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This lecture was given to Genetics and Biotechnology students at San Marcos University (Semester 2009-I)

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  • 1. Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) Facultad de Ciencias Biológicas Curso: GENÉTICA MOLECULAR Semana 2 TRANSCRIPCIÓN DEL ADN Gustavo A. Sandoval, MSc PhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB) UNALM – 20090549@lamolina.edu.pe
  • 2. Cromosoma Núcleo ADNmt Bases : A = adenina Célula T = timina G = guanina C = citosina TGAGTCAACG El genoma: nuclear y ADN mitocondrial
  • 3. Doble hélice Antiparalelismo Surco menor Surco mayor 0.34 nm
  • 4. Flujo de la información genética
  • 5. Transcripción y traducción. Los nucleótidos del ARNm son ensamblados para formar una copia complementaria a partir de una cadena de ADN. Cada grupo de tres es un codón el cual es complementario a un grupo de tres nucleótidos en la región del anticodón de una molécula específica de ARNt. Cuando ocurre el apareamiento de bases, un aminoácido llevado al otro extremo de la molécula de ARNt es añadida a la cadena proteica creciente.
  • 6. Transcripción (ADN ARN)
  • 7. ARN polimerasa
  • 8. Condiciones para la transcripción • NTP (ATP, CTP, GTP, UTP). • Complejos proteicos: polimerasa de ribonucleótidos + factores de transcripción • Señales de reconocimiento: (en secuencia de ADN): inicio, elongación, final. codificadora cadena molde
  • 9. Promotor procariote Promotores: secuencias de reconocimiento en el ADN y fijación de la ARN polimerasa. TTGACA TATA
  • 10. Sitio de inicio de la transcripción (eucariotes) Expresión basal Expresión regulada Amplificadores o silenciadores Caja CAAT Gen estructural -75 -25
  • 11. Principales subunidades de las ARN Polimerasas s
  • 12. Estudios bioquímicos de la ARN polimerasa bacteriana 1. Ensayo de unión al ADN “DNase I footprinting” para la búsqueda de secuencias promotoras. 1. Rol de las subunidades individuales Disociación de la holoenzima por cromatografía en columna
  • 13. “DNase I footprinting”: una técnica común para la identificación de sitios de unión a proteínas en el ADN. 1. Un fragmento de ADN es marcado en un extremo con 32P (punto rojo). 2. La muestra es luego digerida con DNase I en la presencia y ausencia de una proteína que se une a la secuencia específica en el fragmento. 3. Se emplea una baja concentración de DNase I de forma que cada molécula de ADN sea clivada sólo una vez (flechas verticales). 4. Luego, las muestras de ADN son separadas de las proteínas y sometidas a electroforesis. El gel resultanto es analizado por autoradiografía, detectando sólo las cadenas marcadas y se procede a la identificación de los fragmentos clivados por la DNase I
  • 14. Cromatografía de intercambio iónico
  • 15. Dissociación de RNAP y purificación de σ por cromatografía de intercambio iónico α β σ α β’ ω [NaCl] [proteina] Carboxymethyl- (-CO2-2) or Número de fracción phospho- (-PO3-2) cellulose α β σ α β’ ω
  • 16. La subunidad sigma disociable le confiere la especificidad a la ARN polimerasa procariota (RNAP) α β α β σ σ + α α β’ β’ ω ω Core enzimático Holoenzima Unión inespecífica al promotor; Unión específica al promotor; (Kd ~5 x 10-12 M) (Kd ~10-7 M); encuentra al promotor 10,000 veces más rápido.
  • 17. Secuencias consenso de la región promotora
  • 18. Otros tipos de promotores
  • 19. Regiones de la subunidad σ (región 2.3)
  • 20. Las subunidades σ y α reclutan a la ARN polimerasa hacia el promotor
  • 21. Posición del ADN dentro y fuera del complejo de transcripción
  • 22. Transcripción en eucariotes • Tres polimerasas, muchas subunidades, factores y elementos reguladores • ARN pol I: ARNr (28S, 18S y 5.8S) • ARN pol II: ARNm • ARN pol III: ARNt, ARNr 5S. • Procesos: Iniciación, elongación, terminación, procesamiento.
  • 23. Promotores de la ARN polimerasa II
  • 24. Transcripción de ARNr CH3 CH3 CH3 ARN 45 S Pol I
  • 25. Transcripción de ARNt y ARNsn (eucar.) RNA Pol III TFIIIB TFIIIC TFIIIB TFIIIC
  • 26. Ensamblaje del complejo de iniciación de ARN Pol II: (TBP y TAFs) A) Reconocimiento del TFIIA promotor B) Estabilización de complejos C) Reclutamiento de Holoenzima ARN Pol II + TFs
  • 27. D) Unión de complejos E) Inicio de la transcripción
  • 28. Amplificadores (enhancers) • Aumentan la velocidad de la transcripción (regulan actividad del promotor) • Se localizan en corriente arriba/abajo o ser parte del gen que controlan. • Algunos TFs (enhancer-binding protein) pueden unirse a regiones DNA distantes a miles de nucleótidos.
  • 29. Cluster de genes globinas • Enhancer β-Locus Control Region (LCR) contiene elementos que son reconocidos por proteinas TFs (activadores) • LCR regula expresión de 5 genes: ε en periodo embrionario, γ en fetal, β y δ en la adultez.
  • 30. “Motivos” proteicos
  • 31. Interacción entre “dedos de Zn2+” y el ADN (63 aa) N C Dominio de unión Dominio de Dominio de unión al ligando activación al DNA Receptor glucocorticoide
  • 32. Burbuja de Transcripción
  • 33. Terminación dependiente de secuencia
  • 34. Terminación de la transcripción
  • 35. Terminación dependiente de Rho