS DE ELECTROFORESISEQUIPO DE ELECTROFORESIS Fuente de alimentación Soporte para las tiras de acetato de celulosa
  • o Aplicadoro Cubeta y puenteo Las tiras de acetato de celulosao Reactivos
  • Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampón barbital (pH8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el cátodo. Después decorrer el gel, éste es fijado en una solución ácido-alcohol y se tiñe con un colorante deproteínas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una técnica CUALITATIVA.Sirve para:- Detectar hipergammaglobulinemias.- Calcular la fracción gamma.- Detectar paraproteínas (componentes monoclonales) en el suero..7.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF). Prueba CUALITATIVA. Método combinado de precipitación. Precipitación por difusión. Electroforesis de los antígenos de acuerdo a su carga. Útil para determinar mezclas complejas de Ag o Ac (Ac´s monoclonales clásicas en mieloma, linfomas).En esta técnica, hay 5 fases:
  • 1. Se prepara un gel de agarosa sobre un porta y se hace un pocillo para el suero y un canalillo para el anticuerpoespecífico.2. Migración de antígenos por carga (Separación). Los Ag del suero se separan primeroen base a su carga eléctrica. El pH se elige de modo que unos Ags se carguenpositivamente y migren hacia el cátodo, y otros Agsse carguen negativamente ymigren hacia el ánodo.3. Difusión. El canalillo se llena con el Ac específico y se deja reposar para conseguir ladifusión.4. Formación del precipitado. Ag y Ac reaccionan y precipitan, formando arcos deprecipitación.5. Interpretación de las bandas.7.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.- Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; después se hace unaautorradiografía de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).- Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.7.4. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.Consiste en acelerar la formación de la banda de precipitación por la acción de uncampo eléctrico. Con estas técnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20mgr/ml. Estas técnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pHseleccionado; puesto que la mayoría de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si lascargas sobre el Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molécula químicamente.7.4.1. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE.
  • Es una IDD acelerada por el paso de una corriente eléctrica. Es muy importante que la carga neta del Ag sea (-) yAc sea (+) y que sean colocados en el lugar adecuado en el campo eléctrico (queviajen uno al encuentro del otro). Es una técnica CUALITATIVA.La sensibilidad es de 10-20 veces mas que en el Mancini.7.4.2. ELECTROINMUNODIFUSIÓN CUANTITATIVA O ELECTROFORESISROCKET.Es un Mancini acelerado por un campo eléctrico. El pH del gel se elige para que el Actenga carga neutra y permanezca inmóvil, y el Ag tenga carga negativa y se desplacehacia el ánodo.En un extremo del gel se perforan los pocillos donde se pone el Ag a distintasconcentraciones. El Ag debe estar cargado negativamente para que se desplace haciael ánodo. El Ag difunde y se forman bandas de precipitación con forma de cohete(cuanto menor es la concentración del Ag, menor es el tamaño del rocket). Es unatécnica CUANTITATIVA en la que se puede construir una curva estándar representandoaltura frente a concentración de Ag.7.4.3. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL.- Primero se hace una electroforesis para que los Ag se separen (como en la IEF).- Después se corta una tira con el Ag separado y se aplica sobre otro gel que contieneAc específicos.- Se hace una electroforesis cruzada como en la IEF.- Se forman bandas de precipitación.- Es una técnica CUALITATIVA con la que podemos reconocer Ag.7.5. INMUNOFIJACIÓN.7.5.1. CARACTERÍSTICASLa inmunofijación es una técnica de laboratorio que permite el estudio de proteínas ensangre y orina, específicamente la identificación de componentes monoclonales uoligoclonales .Las bandas anormales en las corridas electroforéticas de proteínas de sueros u orinas,principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gammaglobulinas son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales, y por lo tanto sonun indicio de gammapatías monoclonales.
  • - La electroforesis seguida de inmunofijación es una técnica sencilla que permite queuna proteína sea retenida después de la electroforesis, in situ, mediante la formaciónde un complejo insoluble con su anticuerpo. Es fácil de realizar (provee resultados en 2o 3 horas) y permite lograr mayor sensibilidad que una inmunoelectroforesis, así comouna interpretación mas sencilla.7.5.2. ESQUEMA DE LA TÉCNICALa inmunofijación es una electroforesis de proteínas seguida de una inmovilización delas mismas al enfrentarse a un antisuero específico formando un complejo insolubleque luego se revela por coloración.Se realiza en cuatro etapas:1-Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa. Se separan lasproteínas plasmáticas en un gel de agarosa que tiene 5 calles, como en unaelectroforesis normal.2-Inmunofijación (inmunoprecipitación) de las proteínas separadas. Se hace unaincubación del gel con antisueros específico (IgM, IgG, IgA, cadenas kappa, cadenaslambda) en cada calle del gel, durante 30 minutos a 30-40 ºC. Los carriles demigración electroforética apropiados son recubiertos con los antisueros individuales,los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antígenos correspondientes cuandoestan presentes. Las proteínas del carril de referencia son fijadas con una soluciónfijadora.3-Prensado y lavado. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gelmediante un blotting y un lavado. La precipitación del complejo antígeno-anticuerpoqueda fijada en la matriz del gel.7.5.3. GAMMAPATÍAS MONOCLONALESEl componente monoclonal, llamado también paraproteína o disglobulinemia ogammapatía monoclonal, se refiere a una producción excesiva de un tipo deinmunoglobulina. El aumento en la proliferación de un clon específico de linfocitos Bhiperestimulados o malignos genera una población homogénea de inmunoglobulinamonoclonal.Tipos de gammapatías monoclonales:I.- MALIGNAS:
  • 1. Mieloma Múltiple2. Variantes de Mieloma:- Mieloma Quiescente- Mieloma No Secretor- Leucemia de Células Plasmáticas- POEMS3. Plasmocitomas localizados- Plasmocitoma Óseo Solitario- PlasmocitomaExtramedular4. Macroglobulinemia de Waldenström5. Amiloidosis PrimariaII.- NO MALIGNAS:1. Gammapatía Monoclonal de Significado Indeterminado2. Gammapatías secundarias7.5.4. TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES- Hiperproducción selectiva de inmunoglobulina monoclonal ( G,A,M y en menorfrecuencia D y E), componente monoclonal que puede ser benigno o maligno.- Hiperproducción de cadenas livianas libres monoclonales (aproximadamente el 5% delos casos).Esto es el incremento excesivo en la biosíntesis de cadenas livianas Kappa oLambda libres. Dicha anormalidad es encontrada exclusivamente en mieloma decadenas livianas maligno, generalmente asociado a hipogammaglobulinemia (GAM).- Hiperproducción de cadenas pesadas libres o llamada también enfermedad decadenas pesadas8. ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLÍNICA.8.1. USOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOSTécnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas“in vitro” algún parámetro ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatomía patológica NEFELOMETRIA turbidometría, determinación Ig séricas CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemiasTécnicas terapéuticas: diseñadas para curar. Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales Tratamientos antiinflamatorios. Neutralización de mediadores proinflamatorios Inmunoestimulación con citocinas o vacunación con antígenos
  • 8.2. USO DE ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir. Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo. Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida. Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y purificación molecular y celular.8.3. TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES1.- ANTITUMORAL.a) CONJUGADOS:- RADIOCONJUGADOS (Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio)I-antiCD45 leucemias mieloides agudasZevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131- QUIMIOCONJUGADOS. AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. Se emplea en leucemias mieloides agudas. AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.b) NO CONJUGADOS:- ACCIÓN ANTITUMORAL AntiCD20 (Rituximab) para linfomas y Leucemias de células B. AntiCD52 (Campath 1H) tumores de células B, enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes. AntiCD40 induce AICD en linfomas.
  • - SELECTIVA. Conjugados con partículas magnéticas. AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética. Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.- ELIMINACIÓN DE CÉLULAS.2.- TERAPIA ANTI-INFLAMATORIA.- Anticuerpos anticitocina Anti-TNFaInfliximab Neutralizan mediadores proinflamatorios Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.- Receptores solubles de TNF Etanercep También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.- Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble9. IDENTIFICACIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS9.1. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)• Anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie decada célula.• Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas enfunción de las combinaciones de parámetros seleccionados.• Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia elcontenedor de fracción deseado.• Se pueden clonar células de características específicas:• Características Metabólicas de las Células: Nivel de pH, estado redox, nivel de calcio• Separación de células que expresan un gen reporter (proteínas fluorescentes)
  • • Separación de poblaciones celulares en función de expresión de diferentes antígenos (intra o extracelulares) a losque se unen anticuerpos con marcaje fluorescente.• Separación de poblaciones celulares en función de su tamaño y complejidad internaContenido de ADN: Estudio de la fase de ciclo celular en la que se encuentra la célula• Separación de células que han iniciado el proceso de muerte por apoptosis, decélulas viables y células necróticas9.2. MÉTODOS DE FASE SÓLIDAFijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida.Panning: Se realiza la fijación de los Ab a plástico. Las células portadoras del antígenose unen al soporte, después se realiza un lavado y por último la separación mecánica oquímica.9.3. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)- El sistema autoMACS (MiltenyiBiotec) permite la separación automatizada de célulasmediante bolas paramagnéticas adheridas a la superfície celular mediante anticuerposmonoclonales.- Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matrizferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Lavado y eluciónpor eliminación del campo magnético.- Tiene capacidad para separar hasta 4 x 109 células en 5 minutos y realizar diferentesprocesos de separación secuencialmente, con un enriquecimiento de la subpoblacióninicial de hasta 10.000 veces.
  • 9.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS.- Este método está basado en la especificidad de la interacción de los anticuerposmonoclonales que se unen a antígenos de la superficie celular.- Posteriormente, se adiciona un suero sin descomplementar. El compelemto se activay hay eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.10. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.10.1. TÍTULO DE ANTICUERPOS.El título de Ac es la mayor dilución que da una respuesta POSITIVA. El método deevaluación puede ser midiendo la absorbancia a través de la densidad óptica (DO), osea una DO mayor a la línea de corte.10.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN. Prueba utilizada para detectar inmunidad frente a virus. La neutralización (Nt) mide actividad biológica del virus por lo tanto requiere de virus vivos para poder realizarse. Igualmente, se realiza en un sistema vivo. El principio básico de la prueba de Nt es la inhibición (neutralización) de la infección viral a la célula (cultivo o animal) por medio de los Acs específicos, por lo tanto se neutraliza la acción del virus sobre el hospedero.
  • Lectura de la placa10.3. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.Hay precipitación de Ag y Ac cuando se combinan en proporciones de equivalencia ocercanas a ella. Estos métodos se utilizan para examinar la relación entre diferentes Agy/o Ac.La precipitación se efectúa sobre geles de agarosa.
  • 10.1. INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID) O TÉCNICA DE MANCINI.- Método de cuantificación de antígenos.- Útil en inmunología clínica para cuantificar fracciones plasmáticas humanas comoASH, Inmunoglobulinas, C3 y C4, factores de coagulación.Esquema de la técnica:- Placa de gel de agar con suero específico en la matriz. Se incorpora el Ac específicoen el gel de agarosa.- Se hacen pocillos en el gel de agarosa y en ellos se depositan volúmenes estándar desuero con el Ag que se quiere detectar (Ig o proteínas plasmáticas).- Fenómeno de difusión. Se deja en reposo 24 horas para que difunda y reaccionen Agy Ac (punto de equivalencia), formando un anillo de precipitación.
  • - Cuantificar. Se mide el diámetro del anillo. Halo proporcional a la conc. de antígeno. Es una pruebaCUANTITATIVA.- Para el calculo de resultados hay que construir una curva patrón a partir de unosestándares que se ponen en el gel junto con las muestras problemas. Se representagráficamente el cuadrado del diámetro del anillo frente a la concentración de Ag.- Se interpola en la curva el valor de cada muestra.10.3.2. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO I (IDD-I).- Prueba CUALITATIVA.- Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-8.5).- Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.- Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y sí las concentraciones sonadecuadas, se produce una banda de precipitación.- Si en la solución existen dos Ag reconocidos por el Ac, habrá dos bandas.- Se puede usar azul cromassie para teñir las bandas.
  • 10.3.3. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO II (IDD- II) U OUCHTERLONY.También es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).Se puede utilizar para determinar la relación Ag/Ac (prueba CUALITATIVA). Seenfrenta a un suero con dos o más Ag, y nos podemos encontrar con tres patronesbásicos:a) Identidad (los dos Ag tienen los mismo epitopos reconocidos por el suero): se formauna banda de precipitación con forma de arco continuo.b) No identidad (se trata de Ag distintos): se forman bandas de precipitaciónindependientes y no dan un arco continuo. Aparece una figura con forma de aspa.
  • c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo, pero uno de ellos tiene unepitopo extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitación al quele sale un espolón.