UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA INSTITUTO DE MEDICINA EXPERIMENTAL POSTGRADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS COMPONENTES DE LA POTENCIACIÓN A LARGO PLAZO (LTP) Y PLASTICIDAD DE SUBUNIDAD NR2B DE NMDAR EN MEMORIA Neurofisiología Por: E.G. Rubén Carvajal Caracas, 21 de julio de 2009

ANÁLISIS DE LOS COMPONENTES DE LA LTP

Cuando el axón de la célula A está lo suficientemente cerca de la célula B, como para excitarla y activarla de manera repetida y persistente, se producen cambios metabólicos y de crecimiento en una o ambas células, de manera que la eficiencia de A, como activadora de B, se incrementa. Ley del aprendizaje, de Donald Hebbs "Neurons that fire together wire together" 1949

Cuando el axón de la célula A está lo suficientemente cerca de la célula B, como para excitarla y activarla de manera repetida y persistente, se producen cambios metabólicos y de crecimiento en una o ambas células, de manera que la eficiencia de A, como activadora de B, se incrementa.

Ley del aprendizaje, de Donald Hebbs

Milner y Scoville (1953) Paciente H.M. Henry Gustav Molaison (February 26, 1926 – December 2, 2008) Fuerte epilepsia originada en el lóbulo medio temporal (hipocampo) Neurocirugía del hipocampo Después de la operación, H.M. no podía formar recuerdos de largo plazo. Sólo recordaba cosas por un período corto de tiempo , si no era distraido. Podía aprender nuevas actividades senso-motoras pero no podía recordar cómo las había aprendido. H.M. no tuvo nuevos recuerdos desde 1953. Creyó seguir siendo un veinteañero.

Zona de estimulación tetánica de alta frecuencia A y B son estimuladas C y D van del área 18 a la 17 E está en área 17 pero no es estimulada Formación de nuevas sinapsis como resultado de la estimulación

http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book = frplas ∂=ch12

Ramón y Cajal

DG = Giro dentado, MF = Fibras musgosas, SC = Vía colateral de Schaffer, AC = Vía de la comisura asociacional, PP = Paso perforante, Sb = Subículum CA = Células piramidales “ cornu ammonis” (“cuernos de Amón”)

Diseño experimental para demostrar LTP en el hipocampo. La vía colateral de Schaffer es estimulada para provocar una respuesta en las células piramidales CA1 . Comparación de la EPSP (excitatory postsynaptic potential ) en la LTP temprana y tardía. La primera fase se inicia con un tren simple y la última con 4 trenes de pulsos. (Kandel, ER, JH Schwartz y TM Jessell (2000) Principles of Neural Science . New York: McGraw-Hill.)

Receptor IONOTRÓPICO AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) Glutamato

Receptor IONOTRÓPICO NMDA (N-methyl-D-aspartate) Anti-Alzheimer Ansiolítico Glutamato NR2A NR2B NR1 N-Metil-D-Aspartato N-Metil-D-Aspartato AP-5 el bloqueante más efectivo

En la transmisión normal de baja frecuencia, el glutamato interactúa con los receptores ionotrópicos NMDA y AMPA así como los receptores metabotropicos (Kandel, ER, JH Schwartz y TM Jessell (2000) Principles of Neural Science . New York: McGraw-Hill.) Receptores ionotrópicos

(Kandel, ER, JH Schwartz y TM Jessell (2000) Principles of Neural Science . New York: McGraw-Hill.) Estimulación de alta frecuencia  abre canales AMPA  entra Na+  depolarización Mg++ se separa de canales NMDA  Entra Ca++ a la célula  Activa PKC, calmodulina, y TirosinaK  CalmodulinaK fosforila receptores AMPA, incrementando su sensibilidad al glutamato. CalmodulinaK activa s eñal de mensajero retr ógrado a terminal presináptico   liberación de glutamato. Fase inicial de la LTP AMPA NMDA Reverberancia (mantiene el estímulo, cuando se forma circuito: Glu-, Ca++, NOS) AQUÍ ESTÁ LA CLAVE DE LTP

(Kandel, ER, JH Schwartz y TM Jessell (2000) Principles of Neural Science . New York: McGraw-Hill.) Fase final de la LTP Ca++ entra en la célula Calmodulina (a) Adenil ciclasa (a) Quinasa del AMPc (a) MAPK (a) CREB (p) Se activa la síntesis de proteínas (vía BDNF: Brain-derived neurotrophic factor y tPA: Tissue plasminogen activator) Se forman nuevas sinapsis Posible sustrato de la memoria de Largo Plazo ¿EXPANSIÓN DENDRÍTICA ES EL MENSAJERO RETRÓGRADO?

? ¿QUIÉN ES EL MENSAJERO RETRÓGRADO EN LTP? ¿NO? ¿BDNF? ¿Moléculas de adhesión? AÚN SE DESCONOCE

Condiciones mínimas para ser un mensajero retrógrado en LTP DEBE ORIGINARSE EN A PARTIR DE LA NEURONA POSTSINÁPTICA CA1 DEBE TRANSFERIR INFORMACIÓN DE LA ESPINA DENTRÍTICA ACTIVADA AL TERMINAL PRESINÁPTICO DEBE SER UNA SEÑAL ESPECÍFICA ESPACIAL Y TEMPORALMENTE, PARA POTENCIAR LA FUNCIÓN DEL TERMINAL PRESINÁPTICO COGNADO. La expansión dendrítica cumple con los requisitos 1 y 3

DEBE ORIGINARSE EN A PARTIR DE LA NEURONA POSTSINÁPTICA CA1

DEBE TRANSFERIR INFORMACIÓN DE LA ESPINA DENTRÍTICA ACTIVADA AL TERMINAL PRESINÁPTICO

DEBE SER UNA SEÑAL ESPECÍFICA ESPACIAL Y TEMPORALMENTE, PARA POTENCIAR LA FUNCIÓN DEL TERMINAL PRESINÁPTICO COGNADO.

¿CÓMO ES EL MECANISMO DE LA LTP? ¿PRESINÁPTICO O POST-SINÁPTICO? ANÁLISIS QUANTAL IMAGEN DE ALTA RESOLUCIÓN FLUORESCENTE LTP-PRESINÁPTICO Difíciles de investigar Poca literatura LTP-POSTSINÁPTICO Más fáciles de investigar Mucha literatura MÉTODOS USADOS

El dogma de la inducción de LTP ESTIMULACIÓN ACTIVACIÓN DEL NMDAR SINAPSIS CA3-CA1 LTP

Corrección del dogma ESTIMULACIÓN 200 Hz NMDAR SINAPSIS CA3-CA1 LTP ESTIMULACIÓN 25 Hz NMDAR SINAPSIS CA3-CA1 LTP antagonista LTP independiente de NMDAR Expresión Presináptica LTP dependiente de NMDAR Expresión Postsináptica AP-5

Entrada de Ca++ papel clave en la inducción de LTP ESTIMULACIÓN 200 Hz NMDAR SINAPSIS CA3-CA1 LTP ESTIMULACIÓN 25 Hz NMDAR SINAPSIS CA3-CA1 LTP Quelante de Ca++ LTP independiente LTP dependiente BAPTA

Voltage-dependent calcium channel CREB Binding Protein Brain-derived neurotrophic factor Calcium-responsive transcription factor LA LTP COMPUESTA: NMDAR Y L-VGCC PERMITEN LA ENTRADA DE Ca++

Velocidad de expresión de LTP LTP independiente LTP dependiente Canales voltaje-Ca++ dependientes, tipo L Receptores NMDA Rápida y fuerte Lenta y más fuerte Memoria a corto plazo Memoria a largo plazo

Tipos de LTP Estimulaciones débiles LTP postsináptica dependiente de NMDAR Ca++ entra a dendritas postsinápticas vía NMDAR Activa inserción de AMPARs en membrna postsináptica. Estimulaciones fuertes LTP compuesta Ca++ entra a dendritas postsinápt. vía NMDARs y VGCCs Ca++ L-VGCCs  señal retrógrada   actividad presináptica

Protocolos de estimulación que generan LTP Bliss y Lomo (10 – 100 Hz) Tetanizaci ón (25 – 400 Hz) (5 - 100 Hz) + Theta-burst stimulation (TBS) (muchos de 5 Hz) (10 a 15 min) Time-locked depolarization + estimulación de neuronas presinápticas (0,1 a 1 Hz) POST PRE

Métodos de medición de la actividad presináptica y postsináptica ELECTRO FISIOLÓGICOS MÉTODOS IMAGENOLOGÍA ANÁLISIS QUANTAL (Presináptico) PPF (Pair.pulse facilitation) Single-photon Imaging Multiphoton Laser Scanning Microscopy Epifluoresencia Microscopía de escaneado confocal Más efectiva a 50 micras de espesor Quanta de NT 2 estímulos en sucesión de 1 seg

Hipótesis de la sinapsis silenciosa (LTP = fenómeno post-sináptico) Existen sinapsis sin AMPAR funcionales Durante el potencial de reposo, NMDAR están bloqueados por Mg++ Las sinapsis sin AMPAR son “silenciosas” funcionales LTP induce nuevos AMPAR en membrana y reduce las sinapsis silenciosas

Existen sinapsis sin AMPAR funcionales

Durante el potencial de reposo, NMDAR están bloqueados por Mg++

Las sinapsis sin AMPAR son “silenciosas” funcionales

LTP induce nuevos AMPAR en membrana y reduce las sinapsis silenciosas

LTP = ¿SUSTRATO BIOLÓGICO DE LA MEMORIA ?

PRUEBAS FLUORESCENTES PARA MEDIR ACTIVIDAD PRESINÁPTICA LAS PRIMERAS PRUEBAS LAS REALIZÓ ZAKHARENKO COMBINANDO 2 TÉCNICAS MultiphotonLaser Scanning Microscopy CON EL MARCADOR FLUORESCENTE DE VESÍCULAS SINÁPTICAS FM 1-43

FM 1-43: INDICADOR DE ACTIVIDAD PRESINÁPTICA EN HIPOCAMPO FM 1-43 Endocitosis Vesículas presinápticas Descargado por exocitosis junto con NT Velocidad de descarga de FM 1-43 Directamente asociada con la frecuencia de estimulación sináptica. 1Hz > 2Hz > 10Hz botones presinápticos durante carga y descarga (3 minutos)

Caracaterización de LTP post- y pre- sináptica (Zakharenko) Inicio de la inducción de LTP Protocolos de estimulación Frecuencua BAJA de estimulación LTP inducida en sinapsis CA3-CA1con FM 1-43 (Post-sináptica) Actividad presináptica medida por la velocidad de descarga de FM 1-43

Visualización del Hipocampo con SinaptopHluorina

Terminal presináptico expresa synaptopHluorina (spH) en vesículas sinápticas. La fluoresencia (verde) es atrapada dentro de las vesículas ácidas,  expresión (rojo) cuando el lumen vesicular es expuesto al espacio extracelular. SynaptopHluorina permite medir velocidades de endocitosis y exocitosis presináptica SynaptopHluorina mide actividad presináptica en el hipocampo

Actividad presináptica durante LTP compuesta Potencial excitatorio post-sináptico Potencial pre-sináptico Potencial excitatorio post-sináptico Potencial pre-sináptico No induce potenciación presináptica Induce leve potenciación presináptica

Qdots: un nuevo tipo de sonda fluorescente biocompatible

Quantum dots son nanocristales semiconductores VENTAJAS No pierden su fluoresencia durante iluminación prolongada Fácilmente visibles por microscopía electrónica Indican el número exacto de vesículas sinápticas

No pierden su fluoresencia durante iluminación prolongada

Fácilmente visibles por microscopía electrónica

Indican el número exacto de vesículas sinápticas

PAPEL DE LA SUBUNIDAD NR2B DEL NMDAR EN MEMORIA Y DOLOR

LTP NO CONTRIBUYE ÚNICAMENTE A LA MEMORIA DOLOR CRÓNICO  Neuronas del asta dorsal del trigémino  Potenciación de sinapsis excitatoria (TOTALMENTE DEPENDIENTE DE ACTIVACIÓN POSTSINÁPTICA DEL NMDAR) CORTEX PREFRONTAL (PFC) y CORTEX DEL CÍNGULO ANTERIOR (ACC)  Lesión periférica  Inducción de LTP  DOLOR, MIEDO, EMOCIONES AMÍGDALA  SE PRODUCE LTP  Dependiendo del protocolo de estimulación va vía NMDAR o L-VGCC

Papel de la subunidad NR2B del NMDAR en la señalización involucrada en el dolor crónico Zhuo (2009) Molecular Brain 2 :4 Anterior Cyngulate Cortex

MECANISMO DE MANTENIMIENTO DE LA MEMORIA ESPACIAL DURANTE LA LTP

Aparato de entrenamiento para medir LTM y STM Area de entrenamiento de baja velocidad, con área de choque fija (sector en rojo). Protocolo para medir el tiempo de retención de la LTMemory y STMemory en evitar el sitio de choque, al usar ZIP o solución salina

Recorridos de las ratas sesiones de 10 minutos Lugar de potenciales descargas 6 Ratas control (sol. Salina) 6 Ratas inyectadas con ZIP Las ratas de ambos grupos exploran Las ratas de ambos grupos evitan el shock A las 24 h de la 8va prueba (2 h después de inyección intrahipocampal de ZIP y sol. salina Estas ratas retienen la LTMemory Estas ratas pierden la LTMemory

Tiempo antes de entrar a la zona de choque

Tiempo de permanencia en la zona de choque

Dominio regulatorio de PKC contiene pseudosustrato que inactiva dominio catalítico, hasta estimulación por segundos mensajeros. PKMz = Proteinquinasa atípica contituida por el dominio catalítico independiente de la PKCz Carece de dominio regulatorio  es activa de forma autónoma. ZIP contiene pseudosustrato z + miristoil (derivado Mirístico 14:0  permeabilidad celular) ZIP imita dominio regulatorio  inhibe PKMz Similitud estructural entre PKCz y PKMz Zeta Inhibitor Peptide

Efecto de ZIP sobre el potencial excitatorio post-sináptico