Universidad Nacional Mayor de San Marcos
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Cromosoma
                      Núcleo


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Doble hélice
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Flujo de la información genética
Transcripción y traducción.
Los nucleótidos del ARNm son
ensamblados para formar una
copia complementaria a partir
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Transcripción
(ADN        ARN)
ARN polimerasa
Condiciones para la transcripción

• NTP (ATP, CTP, GTP, UTP).
• Complejos proteicos:
  polimerasa de ribonucleótidos + fa...
Promotor procariote

Promotores: secuencias de reconocimiento en el ADN y
fijación de la ARN polimerasa.


               ...
Sitio de inicio de la transcripción
                    (eucariotes)


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Principales subunidades de las ARN Polimerasas




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Estudios bioquímicos de la ARN polimerasa
                bacteriana

1. Ensayo de unión al ADN
   “DNase I footprinting” ...
“DNase I footprinting”: una técnica común
para la identificación de sitios de unión a
proteínas en el ADN.

1. Un fragment...
Cromatografía de intercambio iónico
Dissociación de RNAP y purificación de σ
                   por cromatografía de intercambio iónico

 α           β
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La subunidad sigma disociable le confiere la especificidad a la
                ARN polimerasa procariota (RNAP)



      ...
Secuencias consenso de la región promotora
Otros tipos de promotores
Regiones de la subunidad σ (región 2.3)
Las subunidades σ y α reclutan a la ARN polimerasa
               hacia el promotor
Posición del ADN dentro y fuera del complejo de
                transcripción
Transcripción en eucariotes
• Tres polimerasas, muchas subunidades,
  factores y elementos reguladores
• ARN pol I: ARNr (...
Promotores de la ARN polimerasa II
Transcripción de ARNr
CH3
         CH3
                     CH3
                                  ARN
                    ...
Transcripción de ARNt y ARNsn (eucar.)


    RNA Pol III
TFIIIB
     TFIIIC




TFIIIB
     TFIIIC
Ensamblaje del complejo
de iniciación de ARN Pol
II:                                (TBP y TAFs)


A) Reconocimiento del  ...
D) Unión de complejos




E) Inicio de la
  transcripción
Amplificadores (enhancers)
• Aumentan la velocidad de la transcripción (regulan actividad
del promotor)
• Se localizan en ...
Cluster de genes globinas
• Enhancer β-Locus Control Region (LCR) contiene elementos que son reconocidos
por proteinas TFs...
“Motivos” proteicos
Interacción entre “dedos de Zn2+” y el ADN




                                                   (63 aa)




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Burbuja de Transcripción
Terminación dependiente de secuencia
Terminación de la
transcripción
Terminación
dependiente de Rho
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  1. 1. Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) Facultad de Ciencias Biológicas Curso: GENÉTICA MOLECULAR Semana 2 TRANSCRIPCIÓN DEL ADN Gustavo A. Sandoval, MSc PhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB) UNALM – 20090549@lamolina.edu.pe
  2. 2. Cromosoma Núcleo ADNmt Bases : A = adenina Célula T = timina G = guanina C = citosina TGAGTCAACG El genoma: nuclear y ADN mitocondrial
  3. 3. Doble hélice Antiparalelismo Surco menor Surco mayor 0.34 nm
  4. 4. Flujo de la información genética
  5. 5. Transcripción y traducción. Los nucleótidos del ARNm son ensamblados para formar una copia complementaria a partir de una cadena de ADN. Cada grupo de tres es un codón el cual es complementario a un grupo de tres nucleótidos en la región del anticodón de una molécula específica de ARNt. Cuando ocurre el apareamiento de bases, un aminoácido llevado al otro extremo de la molécula de ARNt es añadida a la cadena proteica creciente.
  6. 6. Transcripción (ADN ARN)
  7. 7. ARN polimerasa
  8. 8. Condiciones para la transcripción • NTP (ATP, CTP, GTP, UTP). • Complejos proteicos: polimerasa de ribonucleótidos + factores de transcripción • Señales de reconocimiento: (en secuencia de ADN): inicio, elongación, final. codificadora cadena molde
  9. 9. Promotor procariote Promotores: secuencias de reconocimiento en el ADN y fijación de la ARN polimerasa. TTGACA TATA
  10. 10. Sitio de inicio de la transcripción (eucariotes) Expresión basal Expresión regulada Amplificadores o silenciadores Caja CAAT Gen estructural -75 -25
  11. 11. Principales subunidades de las ARN Polimerasas s
  12. 12. Estudios bioquímicos de la ARN polimerasa bacteriana 1. Ensayo de unión al ADN “DNase I footprinting” para la búsqueda de secuencias promotoras. 1. Rol de las subunidades individuales Disociación de la holoenzima por cromatografía en columna
  13. 13. “DNase I footprinting”: una técnica común para la identificación de sitios de unión a proteínas en el ADN. 1. Un fragmento de ADN es marcado en un extremo con 32P (punto rojo). 2. La muestra es luego digerida con DNase I en la presencia y ausencia de una proteína que se une a la secuencia específica en el fragmento. 3. Se emplea una baja concentración de DNase I de forma que cada molécula de ADN sea clivada sólo una vez (flechas verticales). 4. Luego, las muestras de ADN son separadas de las proteínas y sometidas a electroforesis. El gel resultanto es analizado por autoradiografía, detectando sólo las cadenas marcadas y se procede a la identificación de los fragmentos clivados por la DNase I
  14. 14. Cromatografía de intercambio iónico
  15. 15. Dissociación de RNAP y purificación de σ por cromatografía de intercambio iónico α β σ α β’ ω [NaCl] [proteina] Carboxymethyl- (-CO2-2) or Número de fracción phospho- (-PO3-2) cellulose α β σ α β’ ω
  16. 16. La subunidad sigma disociable le confiere la especificidad a la ARN polimerasa procariota (RNAP) α β α β σ σ + α α β’ β’ ω ω Core enzimático Holoenzima Unión inespecífica al promotor; Unión específica al promotor; (Kd ~5 x 10-12 M) (Kd ~10-7 M); encuentra al promotor 10,000 veces más rápido.
  17. 17. Secuencias consenso de la región promotora
  18. 18. Otros tipos de promotores
  19. 19. Regiones de la subunidad σ (región 2.3)
  20. 20. Las subunidades σ y α reclutan a la ARN polimerasa hacia el promotor
  21. 21. Posición del ADN dentro y fuera del complejo de transcripción
  22. 22. Transcripción en eucariotes • Tres polimerasas, muchas subunidades, factores y elementos reguladores • ARN pol I: ARNr (28S, 18S y 5.8S) • ARN pol II: ARNm • ARN pol III: ARNt, ARNr 5S. • Procesos: Iniciación, elongación, terminación, procesamiento.
  23. 23. Promotores de la ARN polimerasa II
  24. 24. Transcripción de ARNr CH3 CH3 CH3 ARN 45 S Pol I
  25. 25. Transcripción de ARNt y ARNsn (eucar.) RNA Pol III TFIIIB TFIIIC TFIIIB TFIIIC
  26. 26. Ensamblaje del complejo de iniciación de ARN Pol II: (TBP y TAFs) A) Reconocimiento del TFIIA promotor B) Estabilización de complejos C) Reclutamiento de Holoenzima ARN Pol II + TFs
  27. 27. D) Unión de complejos E) Inicio de la transcripción
  28. 28. Amplificadores (enhancers) • Aumentan la velocidad de la transcripción (regulan actividad del promotor) • Se localizan en corriente arriba/abajo o ser parte del gen que controlan. • Algunos TFs (enhancer-binding protein) pueden unirse a regiones DNA distantes a miles de nucleótidos.
  29. 29. Cluster de genes globinas • Enhancer β-Locus Control Region (LCR) contiene elementos que son reconocidos por proteinas TFs (activadores) • LCR regula expresión de 5 genes: ε en periodo embrionario, γ en fetal, β y δ en la adultez.
  30. 30. “Motivos” proteicos
  31. 31. Interacción entre “dedos de Zn2+” y el ADN (63 aa) N C Dominio de unión Dominio de Dominio de unión al ligando activación al DNA Receptor glucocorticoide
  32. 32. Burbuja de Transcripción
  33. 33. Terminación dependiente de secuencia
  34. 34. Terminación de la transcripción
  35. 35. Terminación dependiente de Rho
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