Miten voitaisiin tehokkaasti tunnistaa hunajan kasvialkuperä? Maaria Kortesniemen esitelmä SML:n Talvipäivillä 2015.

1. Kotimaisen lajihunajan karakterisointi
NMR-metabolomiikalla
Talvipäivät 24.–25.1.2015, Jyväskylä
Maaria Kortesniemi
Elintarvikekemia ja elintarvikekehitys
Biokemian laitos
Turun yliopisto

2. Tutkimusasetelma
• Lähtökohta
• Lajihunajien tunnistus työlästä, aikaa vievää ja osittain epävarmaa
• Lisätietoa kotimaisista lajihunajista
• Tavoitteet
• Yksiselitteinen ja tehokas menetelmä lajihunajien (kasvi)alkuperän
tunnistukseen ja yhdisteiden kvantitointiin

3. NMR-metabolomiikka
• NMR
• engl. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
• Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia
• 1H NMR mittaa protoneita eli vety-ytimiä
• Yhdisteiden rakennetutkimus
• Metabolomiikka
• Tutkii aineenvaihduntatuotteita erilaisissa biologisissa kokonaisuuksissa
• ”Tilannekuva”

4. Aiempia NMR-tutkimuksia hunajasta
• Hunajan aminohappojen NMR-metabolomiikka ja kvantitointi
(Sandusky et al., 2005)
• Maantieteellisen alkuperän toteaminen NMR:llä (Consonni et al., 2008;
Donarski et al., 2008)
• Kasvialkuperän määritys kloroformiuutteista 1H NMR:n ja
kemometrian avulla (Schievano et al., 2010 & 2012)
• Sokerisiirapilla väärennettyjen hunajien tunnistus NMR-
menetelmillä (Bertelli et al., 2010)
• Kasvialkuperän määritys vesiliukoisten yhdisteiden perusteella
(Ohmenhauser et al., 2013; Zíelinski et al., 2014)
• Nopea NMR-profilointimenetelmä hunajan aitouden
varmistamiseksi (Spiteri et al., 2015)

5. Menetelmä
• Näytteenkäsittely
• 100 mg hunajaa + 800 µl vettä
• Suodatus
• Lisäys 10% D2O (sis. sisäinen standardi
DSS-d6 ja 2% NaN3)
• pH:n mittaus ja säätö 6.55 ± 0.05
• mitattava näyte 180 µl (3 mm NMR-putki)
• 1H NMR -mittaus
• 600 MHz Bruker Avance
• TCI cryoprobe
• 298 K (25 ºC)
• Tulosten käsittely
• Chenomx NMR Suite: prosessointi, profilointi, kvantitointi
• SIMCA-P+: monimuuttujamallit

6. Kustannukset ja ajankäyttö
• Näytteenkäsittely per näyte
• 20 min (aktiivinen) + 20 min (passiivinen)
• Tarvikkeet ja reagenssit n. 5 €
• Mittaus per näyte
• 12 min
• Laiteaika 40–100 €/h (Laitekeskus, TY)
• Tulosten käsittely
• Kvalitatiivinen n. 5–15 min
• Kvantitatiivinen n. 1h

7. NMR-spektrit

8. lehmus
voikukka
mesikaste
tattari
kanerva
NMR-spektrit (0.7–3.1 ppm)
Ile, Leu, Val
fenyylimaito-
happo
Pro
EtOH
maito-
happo,
Thr
AlaTyr

9. NMR-spektrit (3.2–4.2 ppm)
glukoosi
fruktoosi
maltoosi

10. NMR-spekrit (4.1–4.7 ppm)
lehmus
mesikaste
α-glukoosi

11. NMR-spektrit (4.9–5.5 ppm)
β-glukoosi
mesikaste
meletsitoosi
lehmus
maltoosi,
sakkaroosi, …

12. kanerva
tattari
lehmus
fenyylimaitohappo,
fenyylietikkahappo
muurahais-
happo
HMF
bentsoe-
happo
Phe
NMR-spektrit (5.6–9.5 ppm)
Tyr

13. -0,4
-0,3
-0,2
-0,1
-0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
t[2]
t[1]
BinningResults_002total_final_150115.M2 (PCA-X), Pareto scaled
t[Comp. 1]/t[Comp. 2]
R2X[1] = 0,500051 R2X[2] = 0,327408
Ellipse: Hotelling T2 (0,95)
11C11B
12A
12C
19A
19C
19B
12B
12A
10B10C10A
11D
02B02A
02C
01B
01A
20A
20B
20C
01C
08C
08A
08B
09C09A09B
06C
13B13C
06B06A
13A13A
07B
07A
07D
14C14A14B
15A15B15C
03C03A
04A
05A
04C
04B
05C05B
03B
17A17B
17C
16A
16B
16C18C
18B
18A
SIMCA-P+ 12.0.1 - 2015-01-16 12:17:35 (UTC+2)
Pääkomponenttianalyysi (PCA)
tiivistää aineiston ja kuvaa näytteiden välisiä suhteita
kanerva
tattari
apila
mesikaste
voikukka
lehmus

14. -0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
-0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
-0,28 -0,26 -0,24 -0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28
p[2]
p[1]
BinningResults_002total_final_150115.M2 (PCA-X), Pareto scaled
p[Comp. 1]/p[Comp. 2]
R2X[1] = 0,500051 R2X[2] = 0,327408
9,999,979,959,939,919,899,879,859,839,819,799,779,759,739,719,699,679,659,639,619,599,579,559,539,519,499,479,459,439,419,399,379,359,339,319,299,279,259,239,219,199,179,159,139,119,099,079,059,039,018,998,978,958,938,918,898,878,858,838,818,798,778,758,738,718,698,678,658,638,618,598,578,558,538,518,498,47
8,45
8,438,418,398,378,358,338,318,298,278,258,238,218,198,178,158,138,118,098,078,058,038,017,997,977,957,937,917,89
7,877,85
7,837,817,797,777,757,737,717,697,677,657,637,617,597,577,557,537,517,497,477,457,437,41
7,39
7,37
7,35
7,33
7,317,29
7,277,257,237,217,197,177,157,137,117,097,077,057,037,016,996,976,956,936,916,896,876,856,836,816,796,776,756,736,716,696,676,656,636,616,596,576,556,536,516,496,476,456,43
6,416,396,376,356,336,316,296,276,256,236,216,196,176,156,136,116,096,076,056,036,015,995,975,955,935,915,895,875,855,835,815,795,775,755,735,715,695,675,655,635,615,595,575,555,535,51
5,49
5,47
5,45
5,43 5,415,39
5,37 5,35 5,335,31
5,29
5,27
5,25
5,23
5,21
5,195,17
5,155,135,11
5,09 5,07
5,055,035,01
4,99
4,97
4,95
4,93
4,67
4,65
4,63
4,61
4,594,57
4,55
4,53
4,51
4,494,474,454,434,414,39 4,374,354,33
4,31
4,29
4,27
4,254,23
4,214,19
4,17 4,15
4,13
4,114,09
4,07
4,05
4,03
4,01
3,99
3,97
3,95
3,93
3,91
3,89
3,87
3,85
3,83
3,81
3,79
3,77
3,75
3,73
3,71
3,69
3,67
3,65
3,63
3,61
3,59
3,57 3,55
3,53
3,51 3,49
3,47
3,45
3,43
3,41
3,39
3,37
3,35
3,33 3,313,293,27
3,25
3,23
3,21
3,193,173,153,13
3,113,093,073,053,033,012,992,972,952,932,91
2,892,872,85
2,832,812,792,772,752,732,712,692,672,652,632,612,59
2,572,552,532,512,492,472,452,43
2,41 2,39
2,372,352,332,312,292,272,252,232,212,192,172,152,132,112,092,072,052,03
2,011,99
1,971,95
1,93
1,91
1,891,871,851,831,811,791,771,751,731,711,691,671,651,631,611,591,571,551,531,511,491,471,451,431,411,391,371,351,331,31
1,291,271,251,231,21
1,19
1,17
1,151,13
1,111,09
1,071,051,03
1,010,990,97
0,950,93
0,910,890,870,850,830,810,790,770,750,730,710,690,670,650,630,61
SIMCA-P+ 12.0.1 - 2015-01-16 12:28:18 (UTC+2)
Pääkomponenttianalyysi (PCA)
lataukset
fruktoosi
glukoosi
meletsitoosi

15. Potentiaaliset markkerit, esim.
• Kanerva
• Fenyylietikkahappo, fenyylimaitohappo, …
• Lehmus
• Terpeenihapon sokeriesteri (6-O-(β-D-glukopyranosyyli)-β-D-glukopyranosyyli-
4-(1-hydroksi-1-metyylietyyli)sykloheksa-1,3-dieeni-1-karboksylaatti)
• Mesikaste
• Meletsitoosi
• Tattari
• Isoleusiini, leusiini, valiini
• Tyrosiini

16. Yhteenveto
• Kemiallinen sormenjälki
• Hunajatyypeille spesifiset markkerit
• Yhdellä mittauksella paljon tietoa näytteestä
• Kvantitatiivinen
• Pieni näytemäärä
• Helppo näytteenkäsittely
• Ei orgaanisia liuottimia

17. Kirjallisuutta
• Bertelli et al. (2010), Detection of Honey Adulteration by Sugar Syrups Using One-Dimensional and
Two-Dimensional High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance, J. Agric. Food Chem.
• Consonni et al. (2008), Geographical Characterization of Polyfloral and Acacia Honeys by Nuclear
Magnetic Resonance and Chemometrics, J. Agric. Food Chem.
• Donarski et al. (2008), Application of Cryoprobe 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and
Multivariate Analysis for the Verification of Corsican Honey, J. Agric. Food Chem.
• Donarski et al. (2010), Identification of botanical biomarkers found in Corsican honey, Food Chem.
• Sandusky et al. (2005), Use of Selective TOCSY NMR Experiments for Quantifying Minor
Components in Complex Mixtures: Application to the Metabonomics of Amino Acids in Honey, Anal.
Chem.
• Schievano et al. (2010), 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Chloroform Extracts of Honey
for Chemometric Determination of Its Botanical Origin, J. Agric. Food Chem.
• Schievano et al. (2012), An NMR-based metabolomic approach to identify the botanical origin of
honey, Metabolomics
• Schievano et al. (2013), Characterization of Markers of Botanical Origin and Other Compounds
Extracted from Unifloral Honeys, J. Agric. Food Chem.
• Spiteri et al. (2015), Fast and global authenticity screening of honey using 1H-NMR profiling, Food
Chem.

18. Kiitos
• Lassi Kauko ja Olli Sjövall
• Heikki Vartiainen ja Tarja Ollikka (SML)
• Heikki Kallio ja Baoru Yang (UTU)
• Carolyn Slupsky (UC Davis)
• Suomen Kulttuurirahasto
• Magnus Ehrnroothin säätiö