L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1
        RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA
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L’analisi della viremia e del pro virus dell’HIV-1 rivelano una nuova fonte di viremia residua nei pazienti in trattamento antiretrovirale

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C’è voluto un bel po’ ma la traduzione del monumentale articolo di Brennan et al. (Siliciano lo si cita solo perché è famoso, ma credo abbia contribuito veramente poco…) è terminata.
Voglio ringraziare Dora&Gexgex, che hanno contribuito con generosità alla revisione, permettendo che la traduzione fosse in buon italiano e aggiungendo un po’ di commenti utilissimi ([i]non a me, che tanto non ci capirò nulla lo stesso[/i]).
Per farla breve: cosa dice l’articolone? Ecco un riassunto stringatissimo:

Il successo nel trattamento antiretrovirale ad alta attività (HAART) dell’HIV riduce il virus libero nel sangue a livelli non determinabili dai più sensibili test clinici. Nondimeno, l’HIV persiste come pro virus latente, all’interno dei CD4 memoria quiescenti e forse in altri tipi di cellule.
La prima affermazione degli autori è che i pro virus presenti nelle cellule CD4 circolanti attivate e quiescenti appartengono a una popolazione mista, ossia che i pro virus dei CD4 fanno parte della “stessa famiglia”.
Purtroppo però, c’è una sorpresa: i dati dei test condotti sulla struttura genetica dei vari campioni suggeriscono che la viremia residua (il virus libero nel sangue) includa una o più popolazioni virali geneticamente distinte dai pro virus nelle cellule CD4 quiescenti.
Questo studio, come altri che l’hanno preceduto, ha alcuni problemi: innanzitutto i campioni di virus sono ottenuti in tempi diversi, il che non esclude che il virus stesso “ci inganni” con le sue mutazioni, inoltre questi campioni, complice l’efficacia della HAART, sono veramente ridotti, e quindi (per parlare da salumieri) danno troppo poco materiale su cui lavorare, e il rischio di errori è amplificato (un errore su cento è l’1%, un errore su uno è il 100%)
C’era solo un paziente (il “paziente 154”) per il quale la qualità e quantità di campioni era tale da consentire un’analisi “affidabile”, ossia aveva una buona quantità di virus attivo (cioè senza errori) per poterlo confrontare con il virus della viremia residua. E l’analisi ha mostrato che in questo paziente, il virus plasmatico era significativamente differente dal pro virus derivato dai CD4 sia attivati sia quiescenti. Lo studio di questo paziente cioè indicherebbe che ci sono due popolazioni distinte di virus.
Che la maggior parte del virus plasmatico possa essere derivato da alcune fonti cellulari ancora non identificate ha diverse importanti implicazioni cliniche rispetto alla gestione della HAART, al fallimento terapeutico, alla moltiplicazione della viremia associata all’interruzione del trattamento ed alle strategie tese all’eradicazione.
Numerosi laboratori stanno attivamente seguendo diverse strategie di eradicazione, la maggior parte delle quali comprende alcune attività di bersaglio e ripulitura dei reservoir latenti nei CD4 memoria quiescenti. Se la maggior parte della viremia residua nei pazienti trattati con la HAART provenisse da altri reservoir o compartimenti, come qui suggerito, allora, per essere efficaci, le strategie di eradicazione dovrebbero includere vie per bersagliare e ripulire anche questi altri reservoir.

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L’analisi della viremia e del pro virus dell’HIV-1 rivelano una nuova fonte di viremia residua nei pazienti in trattamento antiretrovirale

  1. 1. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA 1 NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE INTRODUZIONE Il successo nel trattamento antiretrovirale ad alta attività (HAART) dell’HIV riduce il virus libero nel sangue a livelli non determinabili dai più sensibili test clinici. Nondimeno, l’HIV persiste come pro virus latente, all’interno dei CD4 memoria quiescenti2 e forse in altri tipi di cellule. I reservoir latenti nelle cellule CD4 rappresentano una barriera all'eradicazione a causa della loro lunga emivita e perché colpire e liberare questi reservoir è intrinsecamente difficile. In aggiunta ai reservoir latenti nei CD4 quiescenti, i pazienti in HAART hanno anche una ridotta quantità di virus libero nel plasma, a livelli al di sotto del limite di sensibilità degli esami clinici attuali. Poiché il virus libero ha un’emivita breve, la viremia residua è indicativa di una produzione virale attiva. La continuata presenza di virus libero nel plasma dei pazienti in HAART può indicare sia una replicazione in corso, sia il rilascio del virus da CD4 infetti latenti riattivati, sia il rilascio da altri reservoir cellulari o combinazioni di questi meccanismi. Scoprire la sorgente cellulare della viremia residua è importante perché ciò identificherà le cellule che sono ancora in grado di produrre il virus nei pazienti trattati con la HAART, cellule che devono diventare l'obiettivo di ogni sforzo di eradicazione. L’analisi dettagliata della viremia residua è stata resa difficile da sfide tecniche collegate al dover lavorare con concentrazioni molto basse di virus, ma recentemente nuovi risultati sono stati ottenuti attraverso il campionamento intensivo di pazienti e metodi di sequenziamento ultrasensibili. In un sottogruppo di pazienti la maggior parte della viremia residua consisteva di un piccolo numero di cloni virali prodotti da un tipo di cellule fortemente sottorappresentate nella circolazione periferica. Questi cloni virali - definiti PPC, cloni plasmatici predominanti – persistono immutati per estesi periodi di tempo3. La persistenza di questi PPC indica che in alcuni pazienti potrebbe esserci un'altra fonte cellulare di viremia residua. In ogni modo, i PPC sono stati osservati in un piccolo gruppo di pazienti che avevano iniziato la terapia partendo con una conta dei CD4 molto bassa, e non è perciò chiaro se questo fenomeno sia presente anche al di fuori di questo tipo di pazienti. Molto più importante, è che non era chiaro se davvero la viremia residua generalmente consistesse di distinte popolazioni virali prodotte da diversi tipi cellulari. 1 Articolo originale: Analysis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Viremia and Provirus in Resting CD4+ T Cells Reveals a Novel Source of Residual Viremia in Patients on Antiretroviral Therapy, Timothy P. Brennan, John O. Woods, Ahmad R. Sedaghat, Janet D. Siliciano, Robert F. Siliciano, and Claus O. Wilke. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2009, p. 8470–8481 Vol. 83, No. 17. Per acquistare la versione integrale su internet: http://jvi.asm.org/cgi/content/abstract/83/17/8470 Traduzione e adattamento ai sensi del comma 1 dell’Art. 70 Legge 633/1941: Il riassunto, la citazione o la riproduzione di brani o di parti di opera e la loro comunicazione al pubblico sono liberi se effettuati per uso di critica o di discussione, nei limiti giustificati da tali fini e purché non costituiscano concorrenza all'utilizzazione economica dell'opera; se effettuati a fini di insegnamento o di ricerca scientifica l'utilizzo deve inoltre avvenire per finalità illustrative e per fini non commerciali. Licenza Creative Commons 2.5: sei libero di riprodurre, distribuire, comunicare al pubblico, esporre in pubblico, modificare quest'opera alle seguenti condizioni: devi attribuire la paternità dell'opera all'Autore originario e devi attribuire la paternità della traduzione ai sensi del comma 3 dell’articolo 70 della legge 633/1941, in modo tale da non suggerire che essi avallino te o il modo in cui tu usi l'opera. Ogni volta che usi o distribuisci quest'opera, devi farlo secondo i termini di questa licenza, che va comunicata con chiarezza. In ogni caso, puoi concordare col titolare dei diritti utilizzi di quest'opera non consentiti da questa licenza. Questa licenza lascia impregiudicati i diritti morali degli Autori. La licenza Creative Commons riguarda esclusivamente la traduzione, e non incide in alcun modo sulla disciplina legale del diritto d’Autore, le utilizzazioni consentite dalla legge sul diritto d'Autore e gli altri diritti non sono in alcun modo limitati da quanto sopra. Questo documento: traduzione Uffa2, revisione linguistica Dora, revisione scientifica GexGex. Legenda per le Note: dove non indicata la fonte (Wikipedia o altre risorse internet), le note sono di GexGex. Scarica questo PDF da http://www.slideshare.net/hivforum 2 Sono i CD4 che possono vivere fino a 40 anni e che si riproducono molto poco 3 Quindi potrebbero provenire da CD4 di lunga memoria oppure da altre fonti ancora non identificate di viremia residua
  2. 2. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE Poiché l'infezione da HIV nella maggior parte dei pazienti deriva da un singolo clone virale4, con susseguente diversificazione, la presenza di popolazioni geneticamente distinte del virus in un singolo individuo può riflettere l'ingresso del virus in compartimenti5 dove la replicazione si verifica con mescolamenti intercompartimentali limitati. Test genetici sofisticati possono determinare la struttura di questa popolazione6 in un campione di sequenze virali. Usando due test complementari di struttura della popolazione, abbiamo analizzato le sequenze virali da sorgenti multiple in pazienti singoli in modo da determinare se ci fosse una sorgente diversa dai CD4 quiescenti circolanti a contribuire alla viremia e alla persistenza virale. I nostri risultati hanno importanti implicazioni cliniche per la comprensione della persistenza dell'HIV e del fallimento del trattamento e per il miglioramento delle strategie di eradicazione che attualmente si concentrano solo su reservoir latenti dei CD4. MATERIALI E METODI *** omissis *** RISULTATI I pro virus presenti nelle cellule CD4 circolanti attivate e quiescenti appartengono a una popolazione mista. Abbiamo per prima cosa condotto un test per la presenza di strutture di popolazione in set di sequenze pro virali derivate dalle cellule CD4 circolanti attivate e quiescenti. Poiché queste cellule rappresentano una singola popolazione di cellule nei suoi differenti stadi di attivazione, non è atteso che vi siano popolazioni geneticamente distinte di pro virus a meno che i CD4 attivati non siano stati infettati de novo da un virus di altra origine. Per valutare la struttura di popolazione abbiamo usato due test complementari7, il test SM8 e il test AMOVA9,su set di dati pubblicati e di nuovo acquisto. Il test SM valuta se le sequenze10 appartenenti a due o più gruppi sono distribuite casualmente lungo i rami di un albero filogenetico11,12 che comprenda tutte le sequenze. Abbiamo usato due metodi di ricostruzione filogenetica, quella ML13 classica e quella Bayesiana14 Nella maggior parte dei casi entrambi i metodi restituivano alberi d’identica topologia, con differenze minori nella lunghezza dei rami. La figura 1 mostra alberi ML consistenti di sequenze pro virali derivate da CD4 attivati e quiescenti provenienti da un paziente con 4 il primo virus quando si ha il contagio 5 La compartimentalizzazione cellulare è un sistema per ottimizzare le risorse cellulari, La compartimentalizzazione è uno degli ingredienti fondamentali della vita. Essa rappresenta il processo mediante il quale una serie di segnali biologici viene isolata dal contesto formando un aggregato di segnali; tale aggregato assumerà una propria identità. La compartimentalizzazione è alla base dell’origine della vita. Secondo Shuster ed Eigen (Eigen 1979) essa può essere stata la sola causa della formazione di ipercicli di RNA all’interno di brodi primordiali. Secondo questi due Autori, coppie di RNA possono essersi complementarizzate per via della grande possibilità combinatoriale offerta dal brodo primordiale. Ma se due filamenti di RNA, che casualmente si ritrovano nel brodo, riescono a catalizzare la replicazione di un terzo filamento, allora è possibile che si venga a generare un grosso ciclo di relazioni fra coppie di RNA (http://www.functional-genomics.it/center/Downloads/ModelliDellaMente27Marzo2008.pdf) Sulla compartimentalizzazione dell’HIV vedi anche: www.unicef.it/flex/cm/pages/ServeAttachment.php/L/IT/D/D.ff4b4ff3d012fbf1fbd2/P/BLOB:ID%3D4328. 6 La “struttura” mostra come è composta una “popolazione”, facendo un paragone con una popolazione animale: rapporto tra sessi, rapporto tra le classi di età, numero piccoli per femmina…, quindi per un virus indica come la “popolazione” complessiva del virus è composta. 7 questi due test consistono nell’analizzare la sequenza di un gene e confrontarlo con una scala di valori per vedere se le variazioni corrispondono alla stessa popolazione virale o a popolazioni virali diverse. 8 Slatkin-Maddison test, determina il numero minimo di eventi di migrazioni tra le popolazioni separate coerenti con la struttura di un albero filogenetico. Il supporto statistico è basato sul numero di eventi di migrazioni che potrebbero essere attesi in una popolazione strutturata casualmente, derivato permutando le sequenze tra i compartimenti. (Internet) 9 Analysis of molecular variance (AMOVA), un modello statistico per le variazioni molecolari in una singola specie, tipicamente biologica. Il metodo è stato sviluppato da Laurent Excoffier presso la Rutgers University nel 1992. 10 Del gene, ossia del pezzetto di RNA virale. 11 In questo caso: sono quei diagrammi che permettono di risalire al progenitore comune a tutte le popolazioni virali. 12 Definizione generale: un Albero filogenetico è un diagramma che mostra le relazioni di discendenza comune di gruppi tassonomici di organismi. La rappresentazione delle relazioni in questa forma è tipica della visione evoluzionistica, secondo la quale lo sviluppo delle forme di vita è avvenuto a partire da un progenitore comune (il tronco o la base dell'albero, altrimenti detta radice), il quale ha dato origine per speciazione a diverse linee di discendenza, fino ad arrivare alle specie attualmente esistenti (le cime dell'albero, altrimenti dette ramificazioni terminali). In un albero filogenetico, ciascun nodo (o biforcazione) rappresenta l'antenato comune più recente dei soggetti che si trovano ai nodi successivi e la lunghezza delle ramificazioni può -o meno- essere correlata al tempo o ai cambiamenti genetici che intercorrono tra di essi. (Wikipedia) 13 Massima Verosimiglianza, cerca il modello evolutivo, albero compreso, che ha la massima verosimiglianza rispetto alla produzione delle sequenze osservate, http://biochimica.unipr.it/biocomp/alberi_filogenetici.pdf, http://www.bio.disco.unimib.it/~mauri/download/Lez11Filog.ppt, 14 Sono semplici osservazioni delle due sequenze: quelle più simili sono considerate attendibili PAGINA 2
  3. 3. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE un PPC definito [figura 1/a] e da un paziente senza un PPC [figura 1/b]. Entrambi gli alberi mostrano l’evidenza di un mescolamento tra sequenze pro virali derivate da CD4 attivati e quiescenti, al di fuori di ogni ovvia struttura a livello di popolazione15 Risultati simili sono stati ottenuti per altri pazienti, come si può vedere nelle figure supplementari S1 a→e e S1 g (http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1). figura 1/a I risultati dal test SM erano coerenti con la natura mescolata delle sequenze illustrate nelle filogenie ricostruite. In tutti i pazienti tranne uno non abbiamo potuto respingere l’ipotesi nulla16 che non esistesse struttura di popolazione tra i due gruppi di sequenze (tabelle 1 e 2)17 15 Cioè sono popolazioni diverse. PAGINA 3
  4. 4. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE L’albero filogenetico per il paziente J2, il solo paziente per il quale potessimo respingere l’ipotesi nulla, conteneva un clade18 di sequenze di virus libero nel plasma prive di ogni sequenza pro virale, così come clade di sequenze pro virali prive di sequenze di virus libero nel plasma19 (figura S1f nel materiale supplementare20) Nondimeno, questa struttura era atipica. Per tutti gli altri pazienti, l’analisi filogenetica mostrava una mancanza di struttura compartimentalizzata. Simili risultati erano ottenuti quando il test SM era condotto usando filogenesi21 costruite con il metodo di inferenza Bayesiano (tabelle 1 e 2). Poiché il test SM si basa sulle filogenie, che sono difficili da stimare in situazioni di bassa diversità e possibile ricombinazione22 abbiamo anche incluso un test di struttura di popolazione indipendente dalla filogenia, un AMOVA basato sulla distanza genetica. Questo test analizza la variazione molecolare all’interno e tra i gruppi, in una struttura di analisi nidificata di varianza23. I risultati del test AMOVA corrispondevano a quelli dei test SM. Per tutti i pazienti, tranne il paziente J2, l’ipotesi nulla di nessuna struttura di popolazione non poteva essere respinta (tabelle 1 e 2). In altre parole, le sequenze pro virali derivate dai CD4 circolanti attivati e a risposo in un paziente tipo comprendono una popolazione geneticamente mescolata, senza una struttura significativa. Questo risultato è coerente con la biologia conosciuta di queste cellule24. I pro virus derivanti dalle cellule CD4 circolanti quiescenti e il virus plasmatico rappresentano distinte popolazioni genetiche nella maggior parte dei pazienti. Per valutare la presenza di strutture di popolazione tra il virus libero nel sangue e il pro virus derivato dalle cellule CD4 quiescenti, abbiamo condotto gli stessi test sopra descritti. La figura 3 mostra gli alberi ML di sequenze pro virali derivate da CD4 quiescenti e da virus nel plasma da un paziente con PPC definito (fig. 3/a) e da un paziente senza un PPC (figura 3/b). Un PPC era stato precedentemente definito come sequenza clonale derivata dal virus plasmatico che rappresentasse >50% del totale delle sequenze di virus plasmatico, rappresentando allo stesso tempo <1% del totale delle sequenze pro virali ottenute dai CD4 circolanti. In entrambi i casi, alcune delle sequenze plasmatiche erano identiche a sequenze trovate nei reservoir dei CD4. Per questo motivo, almeno parte del virus plasmatico potrebbe essere stato prodotto dai CD4 infetti latenti una volta attivati. Nondimeno, entrambi gli alberi rivelano una tendenza di parte del plasma e dei reservoir a separarsi fra loro, in contrasto col modello completamente mescolato osservato per il pro virus nei CD4 attivati e quiescenti25. L’analisi SM ha rivelato una significativa struttura di popolazione tra le due sorgenti di virus in tutti i pazienti tranne due: il paziente 134 e il paziente 202 (tabella 2 e figura 2). 16 Un'ipotesi nulla (letteralmente dall'inglese "ipotesi zero") è un'affermazione sulla distribuzione di probabilità di una o più variabili casuali. Nel test statistico viene verificata in termini probabilistici la validità di un'ipotesi statistica, detta appunto ipotesi nulla, di solito indicata con H0. Attraverso una funzione dei dati campionari si decide se accettare l'ipotesi nulla o meno. Nel caso l'ipotesi nulla venga rifiutata si accetterà l'ipotesi alternativa, indicata con H1. Se si rifiuta un'ipotesi nulla che nella realtà è vera allora si dice che si è commesso un errore di prima specie. Accettando invece un'ipotesi alternativa falsa si commette un errore di seconda specie. (Wikipedia) 17 Qui gli Autori intendono che si tratta di due popolazioni virali diverse e che quindi vi sono nel paziente due popolazioni virali geneticamente diverse; questo può essere spiegato in vari modi: o quello dei CD4 a lunga memoria (non essendo questi molto attivi nel riprodursi, il virus potrebbe essere rimasto praticamente intatto e uguale al primo clone che ha contagiato), oppure esiste un’altra zona di accumulo virale diversa dai CD4 di memoria e CD4 normali. 18 Un clade è definito come un gruppo tassonomico di organismi costituito da un antenato singolo comune e tutti i discendenti comuni a quell'antenato. Qualsiasi gruppo che corrisponde alla definizione viene considerato monofiletico e può essere rappresentato sia da un'analisi filogenetica, o da un cladogramma. (Wikipedia) 19 Cioè aveva due virus completamente differenti che non venivano da un genitore comune, questo potrebbe essere stato causato anche da una reinfezione con rapporti a rischio... 20 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1 21 La Filogenesi o filogenetica o filogenia, (dal greco φυλή (classe", "specie) e Γένεσις ("nascita", "creazione", "origine"), è lo studio dell'evoluzione della vita. È uno strumento fondamentale della sistematica che si occupa di ricostruire le relazioni di parentela evolutiva, di gruppi tassonomici di organismi a qualunque livello sistematico. (Wikipedia) 22 Vuol dire che essendo piccolissimi pezzetti di virus non tanto diversi fra loro allora ci possono essere dei mescolamenti di pezzetti per cui per escludere questo hanno fatto un altro test genetico detto di distanza (cioè hanno valutato quanta possibilità ci sia che i due pezzetti appartengano allo stesso virus o no). 23 Media degli scarti al quadrato, è un indice statistico per vedere quanto due cose sono simili fra loro. 24 Cioè col fatto che esistono due CD4 che si comportano in maniera completamente diversa: uno dormiente e uno attivo. 25 Nelle provette invece i virus si mescolano: se si mescolano vuol dire che sono molto simili fra loro. PAGINA 4
  5. 5. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE Per i pazienti 134 e 202 gli alberi filogenetici mostrano un modello di mescolamento tra sequenze pro virali e sequenze di virus plasmatico non dissimili dal modello che abbiamo trovato per le sequenze pro virali derivate dai CD4 attivati e quiescenti26 (cfr. fig. S1k e S1L nel materiale supplementare27) In ogni modo, per tutti i restanti pazienti, gli alberi filogenetici mostrano sequenze pro virali e plasmatiche segreganti. (cfr. fig. 3 e fig. S1h J e S1m s nel materiale supplementare28). I risultati non sono stati influenzati dal metodo di ricostruzione filogenica (tabella 2). I risultati del test AMOVA erano anch’essi coerenti con quelli del test SM (tabella 2 e figura 2). Presi insieme, questi dati suggeriscono che la viremia residua sia compartimentalizzata e includa una o più popolazioni virali che sono geneticamente distinte dai pro virus nelle cellule CD4 quiescenti. In un sottogruppo di pazienti in HAART, la viremia residua è dominata da un PPC. I PPC sono stati individuati in 6 dei 13 pazienti studiati (tabella 2). Ci si potrebbe attendere che la presenza di un PPC influenzi l’analisi di una struttura di popolazione. Infatti, per il gene RT nei pazienti con PPC, il test AMOVA ha rilevato che tra il 10% e il 40% di tutte le variazioni molecolari erano tra i gruppi (cioè distinte tra sequenze pro virali e plasmatiche), mentre tra il 60% e il 90% di tutte le variazioni molecolari era divisa tra i due gruppi di sequenze (tabella 2). Per il gene RT in pazienti senza PPC, dall’altro lato, la variazione tra gruppi era solo del 2-3%. (nel paziente 134, la variazione percentuale tra popolazioni è negativa. Percentuali negative possono registrarsi in AMOVA, ma di solito coincidono con valori di P non significativi29). In contrasto, per il gene Env, l’assenza di un PPC sembra aumentare piuttosto che diminuire la variazione percentuale tra le popolazioni30 (tabella 2) Per determinare fino a quale estensione i PPC influenzassero l’analisi e determinare se sequenze plasmatiche diverse da PPC fossero geneticamente distinte dalle sequenze nei CD4 quiescenti abbiamo applicato le nostre analisi a dataset privati di tutti i PPC31 (tabella 4). Abbiamo scoperto che anche se i PPC influenzano la nostra analisi, nella maggior parte dei pazienti restano significative strutture di popolazione anche dopo la rimozione di tutte le sequenze di PPC. Per il test SM, in tutti i pazienti tranne il paziente 113, possiamo respingere l’ipotesi nulla che non ci sia una struttura di popolazione dopo la rimozione dei PPC (tabella 4). 26 Cioè in questi pazienti i virus si mescolano. 27 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1 28 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1 29 Valore p (o P-Value) è detto il minimo livello di significatività. In statistica inferenziale quando si fa un test di verifica d'ipotesi si fissa un livello di significatività, generalmente indicato con α, che determina la regione di rifiuto per l'ipotesi nulla. Generalmente si fissa α = 0,05 (5%), o α = 0,01 (1%). Con i dati campionari si esegue il test e si valuta se il suo valore cade nella regione di rifiuto e nella regione di accettazione. Se, ad esempio, cade nella regione di rifiuto si dice che il test è significativo al 5% (o 1% a seconda del valore di α). Alle volte è bene non limitarsi a fornire una indicazione sintetica dell'esito dell'esperimento (del tipo significatività o non significativo), ma dare un'indicazione più analitica così da mettere in condizione altre persone, che non hanno eseguito il test, di valutare come/per quanto abbiamo ritenuto di rifiutare o accettare il test. Il valore p è appunto un indicatore della plausibilità dell'ipotesi nulla, e si definisce come: il minimo livello di significatività α del test per il quale si rifiuterebbe l'ipotesi nulla. Ecco che si capisce il perché il valore-p venga anche chiamato: “livello di significatività osservato” (Wikipedia). 30 Vuol dire che alcuni geni virali sono gli stessi fra tutte le popolazione cellulari tipo RT mentre altri tipo ENV (quelli dell’involucro) sono diversi fra le diverse popolazioni. 31 Hanno confrontato con altri PPC. PAGINA 5
  6. 6. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE Il set di dati del paziente 113 aveva il minor numero di sequenze, e il cambiamento di risultato per questo paziente, poteva semplicemente riflettere la mancanza di potenza statistica32,33 Nelle analisi col test AMOVA, tutti i pazienti tranne due (il 113 e il 209) mostravano ancora una significativa differenza dopo avere rimosso il PPC. La rimozione dei PPC portava a una riduzione nella variazione intra popolazione tra il 10 e il 30% per il gene RT e tra il 5 e il 6% per il gene Env. Sorprendentemente, per il gene RT, la variazione tra popolazione per i pazienti 139, 148, 154 dopo la rimozione del PPC eccedeva ancora la variazione tra popolazione di ciascuno dei pazienti senza PPC. Prendendo i risultati tutti insieme, abbiamo trovato un coerente pattern di virus plasmatico e di pro virus dai CD4 quiescenti, mostrando una struttura di popolazione significativa nella maggioranza dei pazienti, senza riguardo della presenza o meno di PPC né del gene sequenziato34. Precedenti studi hanno dimostrato che l’insieme dei CD4 quiescenti che danno rifugio al DNA dell’HIV consiste di un misto di pro virus competenti per la replicazione e di pro virus difettosi, con i precedenti (cioè quelli difettosi) che rappresentano solo una piccola frazione del totale. Perciò potrebbe essere possibile che la popolazione di virus plasmatico appaia geneticamente differente dalla popolazione totale di pro virus integrati, mentre possa apparire allo stesso tempo simile alla piccola frazione di virus capaci di replicarsi35. Siamo stati in grado di esaminare questa possibilità usando sequenze di virus competenti per la replicazione36 ottenute da un paziente estensivamente caratterizzato, il 154. Abbiamo scoperto che due popolazioni potenzialmente distinte (pro virus totalmente integrato e pro virus integrato competente per la replicazione) sembrano appartenere a una popolazione mescolata di pro virus (cfr. tabella S1 nel materiale supplementare37). Inoltre, i nostri risultati, quando confrontavamo il virus plasmatico con la popolazione totale dei pro virus integrati (tabella 2) erano quasi identici ai nostri risultati quando confrontavamo il virus plasmatico con il solo sottogruppo del virus capace di replicarsi38 (cfr. tabella S1 nel materiale supplementare39). Nella nostra analisi della struttura di popolazione tra virus plasmatico e pro virus derivato dai CD4 quiescenti circolanti, abbiamo combinato campioni ottenuti in momenti diversi. Perciò la nostra analisi di questa relazione riflette un campionamento di medie temporali da questi compartimenti. Per determinare se potessimo considerare il nostro data set come temporalmente omogeneo, lo abbiamo testato per verificare la presenza o assenza di strutture temporali di popolazione nei diversi pazienti. Non abbiamo trovato evidenza di strutture di popolazione quando abbiamo confrontato le popolazioni pro virali da differenti posizioni temporali (dati non mostrati); nondimeno, abbiamo trovato evidenze di strutture di popolazione quando abbiamo confrontato le popolazioni del virus plasmatico da differenti posizioni temporali40 (dati non mostrati). In aggiunta al confrontare virus plasmatici e pro virus derivati da CD4 quiescenti, per un paziente (154) siamo stati anche in grado di confrontare virus plasmatici e pro virus derivati da CD4 attivati, monociti e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Le nostre analisi hanno rivelato che il virus plasmatico residuo 32 In poche parole per questo paziente non c’è significatività statistica. 33 La misura della potenza fornisce un criterio di discriminazione tra test diversi per saggiare la stessa ipotesi: è opportuno preferire il test con la maggiore potenza statistica. Il calcolo della potenza è inoltre alla base della procedura per definire la dimensione campionaria necessaria ad uno studio. La potenza statistica dipende dal numero di eventi che si verificano in uno studio e dal numero di soggetti inclusi nel campione. Quanto più uno studio è dotato di potenza, tanto meno probabile è il rischio di commettere un errore di secondo tipo, giudicando non significativa una differenza invece esistente. 34 Gli Autori continuano a dire la stessa cosa cioè che esistono due popolazioni virali diverse in tutti i pazienti tranne il 113 e il 209, ma forse solo perché i dati non hanno significatività statistica. 35 Vuol dire che non tutti i pezzetti di DNA virale che ci sono nei CD4 sono buoni, una parte di questi contengono molti errori che non gli permettono di formare un virus completo e adatto a riprodursi, perciò sono stati trovati pezzetti nel sangue che non sono molto simili al virus che riesce a replicarsi, e questi potrebbero essere i virus difettosi. E’ chiaro che un virus che si replica moltissime volte genera anche tanti errori che poi muoiono naturalmente ma e’ il prezzo da pagare per sopravvivere agli attacchi del sistema immunitario, infatti nelle tante mutazioni ve ne sono alcune che riescono a ingannare il sistema immunitario e riprodursi. 36 Cioè un virus che si replica e che non ha molti errori. 37 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1 38 Cioè il paziente 154 conferma in pieno lo studio infatti i due virus sono completamente diversi: il pro virus e il virus buono che si replica. 39 http://jvi.asm.org/cgi/data/83/17/8470/DC1/1 40 Ossia hanno preso campioni in periodi di tempo diversi per vedere se venivano confermati i dati, e sono stati confermati. PAGINA 6
  7. 7. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE forma una popolazione significativamente distinta da tutte queste altre sorgenti cellulari in questo paziente41 (tabella 3). Ancora, per determinare l’estensione con la quale i PPC stavano influenzando i risultati di queste analisi, abbiamo ripetuto tutte le analisi con tutti i PPC rimossi (tabella 4). La tabella 4 mostra che, in tutti gli scenari tranne uno (test SM che confronta il virus plasmatico al pro virus da CD4 attivati). I risultati restavano significativi. Le analisi col test AMOVA trovavano una significativa struttura di popolazione per tutti gli scenari (tabella 442). Presi insieme, questi risultati sono anche largamente coerenti, indipendentemente dalla presenza o assenza di un PPC. DISCUSSIONE C'è un grande interesse sulla natura dei virus dell'HIV che persistono nei pazienti in trattamento con la HAART e che causano la moltiplicazione della viremia dopo l'interruzione del trattamento. Precedenti studi hanno confrontato questo rimbalzo della viremia nei pazienti dopo l'interruzione della HAART rispetto ai pro virus nei reservoir delle cellule CD4 quiescenti. Purtroppo gli studi sulla moltiplicazione della viremia soffrono del fatto che il virus che inizialmente si moltiplica quando il trattamento è interrotto in un certo momento può essere differente dal virus che si sarebbe moltiplicato se il trattamento fosse stato interrotto in un momento successivo. In altre parole la moltiplicazione della viremia potrebbe riflettere l'attivazione stocastica43 di alcuni reservoir stabili44. In aggiunta, la moltiplicazione della viremia non può essere attribuito a una particolare fonte cellulare senza un campionamento estensivo di entrambi i compartimenti e rigorose comparazioni genetiche, caratteri questi che sono assenti dagli studi precedenti45. Un più esauriente approccio alla comprensione della persistenza virale tende a esaminare la natura dei virus liberi che continuano ad essere prodotti nei pazienti in trattamento antiretrovirale e a confrontare le caratteristiche di questa viremia residua con i reservoir cellulari conosciuti46. Abbiamo inserito la genetica delle popolazioni [virali] in una struttura statistica per analizzare sistematicamente la relazione tra virus plasmatico e pro virus nei CD4 quiescenti nei pazienti in HAART. Abbiamo scoperto che in tutti i pazienti tranne due il virus residuo libero nel plasma era, in generale, geneticamente diverso dalle sequenze pro virali delle cellule CD4 quiescenti. In contrasto le sequenze pro virali derivate dalle cellule CD4 quiescenti e attivate comprendevano una popolazione geneticamente mista. Uno studio recentemente pubblicato ha trovato risultati simili, usando il test SM per mostrare una significativa compartimentalizzazione tra le sequenze virali plasmatiche e quelle derivate dai CD4. Nel nostro lavoro abbiamo preso di mira un certo numero di questioni non risolte in quello studio. In primo luogo, ogni volta che si amplifichi un virus da un paziente con una bassa viremia, si dovrebbe essere consapevoli del possibile ricampionamento47 della Reazione a catena della polimerasi48, 41 Cioè CD4 attivati monociti e PBMC hanno stessa popolazione virale diversa dal virus plasmatici residuo (cioè quello dei reservoir) 42 La Tabella 4 illustra altri esami per confermare la stessa cosa (l’esistenza di due diverse popolazioni virali). 43 Casuale. 44 Cioè quando si sospende la HAART si potrebbe avere un virus diverso nel sangue che è quello dei reservoir. 45 Cioè quando la viremia si alza, ciò non dipende solo da una popolazione virale ma da più popolazioni. 46 Ossia: bisogna continuare a studiare questi virus residui e capire da dove vengono. 47 Cioè questa tecnica fa degli errori e potrebbero essere scambiati per altri virus perciò gli Autori hanno usato anche i test statistici per non sbagliare 48 La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain Reaction), comunemente nota con l'acronimo PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e PAGINA 7
  8. 8. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE in modo da assicurarsi che questo fenomeno non domini i risultati. Il nostro studio ha utilizzato sia pazienti derivati dallo studio di Baley et al, sia pazienti di nuovo arruolamento, per i quali tutti i campioni sono stati preparati in maniera da evitare questo fenomeno. In secondo luogo, differenti test di struttura della popolazione possono condurre a risultati contraddittori, e un’analisi prudente dovrebbe perciò usare almeno due test complementari di compartimentalizzazione. Per questa ragione, abbiamo usato un test aggiuntivo di struttura della popolazione, il test AMOVA49. In terzo luogo, abbiamo affrontato il problema dei PPC, che erano stati descritti da Bailey et al., e abbiamo indagato la loro relazione col più generale fenomeno della compartimentalizzazione. Il nostro studio inoltre affronta la relazione tra le sequenze pro virali derivate dai CD4 attivati e quiescenti, assumendo implicitamente la compartimentalizzazione tra questi due tipi di cellule. Poiché nella maggioranza dei pazienti non abbiamo potuto respingere l’ipotesi nulla della mancanza di compartimentalizzazione, ne concludiamo che gli indici di migrazione calcolati in lavori precedenti non hanno interpretazione sensata50. Per quanto la HAART possa fermare la replicazione in corso, le cellule CD4 memoria offrono rifugio al pro virus dell'HIV che può ancora produrre virus dopo la riattivazione. Perciò i reservoir latenti contribuiscono probabilmente alla viremia residua nei pazienti con la HAART. Nondimeno, abbiamo dimostrato in questo studio che, a livello della popolazione, i pro virus derivati dalle cellule CD4 quiescenti e il virus libero nel sangue esistono come due diverse popolazioni genetiche. Ci sono diverse possibili spiegazioni. Poiché noi abbiamo campionato soltanto le cellule CD4 quiescenti circolanti, una spiegazione è che le cellule CD4 quiescenti sequestrate nei vari tessuti possano essere la sorgente del virus libero osservato nel plasma di questi pazienti51. L'assunto che il campionamento dalla periferia possa offrire una buona rappresentazione delle quasi-specie presenti nei CD4 reservoir, mentre è una potenziale limitazione di questo studio, non è raro in questa area di ricerca. Un'altra possibile spiegazione è che altri tipi cellulari o compartimenti anatomici possano svolgere anche essi la funzione di reservoir di lungo termine. Recenti studi che identificano i PPC suggeriscono che un reservoir alternativo per l'HIV possa essere responsabile di parte della viremia residua osservata52. Suggeriamo che la presenza dei PPC possa essere una manifestazione di un più generale fenomeno nel quale una sorgente di virus libero nel plasma è figlia d'un qualche comparto cellulare fortemente sottorappresentato nel sangue periferico53. Abbiamo trovato che la struttura di popolazione tra virus plasmatico e pro virus dai CD4 quiescenti non dipendeva dalla presenza di un PPC. Cionondimeno, la percentuale di variazione molecolare tra (cioè non condivisa da) questi due gruppi di sequenze era fortemente influenzata dai PPC. Abbiamo studiato l’impatto dei PPC analizzando nuovamente tutti gli insiemi di dati54 dopo avere rimosso tutti i PPC. Abbiamo trovato che la rimozione dei PPC riduceva la variazione percentuale tra i gruppi, ma nella maggior parte dei casi rimanevano significative strutture di popolazione anche dopo la rimozione dei PPC. La nostra analisi comprende due geni: RT ed Env. La nostra scoperta di una struttura di popolazione tra il virus plasmatico e il pro virus derivato dai CD4 quiescenti non sembrava dipendere dai geni in studio. Comunque, la percentuale di variazione molecolare tra i gruppi, come calcolata col test AMOVA, era differente per i due geni, così come l’effetto della presenza di sequenze PPC o la rimozione di questo. La differenza osservata nella variazione percentuale tra i gruppi per i geni RT ed Env potrebbe essere spiegata dalla differenza nella diversità globale trovata in questi due geni. Il test AMOVA è basato sulla diversità molecolare, che è molto inferiore nel terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. 49 Gli Autori ripetono qui che a volte le tecniche di amplificazione genica (PCR) fanno degli errori e quindi bisogna eseguire più test di controllo. 50 In alcuni pazienti però sembra che ci sia lo stessa popolazione virale o forse solo perche il dato non e statisticamente significativo. 51 Quindi i reservoir potrebbero essere solo i CD4 quiescenti e basta. 52 Cioè ci potrebbe essere anche un altro reservoir, come dice un altro studio, ma non si è certi. 53 Cioè se la viremia residua è cosi bassa vuol dire che il virus è nascosto in una popolazione cellulare formata da pochissimi elementi. 54 Nell’articolo: dataset PAGINA 8
  9. 9. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE gene RT che in quello Env. Poiché l’infezione iniziale da HIV è probabilmente determinata da un singolo clone, due distinte sotto popolazioni potrebbero mostrare scarse differenze tra popolazioni se il tempo per accumulare queste diversità è stato breve, e questo effetto potrebbe essere più forte nel gene RT che in quello Env. In questo scenario, possiamo concludere che c’è una fonte maggiore di viremia residua diversa dai CD4 riattivati, ma che questa fonte diviene chiaramente visibile nel gene RT solo quando questo produce un PPC55. Alternativamente, se rigettiamo la nozione che il gene Env sia significativamente molto diverso dal gene RT, possiamo spiegare la correlazione tra la presenza o assenza di un PPC e la variazione percentuale tra popolazioni con un modello in cui la maggioranza del virus plasmatico si origina dai CD4 quiescenti, mentre un sottogruppo (esemplificato nel PPC) si origina da una fonte ancora non identificata. Basandoci sulle nostre analisi di pazienti concernenti sequenze Env, sentiamo [di poter sostenere che] il primo modello (una fonte di viremia residua diversa dai CD4 riattivati) si adatti meglio ai dati. Non avevamo i dati per analizzare i geni RT ed Env per ciascun paziente, ma abbiamo dati sufficienti per un paziente, il 154. Per questo paziente, abbiamo trovato che i nostri risultati erano comparabili per i due geni56. Nella nostra analisi di struttura della popolazione tra virus plasmatico e pro virus derivato dai CD4 quiescenti abbiamo usato campioni derivati in momenti diversi. Perciò la nostra analisi riflette un campionamento in un tempo medio dei compartimenti sotto analisi. Il campionamento temporale è una necessità logistica quando si conducono analisi di virus plasmatico in pazienti in HAART soppressiva, a causa del numero molto ridotto di sequenze ottenibili con ogni prelievo di sangue. Non abbiamo trovato evidenze di variazioni temporali nelle popolazioni pro virali rispetto ai differenti momenti. Abbiamo, comunque, osservato che i virus plasmatici isolati in momenti differenti sembravano essere campionati da differenti sottopopolazioni. Questa osservazione presta ulteriore supporto alla nostra conclusione complessiva che il virus plasmatico non derivi esclusivamente dai CD4 circolanti. La nostra analisi di sequenze di plasma virale campionato longitudinalmente è in accordo con il lavoro precedentemente pubblicato da Joos et al., che ha trovato variazioni temporali ma non l’evidenza di una evoluzione continuata nel virus plasmatico prelevato in diversi momenti57. È risaputo che l’insieme del pro virus dell’HIV derivato dalle cellule T quiescenti contiene un insieme di specie competenti e non competenti per la replicazione, con le prime rappresentanti solo una piccola frazione del totale. Perciò è possibile che il virus plasmatico prelevato possa essere geneticamente simile a un sottogruppo dell’insieme del totale pro virale, rappresentato dalla popolazione competente per la replicazione, pur apparendo geneticamente distinto rispetto alla popolazione totale. I metodi sviluppati per isolare il pro virus competente per la replicazione nei pazienti sono tecnicamente impegnativi e spesso conducono a troppe poche sequenze per essere utili a un’analisi filogenetica dettagliata. Perciò noi avevamo dati sufficienti per condurre un’analisi dai pro virus competenti per la replicazione solo in un paziente estensivamente caratterizzato: il paziente 154. I nostri risultati hanno mostrato che il pro virus competente per la replicazione e totalmente integrato comprende un compartimento genetico misto. Inoltre, quando confrontiamo il virus plasmatico con il pro virus competente per la replicazione, troviamo che queste due popolazioni formano distinti compartimenti genetici. Per quanto limitati a un paziente, i nostri dati supportano l’ipotesi che le cellule T infette isolate dalla circolazione periferica rappresentino un singolo compartimento. Perciò, le mutazioni o altri eventi che conducono all’incompetenza per la replicazione occorrono nel contesto di una popolazione genetica mescolata, e perciò, a livello di popolazione, ci dovrebbe essere una piccola differenza genetica globale58. 55 In altre parole, vuol dire che analizzando i due geni RT ed Env sembra che vi potrebbe essere anche un’altra viremia residua, ossia non solo dovuta ai CD4 memoria. 56 Cioè dall’analisi dei due geni esiste una viremia residua che gli Autori sostengono potrebbe essere diversa dai CD4 quiescenti. 57 Parla del problema tempo di campionamento: il tempo deve essere sempre uguale sennò di una popolazione virale ne abbiamo di più di un'altra e i risultati sono falsati. 58 In breve: solo il paziente 154 aveva una buona quantità di virus attivo (cioè senza errori) per poterlo confrontare con il virus della viremia residua. E l’analisi di questo ha confermato lo studio cioè che ci sono due popolazioni distinte di virus. PAGINA 9
  10. 10. L’ANALISI DELLA VIREMIA E DEL PRO VIRUS DELL’HIV-1 RIVELANO UNA NUOVA FONTE DI VIREMIA RESIDUA NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE Abbiamo altresì dimostrato che i pro virus derivati dai CD4 attivati e quiescenti formano una popolazione genetica mescolata. Possiamo spiegare questa osservazione nel contesto della biologia di base delle cellule T. I CD4 attivati e quiescenti rappresentano la stessa popolazione di cellule, ma fissata a differenti stadi di attivazione. Perciò, i pro virus derivati dai CD4 attivati o quiescenti provengono dallo stesso compartimento cellulare e dovrebbero formare una popolazione geneticamente mista. Questo sarebbe vero, tuttavia, se i CD4 attivati non fossero di nuova infezione a opera del virus plasmatico. Se ci fosse replicazione in corso, ci si potrebbe attendere discordanza tra i pro virus derivati dai CD4 attivati e quiescenti, e ci si potrebbe aspettare una piccola evidenza di struttura di popolazione tra il virus plasmatico e quello derivato dai CD4 attivati. Noi abbiamo i dati per testare l’ultima ipotesi solo per il paziente 154. In questo paziente, il virus plasmatico era significativamente differente dal pro virus derivato dai CD4 sia attivati sia quiescenti. In contrasto, il pro virus derivato dai CD4 attivati e quiescenti non mostrava evidenza di struttura di popolazione, un risultato coerente con la struttura globale che emerge da questo studio59. Il nostro studio non si occupa della relazione filogenetica tra il virus plasmatico e quello nei CD4 quiescenti dei pazienti con replicazione virale attiva. Nei pazienti con replicazione virale attiva, la maggior parte del virus plasmatico è derivata da cellule recentemente infettate dal rapido turnover60. Le varianti virali dominanti nel plasma sono tipicamente quelle che più si adattano alle condizioni esistenti. In contrasto, i reservoir latenti nei CD4 quiescenti danno rifugio a un archivio stabile di varianti virali preesistenti. Per esempio, abbiamo mostrato precedentemente che nei pazienti che vanno incontro a fallimento terapeutico, il plasma contiene varianti resistenti al farmaco, mentre i reservoir ospitano il virus originale “selvaggio”61 e le varianti farmaco resistenti precedenti62. Perciò, nei pazienti viremici, è atteso che ci saranno differenze nelle quasi specie virali individuate in plasma e reservoir latenti. Nondimeno, questo riflette le differenze tra replicazione attiva e rilascio dai reservoir stabili piuttosto che differenze tra i reservoir stabili. Sfortunatamente, le attualmente persistenti difficoltà tecniche precludono un’analisi dettagliata di questo problema. Stevenson et coll. hanno mostrato che la maggior parte del DNA dell’HIV nei CD4 quiescenti dei pazienti viremici è una forma labile, non integrata, in cellule di recente infezione. Questo DNA non integrato complica grandemente la ricerca delle più rare forme integrate. Noi abbiamo sviluppato un approccio sperimentale per isolare il DNA dell’HIV integrato, ma il numero di sequenze che può essere ottenuto con questo approccio è generalmente troppo limitato per un’analisi filogenetica dettagliata. Questo numero è, comunque, sufficiente per confermare l’impressione generale che nei pazienti viremici ci siano sostanziali differenze tra l’insieme di virus attivamente replicante osservato nel plasma e l’insieme stabile archiviato di pro virus integrati nei CD4 quiescenti63. Che la maggior parte del virus plasmatico possa essere derivato da alcune fonti cellulari ancora non identificate ha diverse importanti implicazioni cliniche rispetto alla gestione della HAART, al fallimento terapeutico, alla moltiplicazione della viremia associata all’interruzione del trattamento ed alle strategie tese all’eradicazione. Numerosi laboratori stanno attivamente seguendo diverse strategie di eradicazione, la maggior parte delle quali comprende alcune attività di bersaglio e ripulitura dei reservoir latenti nei CD4 memoria quiescenti. Se la maggior parte della viremia residua nei pazienti trattati con la HAART provenisse da altri reservoir o compartimenti, come qui suggerito, allora, per essere efficaci, le strategie di eradicazione dovrebbero includere vie per bersagliare e ripulire anche questi altri reservoir. 59 Ribadisce di nuovo che grazie al paziente 154 si e’ riusciti a capire che esistono due popolazioni virali distinte. 60 Il termine turnover di un determinato elemento chimico è sinonimo di "ciclo" di quell'elemento, cioè di quella serie di passaggi che comprendono il suo assorbimento da parte dei viventi, la sua metabolizzazione, il suo trasporto e la sua restituzione all'ambiente (Wikipedia) 61 Wild-type. 62 Nei reservoir vengono conservate varie mutazioni del virus selvaggio ma anche qualche mutazione più recente, dovuta a nuove reinfezioni di altri CD4 di memoria. Per cui, quando si sospende la HAART, le varianti più aggressive e toste hanno la meglio. 63 Le tecniche attuali non permettono di valutare con esattezza tutte le mutazioni del virus, ma permettono di creare un archivio da cui attingere per studi futuri, quando le tecniche si saranno evolute. PAGINA 10

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