Una guía para 4º medio, biología común. Los alumnos, usando papel, tijera, pegamento y cinta adhesiva, simularán la labor de un biotecnólogo para crear una bacteria con el gen de la insulina humana inserto en el plásmido.

1. SFC Prof. Gustavo Toledo C.
TÉCNICA DE ADN RECOMBINANTE
Objetivo: Los estudiantes modelarán el proceso usando enzimas de restricción y plásmidos para formar ADN
recombinante
INFORMACIÓN: Las principales herramientas de la
tecnología de DNA recombinante son enzimas
bacterianas llamadas enzimas de restricción o
endonucleasas de restricción. Cada endonucleasa
reconoce una secuencia corta y específica de
nucleótidos en moléculas de DNA y cortan la
“columna vertebral” de las moléculas en esa
secuencia. El resultado es un sistema de
fragmentos de DNA de doble hebra con los
"extremos pegajosos." Los extremos pegajosos no
son realmente pegajosos; sin embargo, las bases
nitrogenadas en los extremos pegajosos se unen
con las bases complementarias en otras moléculas
de DNA. Así, los extremos pegajosos de los
fragmentos de DNA se pueden utilizar para unir
pedazos de la DNA originados de diversas
diferentes especies.
Para ser útiles, las moléculas de DNA recombinante
tienen que ser hechas para replicarse y para
funcionar genéticamente dentro de una célula. Un
método para hacer esto es utilizar DNA del plásmido
de bacterias. Los fragmentos pequeños del DNA se
pueden insertar en los plásmidos, que luego se
introducen en las células bacterianas. A medida que
las bacterias se reproducen, también lo hace el
plásmido recombinante. El resultado es una colonia
bacteriana en la cual se ha reproducido el gen
deseado.
Materiales
Para cada grupo:
• Secuencia de bases del plásmido
• Secuencia de bases de DNA (gen deseado)
• Enzimas de restricción
• Tijeras
• Cinta adhesiva
• Lápiz
• Papel

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Instrucciones
1. Corte las 4 tiras del plásmido a lo largo de las líneas punteadas. Luego pegue las 4 tiras en
cualquier orden formando una sola tira larga (todas las letras deben quedar en la misma
dirección cuando pegue las tiras). Los dos extremos de la tira deben pegarse por sus extremos
formando un plásmido circular, teniendo cuidado de que el código genético quede por el lado
de afuera del plásmido.
2. Corte a lo largo de las punteadas la secuencia de DNA y péquelas para formar una tira larga.
Los pedazos se deben pegar en el orden indicado en la parte inferior de cada tira.
3. A continuación corte las tarjetas que representan las enzimas (endonucleasas) de restricción.
Note que las tarjetas de cada enzima tiene ilustrada una secuencia corta de DNA que muestre
la secuencia que corta cada enzima en particular.
4. Compare la secuencia de pares de bases de una tarjeta-enzima con las secuencias de los pares
de base del plásmido. Si encuentran la misma secuencia de pares de bases en la tarjeta-
enzima y la tira del plásmido, deben marcar la localización en el plásmido con un lápiz y
escribir el número de la enzima en el área marcada. Deben hacer esto para cada tarjeta-
enzima. Es probable que notes que algunas secuencias de enzimas pueden que no tengan una
secuencia correspondiente en el plásmido y que algunas secuencias enzimáticas pueden tener
más de una secuencia correspondiente en el plásmido.
5. Una vez que hayas identificado todas las correspondientes secuencias de las enzimas en el
plásmido, identifica a aquellas enzimas que cortan el plásmido solamente una vez. Desechen
cualquier enzima que corte el plásmido en la secuencia sombreada, pues esta corresponde a
la secuencia de replicación. Deben registrar sus resultados en un pedazo de papel separado.
6. Compara las enzimas que te servirán para cortar el plásmido con la tira de DNA humano.
Trata de hallar alguna enzima que haga dos cortes en el DNA, uno sobre la secuencia
sombreada del gen de la insulina y uno debajo de la secuencia sombreada del gen de la
insulina. Marquen las áreas, que cada enzima cortará, en la tira de DNA.
7. Después que hayan comparado cada enzima con la tira de DNA, seleccione una enzima para
hacer los cortes. Su objetivo es cortar el filamento de DNA lo más cerca posible a la secuencia
del gen de la insulina sin llegar a cortar la secuencia del gen. Hagan cortes en el plásmido y en
las tiras de DNA. Deben hacer los cortes de manera escalonada indicada por la línea negra en
la tarjeta-enzima.
8. Pegue los extremos pegajosos del plásmido a los extremos pegajosos del gen de la insulina
para crear su DNA recombinante.
PREGUNTAS DE DISCUSIÓN
1) ¿Por qué es importante encontrar una enzima que corte el plásmido en solo un sitio? ¿Qué podría
suceder si el plásmido fuese cortado en más de un sitio?
2) ¿Por qué es importante desechar enzimas que pudiesen cortar el plásmido en el sitio de la réplica?
3) ¿Por qué puede ser importante cortar el filamento del DNA tan cerca como sea posible del gen deseado?
4) En esta actividad, usted incorporó un gen de la insulina en el plásmido. ¿Cómo será utilizado el nuevo
DNA del plásmido para producir la insulina?
5) ¿Por qué la técnica se llama "ADN recombinante"?
6) ¿Por qué se llaman "extremos pegajosos" si la unión que permite reconstituir al plásmido se basa en los
mismos puentes de hidrógeno que forman el resto de la doble hebra de ADN?
7) Enzimas que modifican al DNA, tales como las enzimas de restricción, han sido descubiertas y aisladas de
células vivas. ¿Qué funciones crees que tienen ellas en las células?
8) ¿Qué característica en particular tienen las enzimas de restricción que la hacen eficiente para trabajar en
esta técnica?

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a. Responde verdadero o falso según corresponda. Justifica tus respuestas FALSAS.
1. Las enzimas de restricción reconocen secuencias de nucleótidos en el ADN.
2. La única técnica empleada para originar fragmentos de ADN es la que se basa en la
utilización de enzimas de restricción.
3. Las enzimas de restricción rompen la doble hélice del ADN en lugares específicos o cerca de
ellos.
4. Los fragmentos de ADN pueden ser incorporados a plásmidos o virus que actúen como
vectores.
5. Los plásmidos extracromosómicos no son vehículos corrientes utilizados para clonación.
6. Las enzimas de restricción ofrecen la posibilidad de segmentar el ADN en trozos y
ordenarlos en forma secuencial.
7. Escherichia coli es la única bacteria que produce enzimas de restricción.
8. Las bacterias producen enzimas de restricción para degradar el material genético extraño
que entre en la célula.
9. Las enzimas de restricción actúan sobre cualquier tipo de molécula.
b. Ordenar la secuencia de hechos que se emplean en ingeniería genética:
• Transferencia del vector con el ADN de interés (vector recombinante) a una célula en donde
se replique, proceso llamado “transformación” de la célula huésped.
• Generación de un fragmento o fragmentos de ADN que han de utilizarse o manipularse.
• Selección de aquellas células que llevan las moléculas de ADN recombinante deseado, y su
replicación como clones.
• Empalme de los fragmentos de ADN formando una molécula compuesta, ADN
recombinante, que puede actuar como vector, o ser incorporado en un vector para su
posterior transmisión.
Ordénala aquí:

4. SFC Prof. Gustavo Toledo C.

5. SFC Prof. Gustavo Toledo C.
ADN del Plásmido. La secuencia de ADN con el gen de la insulina (área más óscura)
replicación es el área más oscura.

6. SFC Prof. Gustavo Toledo C.
ADN del Plásmido. La secuencia de ADN con el gen de la insulina (área más óscura)
replicación es el área más oscura.