Laboratorio de reacción en cadena de la polimerasa pcr y ciclo de secuenciación
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Laboratorio de reacción en cadena de la polimerasa pcr y ciclo de secuenciación Document Transcript

  • 1. Laboratorio de Reacción en cadena de la polimerasa PCR y ciclo de secuenciación Dr. Giovanni González DMV, Esp, MsC Area de Biologia Molecular Justificación Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente como revolucionarios. Sin embargo cuando ello ocurre, transformamos correctamente el modo en que trabajamos y pensamos. Aunque el progreso en las diferentes ciencias parece ser lento y su evolución resulta una letanía paso a paso, en el caso de la biología molecular ha sucedido lo contrario. Dicha disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiempo relativamente corto. Uno de los principales cambios tecnológicos citados ocurrió en 1985 gracias al señor Kary Mullis, con la introducción de una de las herramientas moleculares con mayor aplicación en el laboratorio clínico veterinario: la reacción en cadena de la polimerasa, más conocida por siglas en inglés PCR (Polymerase Chain Reaction). Es de mi particular interés dar a conocer las pautas y aspectos generales de las técnicas de PCR y ciclo de la secuenciación, es necesario resaltar que para las dos, se
  • 2. necesitan el uso del termociclador, siendo importante conocer su uso de forma clara y exacta. Objetivo. Realizar en la práctica, un laboratorio de biología molecular usando las técnicas de PCR y ciclo de la secuenciación, además aprender a usar y programar el termociclador para amplificación de material genético. Materiales: Tubos para PCR y secuenciacion Micropipetas Puntas Reactivos Bandeja de PCR y secuenciacion Rack para tubos Papel microfilm Protocolos para PCR protocolo - 16.38 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.
  • 3. - 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1 µl de cada cebador a una concentración de 20 µM. - 0.12 µl de Taq polimerasa (Qiagen). - 1 µl de ADN genómico. Segundo protocolo. - 14.22 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2. - 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1 µl de cada cebador, a una concentración de 20 µM. - 0.28 µl de Taq polimerasa (BOEHRINGER MANNHEIM). - 3 µl de ADN genómico. Tercer Protocolo - 12.4 µl de ddH2O. - 2.5 µl de buffer 10x, para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5). - 3.0 µl de 2.5 mM de MgCl2. - 2.5 µl de 8 µM de cada uno de los dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados). - 1.25 µl de cada cebador a una concentración de 10 µM. - 0.1 µl de 2.5 unidades de Ampli Taq (Perkin Elmer) - 2 µl de ADN genómico.
  • 4. Para cada uno de los protocolos presentados con anterioridad, se utilizaron perfiles de amplificación diferentes, los perfiles son los siguientes: Primer perfil de amplificación Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 2:00 2 94 O:30 3 57 0:40 seg (-0.5 por/ciclo) 4 72 0.3 ºC/seg 5 72 1:10 (+1seg/ciclo) 6 Ir a Ciclo 2 7 veces 7 94 0.30 8 53 0:40 9 72 1.18seg +1segundo por ciclo 10 Ir a Ciclo 7 26 veces 11 72 10:00 12 10 Permanente 13 Fin Fin Segundo perfil de amplificación. Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo
  • 5. 1 93 2:00 2 93 O:30 3 50 0.35 4 72 0.4 ºC/seg 5 72 1:10 (+1seg/ciclo) 6 Ir a Ciclo 2 34 veces 7 72 10:00 8 10 Permanente 9 fin fin Tercer perfil de amplificación. Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 3:00 2 94 1:10 3 52 1.30 4 72 2:30 5 Ir a Ciclo 2 30 veces 6 72 5:00 7 10 Permanente 8 fin fin
  • 6. Ciclo de la secuenciación componentes son: - 3 µl de ddH2O - 2 µl buffer 5x - 1 µl de cada cebador a una concentración (ver Tabla 3) - 1 µl Big Dye - 3 µl de ADNmt (gelasa) El perfil de secuenciación cíclica programado Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 95 0:15 2 60 0:30 3 60 4:00 4 Ir a Ciclo 1 29 veces 5 10 Permanente 6 fin Fin
  • 7. El perfil de secuenciación cíclica programado para Ciclo Temperatura (ºC) Tiempo 1 96 0:15 2 95 0:10 3 50 0.05 4 60 4:00 5 Ir a ciclo 2 29 veces 6 10 Permanente 7 fin Fin Nota. Es necesario el uso de bata blanca y guantes es de caracter obligatorio