PENGERTIAN HIBRIDOMA        HIBRIDOMA A. Pengertian HibridomaTeknik DNA rekombinan, dikenal pulateknologi hibridoma. Hibri...
hibnd yang membuat antibody seperti sel timpa dan dapat dibiakkan terus menerusseperti sel mieloma (9,10,11)2) Eliminasi s...
complete Freuncfs adjuvant, bila antigen seluier dibuat tanpa ajuvan. Antigen disuntikkansubkutan pada beberapa tempat ata...
yang mudah didapat, N-acetytmuramyl-L-alanyi- D-isoglutamine. Cara ini terbukti telahmeningkatkan jumlah hibridoma pembuat...
me- dium tanpa serum karena memberi keuntungan: ? memungkinkan penetitian yang takmemperbotehkan adanya protein serum atau...
faktor mitogennya sampai sekarang betum diketahui. Demikian juga dengan serum talipusat manusia yang sampai saat ini belum...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Pengertian hibridoma

9,027 views

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
9,027
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
32
Actions
Shares
0
Downloads
143
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Pengertian hibridoma

  1. 1. PENGERTIAN HIBRIDOMA HIBRIDOMA A. Pengertian HibridomaTeknik DNA rekombinan, dikenal pulateknologi hibridoma. Hibridoma adalah sel-selyang dihasilkan dengan cara peleburan ataufusi dua tipe sel yang berbeda menjadi kesatuantunggal yang mengandung gen-gen dari keduayang digabungkan. Salah satu teknikpengabungan yang digunakan yaitu elektrafusiatau fusi secara elektris. Teknik sel-sel tertariksatu sama lain dan melebur (fusi) B. TeknikHibridoma Teknik hibridoma adalah teknikpembuatan sel yang dihasilkan dari fusi antarasel B limfosit dengan sel kanker. Sifat dari sel hibridoma ini adalah imortal. Proses pembuatandari sel hibridoma adalah sebagai berikut, pertama-tama dilakukan proses imunisasi denganmenggunakan antigen tertentu. Kemudian dipisahkan sel B-limfosit dari organ limpa, lalu sel inidifusikan dengan sel kanker immortal. Tahapan fusi sel hibridoma ini dilakukan denganmembuat membran sel menjadi lebih permeabel. Sel hibrid hasil fusi inilah yang disebut sebagaisel hibridoma yang merupakan sel imortal yang dapat menghasilkan antibodi. Dalam percobaanyang umum dilakukan, proses pembuatan sel hibridoma dilakukan dengan menggunakan selmieloma NS-1 dan sel limpa dari mencit.Proses pembuatan dari sel hibridoma : 1. proses imunisasi dengan menggunakan antigen tertentu yang disuntikan ke dalam tubuh mencit (Mus musculus) 2. sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk antibodi 3. pemisahan sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari organ limpa mencit 4. sel B-limfosit kemudian difusikan dengan sel kanker immortal menghasilkan sel hibridoma 5. fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel menjadi lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu 6. sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga dihasilkan banyak sel yang memiliki anti bodi tertentu sehingga dikenal dengan antibodi monoklonal yang bisa disimpan lama dalam keadaan dibekukan 7. Perkembangan Teknik Hibridoma 8. PRINSIP PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL Tujuannya ialah menciptakan sel pembuat antibody homo- gen yang dapat dibiakkan terus menerus (immortal), melalui : 1) Fusi sel limpa kebal dan sel mieloma Pada kondisi biakanjaringan biasa, sel limpa yang membuat antibodi akan cepat mati sedangkan sel mieloma dapat dibiakkan terus menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel
  2. 2. hibnd yang membuat antibody seperti sel timpa dan dapat dibiakkan terus menerusseperti sel mieloma (9,10,11)2) Eliminasi sel induk yang tidak fusiFrekuensi terjadinya hibrid sel timpa-sel mieloma biasanya rendah, karena itu pentinguntuk mematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnya lebih banyak agar sel hibridmempunyai kesempatan untuk tumbuh, dengan cara menggunakan:(i) Sel mieloma mutan yang mempunyai kelainan (defect) sintesis nukleotida yaitu selmieloma yang tidak mempunyai enzim timidin kinase (TK) atau hypoxanthinephosphoribosyt transferase (HGPRT) sehingga dalam sintesis nukleotida tidak dapatmenggunakan salvage pathway dan(ii) Media selektif yang dikembangkan oleh Littlefield, me- ngandung hypoxanthine,aminopterin dan thymidine (HAT). Aminopteninmenghambatjalan biasa biosintesis purindan piri- midin sehingga memaksa sel menggunakan salvage pathway. Sel yang tidak fusikarena tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthinephosphonibosyttransferase akan mati, se- dangkan sel hibrid karena mendapatkan enzimtersebut dan sel mamalia yang difusikan dapat menggunakan salvage pathway sehinggatetap hidup dan berkembang (10,12).3) Isolasi Mon yang diinginkanSel hibrid dikembang biakkan sedemikian sehingga tiap sel hibrid akan membentukkotoni sendiri. Tiap koloni kemudian dipelihara terpisah satu sama lain. Hibridoma yangterbentuk di- pilih dengan cara mendeteks antibodi yang disekresikan dalam medium.Kadarantibodi biasanya cukuptinggi, sehingga banyak uji serologi yang dapat digunakantergantung jumlah antigen spesifik yang tersedia, tetapi yang paling sering digunakanadalah radioimmunoassay (RIA) dan enzyme linked immunosorbent assay (EL1SA).4) Produksi antibodi monokional spesifikSetelah klon hibridoma yang diinginkan dapat diisoiasi, maka produksi antibodimonokional dapat dilakukan dengan cara :(i) in vitro, membiakkan pada medium biakan jaringan dan antibodi dapat dipanen dansupernatan. Kadar pada umumnya 10?100 ug/ml supernatan,(ii) in vivo, mentranspiantasikan intraperitoneal pada binatang, antibodi dipanen dancairan asites. Kadar pada umumnya 1-25 mg/ml cairan asites (10,12) .PERKEMBANGAN TEKNIK HIBRIDOMASejak diperkenaikan, teknik hibridoma telah banyak mengalami perkembangan untukmendapatkan klon secara efisien dan hibridoma yang hidup secara maksima (13) .Sejalan dengan tujuan maka pengembangan timbul pada cara-cara:1) ImunisasiHibridoma merupakan hasii fusi 2 sei yaitu sd mieioma dan sel B penghasii antibodi.Karena itu supaya memperbanyak sel B spesifik terhadap antigen yang diinginkanpenting supaya popu- lasi sel B pesifik jumlahnya lebih banyak sehingga hasil fusimencapai maksimal. Banyaknya sel B spesifik dipengaruhi anti- gen baik caranyastimuiasi maupun sifat dan antigen sendiri, Se- hingga untuk memperbanyak sel Bspesifik, dilakukan berbagai cara imunisasi, yaitu:(i) KonvensionalCara ini sebenarnya sama dengan cara imunisasi untuk membuat antibodi poiikional.Antigen berupa protein atau poli- sakanida dalam volume yang sama diemulsikan dengan
  3. 3. complete Freuncfs adjuvant, bila antigen seluier dibuat tanpa ajuvan. Antigen disuntikkansubkutan pada beberapa tempat atau intra- peritoneai, setelah 2?3 minggu disusulsuntikan antigen tanpa ajuvan secara intravena sekali atau beberapa kaii. Mencit dengantanggap kebal terbaik dipilih, 1?2 hari setelah suntikan terakhir mencit dibunuh dandiambil sel limpanya (11,12) . Cara ini dianggap cukup baik dan secara umum banyakdipakai, walaupun di- pengaruhi sifat antigen berupa imunogen kuat atau lemah sertatanggap kebal binatang yang berbeda-beda. Bila informasi anti- gen yang iengkap tidakbisa didapatkan cara imunisasi ini ter- bukti memberi hasil cukup baik (11) ..(ii) Imunisasi sekali suntik intralimpa (Single-shot intrasplenic immunization) Padaimunisasi konvensional, antigen dipengaruhi ber- macam-macam faktor. Bila disuntikkanke dalam darah sebagian besar akan dibuang secaraaiami, sedangkan melalui kulit akantersaring kelenjar limfe regional, makrofag dan sel retikuler. Hanya sebagian keciiantigen yang terlibat daiam proses tanggapkebal. Pada hibridoma yang diperlukan adalah sel limpa, karena itu untuk mencegaheiimin antigen oleh bagian lain dari tubuh dilakukan suntikan imunisasi langsung padalimpa dan ternyata hasilnya lebih baik dan cara konvensional (14) . Selain memberi- kanhasil klon spesifik yang lebih banyak, imunisasi intraiimpa ini memberi keuntungan yanglain :(1) Pemakaian antigen yang sangat hemat, misalnya untuk imunisasi dengan 1gMmanusia hanya diperiukan 20 ug, sedangkan untuk antigen berupa sel hanya diperlukan200.000 sel, sehingga dapat dibuat hibridoma dan antigen yang terbatas jumiahnya.Karena hampir semua binatang percobaan membeni tanggap kebal yang baik, tidak di-periukan binatang dalam jumlah yang besar (14) .(2) Fusi dapat dilakukan dalam waktu 3 hari seteiah imunisasi (14) .(iii) Imunisasi in vitroTidak ditemukannya antibodi monokional spesifik sering karena kegagalan stimulasilimfosit B pada imunisasi in vivo. ini mungkin disebabkan toleransi atau adanya antigenhierarchy response (reaksi tanggap kebai hanya terhadap beberapa kom- ponen antigen).Sering terjadi seteiah imunisasi dengan antigen yang Iemah, wataupun titer antibodinyatinggi ternyata gagal mendapatkan hibridoma spesifik karena rendahnya jumtah sel Bspesifik dalam limpa, maka untuk mengatasinya dilakukan imunisasi in vitro (15) Padaprinsipnya sel timpa belum imun ditambah antigen dan TCM (thymocyte culture-conditioned medium) yaitu medium biakan sel thymus setelah inkubasi 48 jam. Antigendapat benupa antigen tertarut sebanyak 30?1000 ug atau sel yang difiksasi aikohol atauyang diradiasi 4500 rad dengan Cesium radioaktif. Setelah diinkubasikan 37?C selama 5hari akan banyak dijumpai sel blast yang besar dan pada keadaan ini sel siap untukdilakukan fusi (15) Sebagai contoh kebenhasiian imunisasi in vitro : melalui imunisasi invitro dengan 107 sel acute myeloid leukemia (AML) yang difiksasi alkohol, 31 dan 96sumur biakan menghasilkan hibridoma spesifik dan antibodi dan 6 dari klon ternyatasangat spesifik karena tidak beneaksi dengan sel darah penifer maupun sel sumsumtuiang. Hasil ini berbeda bila dibandingkan melalui imunisasi in vivo, antibodi yangdihasiikan sebagian besar bereaksi dengan major histocompatibility antigen atau majorrnyeloid differentiation antigen yang merupakan bagian terbanyak dari permukaan sel(15) . Perkembangan selanjutnya merupakan penyederhanaan kon- disi imunisasi in vitroyaitu menggunakan medium yang biasa untuk biakan jaringan yaltu RPMI (Roswell ParkMemorial Institute) atau DMEM (Dulbeco `s Mod Eagles Medium) dan ajuvan peptida
  4. 4. yang mudah didapat, N-acetytmuramyl-L-alanyi- D-isoglutamine. Cara ini terbukti telahmeningkatkan jumlah hibridoma pembuat antibodi sertajumlah hibridoma yang dapatbertahan hidup. Pada pninsipnya cara ini sama dengan di atas, yaitu sel limpa beium imunditambah antigen dan 20 ug N- acetylmuramyi-L-alanyi-D-iso- glutamine, diinkubasikan37?C dengan 5% CO 2 95% udara setama 4 hari (16) . Berhasilnya imu- nisasi in vitro initelah membuka petuang dilakukannya stimulasi in vitro sel B manusia, karena imunisasiin vivo tidak dapat di- jaiankan karena dibatasi etika, yang seianjutnya diikuti fusi dengansel mieloma manusia atau transformasi dengan virus Epstein-Barr sehingga dapat dibuatantibodi monoktonat ma- nusia(16) .2) Pilihan sel mielomaYang rnenjadi pertimbangan dalam memilih sel mieloma, adalah:a) SpesiesSd mieloma yang berasal dari spesies yang sama dengan binatang yang diimunisasi akanmengurangi segregasi kromo- som pasca fusi. Contoh yang ekstrim ialah hibridoma selmieloma mencit dengan sel limpa manusia,kromosom sel manusia dengan cepatmengalami segregasi sehingga hasil hibrid menjadi tidak stabi1 (11,17) . Dalamperkembangannya, pemilihan sel mieloma yang berbeda spesies dapat dilakukan terutamauntuk tujuan ter- tentu. Hibrid sel mencit dengan tikus telah dibuat dan berhasil baik,tetapi perbedaan spesies yang terlalu jauh dikatakan tidak produktif (18) . Walaupunpembuatan antibodi monokional mencitdan tikus sudah berhasil baik, gunanya secaraklinis sangat terbatas karena tetap merupakan protein asing untuk manusia. Karena itudikem- bangkan hibrid manusia dengan mengembangkan sel mieloma manusia yangsensitif terhadap hypoxanthinc-aminopterin- thymidine. Tim dari Stanford Universitytelah berhasil membuat galur sel mieloma tersebut yaitu U-266 AR1 dengan nomorregistrasi SKO-007. Sayangnya galur ini masih membuat sendiri IgE (19).b) Sintesis imunoglobulinSel hibridoma mengekspresikan rantai imunoglobulin se- cara codominant, sehinggaimunoglobulin dan sel mieloma akan diekspresikan bersama imunoglobulin dan sel limpadengan kombinasi secara acak (19). Sebagai contoh, bila sel mieloma membentuk rantaiberat dan rantai ringan imunoglobulin, seperti juga halnya dengan sel limpa, makaimunoglobulin dan sel hibrid merupakan kombinasi acak dari ke-4 rantai dan antibodispesifik hanya terdapat 1/16 dari seluruh imunoglobutin yang terben- tuk (20) . Karenaitu pengembangan diarahkan untuk membuat sel mieloma yang tidak membuat rantaiimunoglobulin tetapi tetap dapat fusi dengan baik. Gatur sel mieloma mencit SP2/O-Ag14 yang merupakan hasil reclone SP2/HI-Ag adalah sel mieloma pertama yang tidakmembentuk rantai imunogtobutin (20) . Ber- bagai jenis mieloma dapat dilihat padaTabel 1.3) Medium biakanMedium biakan umumnya DMEM atau RPMI 1640 dengan tambahan fetal calfserum(FCS) dan aditif lainnya. Yang menjadi masalah adalah FCS harganya mahal, sutitdidapat dan kuali- tasnya sangat bervariasi tergantung sumbernya bahkan juga bervariasiuntuk tiap batch. Penambahan FCS sangat penting, bahkan pada waktu fusi, seleksi dancloning kadar FCS dalam medium sering dinaikkan. Dipilih FCS karena kandunganimunogtobulinnya rendah sehingga tidak mempengaruhi assay serta sangat mendukungtumbuh dan kembang biak sel (11) . Usaha pengembangan dilakukan untuk mendapatkan
  5. 5. me- dium tanpa serum karena memberi keuntungan: ? memungkinkan penetitian yang takmemperbotehkan adanya protein serum atau bahan-bahan dan serum misatnya hormon,antibodi. ? ekonomis, terutama untuk menumbuhkan sel dalam skala besar. ?mempermudah pemurnian antibodi monokional, bahkan pada beberapa keadaan, antibodimonokional dapat langsung digunakan tanpa pemurnian (21) . Salah satu dari mediumtanpa serum adalah Serum-free KSLM medium yang menggunakan medium dasar RPMI1640 + DMEM + Hams F-12 medium dengan perbandingan 2: 1: 1, ditambah insulin, 2-amino etanol, 2-merkaptoetanot, natrium selenit, LDL manusia, asam oleat dalamkompleks dengan albumin serum sapi (BSA) (22) . Serum- free KSLM medium terbuktisama baiknya untuk menumbuhkan sel mieloma NS- 1 dan sel hibnidoma (Tabet 2),dibandingkan medium dengan 10% FCS. Harus menjadi perhatian bahwa tidaksemuajenis sel mieloma atau hibridoma cocok dengan medium tanpa serum (21) .4) Fusi selFusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga menghasitkan sel besar dengandua atau lebih inti yang berasal dari kedua induk sel yang berbedajenis, disebutheterokaryon, pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk 1 inti yang me- ngandungknomosom kedua induk disebut sebagai sel hybrid (17) .Frekuensi fusi dipengaruhi bermacam?macam faktor:? jenis medium.? perbandingan jumtah sel timpa dengan sel mieloma.? jenis sel mieloma yang digunakan.? bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen), misainya polyethylene glycol (23) .Secara garis besar fusogen dibagi menjadi 2 kategori:? Virus berselubung. Yang sering digunakan adalah virus Sendai (17,24) .? Reagensia tipofitik atau tipolitik, misal lysole cithin dan polyethylene g1ycol (17) .Pada awal penelitiannya Kohier dan Milstein menggunakan virus Sendai yang inaktifsebagai fusogen (3) , tetapi karena sulit menyiapkannya, efisiensinya sangat bervariasidan hanya men- dorong fusi pada beberapa jenis sel saja, maka fusogen diganti denganpolyethylene glycol yang lebih mudah didapat dan dapat mendorong fusi pada sel denganjenis yang lebih luas (17) . Pengem- bangan fusi sel banyak diarahkan untuk menaikkanefisiensi fusi yang dianggap masih rendah, antara lain dengan cara: ? mengembangkanfusogen Polyethyleneglycol (PEG) secara luas sudah digunakan se- bagai fusogen,biasanya dengan berat molekul 1000?6000, kon- sentrasi 50%. Penambahan PEG denganDMSO (dimethylsul- phoxide) ternyata dapat menaikkan efisiensi fusi (17) . ?mengembangkan teknik fusi lain,yaitu menggunakan medan listrik pada limfoblas (25) .5) Penumbuhan hibndomaBerdasarkan pengamatan Fazekas de St Groth dan Schei- degger, penumbuhan hibridpasca fusi yang dilakukan dengan feeder cell (sel limpa tidak imun) memberi hasil yanglebih konstan dibanding tanpa feeder cell (18) . Sebagai feeder system dapat digunakansel limpa tidak imun, thymocyte, makrofag peritoneum, fibroblas manusia yang telahdiradiasi (18), lipopoli- sakarida (LPS), supernatan makrofag, supernatan biakan endotelmanusia dan serum darah tali pusat manusia (13) . Dalam feeder system terdapat faktorpendorong penumbuhan sel, sebagai con- toh: ? mitogen lipopolisakarida (LPS), efeknyadiperkuat dengan penambahan dextran sufat. ? supernatan makrofag mengandungmonokin (interleukin-1) menimbulkan aktivasi limfosit. ? supernatan biakan endotelpembuluh darah manusia dapat mendorong proliferasi dan diferensiasi hibridoma sel B,
  6. 6. faktor mitogennya sampai sekarang betum diketahui. Demikian juga dengan serum talipusat manusia yang sampai saat ini belumdiketahui faktor yang mendorong tumbuhnya hibridoma (13) . Penambahan feedersystem terbukti menaikkan frekuensi sel limpa pembentuk klon dan frekuensiterbentuknya klon yang membuat antibodi setelah fusi (Tabel 3)(13)KESIMPULANHibridoma merupakan fusi sel limfosit B dengan sel mieloma, yang dapat dibiakkan terusmenerus. Karena hibridoma sel limfosit B tetap mempertahankan ekspresi genimunoglobulin maka dimanfaatkan untuk membuat antibodi monoklonal. Frekuensitimbulnya hibrid setelah fusi sangat rendah, karena itu pengembangannya banyakdiarahkan untuk menaikkan frekuensi fusi dan mendapatkan klon hidup secara maksimal.Cara imunisasi konvensional memberi hasil cukup baik, tetapi cara imunisasi sekalisuntik intratimpa dan in vitro mem- beri hasil lebih baik, lebih hemat antigen sertawaktunya lebih singkat, bahkan imunisasi in vitro membuka peluang dilakukan- nyaimunisasi limfosit B manusia, dimana imunisasi in vivo tidak dapat dilakukan karenadibatasi etika. Pilihan sel mieloma makin beragam, baik spesies (mencit, tikus, manusia)maupun sifatnya, makin ideal untuk membuat antibodi monokional dengandikembangkannya galur sel mieloma yang tidak membentuk rantai imunogtobulin.Medium dasar ditambah FCS (fetal calf serum) secara umum cukup baik, tetapi FCSmerupakan hambatan karena harganya mahal, sulit di- dapatkan serta hasilnya bervariasi.Karana itu dikembangkan medium tanpa serum sehingga penelitian yang perlu keadaantanpa serum dapat dilakukan dan biaya pemeliharaan sd dalam skala besar akan lebihmurah. Untuk mendorong timbulnya fusi sel banyak digunakan polyethyleneglycol(PEG) yang mudah didapat dan cukup efek- tif. Pengembangan dilakukan untukmemperbaiki frekuensi fusi dengan menambahkan DMSO bersama PEG dan penggunaanmedan listnik. Penambahan bermacam-macam feeder system, terbukti dapat mendorongpenumbuhan hibridoma.

×