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Curso básico de citometría de flujo

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Curso básico de citometría de flujo. Cedido por Javier Godino Gómez.Unidad de Separación Celular y Citometria …

Curso básico de citometría de flujo. Cedido por Javier Godino Gómez.Unidad de Separación Celular y Citometria
Servicios Científico Técnicos IIS Aragón. Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Edificio CIBA

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  • 1. CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO. Javier Godino. César Vallejo. Desirée Perebom Servicio de separación celular y citometría CITOMETRÍA DE FLUJO. FUNDAMENTOS. • Que es la citometría de flujo. • Componentes de un citómetro de flujo. • Dispersión de la luz. • Fluorescencia. Fluorocromos, Compensación de fluorescencias. • Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo 1
  • 2. ¿Qué es la citometría de flujo? La citometría de flujo es una técnica que permite medir simultáneamente múltiples características ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada una de las células o partículas presentes en una suspensión. • Suspensión de células individuales. - Buffer + EDTA o DNAsa. - Células en frío. - Lisados tisulares: Disgregación enzimática + filtrado • Comprobar que el método de disgregación o recolección del cultivo no afecta a los parámetros que queremos medir. Parámetros medibles • Directos. - Tamaño y complejidad celular • Indirectos. Se añaden a la suspensión celular reactivos con propiedades ópticas determinadas: FLUOROCROMOS. - Unión a componentes nucleares: ADN. - Parámetros metabólicos: pH, concentración de Ca2+ - Unión a proteínas de membrana o intracelulares a través de anticuerpos conjugados a fluorocromos 2
  • 3. ¿Que es un citómetro? •Sistema que hace pasar células de una en una haciendo incidir sobre ellas un láser. • Mide dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y emisión de fluorescencia. Boquilla de inyección Dispersión Señal fluorescente Dispersión Láser incidente focalizado Partes de un citómetro de flujo • Sistema de Fluidos – Crea un flujo constante de fluido envolvente – Transporta la muestra al punto de interrogación – Alinea las partículas de modo que pasen de una en una por el punto de interrogación • Óptica – Focaliza el láser de excitación – recoge y mide la luz emitida • Electrónica – Convierte la señal óptica en un pulso electrónico – Envía la señal al procesador para ser analizado • Software – Muestra gráficamente los datos – Controla la configuración del sistema Sistema de fluidos del FACSAria Carro de fluidos Presión Plenum Cámara Fluido envolvente Tubo de muestra Basura 3
  • 4. Enfoque hidrodinámico Muestra Fluido envolvente Baja velocidad de inyección Muestra Envolvente Alta velocidad de inyección Enfoque hidrodinámico El flujo laminar permite mantener las células en el centro del flujo y evita la formación de turbulencias. Enfoque hidrodinámico Flujo laminar Flujo turbulento 4
  • 5. Enfoque hidrodinámico 10 psi 10 psi 10 psi 10.2 psi 10.4 psi • 10.8 psi La diferencia entre las presiones de la muestra y la del líquido envolvente determina el diámetro del “capilar virtual” Enfoque hidrodinámico Velocidad de muestra alta (dif. presión alto) dif. Velocidad de muestra baja (dif. presión bajo) dif. Haz del láser Haz láser Intensidad de luz Muestra Líquido de arrastre 400 300 # Cells Máxima iluminación CV bajos 200 100 0 10 0 10 1 2 10 CD4 FITC 10 3 10 4 Iluminación variable CV altos Óptica de excitación • Excitación mediante fuentes de luz coherentes. Láseres • Un sistema de prismas dirige la luz hacia la cámara de flujo. • Enfoca el láser sobre el flujo de células 5
  • 6. Óptica de emisión • Una vez que el láser incide la célula responde emitiendo luz a varias longitudes de onda, en función de que fluorocromos hayamos usado → Tenemos que separar la fluorescencia asociada a cada característica celular: FILTROS Transmittance Óptica de emisión: Filtros 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance Óptica de emisión: Filtros 400nm 500nm 600nm 700nm 6
  • 7. Transmittance Óptica de emisión: Filtros 400nm 500nm 600nm 700nm Óptica de emisión: Espejos Óptica de emisión PMT 4 PMT 3 Filtros Dicroicos PMT 2 PMT 1 Cámara de flujo SS C FSC Laser Bandpass Filters 7
  • 8. Óptica de emisión PMT 4 PMT 3 Filtros Dicroicos PMT 2 Cámara de flujo PMT 1 SS C FSC Laser Bandpass Filters Óptica de emisión Óptica de emisión PerCP-Cy5.5 PE FITC SSC PE-Txred PE-Cy7 8
  • 9. Detectores • Convierten la señal luminosa en corriente eléctrica. La intensidad de esta señal es proporcional a la luz que llega. • En citometría se usan de 2 tipos ambos basados en el efecto fotoeléctrico: - Fotodiodos de silicio: Los fotones que inciden en una placa de silicio liberan electrones. • Menos eficientes se usan para medir la dispersión frontal (FSC) - Tubos fotomultiplicadores: Mas eficientes: Se usan para medir fluorescencias y dispersión lateral (SSC) Tubo fotomultiplicador Laser 1 Voltaje ELECTRONICA Creación de un pulso de voltaje 2 Laser Voltaje Tiempo 3 Laser Voltaje Tiempo Tiempo 9
  • 10. Pulse area(A) 0 40 Pulse Width (W) 10 256 196 1 10,000 1000 3.54 volts .1 (Volts) (Volts) 6.21 volts 128 .01 64 .001 (1mV) 100 0 1.23 volts 0 Channel Number 10 Time (µs) 10 Relative Brightness Voltage Pulse Height (H) Área, altura, anchura 1 Umbral de adquisición (Treshold) • Eliminamos las señales muy bajas que en general corresponden a restos celulares que no nos interesan 1 256 196 .1 (Volts) 3.54 volts (Volts) 6.21 volts 128 .01 64 .001 (1mV) 0 1.23 volts UMBRAL 0 10,000 1000 100 10 Relative Brightness 10 Channel Number 10 1 10
  • 11. Medición del tamaño y la complejidad celular Forward scatter tamaño (488 nm) Láser (488 nm) Side scatter Complejidad (488 nm) Dispersión frontal (FSC) Dispersión lateral (SSC) se mide en la dirección de la luz incidente (2-5 grados) a la misma λ Medido perpendicularmente a la dirección de la luz incidente a la misma λ Relacionado con el tamaño/ superficie celular (relación lineal sólo para partículas esféricas) Relacionado con la complejidad celular (granularidad) Representación de la información: Histogramas Voltaje Tamaño- FSC Laser Tiempo Representación de la información: Histogramas Laser Voltaje Tamaño- FSC Tiempo 11
  • 12. Representación de la información: Histogramas Voltaje Tamaño- FSC Laser Tiempo Representación de la información: Histogramas Tamaño- FSC FSC Tamaño/Complejidad Voltaje Representación de la información: Diagrama de puntos Tamaño Tiempo Voltaje Laser Complejidad Tiempo 12
  • 13. Tamaño y complejidad: Células sanguíneas Granulocitos Monocitos Linfocitos Debris Fluorescencia S2 El fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente y S1 se excita Disipa la energía absorbida de forma prácticamente hλ instantánea: S0 Vibración y generación de calor emisión de un fotón de mayor longitud de onda (menos energético) Absorción Emisión Fluorocromos Moléculas orgánicas pequeñas. Isotiocianato de fluoresceina (FITC) Proteínas. Ficoeritrina (PE) 13
  • 14. Quantum dots • Nanoesferas de material semiconductor: Cd + Se o Te. • Rodeadas de ZnS y un polímero orgánico. • Funcionalizadas anticuerpos. para poder unirse a Quantum dots • Funcionan como fluorocromos. Al recibir un fotón emiten otro de mayor longitud de onda. • La λ a la que emiten es proporcional al tamaño del núcleo del material semiconductor. Quantum dots • Ventajas: - Pico de absorción ancho: Con un láser excitamos muchos QD. - Pico de emisión estrecho: Mejor compensación. - Más estables. • Inconvenientes: - Poca disponibilidad. - Toxicidad: pesados. Liberan metales - ¿Conjugación con anticuerpos?, ¿marcaje intracelular? 14
  • 15. Brilliant violet • Polímeros orgánicos conductores • Ultra brillantes. Entre PE y APC. • Un solo láser (405) excita todos los BV Cytometry Part A 81A: 456466, 2012 PK Chattopadhyay Fluorocromos Intensidad relativa 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Excitation Emission Fluoresceina (FITC) Fluorocromos Intensidad relativa 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Excitation Emission Ficoeritrina (PE) 15
  • 16. Intensidad relativa Fluorocromos 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Excitation Emission Fluoresceina (FITC) Ficoeritrina (PE) Inmunofenotipado λ=488 nm Excitación λ=520 nm λ=580 nm Emisión 16
  • 17. • La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o colorante debido a la excitación por el láser es emitida en todas direcciones. • Situamos el detector a 90º para minimizar interferencias. • La especificidad de la detección está controlada por la selección de longitudes de onda por parte de espejos y filtros ópticos. Láser Detector FSC Detector de FLs (PMT3, PMT4 etc.) Los citómetros de flujo pueden llevar incorporados diversos láseres de forma simultanea. 350 300 nm 407 457 488 532 400 nm 500 nm 610 632 600 nm 700 nm PE-TR Conj. PETexas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid cis- 17
  • 18. Compensación de Señales Fluorescentes Intensidad Relativa FITC PE 488 Longitud de onda 505505-520 570570-590 Compensación de Señales Fluorescentes Células marcadas sólo con FITC Compensación de Señales Fluorescentes Muestra compensada F CompensadaPE = F Medida PE - % FFITC 18
  • 19. Compensación de Señales Fluorescentes SIN COMPENSAR COMPENSADA PE FITC Universidad de Purdue Compensación de Señales Fluorescentes PE PE FITC FITC El valor de la compensación depende de la intensidad de la señal PE Universidad de Purdue Compensación de Señales Fluorescentes • COMP BEADS: Mezcla de bolas de látex de 2 tipos: - Recubiertas de anticuerpos anti cadena κ. - “Desnudas” • Al añadir cualquier anticuerpo con cadenas ligeras κ se unirá a las partículas recubiertas y no a las desnudas. • Preparamos tantos tubos como fluorocromos vamos a usar y encada uno añadimos un anticuerpo con un fluorocromo diferente 19
  • 20. Compensación de Señales Fluorescentes. Comp Beads • La compensación es correcta cuando la media de la fluorescencia para PE es igual para las 2 poblaciones Compensación de Señales Fluorescentes • Fluorocromos en tándem • El desplazamiento de λ entre absorción y emisión es pequeño: Limita los fluorocromos utilizables simultáneamente → FLUOROCROMOS EN TANDEM Láser APC Cy7 Emisión 20
  • 21. • Cuidado con los flurocromos en Tándem. El “fluorocromo lejano” se puede excitar directamente al pasar por un láser adecuado. PE 770 nm Cy7 Láser azul PE 770 nm Cy7 Láser rojo Fluorocromos en tándem • Aumenta el número de fluorocromos utilizables, pero se rompen con facilidad. 0 horas 2 horas 22,5 horas S.C Bendall et al. 21
  • 22. ASPECTOS PRÁCTICOS ¿Qué fluorocromo uso? • No todos los fluorocromos son igual de “buenos” produciendo fluorescencia. • Rendimiento cuántico: Cuantos fotones necesita recibir un fluorocromo para emitir uno → Determina el llamado “indice de marcado” Indice de marcado = D / W D = Diferencia entre la mediana de los picos W = 2 x SD (Desviación estandar) CD127 PE 40 35 Stain index 30 25 mW green laser (532 nm) 25 100 mW blue laser (488 nm) 20 25 mW blue laser (488 nm) 15 10 5 0 300 400 500 600 700 PMT voltage • Hay que elegir la combinación “mas brillante” posible, en cualquier caso, los fluorocromos más brillantes deben reservarse para los marcajes más débiles y debe minimizarse la compensación . 22
  • 23. AUTOFLUORESCENCIA • Tambien FAD, AA aromáticos, Vit A…. • Sobre todo azul-verde (FITC). • Granulocitos, monocitos, linfocitos activados Espectro de absorción y emisión de NAD(P)H Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF S.C Bendall et al. Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF 23
  • 24. Hay vida más allá de la fluorescencia: CYTOF • En teoría + de 100 marcajes simultáneos (contaminación y oxidación bajan el número) sin necesidad de compensación • Índice de Marcado peor que los fluorocromos más brillantes pero muy parecido entre ellos. • Vmax 1000 cels/seg. Además sólo aprovecha el 30% de la muestra. • No FSC/SSC, ni niveles de calcio, división celular……… ¿ Que podemos medir por citometría de flujo? Metabolitos Características de la citometría de flujo -El análisis es multiparamétrico y simultáneo. - El análisis se realiza sobre partículas individuales dentro de una población compleja. - El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000 partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad estadística (permite analizar poblaciones representadas en baja frecuencia). - Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm (bacterias, levaduras, células eucarióticas). 24
  • 25. Características de la citometría de flujo •El análisis no permite determinar la localización de la fluorescencia. • En el caso de células adherentes tenemos que despegarlas del soporte de cultivo, lo que puede alterar su fisiología. • Se consume muestra. La citometría convencional no permite re-análisis de la misma. CITOMETRÍA DE FLUJO. INMUNOFENOTIPADO • ¿Qué es un anticuerpo?. • Marcaje directo extracelular. Representación de la información: Histogramas, gráficas de puntos y densidad, escalas. • Otras estrategias de marcado: Marcaje intracelular, marcaje indirecto. • Controles en inmunofenotipado: Isotipo, biológicos y FMO. • Bloqueo de receptores Fc • ¿Cuánto anticuerpo uso? 25
  • 26. • Se basa en la unión específica de los anticuerpos con su antígeno correspondiente. • Se generan anticuerpos frente a las proteínas cuya presencia en la célula queremos determinar y se les acopla un fluorocromo. • Si la célula expresa la proteína el anticuerpo se une y veremos fluorescencia asociada a esa célula Anticuerpos • Son glicoproteínas producidas por linfocitos B. Reconocen con alta afinidad sustancias extrañas y activan la posterior respuesta inmune. • Principal Característica: Enorme diversidad. - Recombinación somática. - Hipermutación - Cambio de clase. • En proteínas reconoce zonas pequeñas (± 7 aa). Se pueden generar varios anticuerpos misma proteína Estructura de las Anticuerpos inmunoglobulinas Región variable Región variable κ, λ α, δ, ε, γ, µ 26
  • 27. Anticuerpos Anticuerpos monoclonales. • Cuando inmunizamos un animal con un antígeno obtenemos una mezcla de anticuerpos contra los diferentes epítopos → Anticuerpo policlonal. - Producción limitada: Necesidad de sucesivas inmunizaciones. • Anticuerpos monoclonales. Son producidos por un único clon específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y subclase determinadas y tienen una especificidad única frente a un antígeno determinado. Anticuerpos Marcaje superficial λ=488 nm Excitación λ=530 nm Emisión 27
  • 28. Marcaje superficial • La intensidad del marcaje es proporcional al número de moléculas diana que hay en la superficie Estudio monoparamétrico Estudio multiparamétrico Triples negativos Simples positivos Dobles positivos Triples positivos 28
  • 29. Representación de la información • Gráficas bidimensionales S.C Bendall et al. Trens in Immunology Representación de la información Gráficas tridimensionales Gráficas n-dimensionales 29
  • 30. Representación de la información • Diagrama de densidad o de contorno. • Diagrama de puntos Representación de la información Representación de la información Escala lineal. Escala logarítmica 30
  • 31. Representación de la información Escala Logicle-biexponencial: Nos muestra los valores negativos: Los software realizan una corrección del ruido de fondo (baseline) que puede hacer que ciertas partículas muy poco fluorescentes nos den un valor negativo Representación de la información Escala Logicle-biexponencial Estrategia de análisis 31
  • 32. Estrategia de análisis CD28 CD 95 Fluorocromos en Tándem. Falsos positivos HY Maecker Cytometry Part A 62A:169–173 (2004) 32
  • 33. • El marcaje pude ser superficial o intracelular. • En el caso del marcaje intracelular hay que. - Permeabilizar la célula. Los anticuerpos no difunden a través de la membrana celular → Detergentes (Saponina, Tween). - Fijar la célula para evitar que el contenido intracelular salga al exterior → paraformaldehido, etanol. • Comprobar que el tratamiento no afecte al marcaje. Marcaje intracelular Marcaje superficial Fijación Permeabilización Marcaje intracelular Estrategias de marcado Directo Indirecto Avidina-Biotina Primario conjugado (directo) Primario conjugado con biotina Primario sin conjugar (indirecto) Complejo avidina-fluorocromo Secundario conjugado (indirecto) 33
  • 34. • Para realizar el marcaje simplemente se añade el anticuerpo a la suspensión celular, se deja incubar 15-30 min. A 4º C, se lava para eliminar el exceso de anticuerpo, se resuspende y se lleva al citómetro • En el caso de marcaje indirecto se hacen 2 incubaciones consecutivas con un paso de lavado intermedio. • Si trabajamos directamente con sangre debemos realizar un paso final de lisis de eritrocitos sin afectar a los leucocitos. • Si no podemos analizarlas en el momento se puede fijar las células Controles de isotipo. • El anticuerpo puede unirse inespecíficamente a la superficie celular o a las proteínas citoplasmáticas → Falso positivo. • Para controlar este problema se usan los controles de isotipo: Anticuerpos de la misma clase del que usamos y con el mismo fluorocromo pero diseñados para reconocer moléculas que nunca están presentes en las células → el marcaje que aparezca sólo será por uniones inespecíficas. Controles de isotipo Unión específica Unión inespecífica Control de isotipo Primario conjugado (directo) Control de isotipo 34
  • 35. Representación de la información: Controles de isotipo CONTROLES BIOLÓGICOS • Para que los controles de isotipo sean adecuados es necesario que se comporten igual que los anticuerpos que vamos a usar → Difícil de asegurar (¿concentración? ¿moléculas de fluorocromo por anticuerpo?) • El mejor control es usar nuestro anticuerpo en unas células lo mas parecidas posibles a las que queremos estudiar pero que no expresen el marcador de interés → Control biológico. CONTROLES BIOLÓGICOS CD8 35
  • 36. Controles FMO • No corrigen la unión inespecífica sino la interferencia entre fluorocromos que no elimina la compensación •Se añaden en un tubo todos los fluorocromos menos el “controlado” → Fluorescence Minus One Perfetto et al. Nature Review Immunology (4) 648-655, 2004 Controles Comparación de controles H.T MAECKER BD Biosciences Bloqueo de receptores Fc • Diversos tipos de leucocitos poseen receptores que se unen a la zona constante de los anticuerpos. • Unen por lo tanto inespecíficamente cualquier anticuerpo que se les añada Receptor Fc Antígeno Anticuerpo conjugado 36
  • 37. Bloqueo de receptores Fc • Para solucionar este problema, antes de añadir el anticuerpo específico, se incuba la suspensión celular con un gran exceso de anticuerpo sin marcar • Especialmente importante si la señal fluorescente es débil, en el caso de marcajes intensos aunque disminuye la relación señal/ruido no es imprescindible Bloqueo de receptores Fc IgG (ratón) Antígeno Receptor Fc Anticuerpo conjugado ASPECTOS PRÁCTICOS ¿Cuánto anticuerpo añado? • Si añadimos más anticuerpo tenemos más unión a la proteína problema, pero también más unión inespecífica. Señal/ ruido Titulación del anticuerpo: Probar diferentes cantidades hasta encontrar la que da la relación señal/ruido óptima Concentración de anticuerpo 37
  • 38. ASPECTOS PRÁCTICOS ¿Cuánto anticuerpo añado? • Lavar después de añadir el anticuerpo disminuye mucho la unión inespecífica Unión específica Señal Unión inespecífica. Concentración de anticuerpo CITOMETRÍA DE FLUJO. ESTUDIO DE CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN • Estudio de ácidos nucleicos. - Fluorocromos usados. - Aplicaciones: + Detección de células nucleadas. + Discriminación de células muertas. + Estudio de ciclo celular. Fundamento, adquisición y eliminación de dobletes. - Ciclo celular y BrdU - Ciclo celular e inmunofenotipado. • Estudios de proliferación. Número de divisiones celulares 38
  • 39. • Se usan fluorocromos con las siguientes características. - Unión estequiométrica a los ácidos nucleicos. - Fijación estable a los mismos. - La fluorescencia aumenta al unirse. • Diversas especificidades: Unión a ADN y ARN, pares A-T, pares G-C. • 2 tipos. - Impermeables. No atraviesan la membrana plasmática intacta. - Permeables. Atraviesan la membrana plasmática. Detección de células nucleadas • Incubamos con una sonda permeable de unión al ADN. Entra en todas las células y tiñe aquellas que tienen núcleo • Interesante si trabajamos en sangre con poblaciones minoritarias: Elimina hematíes y agregados plaquetarios Stuart T.F et al Blood 2006 39
  • 40. Viabilidad celular. • Cuando la célula muere se abren poros en la membrana lo que permite la entrada de colorantes que se unen al ADN incapaces de atravesar la membrana intacta Importante eliminar del análisis las células muertas → Más autofluorescentes y más unión inespecífica del anticuerpo. Viabilidad celular. Vivas/muertas Marcaje inespecífico Ciclo Celular Ciclo celular y contenido de ADN. G0/G1 → 2n. S → 2n/4n. G2/M → 4n 40
  • 41. Ciclo Celular • La cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de ADN. • El colorante más usado es el yoduro de propidio. • El PI tiene una elevada eficiencia cuántica y es barato, pero se une también a RNA bicatenario (hay que tratar con RNAsa) y tiene un espectro de emisión ancho (dificulta la posibilidad de otros marcajes). Ciclo Celular PI Fijación Permeabilización G0/G1 S G2/M Ciclo Celular. Adquisición en el citómetro. • Siempre en escala lineal: Mayor separación de los picos. • Muy importante conseguir la mayor resolución de los picos (bajo CV). - Adquirir a la menor presión y velocidad de inyección posibles. - Adquirir el máximo número de células posible (> 10.000) 41
  • 42. Ciclo Celular Discriminación de dobletes. 120 Tiempo Láser 90 2n 2n+2n 60 30 0 PI Area Yellow-A 4n Igual área pero diferente anchura del pulso. Contenido de DNA R1 0 30 60 90 120 Yellow-W PI Anchura Ciclo Celular Discriminación de dobletes Ciclo Celular CARIOTIPO DE FLUJO 42
  • 43. Ciclo Celular • No G0/G1 es posible la delimitación exacta de las fases del ciclo G2/M S G0/G 1 S G2/M Ciclo Celular • Se puede recurrir a 280 G0/G1 programas Number 210 que informáticos utilizan modelos matemáticos para delimitar 70 140 G2/M las fases 0 S 0 30 60 90 120 150 Channels (Yellow-A) Ciclo Celular celulares con diferente 400 800 1200 contenido de ADN 0 Number 1600 • Mezcla de 2 poblaciones 0 30 60 90 120 150 Channels (Yellow-A) 43
  • 44. Ciclo Celular 0 200 400 Number 600 800 • Mezcla de poblaciones 2n y 4n 0 50 100 150 200 250 Channels (Yellow-A) Ciclo Celular • Controles en ciclo celular. Timocitos de ternera Eritrocitos de pollo 35% del ADN humano Ciclo Celular. BrdU • La BromodeoxiUridina es un análogo de la Timidina. Se incorpora al ADN de aquellas células que están duplicando el ADN. • Añadiendo posteriormente un anticuerpo anti BrdU y un fluorocromo que se una al ADN podemos determinar que células están en la fase S del ciclo. • Problema. Para que el anticuerpo llegue hasta la BrdU es necesario desnaturalizar el ADN (Calor, DNAsas, ácidos). Existen otros análogos de la T que no requieren este paso. 44
  • 45. Ciclo Celular. BrdU Incubación Br BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) Desnaturalización Br Ciclo Celular. EdU Incubación EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Ciclo Celular. BrdU Ormerod M. Basic flow cytometry 45
  • 46. Ciclo Celular. BrdU • Si añadimos cultivo, lavamos recogiendo BrdU al incubamos, y vamos células a diversos intervalos tenemos una imagen dinámica del ciclo Gary Warnes. University of London Ciclo Celular • No se puede distinguir la fase G0 de la G1 (ambas 2n) y la fase G2 de la M (ambas 4n) • Si medimos el contenido en ARN podemos separa G0 de G1 • Mediante inmunofenotipado de proteínas cuya expresión cambia durante las fases del ciclo podemos discriminar G0 de G1 y G2 de M Ciclo Celular. Contenido de ARN Pyronina. Intercalante en dsNA. - Más especificidad por dsRNA, aunque no exclusivo. - Marca rRNA y tRNA no RNA total. - Exc 547-560nm, emi 565-574nm. Naranga de acridinio. - Mide el RNA total. - Se excita a 488nm y emite en rojo unido al RNA y verde unido al DNA - Muy dependiente de las condiciones: concentración, fuerza iónica, detergentes. 46
  • 47. Ciclo Celular. Contenido de ARN WOODWARD et al. PNAS 2007 Ciclo Celular. Inmunofenotipado • Diferenciación de fase G2- M Ormerod M. Basic flow cytometry Ciclo Celular. Inmunofenotipado Expresión de ciclinas y ciclo celular Ormerod M. Basic flow cytometry. 47
  • 48. Estudio del número de divisiones celulares • Se usa una sonda que difunde a través de la membrana y una vez en el interior de la célula se modifica, se vuelve fluorescente y no pueda salir. CFSE Tras una división Tras dos divisiones Sin dividir Fluorescencia / célula X X/2 X/4 Estudio del número de divisiones celulares Proliferantes No proliferantes • El número de ciclos distinguibles es limitado: Dilución excesiva de la sonda. • La fluorescencia depende del tamaño, poblaciones con mucha dispersión del mismo dan resultados pobres. Estudio del número de divisiones celulares • Combinación con marcaje de membrana • Combinación con estudio de viabilidad 48
  • 49. CITOMETRÍA DE FLUJO. ESTUDIO APOPTOSIS Y MUERTE CELULAR Apoptosis • La apoptosis es un modo de muerte celular activo y fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su propia muerte. Regulado por Caspasas • La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés: choque térmico, hipotónico, pH.. • Los métodos deben distinguirlas Apoptosis 49
  • 50. Apoptosis Apoptosis Diferencias entre apoptosis y necrosis Apoptosis Necrosis Núcleo Condensación densa de la cromatina Agrupación irregular de la cromatina Organelas citoplásmicas Intactas morfológicamente Anormales Membrana celular Cuerpos apoptóticos Blebbing Blebbing y pérdida de la integridad Volumen celular Se reduce Se incrementa En tejidos Células aisladas Grupos de células Respuesta tisular Ninguna Inflamación 50
  • 51. Apoptosis y patología. • Disminuida: • Aumentada: - Cancer: Linfomas foliculares, tumores - SIDA -Enfermedades neurodegenerativas: con mutación en p53, tumores Alzeheimer, Parkinson, ELA, Retinitis hormonodependientes (mama, próstata, pigmentosa ovario) - Anemia aplásica. - - Isquemia: Infarto, Accidente cerebro Glomerulonefritis vascular - - Cirrosis alcohólica adenovirus Enfermedades Virus: autoinmunes: Herpesvirus, LES, poxvirus, Apoptosis Métodos De Análisis por citometría • Exposición fosfatidilserina • Fragmentación de ADN • Detección de caspasas activadas. • Función mitocondrial. • Otros: Radicales de oxígeno, cambios en la permeabilidad de membrana, niveles de iones, Familia Bcl2, cambios en tamaño y complejidad Estudio de apoptosis. Anexina V/PI PS: Fosfatidil serina 51
  • 52. Estudio de apoptosis. Anexina V/PI 10 3 10 3 14% 10 10 2 2 15% 10 1 10 2 10 3 10 4 10 1 37% 10 0 10 1 5% 10 0 10 5% 10 10 4 4 Fármaco 6% 0 Yoduro de Propidio Control 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Anexina V Células vivas Apoptosis temprana Apoptosis tardía Necrosis Estudio de apoptosis. Anexina V/PI • Método sencillo, rápido y relativamente barato. • Fácil de combinar con inmunofenotipado de membrana: La anexina se puede marcar con el fluorocromo que queramos y el PI se puede sustituir por otra sonda similar (7-AAD). • Limitaciones: - Apoptosis sin exposición de PS. - En la necrosis puede haber marcaje de Anexina V. Estudio de apoptosis. Anexina V/PI NECROSIS VIVAS APOPTOSIS TARDIA + ¿NECROSIS? APOPTOSIS TEMPRANA 52
  • 53. Estudio de apoptosis. Fragmentación del ADN Rotura internucleosomal Estudio de apoptosis. Fragmentación del ADN T – Tdt mediated U – dUTP-biotin N – nick E – end L – labelling Poli-BrdU Tdt 3’-OH-ADN 3’-OH-ADN 3’-OH-ADN-UTP-Brd Anti-BrdU-FITC 3’-OH-ADN 3’-OH-ADN ADN • Técnica relativamente sencilla. • Implica fijar las células. • Existen procesos apoptoticos sin rotura internucleosomal Estudio de apoptosis. Fragmentación del ADN • Se puede combinar con inmunofenotipado y con estudio del ciclo celular. Ormerod M. Basic flow cytometry 53
  • 54. Estudio de apoptosis. Fragmentación del ADN • Pico sub-diploide 3% 0.25 µg/mL Control Mitoxantrona G1 S G1 21% S G2/M 0 40 80 120 G2/M 160 200 0 40 80 120 160 200 Channels (FL2-A-PI MITO 24H) Channels (FL2-A-PI CONTROL 24H) Estudio de apoptosis. Activación de caspasas • El método más directo es usar marcados anticuerpos contra la forma activada de las caspasas Estudio de apoptosis. Activación de caspasas • Detección de rotura de sustratos. - Anticuerpos anti-proteínas rotas por caspasas (PARP). - Rotura de sustratos con cambio de fluorescencia. SUSTRATO- SUSTRATO + CASPASA • Inhibidores fluorescentes (FLICA) 54
  • 55. Estudio de apoptosis. Activación de caspasas • Rotura de sustrato fluorescente Estaurosporina Control Ormerod. Basic flow Cytometry Estudio de apoptosis. Función mitocondrial • La mitocondria es el mediador clave en la apoptosis inducida por estrés celular. • Uno de los primeros cambios que ocurre al iniciarse la apoptosis es una pérdida del potencial de membrana mitocondrial (Ψm). • Existen fluorocromos cuya fluorescencia varia con Ψm Estudio de apoptosis. Función mitocondrial • Moléculas fluorescentes que se acumulan en la mitocondria si Ψm está conservado, sino, salen de la mitocondria y de la célula. Control KCN DiOC6(3) N: Vivas; D: muertas; A: apoptóticas Ormerod. Basic flow Cytometry 55
  • 56. Estudio de apoptosis. Función mitocondrial • Moléculas que cambian su fluorescencia en función de su estado de agregación: Si Ψ2 está intacto se acumulan en la mitocondria (alta concentración, agregados) si no salen al citoplasma (baja concentración monómeros) JC-1. • Agregados: rojos. • Monómeros: Verdes A: Control; B: Apoptosis Estudio de apoptosis. Función mitocondrial • Existen otros parámetros mitocondriales que se afectan en la apoptosis y que podemos estudiar por citometría • Liberación cit c. • Producción de ROS: Disfunción de la cadena respiratorio • Apo 2.7: Anticuerpo que reacciona con una proteína mitocondrial que aparece en membrana en la apoptosis. muy temprano Estudio de apoptosis. Proteínas de la familia Bcl2 • Familia de proteínas que controla la formación de poros en la membrana mitocondrial y regula la apoptosis. - Pro apoptóticas: Bax, Bak, Bid, Bik, Bcl-Xs, Bad - Anti apoptóticas : Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Brag-1, Bfl-1 Ratio Bcl2/Bax Neutralidad Supervivencia Muerte 56
  • 57. Cambios en el volumen y la complejidad celular APOPTOSIS VOLUMEN COMPLEJIDAD inicial Disminución Aumento tardía Disminución Disminución inicial Aumento Disminución tardía Disminución Disminución NECROSIS Poco específico y poco sensible: células muertas, debris, núcleos aislados, cuerpos apoptóticos Cambios en volumen y complejidad celular Fármaco 128 128 0 0 64 64 SSC 192 192 256 256 Control 0 64 128 192 256 0 64 128 192 256 FSC Cambios en la permeabilidad de la membrana • A medida que aumenta la apoptosis siendo la membrana va mas permeable a fluorocromos con carga como PI, aunque no pierde totalmente su funcionalidad. Ormerod. Basic flow Cytometry • La cantidad de fluorocromo que entra es demasiado pequeña para dar el máximo de fluorescencia posible 57
  • 58. Estudio de apoptosis. Secuencia de acontecimientos. Formación apoptosoma Disminución ∆ψm Activación caspasa Proteólisis PARP Externalización FS Fragmentación ADN Cambios morfológicos Membrana permeable 2 4 6 8 10 Horas aproximadas después de la inducción por anti-FAS CITOMETRÍA DE FLUJO. ANÁLISIS FUNCIONAL. • Producción de ROS. • Medida de pH • Medida de concentración intracelular de Ca2+ libre • Potencial de membrana • Actividad enzimática. • Estudio de genes reporteros: Proteínas fluorescentes. • Estudio de la “side population”. • Estudio de componentes celulares. • Otras aplicaciones. 58
  • 59. Estudios funcionales APLICACIONES • Se acopla un cambio de emisión a un proceso biológico: Moléculas cuya fluorescencia cambia con pH, nivel de iones, procesamiento por una enzima, potencial de membrana celular o mitocondrial ….. y que se retiene en la célula. Producción de especies reactivas de oxígeno • Fluorocromos cuya Dihidrorodamina 123 fluorescencia cambia con su estado redox H2O2 RODAMINA 123 Producción de especies reactivas de oxígeno • Estallido respiratorio en neutrófilos estudiado con dihidroetidina Ormerod M. Basic Flow Cytometry 59
  • 60. Structure Reactive Oxygen Species H2O2 Hydrogen peroxide Carboxy-H2DCFDA ,CM-H2DCFDA ,Dihydrocalcein AM Dihydrorhodamine 123 , Dihydrorhodamine 6G , H2DCFDA , Lucigenin Luminol , RedoxSensor Red CC-1 HO• Hydroxyl radical 3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl) fluorescein (HPF), CM-H2DCFDA Proxyl fluorescamine ,TEMPO-9AC HOCl Hypochlorous acid Aminophenyl fluorescein (APF) , Dihydrorhodamine 123 ,Luminol NO Nitric oxide DAF-FM , DAF-FM diacetate, DAA , 2,3-Diaminonaphthalene ,Luminol ROO• Peroxyl radical, including both alkylperoxyl and hydroperoxyl radicals (wherein R = H) BODIPY FL EDA, BODIPY 665/676, H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA, DPPP, Luminol, cis-Parinaric acid, RedoxSensor Red CC-1 ONOO– Peroxynitrite anion 3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl) fluorescein (HPF), H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA, Coelenterazine Dihydrorhodamine 123, Dihydrorhodamine 6G, Luminol 1O 2 Singlet oxygen Singlet Oxygen methoxyvinyl)pyrene Superoxide anion Coelenterazine, Dihydroethidium, Fc OxyBURST Green assay reagent OxyBURST Green H2DCFDA SE, OxyBURST Green H2HFF BSA, Lucigenin Luminol, MCLA, MTT, NBT, RedoxSensor Red CC-1, TEMPO-9-AC, XTT •O2– Detection Reagents Sensor Green reagent, trans-1-(2'- Medida del pH • Generalmente ácidos débiles con un pKa cercano a 7 y con un fluorescencia diferente en las formas desprotonadas y protonadas. Cambio en la intensidad de fluorescencia de la fluoresceina con el pH Medida del pH • Generalmente fluorocromos se con usan distintos picos de emisión entre la forma protonada y desprotonada → Medidas ratiométricas Espectro de emisión de SNARF-1 en función del pH 60
  • 61. Medida del pH • Medidas cinéticas de cambio de pH intracelular en leucocitos tras acidificación del medio con BCEF (ratio amarillo/verde) O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001 Medida del pH • Método cuantitativo → Crear curvas de calibración Medida del pH 6.5 7 7.5 MUESTRA 61
  • 62. Concentración de Ca2+ libre intracelular • Moléculas cuya fluorescencia varía con los niveles de Ca2+ intracelular Cambio en la Cambio en la λ de emisión intensidad Espectros de emisión fluo-3 y fura red en función de la concentración de Ca2+ Espectro de emisión Indo-1 en función de la concentración de Ca2+ Concentración de Ca2+ libre intracelular Medidas directas Cambios en la concentración de Ca2+ intracelular en linfocitos, monocitos y macrófagos medidos con Fluo 3 Concentración de Ca2+ libre intracelular Medidas ratiométricas Medida de Ca2+ intracelular en células JurkatJ6 después de añadir un anticuerpo anti-CD3 con una mezcla de Fluo3 y Fura Red (ratio 525/675) 62
  • 63. Medida del potencial de membrana Medida del potencial de membrana Polarizada Despolarizada Despolarización de Staphylococcus aureus inducida por CCCP medida con DiOC2(3). Medida de la actividad enzimática • Se añade un sustrato que difunde en la célula y al ser procesado por la enzima se vuelve fluorescente (sustrato fluorogénico). • Podemos medir la actividad de proteasas (caspasas), esterasas (CFSE), oxidasas, dehidrogenasas, transferasas, fosforilasas……. 63
  • 64. Estudio de laDE ALDOLASA ACTIVIDAD actividad de aldolasa Con actividad enzimática Sin actividad enzimática Genes reporteros, proteínas fluorescentes A Control sin transfectar Células transfectadas con GFP Chudakov D M et al. Physiol Rev 2010;90:11031163 ©2010 by American Physiological Society 64
  • 65. Estudio de la “side population” • Las células progenitoras presenta gran actividad de transportadores de la familia ABC que expulsan fuera de la célula el Hoechst 33342 Estudio de la “side population” Bone Marrow Estudio de la “side population” • Se excita con laser UV y se mide emisión a 420 y 670 nm A B Hoechst Blue + verapamil Hoechst Far Red 65
  • 66. Detección de componentes celulares • Marcaje con rojo nilo y Syto 62 para estudiar células nucleadas con depósitos de lípidos neutros Otras aplicaciones O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001 CITOMETRÍA DE FLUJO. SEPARACIÓN CELULAR. 66
  • 67. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) • Separación individualizada de células en función de parámetros definidos por citometría de flujo. • Posteriores estudios de biología molecular (RT-PCR, FISH), clonación de líneas celulares, estudios funcionales, etc. Sorting Electroestático ooooo ooooo oooo ooo o o Drop delay o o + o o o + o + oo+ o o+ + Transductor Vibra a una frecuencia determinada para producir separación del chorro en gotas. Punto de incidencia del láser y de decisión Carga de la gota + Azul - rojo. - Gotas cargadas son separadas en un campo electroestático ± 3000 V oo o oooo oooo oooo Izq basura der Recogida Nozzle 67
  • 68. • Se generan hasta 100.000 cels/seg. • Lo ideal es que haya un máximo de 1 célula cada 3 gotas Gota satélite Amplitud Frecuencia Separación de dos poblaciones celulares Separación de dos poblaciones celulares 68
  • 69. Separación de dos poblaciones celulares Separación de cuatro poblaciones celulares Separación de cuatro poblaciones celulares 69
  • 70. • Se pueden separar células individuales directamente en placas de 96 pocillos. • Se puede separar directamente en placas de 6, 12, 24 pocillos o en un porta de microscopia. • Se puede mantener la muestra a 4 o 37º C. • Se puede recoger la muestra a 4 o 37º C. • El parámetro crítico es el drop delay: Tiempo que transcurre desde que seleccionamos la célula hasta que se carga la gota que la contiene. • Depende de cómo se forman las gotas → Ajustar cada vez que hacemos una separación. • Separación de esferas fluorescentes sobre un porta • Accudrop. Sistema automatizado basado en esferas fluorescentes. Un láser en la parte inferior del sorter nos permite ver donde están. 70
  • 71. • Recuperación-eficiencia: % de partículas sorteadas recogidas del total de partículas que nos interesan. • Pureza: % de partículas sorteadas recogidas que cumplen los criterios seleccionados en función del total sorteado. • Si aumentamos la pureza disminuimos la recuperación y viceversa rendimiento pureza ¿ Y esto cuanto tarda? Velocidad lectura 2.000 cels/sg Nº deseado de células 1.000 10.000 100.000 1.000.000 10.000.000 100.000.000 Concentración de células en la muestra 0,1% 8 min 1,4 h 14 h 5,8 d 1,9 m 1,6 a 1,0% 48 sg 8 min 1,4 h 14 h 5,8 d 1,9 m 5,0% 50,0% 10 sg 1 sg 1,7 min 10 sg 17 min 1,7 min 2,8 h 17 min 1,2 d 2,8 h 12 d 1,2 d 71
  • 72. • Sistemas de cámara abierta → RIESGO BIOLÓGICO. • Sistemas Caros. Tanto equipamiento como consumibles. • Sistemas lentos. Pureza depende de cuantas células/segundo analicemos y la resolución de la citometría es mejor si el número de células por segundo es bajo. • Viabilidad celular variable: Tipo celular, tiempo y presión de sorting, medio de recogida. Sorters hidraúlicos Emplean jeringas, energía acústica, etc.. para desviar el flujo líquido durante algunos milisegundos y con él la célula seleccionada. Cámara cerrada: no contaminación Poco complicados, baratos y adaptables Sistemas sin necesidad ajuste Facilidad de uso (similar a analizador) Baja velocidad de separación Baja viabilidad del producto Baja concentración celular Sorters hidraúlicos 72
  • 73. Sorting de partículas grandes. BIOSORT MACS • Magnetic activated cell sorting. Utiliza partículas magnéticas unidas a anticuerpos Nanopartículas unidas a la célula MACS Anticuerpo unido a nanopartícula magnética ELECTROIMÁN N S MATRIZ FERROMAGNÉTICA 73
  • 74. FACS vs MACS: Uno o los dos? FACS MACS Separación multiparamétrica Separación por un solo parámetro No permiten separaciones masivas Separan un número elevado de células. Equipos caros, pero amortizables a medio plazo Muy caros Indicado para separar poblaciones poco frecuentes Rápidos Son dos sistemas compatibles CITOMETRÍA DE FLUJO. ANÁLISIS MULTIPLEX. • Estudio de moléculas solubles por citometría de flujo. • El límite de detección en citometría de flujo es de 0.5 µ, para poder estudiarlas necesitamos retenerlas en esferas fluorescentes que se pueden detectar por el citómetro. • La citometría nos permite estudiar diversas moléculas simultáneamente asociando cada una a una esfera diferente que puede distinguirse por citometría. 74
  • 75. • Método realizable en cualquier citómetro aunque existen equipos especialmente diseñados para el análisis multiplex. Diferenciación de las esferas • Mezcla de beads de diferentes tamaños y con diferente concentración de un fluorocromo que se excita con un láser rojo. Diferenciación de las esferas • Esferas del mismo tamaño (5,6-6,5 µ) con una diferente mezcla de 2 colorantes excitados por el láser rojo 75
  • 76. Diferenciación de las esferas Color 1 Matriz de microesferas coloreadas Color 2 Diferenciación de las esferas Discriminador de dobletes Elimina por tamaño restos y agregados de esferas 76
  • 77. Diferenciación de las esferas • Esferas del mismo tamaño con una diferente mezcla de 3 colorantes excitados por el láser rojo → Genera 500 esferas diferentes • Las esferas se funcionalizan con diferentes moléculas en función de lo que queramos estudiar análisis de concentración de proteínas solubles Multiplex ELISA IL-2 IL- IL-5 IL- IL-4 IL- IFN-g IFN- IL-10 ILPE PE PE PE TNFTNF-alfa PE PE 77
  • 78. análisis de concentración de proteínas solubles The immune-complex/ microsphere is then excited by The another high analyte Free excess streptavidin-PE In assays withwash step Afterphycoerythrin is excited The A primaryexcessisis specific The the ******antibodyand bead biotinylated,laser. a binds primary Microsphere biotinylated by the reporter analyte binds to antibodyadded to numbersthe PElaser Streptavidin non-specifically specific emmission specificpolystyrene bindis quantified to thespecific is antibody is forthe aanalyte analytewhich 5.6mMbiotinylated reporter emits antibodies beadto bound reporter reporter fluorescence – no the assay. The biotinylated added the toassay after crossreactivitythe bead conjugatedluminex other with by tofluorescentand the bead two the with dyes is quantified in nonantibody leadinga binds to the Strep-PEby the a signal reporter antibodyto Luminex identified. another manner. analytesby an step. surfacethe fouramine incorporated into it in reader. amplification. specific occurs. one of wash available coupling reaction different ratios. sites. tomado de UPSTATE. Serological corporation análisis de concentración de proteínas solubles Laser A Laser B análisis de concentración de proteínas solubles Una vez clasificada la esfera con el primer láser, el segundo mide la fluorescencia del fluorocromo asociado al segundo anticuerpo que es proporcional a la cantidad de proteína en la muestra Color analizador 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Norte Oeste 1er trim . 2do trim . 3er trim . 4to trim . Este Color clasificador 1 78
  • 79. análisis de concentración de proteínas solubles • Generando una curva de calibración podemos cuantificar la concentración Curva de calibración Se genera una curva de calibración asociando la fluorescencia medida a unas concentraciones de analito conocidas 0 pg/ml 312.5 pg/ml 40 pg/ml 625 pg/ml 156 pg/ml 5000 pg/ml Curva de calibración 79
  • 80. Por último los valores de fluorescencia obtenidos para cada muestra se interpolan en la curva de calibración y se calcula la concentración Control negativo Muestra • Permite determinar hasta 500 proteínas en un solo ensayo. • Gran ahorro: - Económico: Equipamiento más caro que un ELISA pero se compensa con el menor coste de los reactivos - Tiempo - Muestra: Con sólo 25 µl podemos determinar las 500 proteínas. 80
  • 81. Aplicaciones en biología molecular • En lugar de anticuerpo funcionalizamos las esferas con sondas de ácidos nucleicos. • Se puede aplicar a múltiples aplicaciones: Genotipado (estudios de SNPs), expresión génica, concentración de micro RNAs, reordenamientos génicos. • Funcionalizando con sondas de ácidos nucleicos también podemos estudiar expresión de factores de trascripción 81
  • 82. Genotipado Genotipado Genotipado 82
  • 83. Genotipado Comparación de métodos MULTIPLEX Ding C, Jin S. Methods Mol Biol. 2009 Cuantificación de microRNAs • No necesita amplificación por PCR Cuantificación de microRNAs 83
  • 84. Expresión génica • No es necesario convertirlo en cDNA. Grandes reordenamientos Factores de Trascripción 84
  • 85. Factores de Trascripción • Sistema no basado en citometría de flujo. • Requiere el uso de beads magnéticas. • Equipo mas barato que los citómetros pero menos sensible • Las partículas magnéticas se retienen sobre un imán y se iluminan con 2 LEDs: Rojo y verde. • La fluorescencia se lee con una cámara CCD. 85
  • 86. 86