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Artículo inmunología aplicada en Brucella

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  • 1. Inmunología ActualizaciónBrucelosis: una revisión práctica* Hugo Abel Castro 1 , Sofía Raquel González 2 , María Inés Prat 31. Licenciado en Bioquímica. Profesor Adjun- Resumen to Ordinario. La brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por bacterias pertene-2. Licenciada en Bioquímica. Jefa de Trabajos cientes al género Brucella que ocasiona problemas de salud importantes Prácticos. entre los individuos que ingieren alimentos contaminados o mantienen un3. Dra. en Bioquímica. Ayudante de Docencia. estrecho contacto con el ganado. En el presente trabajo se describen, bre- vemente, algunas características de las bacterias de este género, la patolo-* Cátedra de Inmunología. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia. Universi- gía que producen, la respuesta inmune que desencadenan y se destaca la dad Nacional del Sur. San Juan 6 7 0. 8 0 0 0, metodología empleada en el diagnóstico de la enfermedad, tanto en el Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires. hombre como en los animales. Se profundiza además en los aspectos pre- sentes y futuros de las vacunas preventivas. Finalmente, se considera en particular a la brucelosis humana, describiendo su cuadro clínico, los mé- todos directos e indirectos de diagnóstico y la interpretación de sus resul- tados con el objeto de contribuir a esclarecer aspectos relevantes que de- ben tenerse en cuenta para un correcto seguimiento de la infección. Palabras clave: brucelosis* brucelosis en el hombre* métodos de diagnós- tico* interpretación de pruebas diagnósticas Summary BRUCELLOSIS: A PRATICAL REVIEW Brucellosis is a zoonotic disease caused by organisms belonging to the genus Brucella that provoke health troubles in humans ingesting contaminated food or with a close contact with cattle. This work briefly summarizes some characteristics of the genus, the pathogenesis, and the immune response generated, and it emphasizes the methods carried out for its diagnosis in human beings as well as in animals. Present and futureActa Bioquímica Clínica Latinoamericana vaccine aspects are also explored. Finally, human brucellosis is speciallyIncorporada al Chemical Abstract Service. considered, and its clinical features, direct and indirect diagnosis methodsCódigo bibliográfico: ABCLDL. and results interpretation described in order to know the main aspects to be considered for an adequate infection following process.ISSN 0325-2957 Key words: brucellosis * brucellosis in man * diagnostic methods * diagnostic tests interpretationActa Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 2. 204 Castro HA y col.Introducción Este artículo procura efectuar un resumido repaso de los principales aspectos de la infección con el géne- La brucelosis es una patología antropozoonótica de ro Brucella, tanto en el hombre como en los animalesdistribución mundial, conocida desde hace muchos reconocidos como portadores. Además, presta espe-años que, sin embargo, continúa siendo un problema cial atención a los aspectos inmunológicos, así como asanitario y económico de envergadura. los métodos para investigar sus marcadores, y al mane- La diversidad de animales portadores de la bacteria jo e interpretación de sus resultados.responsable complica en gran medida las acciones delucha contra esta infección, en especial las preventivas,ya que aún hoy no existe un panorama real de su pre- Etiologíavalencia ni de los posibles vectores que colaboran consu diseminación. No obstante, los animales aceptados El género Brucella está constituido por bacilos gramhasta el momento como portadores tienen, en mu- negativos pequeños, inmóviles y aerobios estrictos, dechos casos, íntimo contacto con el hombre, lo que crecimiento lento que no poseen cápsulas ni formanagregado a las vías conocidas de infección explica la esporas. A diferencia de muchas otras bacterias, su ge-dimensión del problema que plantea esta zoonosis. noma está constituido por dos cromosomas circulares Además, los productos derivados de los citados ani- y carece de plásmidos (1). Tienen un metabolismomales son objeto de una intensa manipulación por oxidativo, basado en la utilización de nitratos comoparte del hombre, frecuentemente carente de un ade- aceptores de electrones. Son catalasa y oxidasa positi-cuado cuidado y prevención. vos, no atacan la gelatina ni modifican la leche y en ge- Por otra parte, la brucelosis no presenta un cuadro neral no fermentan los azúcares (2).clínico característico que permita una detección pre- El género Brucella incluye seis especies diferentes:coz del infectado, lo que favorece la evolución a la cro- Brucella melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B.nicidad, complicando las alternativas terapéuticas y la neotomae y B. maris (3). De ellas, las cuatro primerascuración definitiva. pueden infectar al hombre. En la Tabla I se encuen-Tabla I. Especies que integran el género Brucella , hospedadores conocidos y características bioquímicas y antigénicas que permitenclasificarlas en biovariedades. A y M : configuraciones alternativas del PSO, R: LPS de las cepas rugosas. Sensibilidad a los Aglutinación con sueros Producción Necesidad Especie Hospedador Biovariedad colorantes monoespecíficos de H 2 S de CO 2 Tionina Fucsina A M R B. melitensis Cabras, bovinos, 1 - - + + - + - ovino, cánidos, 2 - - + + + - - hombre 3 - - + + + + - B. abortus Bovinos, 1 + + - + + - - cánidos,hombre 2 + + - - + - - 3 + + + + + - - 4 + + - + - + - 5 - - + + - + - 6 - - + + + - - 7 + - + + + + - 8 - + + + + + - 9 + + + + - + - B. suis Cerdos, cánidos, 1 - - + - + - - hombre 2 - - + - + - - 3 - - + + + - - 4 - - + - + + - 5 - - + - - + - B. canis Cánidos, hombre - - + - - - + B. neotomae Roedores + - - - + - - B. ovis Ovinos - + + - - - + B. maris Focas, leones marinos, delfines, ballenas.Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 3. Brucelosis: una revisión práctica 205tran detalladas las especies de Brucella, sus hospedado- El lípido A es un glicolípido que contiene glucosa-res conocidos y las características bioquímicas y antigé- mina y diaminoglucosa. En sus grupos amino e hidro-nicas que permiten clasificarlas en biovariedades. xilos presenta sustituciones por ácidos grasos de varia- En base al aspecto de las colonias obtenidas en me- da longitud de cadena. El núcleo contiene glucosa,dio sólido, las diferentes especies de Brucella se clasifi- manosa y ácido 3, deoxi-D-mano-2 octulosónico (KDO)can habitualmente como lisas (S) o rugosas (R). Dentro y no contiene ni heptosas ni fosfatos. La quinovosami-de las primeras se encuentran B. abortus, B. melitensis, B. na está presente en el núcleo del LPS-S pero no en elsuis y B. neotomae y dentro de las segundas B. ovis y B. ca- del LPS-R. El PSO es la porción más distal del LPS. Esnis. El aspecto que adquieren las colonias se debe a la un homopolímero lineal compuesto por n-residuos deexpresión del lipopolisacárido LPS en la superficie bac- N-formil perosamina (4,6 dideoxi-4-formamido-α-D-teriana, LPS-S en las lisas y LPS-R en las rugosas, aunque manopiranosilo). La unión entre estos residuos puededurante su crecimiento en los medios de cultivo pue- ser de dos tipos: α 1-2 o α 1-3, lo que permite diferen-den experimentar mutaciones que afectan la expresión ciar dos configuraciones alternativas, la A y la M, dedel LPS (4). mucha importancia en la determinación de las biova- Las cepas de Brucella en fase lisa son las más virulen- riedades, y que se establecen a partir de la alternanciatas y su ultraestructura es semejante a la de algunas en- de las uniones entre residuos en el PSO (Tabla I).terobacterias (Yersinia enterocolítica, Salmonella Iandau, Las Brucellas contienen otro polisacárido denomi-Pseudomona maltophilia, Escherichia coli) (5), aunque nado hapteno nativo (HN), que es químicamentepresenta ciertas diferencias en las características de su idéntico a la cadena O, pero no está unido al núcleomembrana externa (ME). (6). Se ha descripto un tercer polisacárido conocido como poli B, que se obtiene a partir de la cepa mutan- te en fase rugosa B. melitensis 115, por tratamiento conEstructura y composición química ácido tricloroacético 0,2 M y que para algunos autores sería químicamente equivalente al HN (7). ESTRUCTURA EXTERNA: Las proteínas de membrana externa (PME u OMPs) se asocian estrechamente con los LPS. Dentro La ME de Brucella es rica en fosfatidilcolina a dife- de éstas se encuentran las denominadas proteínas ma-rencia de la perteneciente a las enterobacterias rela- yores, que se clasifican en tres grupos de acuerdo a suscionadas con ella, que es rica en fosfatidiletanolamina. pesos moleculares: grupo 1 (89-94 kDa), grupo 2 (36- Su componente más abundante y mejor estudiado 38 kDa) y grupo 3 (25-27 y 31-34 kDa) (8)(9) y se en-es el LPS, que se conoce también con el nombre de en- cuentran expuestas en la membrana externa, pero sondotoxina. En él se distinguen tres regiones: el lípido A, menos accesibles en las cepas lisas que en las rugosas,inserto en la hoja externa de la membrana, un oligosa- debido al impedimento estérico ocasionado por las ca-cárido intermedio, llamado núcleo, y el polisacárido O denas O del LPS de las primeras. Mediante el empleo(PSO), también conocido como cadena O, ausente o de anticuerpos monoclonales se han identificado otraspresente con pocos residuos en el LPS-R (Fig. 1). proteínas de membrana menos abundantes que se de- Polisacárido O Núcleo Membrana externa Lípido A Fosfolípidos Espacio periplásmicoFigura 1: Esquema simplificado de la membrana externa de la pared celular de Brucella.El LPS-S de las formas lisas está constituido por el lípido A, el núcleo y el polisacárido O (PSO). El LPS-R de las formas rugosascarece de cadena O o está reducida a muy pocos residuos.P: proteínas Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 4. 206 Castro HA y col.nominan proteínas menores, siendo algunas de ellas contaminando de esta forma el suelo, los corrales, lalipoproteínas (10). paja de las camas, el agua de arroyos, canales y pozos. Brucella es capaz de sobrevivir en el medio ambiente, ESTRUCTURA INTERNA: fuera del hospedador, por períodos relativamente lar- gos (Tabla II). Las proteínas citoplasmáticas de las bacterias del gé- La relación entre especies de Brucella, vías de trans-nero Brucella son específicas de ese género y la mayo- misión y patogenia, tanto en el hombre como en losría son compartidas por todas las especies (11). Algu- animales, se detalla en la Tabla III.nas de estas proteínas son de interés diagnóstico,como por ejemplo la glicoproteína A2 termorresisten- Patogeniate (12), una proteína de 17 kDa, involucrada en la sín-tesis de riboflavina, que aparece en la fase activa de la Las especies de Brucella son patógenas intracelula-infección (13) y la proteína periplásmica BP26 (14). res facultativas, propiedad que las mantiene protegi-Todas estas proteínas forman parte de un antígeno de- das de la acción de los antibióticos, y de los mecanis-nominado CP, empleado en pruebas de ELISA. mos efectores dependientes de anticuerpos; esto justifica la naturaleza crónica de la infección ya que son capaces de adherirse, penetrar y multiplicarse enEpidemiología una gran variedad de células eucariotas tanto fagocíti- cas como no fagocíticas. La incidencia y prevalencia de la brucelosis tienen Cuando estas bacterias ingresan al organismo pue-importantes variaciones geográficas. Las zonas de ma- den ser fagocitadas por los polimorfonucleares (PMN)yor prevalencia corresponden a la región del Medite- y macrófagos como parte de la inmunidad innata. Sirráneo, Asia occidental, algunas partes de África y no son eliminadas llegan por vía linfática a los gangliosAmérica (Estados Unidos, México, Brasil, Perú, Co- regionales correspondientes pudiendo desde allí inva-lombia y Argentina) (15). B. melitensis es la especie más dir el torrente sanguíneo, donde son fagocitadas pordifundida seguida de B. abortus y B. suis. En Argentina los PMN y macrófagos circulantes y transportadas, deuna de las principales especies responsable de la bru- esta manera, a los diversos órganos donde pueden so-celosis en el hombre es B. suis (16), aunque la verda- brevivir y multiplicarse dentro de las vacuolas de los fa-dera situación epidemiológica de la brucelosis en cer- gocitos circulantes y tisulares (18). Los mecanismos dedos, portadores de esta especie, es desconocida (17). ingreso de la bacteria a estas células no están suficien- La fuente de infección la constituyen los animales temente aclarados aunque se presume que el LPS y lasinfectados que excretan gran cantidad de bacterias proteínas de la membrana externa podrían participarjunto con los tejidos y productos de abortos, en la le- en los mismos, mediante receptores tipo manosa o in-che, y en menor medida en las secreciones genitales, tegrinas, respectivamente. Las células de la placenta Tabla II. Supervivencia de Brucella en el medio ambiente. Material Tiempo de supervivencia Suelo y estiércol 8 0 días Polvo 1 5-4 0 días Leche a temperatura ambiente 2-4 días Fluídos y secreciones en verano 1 0-3 0 minutos Lanas de depósitos 1 1 0 días Agua a 3 7 °C y pH 7,5 menos de 1 día Agua a 8 °C y pH 6,5 más de 5 7 días Fetos mantenidos a la sombra 6-8 meses Descarga vaginal mantenida en hielo 7 meses Manteca a 8 °C 1-2 meses Cuero manchado con excremento de vaca 2 1 días Paja 2 9 días Grasa de ordeño 9 días Heces bovinas naturales 1-1 0 0 días Tierra húmeda a temperatura ambiente 6 6 días Tierra desecada a temperatura ambiente 4 días.Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 5. Brucelosis: una revisión práctica 207 Tabla III: Huéspedes, especies de Brucella , vía de transmisión y patogenia. Huésped Especie de Brucella Vías de transmisión Patogenia Bovinos B. abortus Oral, nasal y conjuntival. Abortos. Orquitis. Epididimitis. Ocasionalmente artritis. Cerdos B. suis Oral y genital. Aborto. Esterilidad. Orquitis. Ovinos B. ovis Genital. Abortos (poco frecuentes). Epididimitis. Perros y B. melitensis, Oral y genital. Abortos. Esterilidad. Epididimitis. otros cánidos B. abortus, Dermatitis escrotal B. canis, B. suis Hombre Inoculación conjuntival. Fiebre aguda e intermitente. B. melitensis, Inhalación. Cutánea. Adenopatías. B. abortus, Digestiva. Hepatoesplenomegalia B. canis, B. suis Complicaciones osteoarticulares,son ricas en receptores de manosa (19) y en un factor capaz de sobrevivir y multiplicarse dentro de los neutró-de crecimiento conocido como eritritol, presente en filos durante el curso de la infección y de esta forma sertejidos placentarios animales, lo que explica la avidez transportada a los tejidos linfoides. Para que se produz-de Brucella por los mismos (20). ca la muerte de las bacterias intracelulares es necesaria La supervivencia de Brucella dentro de las células se la desgranulación de los gránulos de los neutrófilos,ha asociado con la síntesis de enzimas antioxidantes con la consiguiente liberación de mieloperoxidasa. Se(21) y a la producción de GMP (guanosina 5´monofos- ha demostrado que Brucella posee mecanismos que in-fato) y adenina, que inhiben la fusión fagosoma-lisoso- hiben esta desgranulación y evitan así su destrucciónma, la desgranulación, la activación del sistema mielo- (21). Los neutrófilos de las distintas especies animalesperoxidasa-haluro y la producción del TNF-α (22). reaccionan en forma diferente ante Brucella. Así, los El cuadro clínico y la evolución de la infección va- neutrófilos de los cobayos no son capaces de destruir lasrían en función de la especie animal afectada. En los cepas lisas, mientras que la actividad bactericida de losmamíferos rumiantes y en el ganado porcino la mani- neutrófilos bovinos frente a estas cepas es mayor que lafestación clínica es el aborto. En el hombre presenta de los neutrófilos humanos, no registrándose diferen-una gran tendencia a la cronicidad y se caracteriza por cias entre los dos últimos frente a las cepas rugosas.fiebre y localización de las bacterias en distintos tejidos Otras células que reaccionan ante la presencia de(articulaciones, hueso, endocardio, sistema nervioso). Brucella son los macrófagos. El ingreso de la bacteria a los mismos se produce a través de la interacción entreRespuesta inmune la molécula CD14 y el LPS. Esta interacción induce también la producción de IL-12 que estimula las célu- El ingreso de Brucella en el organismo induce la ac- las NK y los linfocitos T colaboradores o helper (LTH)tivación de los mecanismos de defensa que se inician CD4+, que secretan IFN-γ, favoreciendo el desarrollocon la participación de algunos componentes de la in- de una respuesta inmune predominantemente media-munidad innata, como el complemento (C), los neu- da por LTH1 (26). Este subgrupo de linfocitos T esti-trófilos y los macrófagos. mula fundamentalmente la respuesta de tipo celular y La activación del C por las vía clásica y alterna jue- participa en forma directa en la protección contra mi-ga un rol muy importante en la resistencia contra bac- croorganismos intracelulares, ya que su amplio patrónterias gram negativas. Existen controversias en cuanto de citoquinas incluye IL 2, 3, 6, 12, TNF-α y sobre to-a la capacidad que posee el LPS de Brucella de activar do IFN-γ (27), esencial para la activación de macrófa-la vía alterna del C (23)(24), sin embargo, la activa- gos. Una vez fagocitada la bacteria, los macrófagos po-ción de la vía clásica puede iniciarse con la presencia seen la capacidad de destruirla inmediatamente, perode bajas concentraciones de IgM e IgG anti-LPS, lo- del mismo modo que ha sido descripto para los neu-grándose de esta forma la lisis bacteriana (25). trófilos, Brucella es capaz de inhibir estos mecanismos Los neutrófilos son las primeras células del huésped de destrucción. El hierro presente en los macrófagosque se ponen en contacto con Brucella. La opsonización tiene un papel preponderante en la eliminación de losde las bacterias por anticuerpos y complemento facilita microorganismos ya que cataliza una reacción metabó-su fagocitosis. Como ya se ha mencionado, Brucella es lica destinada a incrementar la producción de inter- Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 6. 208 Castro HA y col.mediarios reactivos del oxígeno, fundamentales en la Procedimientos de laboratorioeliminación de patógenos intracelulares (28). Los linfocitos también son impactados por distintosantígenos de Brucella. Las proteínas de las bacterias MÉTODOS DIRECTOS:son procesadas dentro de la célula presentadora de Se basan en evidenciar la presencia de la bacteria oantígenos y sus péptidos asociados a moléculas CMH de sus componentes en los tejidos de los animales oclase I y II son presentados a los LTH CD4+ y LT cito- del hombre. El diagnóstico definitivo requiere el aisla-tóxicos (LTC) CD8+. Estos últimos son capaces de lisar miento de la bacteria, frecuentemente a partir de he-macrófagos y otras células infectadas con Brucella. mocultivos. La técnica más utilizada para realizarlos es El LPS es considerado un antígeno T independien- la de Ruiz Castañeda (35), que consiste en la inocula-te, capaz de activar a los linfocitos B (LB) sin la parti- ción de sangre en frascos herméticamente cerradoscipación de los LTH. Los primeros anticuerpos que se que contienen, simultáneamente, un medio líquidogeneran en el curso de una infección son de clase (caldo triptosa) y un medio sólido (agar triptosa). LosIgM, seguidos de IgG e IgA, dependiendo de la espe- cultivos deben mantenerse en incubación un tiempocie animal. Pueden aparecer, dentro de la clase IgG, no menor a 30 días debido a que las bacterias del gé-anticuerpos bloqueantes o no aglutinantes, también nero Brucella son de crecimiento lento. En los últimosllamados asimétricos (29)(30), en especial en infec- años se han desarrollado sistemas de hemocultivo au-ciones crónicas, donde suelen alcanzar títulos eleva- tomáticos o semiautomáticos entre los que se destacados. Estos anticuerpos se diferencian de los anticuer- el Bactec, que permite detectar más del 95% de lospos completos en ciertas propiedades tanto in vitro cultivos positivos antes del séptimo día de incubación.como in vivo como, entre otras, la incapacidad de ac- A medida que progresa la enfermedad disminuye lativar complemento por cualquiera de las vías o dar probabilidad de positividad de los hemocultivos, poradecuadas reacciones de aglutinación (31)(32). Para lo que se hace necesario el aislamiento a partir de gan-clarificar el rol de los anticuerpos que se originan du- glios linfáticos, hígado o bazo.rante la infección se han realizado numerosos ensa- Para estudiar la presencia de antígenos de Brucellayos experimentales en ratones, demostrándose que en distintos tejidos pueden emplearse los métodos deanticuerpos anti LPS inyectados en forma pasiva han ELISA, inmunofluorescencia directa, hemaglutina-logrado protegerlos contra infecciones posteriores ción reversa y reacción en cadena de la polimerasa(33). Por su parte, estudios efectuados en bovinos (PCR). En particular, se ha diseñado una técnica dehan demostrado que una elevada concentración de PCR ampliamente utilizada en la búsqueda de BrucellaIgG durante una infección activa resulta perjudicial en alimentos (36), pero que registra muchos casos deya que inhibe la lisis complemento dependiente, pro- falsos positivos debido a la presencia de la bacteriamueve la fagocitosis de los microorganismos e incre- Ochrobactrum anthropi, muy relacionada genéticamentementa la localización intracelular y la diseminación con Brucella. Recientemente se ha descripto otra técni-hacia los distintos tejidos (25). ca denominada PCR-ELISA que se emplea en el diag- La participación de las citoquinas en el control de nóstico de brucelosis humana (37).la brucelosis ha sido investigada mediante la inyecciónde citoquinas recombinantes o la inhibición de su ac-tividad con anticuerpos monoclonales específicos. La MÉTODOS INDIRECTOS:IL-1, IL-12, y el TNF-α participan en las etapas tempra- Las dificultades propias de la implementación delnas de la infección. El IFN-γ es una de las citoquinas aislamiento de Brucella a partir de los distintos tejidosmás importantes en la resistencia contra la infección. hacen que los métodos indirectos sean el recurso diag-El TNF-α parece contribuir a la formación de los gra- nóstico más utilizado.nulomas que se observan en los tejidos infectados. Se Existen numerosas pruebas que están destinadas aha detectado tanto en brucelosis humana como en ra- detectar no sólo el mayor número de individuos infec-tones infectados experimentalmente un incremento tados sino al mismo tiempo diferenciar entre infecta-en la producción de IL-6, aunque su rol no está com- dos y vacunados, así como detectar las reacciones cru-pletamente definido (34). zadas. La mayoría de las pruebas de laboratorio utilizan como antígenos suspensiones de Brucella en fase S o R,Diagnóstico según la cepa bacteriana. Las cepas recomendadas por los organismos internacionales en la elaboración de El diagnóstico de certeza se establece aislando al los mismos son B. abortus 1119-3 ó 99S. Estos antígenosmicroorganismo a partir de cultivos de sangre, médu- permiten detectar anticuerpos anti B abortus, suis y me-la ósea u otros tejidos. Los métodos serológicos sólo litensis, mientras que para anticuerpos anti B. canis y B.aportan un diagnóstico presuntivo. ovis se necesitan antígenos específicos de especie.Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 7. Brucelosis: una revisión práctica 209 Dentro de las pruebas serológicas utilizadas en el Anticuerpos: IgM e IgG1.diagnóstico se encuentran: Se informa como positiva o negativa. a) Aglutinación lenta en tubo de Wright (SAT): es la más e) Antígeno Tamponado en Placa (BPA): es otra de lasantigua (1897) y la más utilizada aún para el diagnós- pruebas tamices que se realiza en placa.tico de brucelosis animal y humana. Bases metodológicas: se ponen en contacto 80 µL de Bases metodológicas: se realizan diluciones crecientes suero con 30 µL de antígeno y se observa la presenciadel suero a investigar que se enfrentan con cantidades de aglutinación.constantes de antígeno observándose la presencia o Antígeno: suspensión de B. abortus al 11% con cris-no de aglutinación luego de un período de incuba- tal violeta y verde brillante.ción. De esa forma se determina el título como la má- Anticuerpos: IgM e IgG1.xima dilución aglutinante. Se informa como positiva o negativa según el resul- Antígeno: suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5%. tado de la aglutinación. Anticuerpos: IgM, IgG1 e IgG2. Título significativo: no existe consenso en cuanto al f) Prueba de Coombs: es una prueba de aglutinacióntítulo que indica una infección activa, por lo que debe en tubo que permite detectar tanto anticuerpos com-establecerse regionalmente. pletos como incompletos. Bases metodológicas: se realizan diluciones seriadas b) Prueba de aglutinación con y sin 2-mercaptuetanol (2- del suero a investigar, que se incuban con una suspen-ME): es una variante de la anterior que emplea el tra- sión antigénica de B. abortus para que se produzca latamiento previo con 2-ME como agente reductor que aglutinación mediada por los anticuerpos completos.inactiva los anticuerpos de clase IgM. Las suspensiones correspondientes a las diluciones ma- Bases metodológicas: se realizan simultáneamente las yores se lavan adecuadamente y se agrega suero anties-pruebas de aglutinación en tubo con y sin tratamiento pecie (Coombs) para detectar de esta forma la agluti-del suero con 2-ME. nación mediada por los anticuerpos incompletos. La diferencia de título obtenida entre ambas prue- Antígeno: suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5%.bas corresponde a los anticuerpos IgM. Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes de la cla- Antígeno: suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5%. se IgG. Anticuerpos: IgG e IgM. Título significativo: el título obtenido es, como míni- Título significativo: mayor de 1:20. mo el de la aglutinación de la primera etapa y frecuen- temente mucho más elevado. c) Reacción de Huddleson: es una reacción de agluti- Este incremento es tanto mayor cuanto mayor es lanación rápida en placa. concentración de anticuerpos no aglutinantes o in- Bases metodológicas: se enfrentan cantidades decre- completos.cientes del suero a investigar con cantidades constan-tes de antígeno y se observa la presencia o no de aglu- g) Fijación de complemento: es una prueba altamentetinación. Existe una escala de títulos, establecida por específica y es la prueba de referencia internacional.convención, que permite la expresión de resultados. Bases metodológicas: en la primera etapa de la reac- Antígeno: suspensión de B. abortus al 3-10% de gér- ción se incuban diluciones del suero inactivado con elmenes en fenol, con verde brillante y cristal violeta. antígeno y el complemento. En la segunda etapa se Anticuerpos: IgM, IgG1, IgG2 e IgA. agrega el sistema hemolítico y se compara la hemólisis Título significativo: mayor de 1:40. En ocasiones se con los estándares correspondientes a 0, 25, 50, 75 yobserva el fenómeno de prozona, donde puede estar 100% de lisis.ausente la aglutinación en los títulos más altos a causa Antígeno: puede utilizarse una dilución 1:200 del an-de un exceso de anticuerpos (38). Este hecho debe te- tígeno empleado en la reacción de Huddleson, o unnerse en cuenta para evitar falsos resultados negativos antígeno soluble denominado HS que se prepara apor esa causa. partir de una suspensión bacteriana tratada con solu- ción salina caliente. d) Prueba de Rosa de Bengala: es una prueba rápida Anticuerpos: IgG1.en placa utilizada como tamiz. Título significativo: mayor de 1:20 . Bases metodológicas: se pone en contacto una alícuo-ta del suero (30µL) con 30µL de antígeno y se obser- h) Inmunofluorescencia indirecta: es una prueba de in-va la presencia de aglutinaciones. teracción primaria. Antígeno: suspensiones de B. Abortus al 8,5%, ajusta- Bases metodológicas: se incuban diluciones crecientesdas a pH ácido, con el agregado del colorante Rosa de del suero a investigar sobre una impronta de Brucella.Bengala. Se agrega luego el anticuerpo anti-especie marcado Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 8. 210 Castro HA y col.con una sustancia fluorescente y se observa en un mi- Bases metodológicas: se efectúa la reacción de doblecroscopio de fluorescencia, determinándose el título. difusión del suero a investigar frente a un suero con- Antígeno: suspensión de bacterias fijadas a un por- trol observando las reacciones de identidad.taobjeto. Antígeno: antígeno soluble HS. Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes. Anticuerpos detectados: IgG e IgM. Título significativo: mayor de 1:80 (39). Los métodos sugeridos por la OIE (Organización Mundial de la Salud Animal) para el estudio de bruce- i) ELISA: es una técnica altamente sensible, especí- losis en las distintas especies animales son:fica y versátil (40), emplea muy pequeña cantidad de – en bovinos: BPA, Rosa de Bengala, fijación desuero (41) y da muy buenos resultados aun en presen- complemento, ELISA-I, ELISA-C, FPA.cia de hemólisis. – en caprinos: Rosa de Bengala, fijación de comple- mento. * ELISA indirecto (ELISA-I): – en ovinos: fijación de complemento, ELISA-I, Bases metodológicas: el antígeno se fija a placas de po- IDAG.liestireno, luego se incuba con el suero a investigar, – en porcinos: BPA, fijación de complemento, ELI-posteriormente con un anti-especie conjugado con SA-C, ELISA-I, FPA.una enzima, se agrega el sustrato correspondiente y se – en caninos: Huddleson, aglutinación con y sin 2-mide el color desarrollado a la longitud de onda deter- ME, aglutinación lenta en tubo, ELISA-I, IDAG.minada. Pueden usarse conjugados que reconozcan Para el diagnóstico de brucelosis humana se em-las distintas clases de inmunoglobulinas. plean habitualmente como pruebas tamices BPA, Rosa Antígeno: los antígenos pueden ser particulados o de Bengala o Huddleson y como pruebas confirmato-solubles, LPS u otras proteínas bacterianas. Se ha ob- rias aglutinación lenta en tubo con y sin 2-ME,tenido un antígeno libre de LPS (antígeno CP), que es Coombs y fijación de complemento.altamente eficaz en detectar la respuesta a IgG duran-te una infección activa evitando al mismo tiempo lasreacciones cruzadas debidas al LPS (42). Interpretación de las pruebas Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes. diagnósticas La interpretación de esta prueba debe ser aún con-validada. Cuando se utilizan los métodos serológicos de diag- nóstico deben tenerse en consideración la reactividad * ELISA competitivo (ELISA-C): cruzada, y el tipo de anticuerpo que predomina en ca- Bases metodológicas: se emplea un anticuerpo mono- da etapa. En la etapa aguda se generan anticuerposclonal que reconoce el epitope O del LPS-S, que com- aglutinantes. La secuencia de producción de los distin-pite con los anticuerpos del suero por la unión al antí- tos isotipos de inmunoglobulinas depende de la espe-geno fijado en la placa. El revelado se efectúa con un cie del hospedador. La IgM e IgA irán descendiendoanticuerpo anti-ratón conjugado con una enzima. progresivamente hasta negativizarse antes de los 6 me- Antígeno: LPS-S. ses, mientras que la IgG podrá permanecer detectable Anticuerpos: aglutinantes y no aglutinantes. durante 2 ó 3 años. Estos anticuerpos completos o Se consideran positivos aquellos sueros con un por- aglutinantes son capaces de reaccionar con antígenoscentaje de inhibición mayor del 28% (43). de la superficie bacteriana y pueden detectarse me- diante reacciones de aglutinación en placa, lenta en j) Polarización de fluorescencia (FPA): esta técnica pue- tubo y fijación de complemento. Los títulos de lasde realizarse en sangre entera y leche. reacciones de aglutinación son elevados desde las pri- Bases metodológicas: los anticuerpos al unirse al antí- meras semanas de la infección. La prueba de aglutina-geno cambian la velocidad de rotación de la molécula. ción con 2-ME se correlaciona con la evolución clínicaSi se hace incidir un haz de luz fluorescente polariza- de la infección. En el comienzo de la misma la diferen-da, el ángulo de difracción cambia en función del an- cia entre los títulos de aglutinación con y sin 2-MEticuerpo unido. Este cambio es medido por un detec- puede ser importante debido a la presencia mayorita-tor que lo traduce en una señal (44). ria de anticuerpos IgM, que se inactivan con 2-ME. Antígeno empleado: PSO de B. abortus conjugado con Los anticuerpos de clase IgG permiten seguir elisotiocianato de fluoresceína (45)(46). curso de la infección. No obstante, a medida que ésta La interpretación de esta prueba es similar al ELI- se torna crónica comienzan a incrementarse, en formaSA-I. progresiva, los anticuerpos de la clase IgG incompletos o no aglutinantes, que no son capaces de dar positivas k) Prueba de inmunodifusión en agar (IDAG): es una las reacciones de aglutinación directa ni activar ade-técnica de doble difusión en geles. cuadamente el sistema complemento. Cuando la con-Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 9. Brucelosis: una revisión práctica 211centración de anticuerpos no aglutinantes en el suero S19. Esta cepa fue aislada en el año 1923 a partir de le-investigado alcanza valores relativos importantes, estas che de vaca, como cepa virulenta, y se mantuvo a tem-reacciones pueden arrojar resultados de bajo título y peratura ambiente durante un año en el laboratorioaún negativos. para obtener bacterias atenuadas. Es incapaz de crecer Para lograr un diagnóstico inicial correcto se reco- en presencia de eritritol, y aunque es de baja virulen-mienda efectuar pruebas que evidencien la presencia cia, la vacunación subcutánea en hembras preñadasde anticuerpos totales, tanto completos como incom- puede ocasionar abortos. La principal desventaja de es-pletos. La prueba de Coombs puede ser reemplazada ta vacuna es que los anticuerpos generados interfierenpor los métodos de IFI y ELISA que cumplen con este en las pruebas diagnósticas más comúnmente utiliza-requisito y permiten discriminar además los isotipos das, que emplean antígenos con LPS-S. La semejanzade inmunoglobulinas involucrados. antigénica, a nivel de esta molécula entre las cepas que se utilizan en vacunación y las cepas salvajes puede ex- plicar la similitud de respuesta inmune que existe en-Vacunación tre un animal vacunado y otro infectado. La mayoría de los animales con una infección activa presentan niveles Desde el año 1906 se investiga el desarrollo de vacu- elevados de anticuerpos anti-LPS. Estos anticuerposnas humanas inocuas y eficaces. La aplicación en el también son producidos en los animales inmunizadoshombre de vacunas a gérmenes muertos o vivos atenua- con vacunas constituidas por bacterias vivas atenuadasdos se ha dejado de lado por su baja eficiencia y por las en fase lisa, por ello resulta tan difícil discriminar entrereacciones colaterales que producen (47). Las vacunas ganado infectado y ganado sano vacunado.elaboradas con complejos de proteínas y polisacáridos Para resolver este inconveniente se han desarrolla-extraídos con ácido acético de la pared de B. abortus ce- do diversas estrategias. Una de ellas fue la de inmuni-pa S19 (48) no han demostrado ser eficaces. Otro tan- zar con bacterias en fase rugosa, que no poseen polisa-to ocurre con las fracciones antigénicas insolubles en cárido O en su LPS. La primera cepa bacteriana usadafenol de B. melitensis cepa M15 y B. abortus cepa S19 con este fin fue B. abortus 45/20, obtenida a partir de(49). Debe, además, investigarse previamente si el indi- la cepa B. abortus 45 por 20 pasajes sucesivos en coba-viduo tuvo una primoinfección con el germen, ya que yos, que dejó de aplicarse ya que tendía a volverse lisaen este caso las citadas vacunas producen diversas reac- y virulenta. Otra cepa utilizada fue B. abortus RB51, se-ciones adversas (dolor local, fiebre, eritema, mialgias). leccionada a partir de la cepa B. abortus 2308 en pre- En cuanto a las vacunas para animales, las más am- sencia de rifampicina. Es una cepa atenuada que nopliamente utilizadas se obtienen a partir de cepas vivas produce abortos cuando se inmunizan hembras pre-atenuadas. En muchos países el control de la brucelo- ñadas, parecería ser de baja virulencia para el hombre,sis en pequeños rumiantes se basa en el uso de la vacu- se aplica en una sola dosis y genera protección aúnna viva Rev 1, obtenida a partir de B. melitensis (50). Es- aplicada en forma oral (52). Esta vacuna es usada ac-ta vacuna, cuando se administra en forma subcutánea , tualmente en los Estados Unidos como vacuna oficialinduce la producción de una intensa y prolongada res- y desde 1998 comenzó a aplicarse también en estepuesta de anticuerpos, en cambio, su administración país. En la Tabla IV se detallan algunas característicasen la conjuntiva, reduce significativamente la intensi- diferenciales de las vacunas S19 y RB51.dad y duración de estas respuestas postvacunales (51). Por otra parte se han obtenido mutantes que care-En Argentina, hasta el año 1998 sólo se aplicaba en bo- cen del gen que codifica para la enzima involucrada envinos la vacuna elaborada a partir de B. abortus cepa la síntesis del polisacárido O del LPS (53), a partir de Tabla IV. Características diferenciales entre las cepas bacterianas más comúnmente utilizadas en vacunación. S1 9 RB 5 1 Cepa lisa. Cepa rugosa, más atenuada que S1 9. Posee la cadena O en su LPS. No posee la cadena O en su LPS. Genera anticuerpos que interfieren en las pruebas Los anticuerpos que genera no interfieren diagnósticas, impidiendo diferenciar en las pruebas diagnósticas. entre un animal vacunado y otro enfermo. Administrada en vacas en gestación puede En vacas gestantes provoca abortos provocar abortos en el 1,4% de los casos. en el 0,1% de los casos. Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 10. 212 Castro HA y col.B. melitensis y B. suis que fueron muy eficaces en generar fáticos. Los microorganismos se multiplican y son fa-protección, particularmente en ovejas, cabras y cerdos. gocitados por los macrófagos fijos de estos tejidos. La Se están realizando estudios que tienden a identifi- aparición de la enfermedad depende de la capacidadcar proteínas que pudieran usarse en el diagnóstico pa- del huésped para restringir esta multiplicación (58).ra luego anular su expresión en bacterias vivas atenua- La supervivencia intracelular de Brucella condiciona eldas. Las mutantes así obtenidas no inducirían la curso ondulante de la enfermedad y la tendencia a laproducción de anticuerpos contra esta proteína, que recaída y evolución crónica.podría ser empleada como antígeno en las distintas Como se ha explicado anteriormente, la principalpruebas diagnósticas. De todas las proteínas investiga- respuesta inmune protectora contra este tipo de bacte-das hasta este momento la que ha logrado resultados rias intracelulares es la inmunidad mediada por célu-más alentadores es la proteína periplásmica BP26 las, que ejerce su acción a través de dos mecanismos:(Omp28). Se han obtenido mutantes de B. abortus S29 la muerte de los microorganismos fagocitados y la lisisque no expresan BP26 y se ha demostrado que generan de las células infectadas por acción de los LTC.protección en ratones (54). La activación que ocurre en respuesta a los mi- Por último se deben mencionar los ensayos de inmu- croorganismos intracelulares es también capaz de cau-nización con plásmidos portadores de genes bacteria- sar injuria en los tejidos mediante una reacción de hi-nos que codifican para las proteínas L7/L12 (55) y lu- persensibilidad tipo IV de Gell y Coombs (59). Lamazina sintetasa (56) que permiten obtener buenos resistencia intracelular de Brucella conduce a una esti-resultados, aunque aún debe establecerse si este tipo de mulación antigénica crónica y activación de células Tvacunación genera una protección prolongada (57). y macrófagos. La respuesta tisular a estos eventos con- Por lo expuesto, el gran capítulo de la vacunación, siste en un infiltrado de células mononucleares con cé-tanto en el hombre como en animales, se encuentra en lulas epitelioides y formación de granulomas necro-intenso estudio y el futuro dirá si es posible disponer de santes, especialmente en bazo y huesos. Cuando eluna vacuna protectora y específica para el género, eco- microorganismo infectante es B. suis o mellitensis pue-nómica y de masiva disponibilidad y que permita dife- den aparecer, además, abscesos (60).renciar entre individuos vacunados e infectados. CUADRO CLÍNICOBrucelosis en el hombre Es una enfermedad que se autolimita o se vuelve crónica. Muchos pacientes padecen infecciones asin- En la Tabla V se resumen los mecanismos de trans- tomáticas.misión de la enfermedad en el hombre. El período de incubación varía entre 10 y 20 días, aunque la sintomatología puede aparecer varios meses PATOGENIA después. La brucelosis humana ha sido clasificada en Una vez introducidas en el organismo las bacterias forma arbitraria en varias categorías: subclínica, suba-pasan con rapidez de la linfa a los ganglios linfáticos guda, aguda, recurrente y crónica, según las manifes-regionales y a la sangre, donde son transportadas por taciones clínicas. La mayoría de los autores consideranlos polimorfonucleares neutrófilos y monocitos a los el desarrollo de dos fases en la enfermedad: la aguda ysinusoides de hígado, bazo, médula ósea y ganglios lin- la crónica. Tabla V. Mecanismos de transmisión de la infección. Vía de infección Puerta de entrada Fuente de infección Población de riesgo oral mucosa digestiva leche cruda, derivados lácteos población en general por contacto piel erosionada, productos animales contaminados: trabajadores en contacto con conjuntiva, mucosa placenta, heces, secreciones animales infectados o sus nasal vaginales productos (veterinarios, matarifes, cuidadores),personal de laboratorio respiratoria mucosa nasal aerosoles en laboratorios con personal de laboratorio, muestras contaminadas, vacunas trabajadores de la lana, vivas, aerosoles en establos, lanas personal de limpieza de los establos. parenteral inoculación accidental, vacunas vivas,material biológico personal de laboratorio, transfusiones contaminado veterinarios, población en general.Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 11. Brucelosis: una revisión práctica 213 La etapa aguda se manifiesta con fiebre elevada, es- pa de curación de la enfermedad el título de anticuer-calofríos, sudoración de olor característico, dolores pos medido por pruebas de aglutinación desciendemusculares y articulares. Es difícil la identificación de lentamente y se negativiza entre los 6 y 12 meses pos-la enfermedad en esta etapa, ya que los signos y sínto- teriores, mientras que la prueba de Coombs puedemas pueden ser comunes a otras enfermedades como mantenerse positiva aún por más tiempo.la salmonelosis, fiebre tifoidea, tuberculosis y leptospi- Para un correcto diagnóstico serológico de brucelo-rosis. Debido al empleo de los antibióticos ya no se re- sis humana es recomendable efectuar por lo menosgistra el clásico patrón de fiebre ondulante. La tercera una prueba de aglutinación y una prueba de Coombs,parte de los pacientes presenta tos seca o productiva, el o alguna prueba de interacción primaria (IFI o ELI-30% estreñimiento, el 5-10% diarreas. En el 50% de los SA), que permita la detección de los distintos tipos decasos se produce hepatomegalia ligera o moderada y anticuerpos presentes (62), y así poder estimar el pe-esplenomegalia y en el 25% adenopatías. Más del 5% ríodo de la infección. Para mayores detalles remitirsede los pacientes presentan lesiones cutáneas: erupcio- a la interpretación de pruebas serológicas.nes papulonodulares en el tronco y extremidades, delas que puede aislarse el microorganismo. Es caracterís-tico el desarrollo de localizaciones específicas como la Principales conceptososteoarticular, respiratoria, genitourinaria y neuronal. El término brucelosis crónica debe reservarse a pa- La brucelosis es una zoonosis que continúa gene-cientes cuya enfermedad lleve un período de evolu- rando grandes pérdidas económicas tanto en la indus-ción mayor de seis meses. Las recaídas o recidivas se tria pecuaria como en la salud pública. Actualmente,presentan en el 15% de los casos, luego de 2 a 3 meses los principales trabajos de investigación en el tema es-de terminado el tratamiento. tán destinados a lograr vacunas más efectivas y a opti- mizar los métodos de diagnóstico. El diagnóstico de brucelosis humana es difícil. Ade- MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO más de considerar la historia clínica, es recomendable El hallazgo de la bacteria por los métodos directos realizar un estudio bacteriológico complementadoes obviamente el diagnóstico de certeza. No obstante, con el análisis de los anticuerpos séricos.pueden ser sustituídos por los indirectos que son los Al no disponer aún de una adecuada vacuna parade uso masivo por su mayor simpleza y accesibilidad. humanos es fundamental el incremento de medidasLa fase bacteriémica de la enfermedad induce la pro- de prevención.ducción de niveles importantes de anticuerpos. Los En Argentina la brucelosis humana es una enferme-primeros anticuerpos que se generan son de tipo IgM. dad que persiste en las regiones donde la infecciónEn seguida en forma progresiva aparecen los de clase animal no está controlada; sin embargo se están reali-IgG e IgA. Estos anticuerpos también están presentes zando esfuerzos importantes para proveer asistencia,en individuos que cursaron infecciones subclínicas diagnóstico y vacunación en todas las provincias argen-(61). Transcurridos los primeros meses se observa una tinas (17).disminución de la IgM aun en los enfermos no trata-dos. Muchos autores han demostrado la persistenciade anticuerpos aglutinantes específicos hasta por pe- Glosarioríodos de cuatro años después de la primoinfección. BP26: proteína periplásmica.Esta respuesta prolongada permite el empleo de méto- C: complemento.dos sencillos de aglutinación en la búsqueda de anti- CD14: molécula de membrana de los macrófagos.cuerpos con fines epidemiológicos. CMH clase I y II: complejo mayor de histocompatibilidad clase I y II. La mayoría de las pruebas usadas para el diagnósti- CP: antígeno citoplasmático libre de LPS.co detectan anticuerpos que reconocen la cadena O ELISA: ensayo inmunoenzimático.del LPS de la membrana externa. Si bien estas pruebas Eritritol: alcohol de cuatro átomos de carbono, factor de crecimien-son de elevado valor diagnóstico no permiten determi- to para Brucellanar si se trata o no de una infección actual. Para medir HN: hapteno nativo, químicamente idéntico al PSO pero libre.anticuerpos aglutinantes se utilizan la prueba del Rosa HS: antígeno para fijación de complemento, obtenido por calenta- miento de una suspensión de Brucella.de Bengala y la aglutinación en tubo que tienen una IFN-γ: citoquina producida por los linfocitos TH1, células NK y LTC,estrecha correlación. participa en la formación de granulomas, en la activación de ma- En la cronicidad se incrementa la producción de crófagos e induce la expresíón de CMH clase I y II.anticuerpos no aglutinantes de la clase IgG, que alcan- IL: interleuquina.zan en ciertos casos al 80 % de los anticuerpos totales. LPS: lipopolisacárido, componente más abundante de la membranaLa prueba de Coombs indirecta es la más importante externa de las bacterias del género Brucella.en la detección de este tipo de anticuerpos. En la eta- LPS-R: lipopolisacárido de las cepas rugosas. Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (2): 203-16
  • 12. 214 Castro HA y col.LPS-S: lipopolisacárido de las cepas lisas. 1 0. Cloeckaert A, Tibor A, Zygmunt MS. Brucella outerLTC: linfocito T citotóxico. membrane lipoproteins share antigenic determinantsLTH: linfocito T colaborador o helper. with bacteria of the family Rhizobiaceae. Clin DiagnNK: células natural killer, linfocitos con actividad citotóxica o citolí- Lab Immunol 1 9 9 9; 6 (4): 6 2 7-9. tica natural. 1 1. Baldi PC, Wanke MM, Loza ME, Fossati CA. BrucellaOMP (outer membrane protein): proteína de membrana externa estre- abortus cytoplasmic proteins used as antigens in an chamente asociada al LPS. ELISA potentially useful for the diagnosis of caninePCR: reacción en cadena de la polimerasa. brucellosis. Vet Microbiol 1 9 9 4; 4 1(1-2): 1 2 7-3 4PMN: polimorfonuclear neutrófilo. 1 2. Stemshorn B, Nielsen K. The bovine immune responsePSO: porción más distal del LPS, también conocida como cadena O. to Brucella abortus IV. 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